JP2002540783A - 生物細胞の超音波分解の装置と方法 - Google Patents

生物細胞の超音波分解の装置と方法

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クレウズィアート，フィリペ
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Biomerieux SA
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子生物学分野を好適用途分野とする、標本（５）がこの用途に適した少なくとも一つの容器（４または１０）内に含まれる、分解される細胞を含む少なくとも一つの生物標本（５）内に出力に差がある超音波を発生するための音極（２）を備えた装置及び少なくとも一つの２つの音極を備えた装置と、少なくとも一つのかかる音極（２）を使用する、容器（４）内に含まれた生物標本を超音波によって分解する方法を提供する。 【解決手段】 装置は音極（２）が一つまたは複数の容器（４）と直接接触することを特徴とするまた方法は：−容器（４）を音極（２）のと直接接触して位置づけるステップと；−後から、例えば、増幅ステップで使用できるように、放出されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡを保存しながら標本（５）内に含まれる細胞を分解するのに十分な時間の間前記一つまたは複数の音極（２）を作動させるステップ：とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はその中のガラス玉の有無を問わず分解される標本の領域で容器内に出
力の差がある超音波を発生させるための装置と方法に関するものである。超音波
周波数はおよそ２０から５０キロヘルツ（ｋＨｚ）の範囲で変動する。
【０００２】
【従来の技術】
現行技術は微生物の分解法として生物学超音波を用いる２つの技法によって主
として構成される。
【０００３】 第一の技法は分解される液体標本内に音極を沈める直接超音波分解を含む。こ
の場合に用いられる原理は、音極を液体と直接接触させ、媒質内に極めて高い空
洞形成を引き起こす高出力超音波を連続して、あるいはパルスモードで発生させ
ることにある。使用される音極は一般的に高出力で（１００から１０００ワット
（Ｗ））、きわめて短時間（１分程度）で分解することが困難であることが知ら
れているきわめて多様な標本を分解することができる。
【０００４】 しかしながら、２つの大きな障害のためにこの技法の利用は制限される。
【０００５】 まず、空洞形成現象は制御がきわめて困難な現象であり、多数の試験に対する
分解率は再現性がなくなるだろう。
【０００６】 更に、この強烈な空洞形成は核酸の制御できない強い切断を引き起こし、この
ことは、使用者がミリリットルあたり数十から数百の微生物（きわめて低濃度）
を分解、検出、増幅しようとする場合に問題になる可能性がある。
【０００７】 最後に、音極は標本と直接接触しているので、自動機械の中で実施するには時
間と費用がかかるステップである、前記音極の清掃ステップを備えない限り、患
者からの採取物に対して自動的に使用することはできない。
【０００８】 上記の問題に関連する他の障害もある。例えば、空洞形成は標本の一部を凝集
させ、それによって実現される分析精度がさらに低下する。最後に、音響出力が
高すぎるので、試験管が過熱して前記試験管が劣化したり、さらには溶解してし
まうことになりかねない。
【０００９】 第二の技法は浴内超音波分解を含み、米国特許ＵＳ−５，３７４，５２２に開
示されている。原理は水を満たした清掃浴を使用し、その中に分析される標本を
含む試験管の下部を浸すものである。標本は約１５分間（ｍｎ）、一般的に一定
の、超音波場に置かれる。試験管内に存在する玉はこのとき強く攪拌されて微生
物を分解するのに十分な衝突と剪断能力を引き起こす。上述の第一の技法と異な
り、この第二の技法は十分な分解有効性を得るためにガラス玉を必要とする。上
述の直接超音波分解技法と比較して、この技法は上述のいくつかの問題を解決す
ることができる。
【００１０】 例えば、標本は試験管内に密閉されているので振動対の汚染がない、それは超
音波が槽の底から標本管の内部まで水（優れた超音波カップラ）を介して伝達さ
れるからである。
【００１１】 更に、媒質内に放出されるエネルギー密度（ミリリットルあたりのワット数で
表す（ｗ／ｍｌ））は、空洞形成現象がもっと弱いので、同じ周波数についてお
よそ３００分の１の低さである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
この技法の主たる問題点は、液体の管理（槽の充填、排出）、超音波分解の前
に必要なガス抜き、超音波分解の後しずくが垂れ、清潔さを損なう濡れた試験管
の管理のために自動化が困難なことにある。
【００１３】 ほかにも課題がある。例えば、結果には再現性がない、それは音響出力は超音
波分解のための浴を受容するすべての区域内で等価ではないからである。それは
、槽の下に、一つまたは複数の変換器を備えた超音波浴の構造自体によるもので
ある。しかるに、超音波場は変換器を介して放射され、空間内で均質にならない
。結果として、微生物の分解度または核酸の切断は標本ごとに全く異なり、制御
できない。
【００１４】 しかしながら、分解される生物標本の容器との音極の直接接触による超音波分
解技法もある。それは例えば、特許ＥＰ−Ａ−０．３３７．６９０の場合である
。
【００１５】 とはいえ、容器と音極の間の接触は平坦表面によって行われるので、分解され
る標本全体に均質な分解を保証することはできない。かかる装置は核酸の遊離に
必要な分解物の要求事項を満たしていない。このとき唯一の解決法は少なくとも
２倍の時間、この分解時間を大幅に延長することであるが、この不均等な超音波
分解にもっとも暴露される核酸が変質、さらには破壊されてしまう。
【００１６】 エネルギー密度（Ｗ／ｍｌ）を比較することによって、上述の現行技術の２つ
の技法の大きな差を理解することができる。エネルギー密度は標本の体積に対す
る標本に放出された出力の時間積分で定義される。この密度はこれら２つの技法
についてある時間内に得られた温度上昇を測定することによって実験的に評価で
きる。
【００１７】
【数１】
【００１８】 ここで Ｅ：エネルギー体積密度 Ｗ：出力（Ｗ） Ｖ：標本体積（ｍｌ） 浴内で１５分の超音波分解の後、試験管内で温度測定を実施して、標本に放出
された出力を評価することができる： ℃ Ｔ＝４０．６℃ すなわち １ｔ＝１９．６℃ またＤＷ＝ｔｘ０．３ｍｌ＝１９．６×０．３
＝５．８８ｃａｌ／１５ｍｎ したがって、Ｗｔ＝（５．８８×４．１８）／（６０×１５）＝０．０２７Ｗ 浴内超音波分解型の超音波浴内のエネルギー密度Ｄ（ｍ／ｌ）は： Ｄ＝０．０２７／０．３＝０．０９Ｗ／ｍｌ
