ES2222190T3 - Aparato y procedimiento de lisis mediante ultrasonidos de celulas biologicas. - Google Patents
Aparato y procedimiento de lisis mediante ultrasonidos de celulas biologicas.Info
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Abstract
Aparato (1), que comprende un sonotrodo (2) destinado a generar ultrasonidos con una potencia más o menos fuerte en al menos una muestra (5) biológica que contiene células que van a lisarse, muestra (5) que está contenida en al menos un recipiente (4) adaptado para este uso, el sonotrodo (2) está directamente en contacto con el o los recipientes (4), que contienen la muestra (5) que va a lisarse, en ausencia de fluido entre dichas superficies en contacto entre el sonotrodo (2) y el recipiente (4), caracterizado porque el sonotrodo (2) tiene una superficie (8) activa que se adapta completamente o parcialmente a la forma de cada recipiente (4) que contiene la muestra que va a lisarse; la superficie (8) activa del sonotrodo (2) en contacto con el recipiente (4) tiene una forma cóncava.
Description
Aparato y procedimiento de lisis mediante
ultrasonidos de células biológicas.
La presente invención se refiere a un aparato y a
un procedimiento para generar ultrasonidos con una potencia más o
menos fuerte en un recipiente sobre una muestra que va a lisarse
con o sin presencia de bolas de vidrio en su interior. La gama de
frecuencia ultrasónica varía aproximadamente de 20 a 50 kilohercios
(kHz).
El estado de la técnica comprende esencialmente
dos técnicas, que utilizan ultrasonidos en biología como método
para lisar microorganismos.
La primera técnica consiste en la sonicación
directa sumergiendo el sonotrodo en la muestra líquida que va a
lisarse. El principio utilizado en este caso consiste en poner en
contacto el sonotrodo directamente con el líquido y en generar en
continuo o en modo por impulsos ultrasonidos con una potencia fuerte
que inducen una cavitación muy intensa en el medio. Los sonotrodos
utilizados tienen generalmente una potencia fuerte (100 a 1000
vatios (W)) y permiten lisar muestras muy diversas, conocidas como
difíciles de lisar en muy poco tiempo (del orden del minuto).
Sin embargo, dos inconvenientes mayores limitan
el uso de esta técnica.
En primer lugar, al ser el fenómeno de cavitación
un fenómeno que puede controlarse muy difícilmente, el porcentaje
de lisis en un número importante de pruebas no podrá pues
reproducirse.
Además, esta cavitación muy intensa induce una
escisión intensa no controlada de los ácidos nucleicos, lo que
puede plantear un problema cuando el usuario intenta lisar,
detectar y amplificar algunas decenas o centenas de microorganismos
por mililitro (concentración muy débil).
Finalmente, al estar el sonotrodo directamente en
contacto con la muestra, esta técnica no puede utilizarse de manera
automatizada sobre muestras de pacientes, excepto si se prevé una
etapa de limpieza de dicho sonotrodo, etapa larga y costosa para
ponerla en práctica en un autómata.
Existen otros inconvenientes en relación con los
problemas descritos anteriormente. Así, la cavitación conlleva la
condensación de una parte de la muestra, lo que reduce más la
finura del análisis realizado. Finalmente, si la potencia acústica
es demasiada elevada, el calentamiento excesivo del tubo puede
producir degradaciones, incluso la fundición de dicho tubo.
La segunda técnica consiste en la sonicación en
baño, que se describe bien en la patente de los EE.UU. número
5.374.522. El principio consiste en utilizar un baño de limpieza
con ultrasonidos lleno de agua, y en el que se sumerge la parte
inferior de los tubos que contienen las muestras que van a lisarse.
Se someten las muestras a un campo ultrasónico, en general
constante, durante un tiempo de aproximadamente 15 minutos (min).
Entonces, las bolas presentes en los tubos se someten a una
agitación fuerte que genera choques y tensiones por esfuerzo
cortante suficientes para lisar los microorganismos. Al contrario de
la primera técnica descrita anteriormente, esta segunda técnica
necesita el uso de bolas de vidrio para obtener una eficacia de
lisis satisfactoria. En comparación con la técnica anterior de
sonicación directa, esta técnica permite resolver algunos de los
problemas mencionados anteriormente.
De este modo, al estar las muestras contenidas en
un tubo cerrado, no hay contaminación del elemento vibratorio, ya
que los ultrasonidos se transmiten a través del agua (que es un
excelente medio de acoplamiento ultrasónico) desde el fondo del
recipiente hasta el interior del tubo de muestra.
Además, al ser la densidad volumétrica de energía
(expresada en vatios por mililitro (W/ml)) liberada en el medio
casi 300 veces más débil para la misma frecuencia, el fenómeno de
cavitación es menos importante.
El mayor inconveniente de esta técnica radica en
su dificultad para automatizarse dada la gestión del líquido
(llenado y vaciado del recipiente), la desgasificación necesaria
antes de la sonicación y la gestión de los tubos húmedos después de
la sonicación, que gotean, lo que afecta a la limpieza.
Existen otros inconvenientes. Así, no pueden
reproducirse los resultados ya que la potencia acústica no es
equivalente en todas las zonas del recipiente que reciben el baño
para la sonicación. Eso se debe a la propia construcción de los
baños de ultrasonidos que comprenden, por debajo del recipiente, uno
o varios transductores. Ahora bien, el campo ultrasónico radia
mediante un transductor, lo que no es homogéneo en el espacio. Por
consiguiente, el grado de lisis de los microorganismos o la
escisión de los ácidos nucleicos es extremamente heterogéneo de una
muestra a otra, y no puede controlarse.
Sin embargo, existen técnicas de sonicación
mediante el contacto directo entre el sonotrodo y el contenido de
la muestra biológica que va a lisarse. Por ejemplo, es el caso de
la solicitud de la patente
EP-A-0.337.690.
Sin embargo, el contacto entre el recipiente y el
sonotrodo está constituido por una superficie plana que no permite
garantizar una lisis homogénea en toda la muestra que va a lisarse.
Tales dispositivos no responden a los requisitos de calidad de
lisado necesarios para la liberación de ácidos nucleicos. De este
modo, la única solución es aumentar considerablemente la duración de
esta lisis, al menos el doble de tiempo, con los riesgos de
desnaturalización, incluso de destrucción, de los ácidos nucleicos
más expuestos a esta sonicación heterogénea.
Una comparación de la densidad de energía (W/ml)
permite entender la gran diferencia entre las dos técnicas del
estado de la técnica presentadas anteriormente. La densidad de
energía puede definirse mediante la integral en el tiempo de la
potencia proporcionada a la muestra en relación con el volumen de
la muestra. Esta densidad puede evaluarse experimentalmente,
midiendo la elevación de temperatura obtenida en un tiempo dado
para estas dos técni-
cas.
cas.
E =
\int_{O}^{T} \frac{W}{V}
dt
con:
E: densidad volumétrica de energía.
W: potencia (W)
V: Volumen de la muestra (ml)
Las mediciones de temperatura efectuadas en los
tubos después de 15 min de sonicación en baño, permiten tener una
evaluación de la potencia proporcionada a la muestra:
T_{0min} =
21ºC
T_{15min} = 40,
6ºC
es decir un \Deltat = 19,6ºC y DW
= \Deltat x 0,3 ml = 19,6 x 0,3 = 5,88
cal/15min
entonces Wt = (5,88 x 4,18) / (60 x 15) = 0,027
W
La densidad de energía D (en W/ml) en un baño de
ultrasonidos de tipo adición en baño es:
D = 0,027 / 0,3 = 0,09
W/ml
Se observa bien que la densidad de energía es
aproximadamente trescientas veces más débil que la obtenida con un
sonotrodo directamente sumergido en el medio, ya que, según la
bibliografía, la densidad de energía es generalmente de al menos 30
W. Las informaciones dadas en el documento
US-A-5.374.522 sobre la sonicación
en baño confirman este valor.
Según la presente invención, el aparato propuesto
permite responder al conjunto de los problemas descritos
anteriormente controlando la escisión de los ácidos nucleicos, y al
mismo tiempo preservando la integridad del tubo que contiene la
muestra. La limpieza del conjunto es perfecta, ya que no hay ningún
contacto entre el exterior del tubo y un líquido cualquiera,
estando el contenido de dicho tubo completamente aislado del
exterior. Este aislamiento evita las proyecciones hacia el exterior
cuando el tubo sufre la sonicación, y limita considerablemente la
condensación y la evaporación.
Con este fin, la presente invención se refiere a
un aparato, que comprende un sonotrodo destinado a generar
ultrasonidos con una potencia más o menos fuerte en al menos una
muestra biológica que contiene células que van a lisarse, muestra
que está contenida en al menos un recipiente adaptado a este uso, el
sonotrodo está directamente en contacto con el o los recipientes,
que contiene la muestra que va a lisarse, en ausencia de fluido
entre dichas superficies en contacto entre el sonotrodo y el
recipiente, caracterizado porque el sonotrodo tiene una superficie
activa que se adapta completamente o parcialmente a la forma de
cada recipiente que contiene la muestra que va a lisarse; la
superficie activa del sonotrodo en contacto con el recipiente tiene
una forma cóncava.
En otro modo de realización, la superficie activa
del sonotrodo en contacto con el recipiente tiene una forma
convexa.
Cuando la superficie activa es convexa, la
superficie del recipiente, que coopera con el sonotrodo, es
flexible de manera que se adapta a la superficie activa de dicho
sonotrodo.
En todos los casos, el sonotrodo coopera con al
menos una bola de vidrio situada en la muestra contenida en un
recipiente.
Cada bola tiene un diámetro de 90 a 150 y
preferentemente de 100 micrómetros (\mum) en el caso de una lisis
de bacterias, y un diámetro de 150 a 1500 y preferentemente de 500
\mum en el caso de una lisis de levaduras. Estos valores no son
teóricos y ya han sido objeto de investigaciones extensas
realizadas por la parte solicitante, que condujeron a la
presentación de una solicitud de patente WO9915621. La originalidad
de este principio radica en el hecho de que también pueden
aplicarse estos valores a la técnica de sonicación directa.
Según una variante de realización particularmente
interesante, el aparato comprende al menos dos sonotrodos.
Además, cada recipiente está en contacto físico
con el o los sonotrodos mediante un medio para ejercer una
presión.
Cada sonotrodo tiene una frecuencia de emisión de
los ultrasonidos comprendida entre 20 y 50 kHz, más precisamente
entre 30 y 40 kHz y preferentemente de prácticamente 35 kHz.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de lisis mediante ultrasonidos de células contenidas
en una muestra biológica presente en un recipiente, que utiliza al
menos un sonotrodo. Según una primera realización, el procedimiento
se caracteriza porque consiste en:
- colocar el recipiente en contacto directo con
la superficie activa del o de los sonotrodos, y
- activar dicho o dichos sonotrodos durante un
tiempo suficiente para lisar las células contenidas en la muestra,
conservando los ADN y/o ARN liberados para permitir su uso
posterior, por ejemplo en una etapa de amplificación.
Según una segunda puesta en práctica, el
procedimiento se caracteriza porque consiste en:
- colocar el recipiente en contacto directo con
la superficie activa del o de los sonotrodos,
- activar dicho o dichos sonotrodos durante un
tiempo suficiente para lisar las células contenidas en la muestra,
escindiendo los ADN y/o ARN liberados, y al mismo tiempo
permitiendo su uso posterior, por ejemplo en una etapa de
amplificación.
Según una variante de realización de las dos
puestas en práctica anteriores, y antes de la activación del o de
los sonotrodos, el recipiente se presiona contra la superficie
activa de dicho o dichos sonotrodos.
La activación de cada sonotrodo se efectúa en las
condiciones siguientes:
- tiempo de la sonicación 10 a 15 minutos,
- relación cíclica comprendida entre el 40 y el
60% y preferentemente del 50%, y
- potencia 10 a 30 W.
Según un modo preferente de puesta en práctica
del procedimiento, la activación de cada sonotrodo consiste en una
serie de impulsos cuya duración está comprendida entre 5 y 20
segundos, y preferentemente entre 10 y 15 segundos.
Los dibujos adjuntos se dan a título de ejemplo
explicativo y no tienen ningún interés limitativo. Permiten
entender mejor la invención.
La figura 1 representa un sonotrodo de 20 kHz en
una configuración de uso con un tubo.
La figura 2 representa un sonotrodo de 35 kHz,
según la invención, en una configuración de uso con un tubo antes
de que éste sea colocado para la sonicación.
La figura 3 representa un sonotrodo de 35 kHz,
según la figura 2, pero que puede utilizarse con doce tubos.
La figura 4 representa una tarjeta en posición
horizontal cuyo contenido sufre una lisis mediante sonicación
directa según la invención.
La figura 5 representa una tarjeta en posición
vertical cuyo contenido sufre una lisis mediante una sonicación
directa según la invención.
La figura 6 representa una vista más precisa de
la figura 4 que muestra el comportamiento del líquido y de las
bolas de vidrio durante la sonicación directa.
La presente invención se refiere a un dispositivo
de lisis de microorganismos mediante ultrasonidos, sin uso de
líquido de acoplamiento entre el emisor ultrasónico y la muestra
biológica. Este dispositivo puede utilizarse para la liberación de
ácidos nucleicos controlando su escisión y maximizando la cantidad
de material genético liberado.
Otro objeto de la presente invención consiste en
un nuevo principio de sonicación cuya originalidad proviene del
hecho de que la transducción se efectúa directamente, también
llamada sonicación directa. Consiste en acoplar directamente el o
los tubos o cualquier otro recipiente adaptado, que contiene la
muestra que va a lisarse, sobre un sonotrodo adaptado a la forma del
o de los tubos. En este caso, por tanto ya no hay líquido de
acoplamiento.
También otro objeto de la presente invención
consiste en encontrar parámetros de sonicación que permitan lisar
de manera eficaz la muestra con una escisión controlada de los
ácidos nucleicos liberados en el medio.
A - Primer modo de
realización
Se ha evaluado un primer aparato 1 de lisis. Este
tipo de aparato 1 se representa bien en la figura 1.
El aparato 1 comprende un sonotrodo 2 modelo VIA
que funciona a 20 kHz, cuyo diámetro es de 4 milímetros (mm) en su
extremo. El generador 3 utilizado para excitar el sonotrodo 2 es un
generador 3 de 300 W (BioBlock, Tipo VibraCell, Modelo 72401) que
puede funcionar en modo continuo o por impulsos. Pueden ajustarse
la potencia de salida así como la relación cíclica de los impulsos
(del 10 al 90%). La relación cíclica se define tal como sigue:
Relación
cíclica (%) = Ton / (Ton +
Toff)
con Ton y Toff que definen un
régimen por impulsos, en el que Ton es el tiempo de generación de
ultrasonidos y Toff el tiempo de pausa entre dos
Ton.