【００１９】 ここで確認されるように、エネルギー密度は媒質内に直接沈めた音極で得られ
るものに比べておよそ３００分の１になるが、それは、文献によれば、エネルギ
ー密度が一般的に少なくとも３０Ｗだからである。浴内超音波分解に関して公報
ＵＳ−Ａ−５，３７４，５２２に与えられた情報はこの値を裏書きするものであ
る。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、提案された装置は標本を入れた試験管の健全性を保ちながら
、核酸の切断を制御することによって上述の課題全体に答えることを可能にする
。全体は完全に清潔で、試験管の外部といずれかの液体の接触が全くなく、前記
試験管の内容物は外界から完全に隔離されている。この隔離によって試験管が超
音波分解を受けたときに外部に飛び出さず、凝集と蒸発が大幅に制限される。
【００２１】 このため、本発明は分解される細胞を含む少なくとも一つの生物標本内に出力
に差がある超音波を発生するための音極を備えた装置において、標本がこの用途
に適した少なくとも一つの容器内に含まれ、音極と容器の間の前記接触表面の間
に流体なしに、音極が分解される標本を含む、一つまたは複数の容器と直接接触
し、音極が分解される標本を含むそれぞれの容器の全体または一部の形状に沿っ
た活性表面を有し；容器と接触している音極の活性表面が凹型であることを特徴
とする装置に関するものである。
【００２２】 別の実施態様によれば、容器と接触している音極の活性表面が凸型である。
【００２３】 活性表面が凹型であるとき、音極と協働する容器の表面は可撓性で、前記音極
の活性表面に適合する。
【００２４】 すべての場合において、音極は容器内に含まれる標本内に配置された少なくと
も一つのガラス玉と協働する。
【００２５】 それぞれのガラス玉の直径は細菌の分解の場合９０から１５０また好適には１
００マイクロメートル（μｍ）であり、酵母の分解の場合直径は１５０から１５
００また好適には５００マイクロメートル（μｍ）である。これらの値は理論的
なものではなく、出願人が鋭意実施した研究の対象であり、その結果として１９
９７年９月２３日付のフランス優先権の下に、１９９８年９月２３日に特許出願
ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１４７５が出願された。この原理の独創性はこれらの値が
直接超音波分解技法にも適用できることである。
【００２６】 とくに有利な変型実施態様によれば、装置は少なくとも２つの音極を備えてい
る。
【００２７】 更に、それぞれの容器は加圧手段によって一つまたは複数の音極と物理的に接
触している。
【００２８】 それぞれの音極は超音波発射周波数が２０と５０ｋＨｚの間、もっと正確には
３０と４０ｋＨｚの間に含まれ、好適にはほぼ３５ｋＨｚである。
【００２９】 本発明は少なくとも一つの音極を使用する、容器内に存在する生物標本内に含
まれる細胞を超音波によって分解する方法にも関する。第一の実施態様によれば
、該方法は、 −容器を一つまたは複数の音極の活性表面と直接接触して位置づけるステップと
； −後から、例えば、増幅ステップで使用できるように、放出されたＤＮＡおよび
／またはＲＮＡを保存しながら標本内に含まれる細胞を分解するのに十分な時間
の間前記一つまたは複数の音極を作動させるステップ： とを含むことを特徴とする。
【００３０】 第二の実施態様によれば、該方法は： −容器を一つまたは複数の音極の活性表面と直接接触して位置づけるステップと
； −後から、例えば、増幅ステップで使用できるように、放出されたＤＮＡおよび
／またはＲＮＡを分割しながら標本内に含まれる細胞を分解するのに十分な時間
の間前記一つまたは複数の音極を作動させるステップ： とを含むことを特徴とする。
【００３１】 上述の２つの実施態様の変型によれば、一つまたは複数の音極の作動の前に、
容器は前記一つまたは複数の音極の活性表面に対して押しつけられる。
【００３２】 それぞれの音極の作動は次の条件でおこなわれる： −１０から１５分間の超音波分解時間 −サイクル比は４０と６０％の間に含まれ、好適には５０％、また −出力１０から３０Ｗ。
【００３３】 方法の推奨実施態様によれば、それぞれの音極の作動は一連のパルスを含み、
その時間は５と２０秒の間に、好適には１０と１５秒の間に含まれる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
添付の図面は例として挙げられたものであり、一切制限するものではない。そ
れらは本発明の理解を助けるものである。
【００３５】 本発明は超音波発生器と生物標本の間にカップリング液を使用しない、超音波
による微生物分解装置に関するものである。この装置は核酸の分割を制御しなが
ら、また遊離される遺伝子物質の量を最大にしながら核酸を遊離するために使用
される。
【００３６】 本発明のもう一つの目的は、直接超音波分解とも呼ばれる、変換が直接行われ
ることを独創性とする新規な超音波分解原理にある。これは分解される標本を含
む、一つまたは複数の試験管または適切なその他いっさいの容器を、一つまたは
複数の試験管の形状に適合した音極に直接結合することをもって成る。この場合
、もはやカップリング液はない。
【００３７】 本発明のさらに別の目的は、媒質内に放出された核酸の分割を制御して標本を
効果的に分解することを可能にする超音波分解パラメータを見つけることにある
。
【００３８】 Ｉ）分解装置の様々な実施態様 Ａ−第一の実施態様 第一の分解装置１を評価した。このタイプの装置１は図１に示されている。
【００３９】 装置１は先端部の直径が４ミリメートル（mm）の２０ｋＨｚで作動するＶ１Ａ
モデルの音極２を備えている。音極の励起に使用される発電機３は連続またはパ
ルスモードで作動することができる３００Ｗの発電機３である（ＢｉｏＢｌｏｃ
ｋ、ＶｉｂｒａＣｅｌｌタイプ、モデル７２４０１）。パルスの出力とサイクル
比は（１０から９０％）調節可能である。サイクル比は次のように定義される： サイクル比（％）＝Ｔｏｎ／（Ｔｏｎ＋Ｔｏｆｆ） ＴｏｎとＴｏｆｆはパルス状態を定義し、Ｔｏｎは超音波発生時間、Ｔｏｆｆは
２つのＴｏｎの間の休止である。
【００４０】 分析される標本５を含む試験管４は容器の役割を果たし、このプローブ２の先
端に位置づけられ、上部板６を用いて加圧によって維持されている。板６の上に
置かれた重し７は重し７の質量に応じて音極２の先端と試験管４の間の結合度を
変えることができる。すべての試験に用いられる試験管４はＣｒｙｏ Ｔｕｂｅ
ＮＵＮＣ １．８ｍｌ型で半球状底部はほぼＵ字形である。他の形状またはメ
ーカーの試験管も使用可能である。
【００４１】 全体がセットされたら、試験管４は一般的に１と１．５分（ｍｎ）の間に含ま
れる可変時間の間超音波にさらされる。
【００４２】 試験によって明らかになったが、各種のパラメータ（出力、時間、サイクル比
、ガラス玉の量、板上の結合重量、など）を調節することによって試験管を劣化
させることなしに、選択したパラメータによって差のある核酸保存率で、十分な
微生物分解を得ることができる。
【００４３】 試験管４に伝達された出力密度を計算することによって試験管４の万一の劣化
、ならびに空洞形成の規模が評価できる。
【００４４】 出力密度Ｄｐ（Ｗ／ｃｍ2）＝Ｐｅ（Ｗ）×η／Ｓｃ（ｃｍ2） ここで、 Ｐｅ：発電機から供給された電気出力（Ｗ単位） η ：電気出力音響出力変換係数（無次元） Ｓｃ：音極試験管接触表面積（ｃｍ2単位） 入力電気出力は一般的に２０Ｗ（１５から３５Ｗで試験）、電気音響変換効率
は８０％と推定され、この装置１の場合、Ｄｐ＝２０×０．８（３．１４×０．
２2）＝１２７Ｗ／ｃｍ2
【００４５】 Ｂ−第二の実施態様 第二の分解装置１が実現され、それは２０ｋＨｚの代わりに３５ｋＨｚでの直
接超音波分解システムに関するものである。この装置１は図２に示されている。
外側構造はそれぞれ２０ｋＨｚと３５ｋＨｚのこれら２つの音極について同一で
あるが、３５ｋＨｚの音極は多数の利点を有する。
【００４６】 第一に、同じ出力で、空洞形成現象の規模を減らすことができる。空洞形成敷
居値、すなわち空洞形成のある、およびない２つの領域の間の出力限度は周波数
におうじて放物線状に大幅に増加する。
【００４７】 第二に、大きな振幅のために２０ｋＨｚの音極で認められた（分解物の回収の
障害となる）標本の飛散が最小になる。
【００４８】 最後に第三に、システムが小型化され、音極２を構成する要素の長さは周波数
が増加すると短縮される。
【００４９】 ３５ｋＨｚで動作するこの音極２はＭＷ１０００ＧＳＩＰ型の５００Ｗの発電
機３（ＳＯＤＥＶＡ社）によって供給を受ける。同じ板６が前記試験管４と音極
２の間の結合を調節するように試験管４を加圧することができる。
【００５０】 ２０または３５ｋＨｚの使用音極２を問わず、昇圧器９を使用すると、その断
面比とそれが置かれた位置によって、プローブ２先端の振動振幅を増減できる。
この増減は使用された試験管４またはその他いっさいの容器の寸法の比に正比例
する。例えば、試験管４の直径が１５から１２mmに減ると、１５／１２＝１．２
５倍振動の振幅を増すことができる。
【００５１】 事実、昇圧器９はプローブの残りの部分と同じ材料の、金属製の円筒で構成さ
れ、一般的にチタンまたはアルミ製である。これはその中心部分で直径が段階的
に変化する。前記昇圧器９の長さは音響適合の問題のために波長の半分の長さに
対応する。
【００５２】 昇圧器９の役割はプローブの先端の振動振幅を増加することであり、結果的に
、媒質に供給された音響出力を増加することである。この振動振幅は昇圧器９の
２つの直径に正比例する。
【００５３】 図２はプローブ２の異なる要素を示し、機械的支えと加圧板は図示されていな
い。
【００５４】 出力密度評価のために、半球の接触面積を計算する： Ｓｃ＝２πＲ2＝２×３．１４×０．６２＝２．２６ｃｍ2 すなわち、入射電力を２０Ｗ、変換係数を８０％とすると、第二の装置１の場合
： Ｄｐ＝２０×０．８／２．２６＝７．１Ｗ ｃｍ2 が得られる、すなわち出力密度は第一の装置の１８分の１になる。
【００５５】 この出力密度ははるかに小さいので、試験管４を損なうことなしにもっと大き
な出力にかけることができる。
【００５６】 Ｃ−第三の実施態様 該方法は複数の試験管４でも実施できる。したがって、装置１の第三の実施態
様では、図３に示したごとく、少なくとも２つの試験管の内容物を同時に分解す
ることができる。周波数は同一で、結合形状は３５ｋＨｚの第二の装置１とほぼ
同じであり、その活性表面は、後述のごとく半球状である。音極２のすべての位
置において、同じ結合力が得られるように、バネシステムによってそれぞれの試
験管４に働く圧力を個別に調節することができる。
【００５７】 ＩＩ）処理標本を含む容器の各種の実施態様 Ａ−第一の実施態様 第一の実施態様は図１から３に示したように、全く従来通りの、試験管４によ
ってもちろん構成される。しかしながら、これらの図に示された試験管４の形状
は非制限的であり、広がりの程度が異なる、正または逆の少なくとも一つの円錐
台区域の有無を問わず、多数の他の形状が本発明に使用することができる。
【００５８】 この場合、第一の分解装置１は第二のものほど効率的ではない。したがって、
第二の分解装置によって、音極２と試験管４の間の結合は前記試験管４のＵ字形
の形状に適合した凹型の先端を実現することによって向上する。音響出力はもっ
と大きな接触表面を介して伝達されるので、接触表面が小さすぎて、出力密度が
高く成りすぎることによる過剰なジュール効果による散逸のために試験管４が劣
化することなしにもっと広い出力範囲を使用することができる。
【００５９】 更に、音極２の活性表面８はＵ字形なので、この形状により音極２に対して容
器４の位置を常に完全にすることができるので、試験ごとの再現性が向上する。
第一の装置では、この結果の再現性は制御がもっと困難であった。
【００６０】 更に、この形状は超音波をもっと均質に配分することを可能にし、したがって
、容器または試験管４内の攪拌を向上させることができる。前記容器４内に、玉
９を備えることが可能であり、さらにはそれが望ましい。ここでも分析結果には
再現性がある。 Ｂ−第二の実施態様 この実施態様は図４から６に示されている。これはプラスチックのカード１０
で、カード１０を貫通する少なくとも一つの横断穴または井戸１３を備えている
。井戸１３はその２つの開口部の領域で、一般的に軟質で透明な材料のフィルム
１２によって限定されているので、それによって超音波分解が実施される空洞が
囲繞される。
【００６１】 この場合、プローブの形状は、一方のフィルム１２に押しつけたときに、当該
フィルムが変型して、結合が増加して、分解が向上するように凸型とすることが
できる。
【００６２】 実験結果 一方は２０ｋＨｚで、他方は３５ｋＨｚで振動する、２種類の音極で研究を実
施した。これらの音極は（市販の）通常の試験管で、あるいはカード型の消耗品
とともに使用した。
【００６３】 異なる音極を評価するために、２つの評価モデルを選択した： −細菌（モデルとして、スタフィロコッカス・エピデルミヂス）、分析される採
取物内でもっとも探されるタイプの微生物の代表 −酵母（モデルとして、カンヂダ・クルセイ）、分解がとくに難しいことで知ら
れ、おなじく分析される採取物内で求められる。
【００６４】 この研究の実施のために、２種類のアプローチが選択された： １−分析至適条件を識別するための超音波分解パラメータの様々な組み合わせ
の研究：分解物の分析は分解率を評価するために光学密度を測定し、核酸の遊離