El tubo 4, que contiene una muestra 5 que va a
lisarse, se utiliza como recipiente, se coloca sobre el extremo de
esta sonda 2 y se mantiene mediante una presión gracias a la
bandeja 6 superior. Un peso 7 puesto sobre la bandeja 6 permite
tener un acoplamiento más o menos importante entre el extremo del
sonotrodo 2 y el tubo 4, en función de la masa del peso 7. Los tubos
4 utilizados para todas las pruebas son de tipo Cryo Tube NUNC 1,8
ml con un fondo hemisférico en forma prácticamente de U. También
pueden utilizarse otras formas o marcas de tubos.
Una vez instalado el conjunto, el tubo 4 se
somete a los ultrasonidos durante un tiempo variable generalmente
comprendido entre 1 y 15 minutos (min).
Las pruebas han mostrado que ajustes entre los
diferentes parámetros (potencia, tiempo, relación cíclica,
cuantidad de bolas de vidrio, peso de acoplamiento sobre la
bandeja...) permiten obtener una lisis de microorganismos
satisfactoria sin degradación del tubo y con una conservación de
los ácidos nucleicos variable según los parámetros elegidos.
El cálculo de la densidad de potencia transmitida
al tubo 4 permite evaluar la degradación eventualmente de los tubos
4 así como la importancia de la cavitación.
Densidad \ de
\ potencia \ Dp \ (W/cm^{2}) = Pe \ (W) \ x \ \eta \ / \ Sc \
(cm^{2})
con,
Pe: Potencia eléctrica suministrada por el
generador (en W),
\eta: Coeficiente de conversión de la Potencia
Eléctrica en Potencia Acústica (sin unidad)
Sc: Superficie de contacto Sonotrodo - Tubo (en
cm^{2})
La potencia eléctrica incidente es generalmente
de 20 W (15 a 35 W probado), el rendimiento de conversión
electro-acústico puede calcularse en el 80%, es
decir en el caso de este aparato 1, Dp = 20 x 0,8 / (3,14 x
0,2^{2}) = 127 W/cm^{2}.
B - Segundo modo de
realización
Se ha realizado un segundo aparato 1 de lisis, se
refiere a un sistema de sonicación directa a 35 kHz, en lugar de 20
kHz. Este aparato 1 se representa en la figura 2. Aunque la
estructura externa es idéntica para estos dos sonotrodos
respectivamente de 20 y 35 kHz, el sonotrodo de 35 kHz tiene
numerosas ventajas.
En primer lugar, con una potencia equivalente,
permite disminuir la importancia del fenómeno de cavitación. El
umbral de cavitación, es decir el límite de potencia entre dos
campos con o sin cavitación, aumenta prácticamente de manera
parabólica en función de la frecuencia. De este modo, con una
potencia acústica absorbida equivalente, la cavitación es un poco
menos importante a 35 kHz que a 20 kHz.
En segundo lugar, minimiza las proyecciones de la
muestra (molestas para la recuperación del lisado) observadas con
el sonotrodo de 20 kHz, debidas a su fuerte amplitud
vibratoria.
Finalmente y en tercer lugar, reduce el volumen
del sistema, ya que la longitud de los elementos, que componen el
sonotrodo 2, disminuye cuando aumenta la frecuencia.
Este sonotrodo 2, que funciona a 35 kHz, se
alimenta con un generador 3 de 500 W de tipo MW 1000 GSIP (empresa
SODEVA). La propia bandeja 6 permite poner el tubo 4 bajo presión
para ajustar el acoplamiento entre dicho tubo 4 y el sonotrodo
2.
Cualquiera que sea el sonotrodo 2 utilizado, de
20 ó 35 kHz, el uso de un impulsor 9 permite, según su relación de
sección y la posición en la que se coloca, amplificar o atenuar la
amplitud vibratoria en el extremo de la sonda 2. Esta amplificación
o atenuación es directamente proporcional a la relación de las
dimensiones del tubo 4 o de cualquier otro recipiente utilizado. De
este modo, por ejemplo, una reducción de diámetro del tubo de 15 a
12 mm permite multiplicar la amplitud de las vibraciones por 15 /
12 = 1,25.
De hecho, el impulsor 9 está constituido por un
cilindro metálico, que es de un mismo material que el resto de la
sonda, generalmente titanio o aluminio. Este comprende un cambio de
diámetro progresivo en su parte media. La longitud de dicho
impulsor 9 corresponde a la semilongitud de onda acústica por
motivos de adaptación acús-
tica.
tica.
La función del impulsor 9 es amplificar la
amplitud de vibración en el extremo de la sonda y de este modo, por
consiguiente, la potencia acústica proporcionada al medio. Esta
amplificación vibratoria es directamente proporcional a la relación
de los dos diámetros del impulsor 9.
La figura 2 describe los diferentes elementos de
la sonda 2, el soporte mecánico y la bandeja 6 que ejerce presión
no están representados.
Para valorar la densidad de potencia, se calcula
la superficie de contacto de un hemisferio,
Sc = 2\pi
R^{2} = 2 \ x \ 3,14 \ x \ 0,6^{2} = 7,1 \
cm^{2}
es decir tomando 20 W de potencia
eléctrica incidente y un coeficiente de conversión del 80%, se
obtiene en el caso del segundo aparato
1:
Dp = 20 \ x \
0,8 \ / \ 2,26 = 7,1 \
W/cm^{2}
es decir una densidad de potencia
dieciocho veces más débil que para el primer aparato
1.
Esta densidad de potencia mucho más débil permite
someter el tubo 4 a una potencia más grande sin degradación de
éste.
C - Tercer modo de
realización
El procedimiento también puede realizarse sobre
varios tubos 4. De este modo, es posible tener un tercer modo de
realización del aparato 1, que permite lisar simultáneamente el
contenido de al menos dos tubos, como se representa en la figura 3.
La frecuencia es idéntica y la forma del acoplamiento es parecida al
segundo aparato 1 de 35 kHz, cuya superficie activa es hemisférica,
como se describirá posteriormente. Un sistema de muelle permite
ajustar individualmente la presión ejercida sobre cada tubo 4 para
tener una fuerza de acoplamiento idéntica para todas las posiciones
del sonotrodo 2.
A - Primer modo de
realización
El primer modo de realización está constituido
evidentemente por un tubo 4, del todo clásico, como se representa
bien en las figuras 1 a 3. Sin embargo, la forma de los tubos 4
representados en estas figuras no es limitativa, y la invención
puede utilizar numerosas otras formas, más o menos anchas, con o sin
al menos una zona troncónica que está invertida o no, etc.
En este caso, el primer aparato 1 de lisis es
menos eficaz que el segundo. Así, con el segundo aparato de lisis,
el acoplamiento entre el sonotrodo 2 y el tubo 4 se mejora con la
realización de un extremo cóncavo adaptado a la forma en U de dicho
tubo 4. Al estar transmitida la potencia acústica a través de una
superficie de contacto más grande, un campo más grande de potencia
podrá pues utilizarse sin degradar el tubo 4 a causa de una
disipación excesiva por efecto Joule, debida a una densidad de
potencia demasiado elevada, siendo la superficie de contacto
demasiado reducida.
Además, al ser en forma de U la superficie 8
activa del sonotrodo 2, esta forma permite tener una colocación
perfecta y constante del recipiente 4 en relación con el sonotrodo
2, lo que permite una mejor reproducibilidad de una prueba a otra.