ならびにその分割状態を評価するために寒天ゲル上で転移させることをもって成
る。寒天ゲル上の電気泳動については、複写で再現することが困難なので写真を
添付していないが、得られた結果は説明する。
【００６５】 ２−感度の研究：核酸が、第一のステップで決定されたパラメータの至適調節
によって、ＰＣＲを始めとする、いっさいの分析技法によって増幅、検出が可能
な、分解された微生物の最小量の決定。
【００６６】 ＩＩＩ）試験管陽の音極による超音波分解 Ａ−２０ｋＨｚ音極 この研究に使用した装置は分析装置のＩ−Ａ章「第一の実施態様」と、図１に
詳述されている。したがって、この装置は発電機によって供給される２０ｋＨｚ
音極を備え、その上に分解管が位置づけられ、重しが音極と試験管の間の接触を
成立させる。
【００６７】 １）パラメータの至適調節の調査 カンヂダ・クルセイ酵母は、手順の各種のパラメータを変化させて、その分解
と、核酸遊離を最大にし、これらの核酸の分割を最小にするために上述の装置で
直接超音波分解によって処理した。
【００６８】 作業条件： すべての試験について、音響出力はＰｓ＝０．８×２５＝２０ＷとＰｓ＝０．
８×３５＝２８Ｗの間に含まれていた。いずれの場合にも、変換係数ηは８０％
である。総体的に、試験管に供給されたエネルギーはどの試験でも同じであった
と考えることができる。この出力調節は、玉の量がもっと多いときに十分な攪拌
を得ることを可能にするだけである。
【００６９】 固定パラメータは次の通りである： −Ｂｉｏｂｌｏｃｋ３００Ｗ発電機を備えた２０ｋＨｚ音極、重量１４３０ｇお
よびＮＵＮＣ試験管１．８ｍｌ −標本は、８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡと２％の硫酸ラウリルリチ
ウムを含むｐＨ＝８．５％の緩衝液内の、約１０7酵素／ｍｌ（５５０ｎｍでの
Ｄ．Ｏ．が０．６００）のカンヂダ・クルセイ酵母（株番号９６０４０５８、ｂ
ｉｏＭｅｒｉｅｕｘの所蔵）の懸濁である、 −標本量＝６００μｌ、また −直径４２５μｍ−６００μｍのガラス玉（酸洗い済み、Ｓｉｇｍａ）。
【００７０】 可変パラメータは表１に示した： −供給出力＝Ｐｓ（ワット単位） −サイクル率（％） −超音波分解時間（分）、および −ガラス玉の量（μｌ）。
【００７１】 結果は下記によって評価した： −玉攪拌観察：低すぎても（運動なし）、強すぎても（標本の過熱を伴う）いけ
ない、および −０．８％寒天ゲル電気泳動と、ブロム化エチジウム（ＢＥＴ）着色による２０
μｌの分解物の分析；分子量マーカーによって無傷の形で遊離した核酸の帯を識
別（ゲノムＤＮＡ、ｒＲＮＡ１８Ｓと２６Ｓ）。 結果：
【００７２】
【表１】
【００７３】 表１：２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解、試験管内酵母分解および攪拌な
らびに、酵母の核酸遊離に対する音響出力、サイクル比およびガラス玉の量の影
響 玉攪拌 （＋）弱、＋正 無傷の核酸の遊離：−無、（＋）弱、＋可視、＋＋可視、強い それぞれの試験条件について、２回の試験を実施した。
【００７４】 試験結果の所見： −ガラス玉の攪拌は試験管に提供される出力（Ｐｓ）の調節によって完全に制御
される、 −酵母は分解可能であり、核酸は分割されない形で遊離できる：ゲノムＤＮＡと
リボソームＲＮＡに対応する、帯の形で、寒天ゲル上に信号が存在する（とくに
条件３と４番について）、また −パラメータの調節は遊離核酸の量と分割に直接影響する： ＊サイクル比：調節が低すぎると（２０％）十分な材料が遊離しない 調節が高すぎるときも（８０％）、核酸の分割が強すぎ
るので、信号が低くなる、また ＊玉の量：もっと大量の玉（３０μｌの代わりに６０μｌ）が正確に攪
拌されると、もっと多くの材料が遊離できる。
【００７５】 実験の続きに最も重要な採用された条件は、したがって、この表１の試験の４
番に記載されたものである。
【００７６】 ２）感度試験： 感度試験は１０7から１０2酵母／試験の希釈範囲で実現した。これらの酵母は
第一部で決定した至適条件で直接超音波分解によって処理した。比較として、同
じ希釈範囲を出願人の特許出願ＦＲ９７／１２１６４に記載の、基準分解法、渦
流によって処理した。
【００７７】 操作条件： １０2、１０3、１０4、１０5酵母／試験で水中に酵母を懸濁した後、次のよう
に処理した： −直接超音波分解：表１，条件４番で先に述べた条件 −渦流 ：５ｍｌＦａｌｃｏｎ管、標本６００μｌ、直径４２５−６００μｍの
ガラス玉１５０μｌ、直径２mmの３個のガラス玉、直径１．５mmの鉄玉５個、最
大出力で１２分間渦流 分解物はサプライヤの手順に従ってＳｅｐｈａｄｅｘカラム（ＤＮＡ精製用Ｑ
ｕｉｃｋ Ｓｐｉｎカラム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上で精
製し、マキムラらの記載した手順（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
１９９４； ４０：３５８−３６４）に従って、ＰＣＲによって１０μｌの分解
物の増幅を実現した。つぎに２０μｌのＰＣＲ生成物を１．２％寒天ゲル電気泳
動と、ブロム化エチジウム（ＢＥＴ）着色によって分析した。 結果：
【００７８】
【表２】
【００７９】 表２：２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解、試験管内分解−２つの分解処理の
後のＰＣＲによる酵母検出 ２種類の分解は下記の通りである： −２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解による分解 −渦流による分解 ゲル上の信号： −不可視、＋可視、＋＋可視で強い それぞれの試験条件について、２回の試験を実施した。
【００８０】 試験結果の所見： −至適条件で直接超音波分解によって得られた分解物はＰＣＲできちんと増幅で
きる：所望のＰＣＲ生成物のサイズにきちんと対応する可視の強い帯が存在する
、また −直接超音波分解および渦流によって分解した後、このＰＣＲ法による検出感度
は１０4酵母／試験であった。したがって、超音波分解による分解は基準分解法
と同じ成績を得ることができる。
【００８１】 ３）結論 これらの試験は、２０ｋＨｚでの直接超音波分解による分解の実現可能性を実
証するものである。それらはまた酵母の核酸遊離を最大にし、その分割を最低に
するために超音波分解パラメータを調節できることを示した。最後に、これらの
パラメータはＰＣＲによって増幅可能な核酸を得て、基準分解法のものと同等の
検出感度に達することができる。
【００８２】 Ｂ−３５ｋＨｚ音極 使用した超音波分解装置は図２に示され、Ｉ−Ｂ章 分解装置の「第二の実施
態様」に詳述されている。２０ｋＨｚの代わりに３５ｋＨｚでの超音波分解の利
点はこの同じ章に説明されている。他方で、この分解装置は試験管と音極の間の
接触表面積がもっと大きい；このことの利点は処理標本を入れた容器の「第一の
実施態様」（ＩＩ−Ａ章）に説明されている。
【００８３】 １）パラメータの至適調節の調査 目的は細菌と酵母の分解を最大にし、したがって、核酸の分割を完全に制御し
て核酸遊離を最大にすることである。これらの最小にするために上述の装置で直
接超音波分解によって処理した。
【００８４】 作業条件： 下記の試験について、音響出力は音極によって発生した振動の振幅によって定
義した。この振幅は超音波分解器に電力を供給する発電機の出力の百分率で与え
られる。
【００８５】 固定パラメータは次の通りである： −ＳＯＤＥＶＡ ５００Ｗ発電機を備えた３５ｋＨｚ音極、重量１４３０ｇおよ
びＮＵＮＣ試験管１．８ｍｌ −標本： ＊酵母試験：８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡと２％の硫酸ラウ
リルリチウムを含むｐＨ＝８．５％の緩衝液内の、約２×１０7酵素／ｍｌ（５
５０ｎｍでのＤ．Ｏ．が０．９５０）のカンヂダ・クルセイ酵母（株番号９６０
４０５８、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘの所蔵）の懸濁、また ＊細菌試験：３０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡと１００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含むｐＨ＝７．２％の緩衝液内の、約１０9細菌／ｍｌ（５５０ｎｍでの
Ｄ．Ｏ．が０．９００）のスタフィロコッカス・エピデルミディス（株番号Ａ０
５４、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘの所蔵）の懸濁 −標本量＝６００μｌ、また −ガラス玉： ＊酵母試験：直径４２５μｍ−６００μｍのガラス玉９０μｌ（酸洗い
済み、Ｓｉｇｍａ）、また ＊細菌試験：直径１０６μｍのガラス玉１２０μｌ（ＶＩＡ Ｉ）。
【００８６】 可変パラメータは表２と３に示した： −振動振幅（％） −供給出力＝Ｐｓ（ワット単位）は振幅に直接結びつけられる −超音波分解パルス時間（Ｔｏｎ）と休止時間（Ｔｏｆｆ）、分単位、これらの
時間がサイクル比：Ｔｏｎ／（Ｔｏｎ＋Ｔｏｆｆ）を定義する、また −超音波分解合計時間（分）。
【００８７】 結果は下記によって評価した： −玉攪拌観察、 −分解処理前と、分解後の細胞懸濁駅内の５５０ｎｍでの光学密度の測定。概算
分解百分率は下記のように求められる： （分解後Ｄ．Ｏ．550nm）／（分解後Ｄ．Ｏ．550nm）×１００、および
−０．８％寒天ゲル電気泳動と、ブロム化エチジウム（ＢＥＴ）着色による２０
μｌの分解物の分析；分子量マーカーによって無傷の形で遊離した核酸の帯を識
別（ゲノムＤＮＡ、ｒＲＮＡ１８Ｓと２６Ｓ）。分割された核酸はこれらの帯の
下に現れる。 結果：酵母試験
【００８８】
【表３】
【００８９】 表３：３５ｋＨｚ音極による直接超音波分解、試験管内分解−酵母の分解百分
率、ならびに核酸遊離およびその分割状態に対する音響出力、サイクル比および
超音波分解時間の影響 核酸の遊離：−無、＋可視、＋＋可視で強い、＋＋＋可視できわめて強い それぞれの試験条件について、２回の試験を実施した。 結果：細菌試験
【００９０】
【表４】
【００９１】 表４：３５ｋＨｚ音極による直接超音波分解、試験管内分解−細菌の分解百分
率、ならびに核酸遊離およびその分割状態に対する音響出力、サイクル比および
超音波分解時間の影響 核酸の遊離：−無、＋可視、＋＋可視で強い、 ＋＋＋可視できわめて強い それぞれの試験条件について、２回の試験を実施した。 玉攪拌に関する結果 出力１５Ｗ（振幅５０％）：中心に攪拌ドームを形成しながら、液体の体積の
下半分内の玉の均質攪拌。玉は互いにこすれあいながら、小さく運動する。
【００９２】 出力２０Ｗ（振幅８０％）：もっと強い攪拌；玉は液体のもっと大きな体積を
占める、もっと大きな運動を実現する。液体の加熱も大きくなる。
【００９３】 攪拌結果からの所見： −ガラス玉を正しく攪拌するには１５Ｗの出力で十分である、 −２０ｋＨｚの音極に比較して、３５ｋＨｚの音極は、もっと大量の玉について
（６０μｌの代わりに９０μｌと１２０μｌ）ガラス玉を攪拌させるのにより低
い出力（２０Ｗの代わりに１５Ｗ）しか必要としない、また −もっと大きな表面積（試験管の底部全体）によって超音波を伝達することによ
って、玉の攪拌はもっと均質になり、液体の加熱は低くなる。
【００９４】 分析結果からの所見： −細菌と酵母が分解可能であり、それらの核酸が遊離できた、 −パラメータの調節は遊離される核酸の量と分割に直接影響する： 出力（振幅）：−振動振幅が高いので（８０％）分解率と遊離核酸の量
をわずかに上げることができる、また分割は強くなる。 −振幅が５０％のときは、ゲノムＤＮＡ全体とリボソームＲＮＡ
の一部を温存しながら、十分な量の核酸が遊離される。 サイクル比：サイクル比が高いとき（Ｔｏｎ １０秒／Ｔｏｆｆ １０
秒）、高い振幅と同じ効果が得られる。
【００９５】 超音波分解時間：時間が長いと（１５分）分割状態に影響することなし
に分解率と遊離核酸の量を上げることができる。 −非分割状態で最大の核酸を得るために採用した条件は振幅とサイクル比が低い
長時間の超音波分解である（表２と３の条件２）、また −分割状態で最大の核酸を得るために採用した条件は振幅が高い長時間の超音波
分解である（表２の条件５）。
【００９６】 ２）感度研究： 感度研究は、１０6から１０2酵母／試験の希釈範囲で実現した。これらの酵母
は第一部で評価した異なる条件で直接超音波分解によって処理した： １．非分割状態で最大の核酸を得るために採用した条件 ２．サイクル比だけを上げた、これと同じ条件 ３．同じく条件１で、振幅だけを上げた。
【００９７】 第一部において示されたごとく、この最後の二つの条件では、分解率が高くな
ったが、核酸の分解も多くなった。他方で、同じ希釈範囲を出願人の特許出願Ｆ
Ｒ９７／１２１６４に記載の、基準分解法、渦流によって処理した。
【００９８】 操作条件： １０2、１０3、１０4、１０5、１０6と１０2酵母／試験で水中に酵母を懸濁し
た後、次のように処理した： −直接超音波分解：第一部の表２と３に記載の条件１，２と３ −渦流 ：５ｍｌＦａｌｃｏｎ管、標本６００μｌ、直径４２５−６００μｍの
ガラス玉１５０μｌ、直径２mmの３個のガラス玉、直径１．５mmの鉄玉５個、最
大出力で１２分間渦流 分解物はサプライヤの手順に従ってＳｅｐｈａｄｅｘカラム（ＤＮＡ精製用Ｑ
ｕｉｃｋ Ｓｐｉｎカラム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上で精