Con el primer aparato, esta reproducibilidad de los resultados era
más difícil de controlar.
Además, esta forma también permite repartir de
manera mucho más homogénea los ultrasonidos y, por tanto, obtener
una mejor agitación en el recipiente o tubo 4. Es posible e incluso
preferible tener, en dicho recipiente 4, bolas 9. Aquí también
puede reproducirse el resultado de la lisis.
B - Segundo modo de
realización
Este modo de realización se representa en las
figuras 4 a 6. Se trata de una tarjeta 10 de material plástico, que
comprende al menos un orificio transversal o pozo 13, que atraviesa
de lado a lado la tarjeta 10. El pozo 13 se delimita a nivel de sus
dos aberturas mediante películas 12 de una materia generalmente
flexible y transparente, lo que circunscribe una cavidad donde puede
efectuarse la sonicación.
En este caso, la forma de la sonda puede ser
convexa de manera que su aplicación contra una de las películas 12
induce una deformación de la película 12 concernida y aumenta el
acoplamiento, sinónimo de mejora de la lisis.
El estudio se ha referido a dos tipos de
sonotrodos, que vibran uno a 20 kHz, otro a 35 kHz. Se han
utilizado estos sonotrodos bien con tubos convencionales
(disponibles en el comercio), bien con consumibles de formato
tarjeta.
Para evaluar los diferentes sonotrodos, se han
elegido dos modelos de evaluación:
- las bacterias (Staphyiococcus
epidermidis, a título de modelo), que representan el tipo de
microorganismos más buscado en muestras para analizar.
- las levaduras (Candida krusei, a título
de modelo), particularmente conocidas por ser difíciles de Usar, y
también buscadas en muestras para analizar.
Se han elegido dos tipos de enfoques para
realizar este estudio:
1- Estudio de diferentes combinaciones de
parámetros de sonicación para identificar las condiciones óptimas
de lisis: el análisis de usados consiste en medir densidades
ópticas para evaluar el porcentaje de lisis y en efectuar una
migración en gel de agarosa para evaluar la liberación de los ácidos
nucleicos así como su estado de escisión. En cuanto a las
electroforesis en geles de agarosa, no se adjunta ninguna
fotografía a causa de las dificultades de reproducción mediante
fotocopia, sin embargo, se comentan los resultados obtenidos.
2- Estudio de sensibilidad: determinación de la
cantidad mínima de microorganismos lisados, cuyos ácidos nucleicos
pueden amplificarse y detectarse, mediante cualquier técnica de
amplificación, especialmente mediante PCR, con el ajuste óptimo de
parámetros determinados en la primera etapa.
El dispositivo utilizado para este estudio se
describe muy bien en el capítulo I-A "Primer modo
de realización" del aparato de lisis, así como en la figura 1.
De este modo, este dispositivo comprende un sonotrodo de 20 kHz,
alimentado por un generador, sobre el que se coloca un tubo de
lisis, y un peso que establece el contacto entre el sonotrodo y el
tubo.
Se han tratado levaduras Candida krusei
mediante sonicación directa con el dispositivo descrito
anteriormente, haciendo variar diferentes parámetros del protocolo,
y con el fin de maximizar su lisis y la liberación de los ácidos
nucleicos, y de minimizar la escisión de estos ácidos nucleicos.
Para todas las pruebas, la potencia acústica
estaba comprendida entre Ps = 0,8 x 25 = 20 W y Ps = 0,8 x 35 = 28
W. En ambos casos, el coeficiente de conversión \eta es del 80%.
Puede considerarse que globalmente la energía proporcionada al tubo
era similar en todas las pruebas. Este ajuste de potencia permite
simplemente obtener una agitación satisfactoria cuando la cantidad
de bolas es más importante.
Los parámetros fijos son los
siguientes:
- sonotrodo de 20 kHz con generador BioBlock 300
W, peso de 1430 g y tubo NUNC 1,8 ml,
- muestra es una suspensión de levaduras
Candida krusei (cepa nº 9604058, colección bioMérieux), con
aproximadamente 10^{7} levaduras/ml (D.O. de 0,600 a 550 nm) en
un tampón con un pH = 8,5 que contiene 80 nM de HEPES, 1 nM de EDTA
y un 2% de lauril sulfato de litio,
- volumen de la muestra = 600 \mul, y
- bolas de vidrio con un diámetro de 425 \mum -
600 \mum (lavado al ácido, Sigma).
Los parámetros se indican en la tabla nº
1:
- -
- la potencia proporcionada = Ps en vatios,
- -
- la relación cíclica en %,
- -
- el tiempo de sonicación en minutos, y
- -
- la cantidad de bolas de vidrio en \mul.
- observación de la agitación de las bolas: que
no debe ser ni demasiado débil (ningún movimiento), ni demasiado
fuerte (acompañada por un calentamiento excesivo de la muestra),
y
- análisis de 20 \mul de lisado mediante
electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y coloración con bromuro
de etidio (BET); identificando las bandas de los ácidos nucleicos
liberados en la forma intacta (ADN genómico, rARN 18S y 26S)
gracias a un marcador de peso molecular.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Agitación de las bolas: (+) débil, + correcta Liberación de ácidos
nucleicos intactos: - ausente, (+) débil,\cr + visible, ++ visible,
intensa\cr}
Para cada condición experimental, se efectúan dos
pruebas:
- puede controlarse perfectamente la agitación de
las bolas de vidrio ajustando la potencia proporcionada al tubo
(Ps),
- han podido lisarse las levaduras y han podido
liberarse los ácidos nucleicos en la forma no escindida: presencia
de señales en el gel de agarosa, en forma de bandas, que
corresponden al ADN genómico y a los ARN ribosómicos (especialmente
para las condiciones nº 3 y 4), y
- el ajuste de los parámetros tiene una
incidencia directa sobre la cantidad y la escisión de los ácidos
nucleicos liberados:
- \text{*}
- relación cíclica: un ajuste demasiado débil (20%) no libera bastante material, un ajuste demasiado fuerte (80%) también genera señales débiles, debidas a una escisión de los ácidos nucleicos demasiado fuerte, y
- \text{*}
- cantidad de bolas: una cantidad de bolas más grande (60 \mul en lugar de 30 \mul) en agitación correcta permite liberar más material.
De este modo, las condiciones más interesantes
elegidas para la continuación de los experimentos son las descritas
para las pruebas nº 4 de esta tabla nº 1.
Se ha realizado el estudio de sensibilidad en una
gama de diluciones de levaduras desde 10^{7} hasta 10^{2}
levaduras/prueba. Se han tratado estas levaduras mediante
sonicación directa en las condiciones óptimas determinadas en la
primera parte. Para comparar, se ha tratado la misma gama de
diluciones mediante un método de lisis de referencia, el vórtex,
descrito en la solicitud de patente WO09915621.
Después de preparar suspensiones de levaduras en
agua con 10^{2}, 10^{3}, 10^{9} y 10^{5} levaduras/prueba,
éstas se tratan mediante:
- sonicación directa: condiciones descritas
anteriormente en la tabla nº 1, condiciones nº 4,
- vórtex: tubo Falcon 5 ml, 600 \mul de
muestra, 150 \mul de bolas de vidrio con un diámetro de
425-600 \mum, tres bolas de vidrio con un diámetro
de 2 mm, cinco bolas de hierro con un diámetro de 1,5 mm, vórtex
durante 12 min con una potencia máxima.