製し、マキムラらの記載した手順（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
１９９４； ４０：３５８−３６４）に従って、ＰＣＲによって１０μｌの分解
物の増幅を実現した。つぎに２０μｌのＰＣＲ生成物を１．２％寒天ゲル電気泳
動と、ブロム化エチジウム（ＢＥＴ）着色によって分析した。 結果：
【００９９】
【表５】
【０１００】 表５：２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解、−各種の分解処理後のＰＣＲによ
る酵母検出感度 各種の分解は下記の通りである： −３つの条件での２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解による分解 −渦流による分解 ゲル上の信号： −不可視、（＋）弱、＋可視、＋＋可視で強い それぞれの試験条件について、２回の試験を実施した。
【０１０１】 試験結果の所見： −至適条件で直接超音波分解によって得られた分解物はＰＣＲできちんと増幅で
きる：所望のＰＣＲ生成物のサイズにきちんと対応する可視の強い帯が存在する
、また −３つの条件で直接超音波分解によって分解した後、ＰＣＲによって１０4酵母
／試験まで検出された；ただし、核酸をもっと強く分割する条件（条件２と３）
で超音波分解したとき、１０4酵母／試験について観察された信号はもっと弱い
、また −超音波分解による分解後に得られた検出感度は基準法、渦流、による分解の後
に得られたものに非常に近い。
【０１０２】 ３）結論 これらの試験は、２つの異なる生体（細菌と酵母）に対する３５ｋＨｚでの直
接超音波分解による分解の実現可能性を実証するものである。さらに、重要ない
くつかの超音波分解パラメータを正当に調節することによって遊離核酸の分割を
完全に制御しながら、これらの生体の分解を最大にできることも実証された。こ
れらの重要な超音波分解パラメータは識別され、至適調節が決定された。他方で
、３５ｋＨｚ直接超音波分解によってＰＣＲによって増幅可能な核酸が遊離され
、ＰＣＲによる増幅に有利なことが分かった超音波分解条件は基準分解法、渦流
、によって得られるものにきわめて近い検出感度を得ることを可能にすることが
分かった。核酸をもっと強く分割する超音波分解条件はＰＣＲによる増幅には若
干不利になる。とはいえ、核酸をあらかじめ断片化することによって促進される
交雑法を用いる核酸の精製などの、分子生物学の他の特定の用途分野では核酸の
強い分割がきわめて遊離になることもある。
【０１０３】 Ｃ−多管３５ｋＨｚ音極 複数の試験管の同時直接超音波分解の概念は、分解装置の「第三の実施態様」
（Ｉ−Ｃ章）に記載されている。以下の試験は、１２の試験管の同時直接超音波
分解を可能にし、他方では、Ｉ−Ｂ部の試験に使用された３５ｋＨｚ音極と同じ
特性値（同じ超音波分解周波数、同じ管音極接触表面積）を示す装置で実施され
た。この多管超音波分解装置の特徴は管・音極接触の、ひいては試験管ごとの分
解有効性の優れた再現性を得るために１２の管のそれぞれに働く圧力を調節でき
ることにある。
【０１０４】 １）再現可能な超音波分解のための管・音極結合の調節 １２の管のそれぞれに重量によってかけられる圧力を測定し、ついですべての
管に均質な圧力が得られるように調節した。この均質性は、Ｉ−Ｂ部で決定した
至適条件での超音波分解の際の玉の均質な挙動によって確認された。 に達することができる。
【０１０５】 操作条件： それぞれの試験管にかかる力は、力センサーに組み合わされた試験管の高さが
標本試験管の高さと同一になるように、一部の欠けた管の上に位置づけられた、
直径１６mm、暑さ＝４．５mmの円盤状の力センサー（製品番号ＢＣ３０２ＫＧ
ＭＶ／Ｖ，サプライア Ｃ２ＡＩ、フランス）によって測定される。センサーは
圧縮力を表す電圧を表示するためにデジタル表示器（タイプ ４８×９６、プロ
グラム式、サプライア Ｃ２ＡＩ、フランス）に接続されている。
【０１０６】 測定のために１１本の標本管と力センサーを備えた試験管が音極の１２の位置
に配置された。センサーを備えた試験管はそれぞれの位置で管にくわえられた圧
縮力を読みとるために、位置１から位置２に向かって、ついで位置２から３に向
かって、…・位置１２まで順次移動された。３系列の測定を実現した。３系列の
測定の平均について計算した結合力からの配分の標準偏差は調節前の大きな分散
を示すが、それは変動率（ＣＶ）が１０％程度だからである（表６参照）。
【０１０７】 次にそれぞれの当接軸の圧縮バネの調節によってセンサーのあるそれぞれの位
置について当接力の調節を次に実施した。 調節後、圧縮力の値のＣＶは１未満の値になることが分かった。 結果：
【０１０８】
【表６】
【０１０９】 表６：多管についての３５ｋＨｚ音極での超音波分解−異なる管にかかる圧力 分解運動特性化： １２本の管にかかる圧力を均質化した後、直接超音波分解の際の玉の運動の均
質化の程度を視覚表示した。超音波分解は表３と４に記載の条件３（最大分解と
核酸の最大保存に最適と決定された）を適用し、水を「標本」に用いて、ＩＩＩ
−Ｂ部に記載したように厳密に実施した。他方で、１２本の管に働く重量は順次
増加させ（２．７ｋｇ、３．７ｋｇ、４．６ｋｇ、５．６ｋｇ）、管・音極接触
を増加させた。
【０１１０】 重量が小さすぎると（２．７ｋｇ）、管ごとに玉の運動の変動性が非常に大き
くなる。事実、一部の管内の玉は静止しているので、この重量は１２本の管と音
極の間に十分な接触を成立させるには不十分である。
【０１１１】 他方、敷居重量（３．７ｋｇ）から、玉の運動は１２本の管のそれぞれの中で
同じ特徴を示す：中心に攪拌ドームを形成して、液体の体積の下半分内での玉の
均質な攪拌。玉は互いにこすれあいながら、小さく運動する。
【０１１２】 ２）結論 至適管音極接触表面積での３５ｋＨｚ超音波分解の原理（Ｉ−Ｂ部に記載）を
複数の管の同時処理に適用できることが分かった。他方で、管音極接触力を調節
することによってすべての管内で均質な分解運動を得ることができる。こら２つ
の観察から、再現可能な仕方で特定の数の標本を処理するために自動機械内で超
音波分解の原理を使用する可能性が実証される。
【０１１３】 ＩＶ）カード型の消耗品に対する音極による超音波分解 カードに対する２０ｋＨｚ音極： カード型超音波分解装置は図４から６に示されている。これらの図は２つの配
置の可能性、ならびに超音波分解の間の液体と玉の挙動も示している。この装置
に用いられる音極は分解装置の「第一の実施態様」（Ｉ−Ａ章）に記載されたも
のであるが、直径１３mmの平坦な口が採用される。カード型の消耗品は処理され
る標本を含む容器の「第二の実施態様」（ＩＩ−Ｂ章）に記載されている。この
消耗品はポリスチレン製であり（生物分析と親和性のある他のプラスチックも使