Los lisados se purifican sobre columnas Sephadex
G-50 (Quick Spin columns for DNA purification,
Boehringer Mannheim) según el protocolo del proveedor, después se
realiza una amplificación de 10 \mul de lisado mediante PCR, según
el protocolo descrito por Makimura et al (J. Med.
Microbiol., 1994; 40; 358-364). Después se
analizan 20 \mul de producto de PCR mediante electroforesis en
gel de agarosa al 1,2% y coloración con bromuro de etidio
(BET).
Los dos tipos de lisis son los siguientes:
- lisis mediante sonicación directa con un
sonotrodo de 20 kHz, y
- lisis mediante vórtex.
Señal en gel: - no visible, + visible, ++ visible
e intensa
Para cada condición experimental, se han
efectuado dos pruebas.
- los lisados obtenidos mediante sonicación
directa en las condiciones óptimas pueden amplificarse bien
mediante PCR: presencia de bandas visibles e intensas que
corresponden bien al tamaño del producto de PCR buscado, y
- después de lisis mediante sonicación directa
así como mediante vórtex, la sensibilidad de detección mediante
este método de PCR es de 109 levaduras/prueba. De este modo, la
lisis mediante sonicación permite obtener los mismos resultados que
un método de lisis de referencia.
Estas pruebas han permitido demostrar que la
lisis puede realizarse mediante sonicación directa a 20 kHz.
También han mostrado que es posible ajustar los parámetros de
sonicación para maximizar la liberación de ácidos nucleicos de
levaduras y minimizar su escisión. Finalmente, estos parámetros
permiten obtener ácidos nucleicos que pueden amplificarse mediante
PCR y alcanzar una sensibilidad de detección equivalente a la de un
método de lisis de referencia.
En la figura 2, se representa el dispositivo de
sonicación utilizado, y se describe muy bien en el capítulo
I-B "Segundo modo de realización" del aparato
de lisis. En este mismo capítulo, se explican las ventajas de una
sonicación a 35 kHz en lugar de a 20 kHz. Además, este dispositivo
de lisis presenta una superficie de contacto más grande entre tubo
y sonotrodo; las ventajas de esto se explican en el capítulo
II-A "Primer modo de realización" del
recipiente que contiene la muestra que va a tratarse.
El objetivo ha sido identificar los parámetros de
sonicación que permiten maximizar la lisis de bacterias y de
levaduras, y, por tanto de maximizar la liberación de los ácidos
nucleicos controlando perfectamente su escisión.
Para las pruebas siguientes, se define la
potencia acústica mediante la amplitud vibratoria de los
ultrasonidos generados por el sonotrodo. Esta amplitud se da en
porcentaje de la potencia del generador que suministra la energía
eléctrica al sonicador.
- sonotrodo de 35 kHz con generador SODEVA 500 W,
peso de 1430 g y tubo NUNC 1,8 ml,
- muestra:
- \text{*}
- para las pruebas sobre las levaduras: suspensión de levaduras Candida krusei (cepa nº 9604058, colección bioMérieux) con aproximadamente 2 x 10^{7} levaduras/ml (D.O. de 0,950 a 550 nm), en un tampón de pH = 8, 5, que contiene 80 mM de HEPES, 1 mM de EDTA y un 2% de lauril sulfato de litio, y
- \text{*}
- para las pruebas sobre las bacterias: suspensión de bacterias Staphylococcus epidermidis (cepa nº A054, colección bioMérieux), con aproximadamente 10^{9} bacterias/ml (D.O. de 0,900 a 550 nm) en un tampón de pH = 7,2, que contiene 30 mM de Tris, 5 mM de EDTA y 100 mM de NaCl,
- volumen de la muestra = 600 \mul, y
- bolas de vidrio:
- \text{*}
- para las pruebas sobre las levaduras: 90 \mul de bolas con un diámetro de 425 \mum - 600 \mum (acid-washed, Sigma), y
- \text{*}
- para las pruebas sobre las bacterias: 120 \mul de bolas con un diámetro de 106 \mum (VIA I).
- la amplitud vibratoria en %,
- la potencia proporcionada = Ps en vatios,
estando relacionada directamente con la amplitud,
- el tiempo de los impulsos de sonicación {Ton) y
el tiempo de las pausas (Toff) en minutos, estos tiempos definen la
relación cíclica: Ton / (Ton + Toff), y
- el tiempo total de sonicación en minutos.
- observación de la agitación de las bolas,
- medición de la densidad óptica a 550 nm de las
suspensiones celulares antes de los tratamientos de lisis, así
aproximado de lisis mediante:
(D.O._{550 \ nm} \
después \ de \ la \ lisis) \ / \ ( (D.O._{550 \ nm} \ antes \ de \
la \ lisis) \ x \
100),
y
- análisis de 20 \mul de lisado mediante
electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y coloración con bromuro
de etidio (BET); identificando las bandas de los ácidos nucleicos
liberados en la forma intacta (ADN genómico, rARN 18S y 26S)
gracias a un marcador de peso molecular. Los ácidos nucleicos
escindidos aparecen situados por debajo de estas bandas.
| Liberación de los ácidos nucleicos: - ausente, + visible, ++ visible e intensa, +++ visible y muy intensa |
Para cada condición experimental, se han
realizado dos pruebas.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Liberación de los ácidos nucleicos: - ausente, + visible, ++
visible e intensa, +++ visible y muy
intensa\cr}
Para cada condición experimental, se han
efectuado dos pruebas.
Potencia 15 W (amplitud del 50%):
agitación homogénea de las bolas en la mitad inferior del volumen
del líquido, formando una cúpula de agitación en el centro. Las
bolas sufren pequeños movimientos, al frotarse entre ellas.
Potencia 20 W (amplitud del 80%):
agitación más violenta; las bolas realizan movimientos más amplios,
que ocupan un volumen mayor del líquido. También el calentamiento
del líquido es más elevado.
- una potencia de 15 W es suficiente para generar
una agitación correcta de las bolas de vidrio,
- en relación con el sonotrodo de 20 kHz, el de
35 kHz necesita una potencia menor para generar una agitación
correcta de las bolas de vidrio (15 W en lugar de 20 W), y esto
para una cantidad mayor de bolas (90 \mul y 120 \mul en lugar
de 60 \mul), y
- gracias a una transmisión de los ultrasonidos
por una superficie más grande (toda la base del tubo), la agitación
de las bolas es más homogénea y el calentamiento del líquido es
menor.
- han podido lisarse las bacterias y las
levaduras y han podido liberarse sus ácidos nucleicos,
- el ajuste de los parámetros tiene una
incidencia directa sobre la cantidad y la escisión de los ácidos
nucleicos liberados:
Potencia: (amplitud)
- una amplitud vibratoria elevada (80%) permite
aumentar ligeramente el porcentaje de lisis y la cantidad de ácidos
nucleicos liberada, y provoca una escisión intensa.
- una amplitud del 50% libera una cantidad
satisfactoria de ácidos nucleicos preservando totalmente el ADN
genómico y parcialmente los ARN ribosómicos,
Relación cíclica: una relación cíclica elevada
(TON 10 seg / Toff 10 seg) tiene el mismo efecto que una amplitud
elevada,
Tiempo de sonicación: un tiempo importante (15
min) permite aumentar el porcentaje de lisis y la cantidad de
ácidos nucleicos liberada sin influir sobre su estado de
escisión,
- la condición elegida para obtener un máximo de
ácidos nucleicos en la forma no escindida es una sonicación larga
con una amplitud y una relación cíclica débiles (condiciones nº 2,
tablas nº 2 y nº 3), y
- la condición elegida para obtener un máximo de
ácidos nucleicos en la forma escindida es una sonicación larga con
una amplitud elevada (condición nº 5, tabla nº 2).