用可能である）、寸法は４０×４０×４mmであり、標本とガラス玉を収納するた
めに、可変直径の、井戸と呼ばれる、円形開口部を中心に備えている。この井戸
の底部は厚み０．３mmのプラスチック、またはポリプロピレン製自己接着フィル
ムで構成されている。このフィルムは消耗品を閉じるのにも用いられる。
【０１１４】 １）カード型に結びつけられるパラメータの評価： Ｉ−Ａ部ですでに研究した、他の超音波分解パラメータについては固定値を選
択して、カードの使用に結びつけられるパラメータだけを評価した。分解試験は
酵母と細菌によって実現した、また分解の有効性と遊離核酸の分解状態を測定し
た。
【０１１５】 操作条件： 固定パラメータは次の通りである： −ＳＯＤＥＶＡ ３００Ｗ発電機を備えた２０ｋＨｚ音極と上述の消耗品、カー
ドは水平位置、 −出力： ・酵母試験は：２５Ｗ，ｍａｔａ ・細菌試験は：１３−１４Ｗ， −サイクル比８０％、超音波分解時間 ５ｍｎ −標本： ＊酵母試験：８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡと２％の硫酸ラウ
リルリチウムを含むｐＨ＝８．５％の緩衝液内の、約２×１０7酵素／ｍｌ（５
５０ｎｍでのＤ．Ｏ．が０．９５０）のカンヂダ・クルセイ酵母（株番号９６０
４０５８、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘの所蔵）の懸濁、また ＊細菌試験：同じ緩衝液内の、約８．５×１０8細菌／ｍｌ（５５０ｎｍ
でのＤ．Ｏ．が０．７２０）のスタフィロコッカス・エピデルミディス（株番号
Ａ０５４、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘの所蔵）の懸濁 −ガラス玉： ＊酵母試験：直径４２５μｍ−６００μｍの玉９０μｌ（酸洗い済み、
Ｓｉｇｍａ）、また ＊細菌試験：直径１０６μｍの玉１２０μｌ（ＶＩＡ Ｉ）。
【０１１６】 可変パラメータは表６と７に示した： −井戸の直径（mm） −井戸の底部の種類（軟質透明フィルムまたはプラスチック底部） −標本体積（μｌ） −ガラス玉体積（μｌ） 結果は下記によって評価した： −玉攪拌観察、 −０．８％寒天ゲル電気泳動と、ブロム化エチジウム（ＢＥＴ）着色による２０
μｌの分解物の分析；分子量マーカーによって無傷の形で遊離した核酸の帯を識
別（ゲノムＤＮＡ、ｒＲＮＡ１８Ｓと２６Ｓ）。分割された核酸はこれらの帯の
下に現れる。 結果：細菌試験
【０１１７】
【表７】
【０１１８】 表７：２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解、カード内分解−細菌の分解、と
くに核酸遊離量およびその分割状態に対する「カード」型に結びつけられたパラ
メータ（井戸のサイズと底部、標本量、玉の量）の影響 核酸の遊離：−無、＋可視、＋＋可視で強い、 備考：条件８についてカードは垂直位置である。 結果：酵母試験
【０１１９】
【表８】
【０１２０】 表８：２０ｋＨｚ音極による直接超音波分解、カード内分解−酵母の分解、と
くに核酸遊離量およびその分割状態に対する「カード」型に結びつけられたパラ
メータ（井戸のサイズと底部、標本量、玉の量）の影響 核酸の遊離：−無、＋可視、＋＋可視で強い、 備考：条件３と４について超音波分解時間は１０ｍｎである。
【０１２１】 攪拌に関する結果 水平位置、軟質フィルムの底部：音極によって発生した超音波は液体と玉を井戸
の周辺部に放射する（図６参照）。玉は互いにこすれあいながら、小さく高速で
運動する。この運動は主としてフィルムによって側面方向に伝達された超音波に
よるものである。フィルムの劣化、液体の顕著な加熱はない。 水平位置、プラスチックの底部：液体と玉は上述と同じように位置づけられるが
、玉の攪拌は明らかに弱い。他方、プラスチックの底部、ひいては液体が強く加
熱される。 垂直位置、軟質フィルムの底部：液体と玉は井戸の下部、音極のちょうど正面、
すなわち水へ位置より小さい体積内に位置づけられる。玉の攪拌はかなり強いが
、顕著な液体の加熱はない。
【０１２２】 結果の所見： −細菌と酵母は分解可能であり、その核酸は遊離できた、 −水平位置、軟質フィルムの底部の超音波分解はＤＮＡもリボソームＲＮＡも分
割せずに、きわめて効果的な分解と、大量の核酸の遊離（ゲル上のきわめて強い
信号）を可能にする。実際、フィルムはきわめて薄く、強くて柔軟なので、音極
とフィルムの間のきわめて良好な結合、したがって、玉のきわめて強い攪拌、そ
してジュール効果による散逸が比較的少ない、すなわち加熱が少ない超音波伝達
が可能になる。更に、音響軸をのぞいて、井戸の周辺に液体が閉じ込められるこ
とによって液体内の空洞形成現象が大幅に減少する。 −プラスチックの底部での超音波分解は核酸の遊離量がより少なく、一方核酸（
ＤＮＡとｒＤＮＡ）はより強く分解された。これは明らかに、玉の攪拌が弱く、
カードの底と液体の加熱が大きいためである。これら２つの現象は音極とカード
の硬質底部との結合が悪く、ジュール効果がより大きいことによって説明される
、また −分解移動の直径が大きくなると、分解効率が低下し、核酸遊離が少なくなる。
液体と玉が中心部で音極から離れると、超音波効果が低下するので、さけなけれ
ばならない。したがって、直径が音極のそれに近いカードを使用することが望ま
しい。
【０１２３】 ２）結論： カード型の消耗品での直接超音波分解の実現可能性ははっきりと実証された。
これらの試験によって、遊離核酸を完全に温存しながら大きな分解効率に至るカ
ードの使用条件も明らかにされた（直径が音極のそれに近い井戸、薄く軟質のフ
ィルムによる結合）。この核酸の温存は核酸が完全に無傷の状態であることが要
求される分子生物学の分析のためにきわめて遊離である。他方で、この種の消耗
品を直接超音波分解に使用することはきわめて有利であり、必要な場合、その後
の標本処理と分析を同じカードに統合することができる。この様にして、微生物
の分解とその分析、識別は同じ消耗品内で実現可能になり、標本間汚染のおそれ
が低下し、工程が容易に自動化できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 試験管による使用配置において、２０ｋＨｚの音極を示している。
【図２】 試験管が超音波分解を受ける前の試験管による使用配置において、本発明によ
る、３５ｋＨｚの音極を示している。
【図３】 １２本の試験管で使用可能な、図２による、３５ｋＨｚの音極を示している。
【図４】 内容物が本発明による直接超音波分解によって分解を受ける水平位置のカード
を示している。
【図５】 内容物が本発明による直接超音波分解によって分解を受ける垂直位置のカード
を示している。
【図６】 直接超音波分解の間の液体とガラス玉の挙動を示す図４の詳細図である。