Se ha realizado el estudio de sensibilidad sobre
una gama de diluciones de levaduras desde 10^{6} hasta 10^{7}
levaduras/prueba. Se han tratado estas levaduras mediante
sonicación directa en diferentes condiciones evaluadas en la
primera parte:
1. la condición elegida para obtener un máximo de
ácidos nucleicos en la forma no escindida,
2. esta misma condición, aumentando simplemente
la relación cíclica,
3. siempre la condición nº 1, pero aumentando
simplemente la amplitud.
En la primera parte, se ha mostrado que estas dos
últimas condiciones conducen a un porcentaje de lisis mayor, pero
también a una escisión más fuerte de los ácidos nucleicos. Además,
se ha tratado la misma gama de diluciones mediante un método de
lisis de referencia, el vórtex, descrito en la solicitud de patente
WO9915621.
Después de la preparación de suspensiones de
levaduras en agua con 10^{2}, 10^{3}, 10^{9}, 10^{5},
10^{6} y 10^{7} levaduras/prueba, se han tratado éstas
mediante:
- sonicación directa: condiciones nº 1, 2 y 3
descritas en la primera parte, tablas nº 2 y 3,
- vórtex: tubo Falcon 5 ml, 600 \mul de
muestra, 150 \mul de bolas de vidrio con un diámetro de
425-600 \mum, tres bolas de vidrio con un diámetro
de 2 mm, cinco bolas de hierro con un diámetro de 1,5 mm, vórtex
durante 12 min con una potencia máxima.
Los lisados se purifican sobre columnas Sephadex
G-50 (Quick Spin columns for DNA purification,
Boehringer Mannheim) según el protocolo del proveedor, después se
realiza una amplificación de 10 \mul de lisado mediante PCR, según
el protocolo descrito por Makimura et al (J. Med
Microbiol., 1994; 40: 358-364). Después se
analizan 20 \mul de producto de PCR mediante electroforesis en
gel de agarosa al 1,2% y coloración con bromuro de etidio
(BET).
Estos diferentes tratamientos de lisis son:
- lisis mediante sonicación directa con un
sonotrodo a 20 kHz en tres condiciones, y
- lisis mediante vórtex.
Señal en gel: - no visible, (+) débil, + visible,
++ visible e intensa
Para cada condición experimental, se han
efectuado dos pruebas.
- los lisados obtenidos mediante sonicación
directa en las condiciones óptimas pueden amplificarse bien
mediante PCR; hay presencia de bandas visibles e intensas que
corresponden bien al tamaño del producto de PCR buscado,
- después de lisis mediante sonicación directa en
tres condiciones diferentes, se detectan hasta 10^{4} levaduras
por prueba mediante PCR; sin embargo, las señales observadas para
10^{4} levaduras por prueba son más débiles, cuando la sonicación
se efectúa en condiciones que escinden con más fuerza los ácidos
nucleicos (condiciones nº 2 y 3), y
- la sensibilidad de detección obtenida después
de lisis mediante sonicación directa se aproxima mucho a la
obtenida después de lisis mediante un método de referencia, el
vórtex.
Estas pruebas han demostrado que puede efectuarse
la lisis mediante sonicación directa a 35 kHZ, sobre dos organismos
diferentes (bacterias y levaduras). También se ha demostrado que un
ajuste juicioso de algunos parámetros de sonicación importantes
permite maximizar la lisis de estos organismos, y al mismo tiempo
controlar perfectamente el estado de escisión de los ácidos
nucleicos liberados. Se han identificado estos parámetros
importantes de sonicación y se han determinado los ajustes óptimos.
Además, se ha mostrado que la lisis mediante sonicación directa a
35 kHz permite liberar los ácidos nucleicos que pueden amplificarse
mediante PCR, y que las condiciones de sonicación identificadas
como favorables para una amplificación mediante PCR permiten
obtener una sensibilidad de detección muy próxima a la obtenida con
un método de lisis de referencia, el vórtex. Las condiciones de
sonicación que escinden con más fuerza los ácidos nucleicos son
ligeramente menos favorables para una amplificación mediante PCR.
Sin embargo, una escisión fuerte de los ácidos nucleicos puede ser
favorable para algunas otras aplicaciones en biología molecular,
como por ejemplo una purificación de los ácidos nucleicos que
utiliza procedimientos de hibridación, que son favorecidas por una
fragmentación previa de los ácidos nucleicos.
El concepto de una sonicación directa simultánea
de varios tubos se representa en la figura 3 y se describe en el
capítulo I-C "Tercer modo de realización" del
aparato de lisis. Se han realizado las pruebas siguientes con un
dispositivo que permite la sonicación de doce tubos
simultáneamente, y que además presenta las mismas características
que el sonotrodo de 35 kHz utilizado para las pruebas de la parte
I-B (misma frecuencia de sonicación, misma
superficie de contacto tubo-sonotrodo, etc.). La
particularidad de este dispositivo de sonicación de múltiples tubos
radica en la posibilidad de ajustar la presión ejercida sobre cada
uno de los doce tubos para que puedan reproducirse bien los
contactos tubo-sonotrodo, y de este modo, la
eficacia de lisis de un tubo a otro.
Se ha medido la presión ejercida por el peso
sobre cada uno de los doce tubos, después se ha ajustado para
obtener una presión homogénea para todos los tubos. Se ha
confirmado esta homogeneidad mediante un comportamiento homogéneo de
las bolas durante la sonicación en las condiciones óptimas
determinadas en la parte I-B.
Se ha medido la fuerza aplicada sobre cada tubo
gracias a un sensor de fuerza (referencia BC302 3KG MV/V, proveedor
C2AI, Francia) en forma de disco, con un diámetro = 16 mm, y con un
espesor = 4,5 mm, colocado sobre un tubo truncado, para que la
altura del tubo de prueba asociado al espesor del sensor de fuerza
sea idéntica a la altura de los tubos de muestra. Se conecta el
sensor a un indicador digital (de tipo 48 x 96 que puede
programarse, proveedor C2AI, Francia) para visualizar una tensión
representativa de la fuerza de compresión.
Para las mediciones, se han colocado once tubos
de muestra y el tubo de prueba con sensor de fuerza sobre las doce
posiciones del sonotrodo. El tubo de prueba, dotado con el sensor,
se desplaza sucesivamente desde la posición 1 hacia la posición 2
después hacia la posición 3...hasta la posición 12, para anotar la
fuerza de compresión aplicada sobre los tubos en cada posición. Se
han realizado tres series de mediciones. La desviación estándar de
distribución de la fuerza de acoplamiento calculada con respecto a
la media de las tres series de mediciones muestra fuertes
disparidades antes del ajuste, ya que el coeficiente de variación
(CV) es del orden del 10% (véase tabla 6).
Después, se efectúa el ajuste de la fuerza de
apoyo para cada posición en presencia del sensor mediante ajuste
del muelle de compresión de cada eje de apoyo.