【符号の説明】
１．装置 ２．音極またはプローブ ３．発電機 ４．管または容器 ５．管４またはカード１０内に含まれる標本 ６．加圧手段または上部板 ７．バラスト重し ８．音極２の活性表面 ９．昇圧器 １０．カードまたは容器 １１．ガラス玉 １２．フィルム １３．井戸 １４．平坦な先端 １５．音極またはプローブ １６．音極１５の活性表面 １７．変換器 １８．基部 １９．支え板 ２０．加圧板 ２１．管４に組み合わされた圧縮体 Ｆ１．標本５の移動 Ｆ２．フィルム１２の振動
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月１７日（２００１．３．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｎ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブロイエル，パトリック フランス、エフ−69100 ビルールバンヌ、 アブニュ ロベルト ロセリーニ、11 (72)発明者 マビラート，クロード フランス、エフ−69650 サン−ジェルマ ン オ モン−ドオール、リュ デュ マ ノワール、５ (72)発明者 インカルドーナ，サンドラ フランス、エフ−69003 リヨン、クール ガーンベット、７ Ｆターム(参考） 4B029 AA16 BB02 BB07 CC01 4B033 NG02 NG03 NH05 NJ05 NK10

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分解される細胞を含む少なくとも一つの生物標本（５）内に出
    力に差がある超音波を発生するための音極（２または１５）を備えた装置（１）
    において、 標本（５）がこの用途に適した少なくとも一つの容器（４または１０）内に
    含まれ、音極（２または１５）と容器（４または１０）の間の前記接触表面の間
    に流体なしに、音極（２または１５）が分解される標本（５）を含む、一つまた
    は複数の容器（４または１０）と直接接触し、音極（２または１５）が分解され
    る標本を含むそれぞれの容器（４または１０）の全体または一部の形状に沿った
    活性表面（８または１６）を有し；容器（４）と接触している音極（２）の活性
    表面（８）が凹型であることを特徴とする装置。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の装置において、 容器（１０）と接触している音極（１５）の活性表面（１６）が凸型である
    ことを特徴とする装置。
  3. 【請求項３】請求項１または２のいずれか一つに記載の装置において、音極
    （１５）と協働する容器（１０）の表面が可撓性で、前記音極（１５）の活性表
    面（１６）に適合することを特徴とする装置。
  4. 【請求項４】請求項１から３のいずれか一つに記載の装置において、 音極（２または１５）が容器（４または１０）内に含まれる標本（５）内に
    配置された少なくとも一つのガラス玉（１１）と協働することを特徴とする装置
    。
  5. 【請求項５】請求項１から４のいずれか一つに記載の装置において、 それぞれのガラス玉（１１）の直径が細菌の分解の場合９０から１５０また
    好適には１００マイクロメートル（μｍ）であり、酵母の分解の場合直径は１５
    ０から１５００また好適には５００マイクロメートル（μｍ）であることを特徴
    とする装置。
  6. 【請求項６】請求項１から５のいずれか一つに記載の装置において、 少なくとも２つの音極（２または１５）を備えていることを特徴とする装置
    。
  7. 【請求項７】請求項１から６のいずれか一つに記載の装置において、 それぞれの容器（４または１０）が加圧手段（６）によって一つまたは複数
    の音極（２または１５）と物理的に接触していることを特徴とする装置。
  8. 【請求項８】請求項１から７のいずれか一つに記載の装置において、 それぞれの音極（２または１５）は超音波発射周波数が２０と５０ｋＨｚの
    間、もっと正確には３０と４０ｋＨｚの間に含まれ、好適にはほぼ３５ｋＨｚで
    あることを特徴とする装置。
  9. 【請求項９】少なくとも一つの音極（２または１５）を使用する、容器（４
    または１０）内に存在する生物標本（５）内に含まれる細胞を超音波によって分
    解する方法において、 −容器（４または１０）を一つまたは複数の音極（２または１５）の活性表
    面と直接接触して位置づけるステップと； −後から、例えば、増幅ステップで使用できるように、放出されたＤＮＡお
    よび／またはＲＮＡを保存しながら標本（５）内に含まれる細胞を分解するのに
    十分な時間の間前記一つまたは複数の音極（２または１５）を作動させるステッ
    プ： とを含むことを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】少なくとも一つの音極（２または１５）を使用する、容器（
    ４または１０）内に存在する生物標本（５）内に含まれる細胞を超音波によって
    分解する方法において、 −容器（４または１０）を一つまたは複数の音極（２または１５）の活性表
    面と直接接触して位置づけるステップと； −後から、例えば、増幅ステップで使用できるように、放出されたＤＮＡお
    よび／またはＲＮＡを分割しながら標本内（５）に含まれる細胞を分解するのに
    十分な時間の間前記一つまたは複数の音極（２または１５）を作動させるステッ
    プ： とを含むことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】請求項９または１０のいずれか一つに記載の方法において、 一つまたは複数の音極（２または１５）の作動の前に、容器（４または１０
    ）が前記一つまたは複数の音極（２または１５）の活性表面に対して押しつけら
    れることを特徴とする装置。
  12. 【請求項１２】請求項９から１１のいずれか一つに記載の装置において、 それぞれの音極（２または１５）の作動が次の条件でおこわなわれる： −１０から１５分間の超音波分解時間 −サイクル比は４０と６０％の間に含まれ、好適には５０％、また 出力１０から３０Ｗ： であることを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】請求項１２に記載の方法において、 それぞれの音極（２または１５）の作動が一連のパルスを含み、その時間は５と
    ２０秒の間に、好適には１０と１５秒の間に含まれることを特徴とする方法。
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