Después del ajuste, se constata que se ha
reducido el CV de los valores de fuerza de compresión a un valor
inferior al 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización del movimiento de
lisis:
Después de la homogeneización de las presiones
ejercidas sobre los doce tubos, se ha evaluado visualmente el
carácter más o menos homogéneo del movimiento de las bolas durante
la sonicación. Se ha realizado la sonicación exactamente como se ha
descrito en la parte III-B, aplicando la condición
nº 2 descrita en las tablas nº 3 y 4 (determinada como óptima
para una lisis máxima y una preservación máxima de los ácidos
nucleicos), y utilizando el agua como "muestra". Además, se ha
aumentado gradualmente el peso que actúa sobre los doce tubos (2,7
kg, 3,7 kg, 4,6 kg, 5,6 kg), lo que aumenta el contacto entre tubos
y sonotrodo.
Se ha constatado que un peso demasiado débil (2,7
kg) conduce a una variabilidad muy grande del movimiento de las
bolas de un tubo a otro. De hecho, este peso no es suficiente para
establecer un contacto suficiente entre los doce tubos y el
sonotrodo, ya que en algunos tubos las bolas están paradas.
En cambio, a partir de un umbral de peso (3,7
kg), el movimiento de las bolas presenta el mismo carácter en cada
uno de los doce tubos: agitación homogénea de las bolas en la mitad
inferior del volumen del líquido, formando una cúpula de agitación
en el centro. Las bolas sufren pequeños movimientos, al frotarse
entre ellas.
Se ha mostrado que es posible trasladar el
principio de sonicación directa a 35 kHz con una superficie de
contacto tubo-sonotrodo óptima (descrito en la parte
I-B) a un tratamiento simultáneo de varios tubos.
Además, es posible obtener un movimiento de lisis homogéneo en
todos los tubos ajustando las fuerzas de contacto
tubos-sonotrodo. Estas dos observaciones demuestran
la posibilidad de utilizar el principio de la sonicación directa en
un autómata para tratar un determinado número de muestras de manera
reproducible.
En las figuras 4 a 6, se representa el
dispositivo de sonicación en tarjeta. Estas figuras también
muestran dos posibilidades de colocación así como el comportamiento
del líquido y de las bolas durante la sonicación. El sonotrodo
utilizado para este dispositivo es el descrito en el capítulo
I-A "Primer modo de realización" del aparato
de lisis, pero adaptando una contera plana con un diámetro de 13
mm. El material fungible con formato tarjeta se describe en el
capítulo II-B "Segundo modo de realización" del
recipiente que contiene la muestra que va a tratarse. Este material
fungible es de poliestireno (pueden utilizarse otros plásticos
compatibles con los análisis biológicos), tiene las dimensiones 40
x 40 x 4 mm y dispone de una abertura circular en el centro,
llamada pozo, con un diámetro variable, para recoger la muestra y
las bolas de vidrio. El fondo de este pozo está constituido bien
por plástico con 0,3 mm de espesor, o bien por una película
autoadhesiva de polipropileno. Esta película también sirve para
cerrar el material fungible.
Se han evaluado sólo los parámetros relacionados
con el uso de tarjetas, eligiendo valores fijos para los otros
parámetros de sonicación, ya estudiados en la parte
I-A. Se han realizado las pruebas de lisis con
levaduras y bacterias, y se ha determinado la eficacia de lisis así
como el estado de escisión de los ácidos nucleicos liberados.
- sonotrodo de 20 kHz con generador Bioblock 300
W y material fungible descritos anteriormente, estando la tarjeta
en posición horizontal,
- potencia:
- \bullet
- para las pruebas sobre las levaduras: 25 W, y
- \bullet
- para las pruebas sobre las bacterias: 13 - 14 W,
- relación cíclica del 80% y tiempo de sonicación
5 min,
- muestra:
- \bullet
- para las pruebas sobre las levaduras: suspensión de levaduras Candida krusei (cepa nº 9604058, colección bioMérieux) con aproximadamente 2 x 10^{7} levaduras/prueba (D.O. de 0,950 a 550 nm), en un tampón con un pH = 8,5 que contiene 80 mM de HEPES, 1mM de EDTA y el 2% de lauril sulfato de litio, y
- \bullet
- para las pruebas sobre las bacterias: suspensión de bacterias Staphylococcus epidermidis (cepa nº A054, colección bioMérieux), con aproximadamente 8,5 x 10^{8} bacterias/ml (D.O. de 0,720 a 550 nm), en el mismo tampón, y
- bolas de vidrio:
- \bullet
- para las pruebas sobre las levaduras: bolas con un diámetro de 425 \mum - 600 \mum (acid-washed, Sigma), y
- \bullet
- para las pruebas sobre las bacterias: bolas con un diámetro de 106 \mum (VIA I).
- el diámetro del pozo en mm,
- la naturaleza del fondo del pozo (película
transparente o fondo de plástico),
- el volumen de la muestra en \mul, y
- el volumen de bolas de vidrio en \mul.
Se evalúan los resultados mediante:
- observación de la agitación de las bolas, y
- análisis de 20 \mul de lisado mediante
electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y coloración con bromuro
de etidio (BET);
identificando las bandas de los ácidos nucleicos
en la forma intacta (ADN genómico, rARN 18S y 26S) gracias a un
marcador de peso molecular.
Los ácidos nucleicos escindidos aparecen por
debajo de estas bandas.
| Liberación de los ácidos nucleicos: + ausente, + visible, ++ visible e intensa |
Observación: para la condición nº 8, la tarjeta
está en posición vertical.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
| Liberación de los ácidos nucleicos: + ausente, + visible, ++ visible e intensa |
Observación: para las condiciones nº 3 y 4, el
tiempo de sonicación es de 10 min.
Resultados en cuanto a la agitación:
Posición horizontal, con fondo de película
flexible: Los ultrasonidos generados por el sonotrodo expulsan
el líquido y las bolas hacia la periferia del pozo (véase figura
6). Las bolas sufren pequeños movimientos de agitación muy rápidos,
al frotarse entre ellas. Esta agitación se debe principalmente a
los ultrasonidos que se transmiten lateralmente por la película: No
hay degradación de la película, ni calentamiento notable del
líquido.
Posición horizontal, con fondo de
plástico: El líquido y las bolas se sitúan de la misma manera
que anteriormente, pero la agitación de las bolas es claramente más
débil. En cambio, hay calentamiento intenso del fondo de plástico,
y por tanto, del líquido.
Posición vertical, con fondo de película
flexible: El líquido y las bolas se sitúan en la parte inferior
del pozo, justo enfrente del sonotrodo, y de este modo, en un
volumen más pequeño que en la posición horizontal. La agitación de
las bolas es bastante fuerte, pero no hay calentamiento notable del
líquido.
- se han podido lisar las bacterias y las
levaduras y se han podido liberar sus ácidos nucleicos,
- la sonicación en posición horizontal y con un
fondo del pozo de plástico flexible permite una lisis muy eficaz y
la liberación de una cantidad importante de ácidos nucleicos
(señales muy intensas sobre gel), sin ninguna escisión del ADN ni
de los ARN ribosómicos. De hecho, la película muy fina, resistente y
flexible permite un acoplamiento muy bueno entre el sonotrodo y la
película, por tanto, una agitación fuerte de las bolas, y una
transmisión de los ultrasonidos con relativamente poca disipación
por efecto Joule, por tanto, poco calentamiento. Además, el
confinamiento del líquido en la periferia del pozo, fuera del eje
acústico, reduce notablemente el fenómeno de cavitación en el
líquido,
líquido,
- la sonicación con un fondo de plástico libera
una cantidad más débil de ácidos nucleicos, y al mismo tiempo
provoca una escisión más fuerte de los ácidos nucleicos (ADN y
rARN). Eso se debe claramente a la agitación más débil de las bolas
y al calentamiento importante del fondo de la tarjeta y del líquido.
Estos dos fenómenos se explican por un acoplamiento malo entre el
sonotrodo y el fondo rígido de la tarjeta, así como por un efecto
Joule más importante, y
- cuanto más aumenta el diámetro del pozo de
lisis, más se reduce la eficacia de lisis y menos ácidos nucleicos
se liberan. Por tanto, se debe evitar el alejamiento del líquido y
de las bolas del sonotrodo en el centro, ya que el efecto de los
ultrasonidos se reduce. Por tanto, se recomienda utilizar tarjetas
con un pozo con un diámetro próximo al del sonotrodo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado claramente que puede realizarse
una sonicación directa en material fungible con formato tarjeta.
Estas pruebas también han permitido identificar condiciones de uso
de tarjetas que conducen a una gran eficacia de lisis con una
preservación total de los ácidos nucleicos liberados (pozo con un
diámetro próximo al del sonotrodo, y acoplamiento mediante una
película fina y flexible). Esta preservación de los ácidos
nucleicos es muy ventajosa para análisis de biología molecular que
necesitan un estado perfectamente intacto de los ácidos nucleicos.
Además, el uso de este tipo de material fungible para la sonicación
directa es muy interesante, porque permitiría integrar eventuales
tratamientos posteriores de la muestra en la misma tarjeta. De este
modo, la lisis de microorganismos y su análisis e identificación
podrían realizarse en un solo material fungible lo que reduciría
los riesgos de contaminación entre las muestras y permitiría una
automatización fácil del procedimiento.
- 1.
- Aparato
- 2.
- Sonotrodo o sonda
- 3.
- Generador
- 4.
- Tubo o recipiente
- 5.
- Muestra contenida en el tubo 4 o la tarjeta 10
- 6.
- Medio para ejercer presión o bandeja superior
- 7.
- Peso de lastre
- 8.
- Superficie activa del sonotrodo 2
- 9.
- Amplificador
- 10.
- Tarjeta o recipiente
- 11.
- Bolas de vidrio
- 12.
- Películas
- 13.
- Pozo
- 14.
- Contera plana
- 15.
- Sonotrodo o sonda
- 16.
- Superficie activa del sonotrodo 15
- 17.
- Transductor
- 18.
- Base
- 19.
- Placa de soporte
- 20.
- Placa de presión
- 21.
- Elemento de compresión asociado a un tubo 4
- F1.
- Desplazamiento de la muestra 5
- F2.
- Vibraciones de la película 12
Claims (13)
1. Aparato (1), que comprende un sonotrodo (2)
destinado a generar ultrasonidos con una potencia más o menos
fuerte en al menos una muestra (5) biológica que contiene células
que van a lisarse, muestra (5) que está contenida en al menos un
recipiente (4) adaptado para este uso, el sonotrodo (2) está
directamente en contacto con el o los recipientes (4), que
contienen la muestra (5) que va a lisarse, en ausencia de fluido
entre dichas superficies en contacto entre el sonotrodo (2) y el
recipiente (4), caracterizado porque el sonotrodo (2) tiene
una superficie (8) activa que se adapta completamente o parcialmente
a la forma de cada recipiente (4) que contiene la muestra que va a
lisarse; la superficie (8) activa del sonotrodo (2) en contacto con
el recipiente (4) tiene una forma cóncava.
2. Aparato, que comprende un sonotrodo (15)
destinado a generar ultrasonidos con una potencia más o menos
fuerte en al menos una muestra (5) biológica que contiene células
que van a lisarse, muestra (5) que está contenida en al menos un
recipiente (10) adaptado para este uso, el sonotrodo (15) está
directamente en contacto con el o los recipientes (10), que
contienen la muestra (5) que va a lisarse, en ausencia de fluido
entre dichas superficies en contacto entre el sonotrodo (15) y el
recipiente (10), caracterizado porque el sonotrodo (15)
tiene una superficie (16) activa que se adapta completamente o
parcialmente a la forma de la superficie exterior de cada
recipiente (10) que contiene la muestra que va a lisarse; la
superficie (16) activa del sonotrodo (15) en contacto con el
recipiente (10) tiene una forma convexa.
3. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la superficie
del recipiente (10), que coopera con el sonotrodo (15), es
flexible de manera que se adapta a la superficie (16) activa de
dicho sonotrodo (15).
4. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el sonotrodo (2
ó 15) coopera con al menos una bola (11) de vidrio situada en la
muestra (5) contenida en un recipiente (4 ó 10).
5. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cada bola (11)
tiene un diámetro de 90 a 150 y preferentemente de 100 micrómetros
(\mum) en el caso de una lisis de bacterias, y un diámetro de 150
a 1500 y preferentemente de 500 \mum en el caso de una lisis de
levaduras.
6. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende al
menos dos sonotrodos (2 ó 15).
7. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque cada recipiente
(4 ó 10) está en contacto físico con el o los sonotrodos (2 ó 15)
mediante un medio (6) para ejercer una presión.
8. Aparato, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque cada sonotrodo
(2 ó 15) tiene una frecuencia de emisión de ultrasonidos
comprendida entre 20 y 50 kHz, más precisamente entre 30 y 40 kHz y
preferentemente de prácticamente 35 kHz.
9. Procedimiento de lisis por ultrasonidos de
células contenidas en una muestra (5) biológica presente en un
recipiente (4 ó 10), que utiliza al menos un sonotrodo (2 ó 15),
caracterizado porque consiste en:
- colocar el recipiente (4 ó 10) en contacto
directo con la superficie activa cóncava o convexa del o de los
sonotrodos (2 ó 15), y
- activar dicho o dichos sonotrodos (2 ó 15)
durante un tiempo suficiente para lisar las células contenidas en
la muestra (5) conservando los ADN y/o ARN liberados para permitir
su uso posterior, por ejemplo, en una etapa de amplificación.
10. Procedimiento de lisis por ultrasonidos de
células contenidas en una muestra (5) biológica presente en un
recipiente (4 ó 10), que utiliza al menos un sonotrodo (2 ó 15),
caracterizado porque consiste en:
- colocar el recipiente (4 ó 10) en contacto
directo con la superficie activa cóncava o convexa del o de los
sonotrodos (2 ó 15), y
- activar dicho o dichos sonotrodos (2 ó 15)
durante un tiempo suficiente para lisar las células contenidas en
la muestra (5) escindiendo los ADN y/o ARN liberados, y al mismo
tiempo permitiendo su uso posterior, por ejemplo, en una etapa de
amplificación.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque, antes de la
activación del o de los sonotrodos (2 ó 15), el recipiente (4 ó 10)
se presiona contra la superficie (8 ó 16) activa de dicho o dichos
sonotrodos (2 ó 15).
12. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la activación
de cada sonotrodo (2 ó 15) se hace en las condiciones
siguientes:
- tiempo de la sonicación 10 a 15 minutos,
- relación cíclica entre el 40 y el 60% y
preferentemente del 50%, y
- potencia 10 a 30 W.
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
caracterizado porque la activación de cada sonotrodo (2 ó
15) consiste en una serie de impulsos cuya duración está
comprendida entre 5 y 20 segundos y preferentemente entre 10 y 15
segundos.
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