DE60011253T2

DE60011253T2 - Vorrichtung und verfahren zur ultraschall-lyse biologischer zellen

Info

Publication number: DE60011253T2
Application number: DE60011253T
Authority: DE
Inventors: Bruno Colin; Philippe Cleuziat; Patrick Broyer; Claude Mabilat; Sandra Incardona
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-04-03
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2020-04-04
Also published as: FR2791697A1; US6686195B1; CA2365493C; CA2365493A1; EP1466966A1; FR2791697B1; ES2222190T3; EP1165748A1; JP2002540783A; ATE268376T1; EP1165748B1; DE60011253D1; AU3664900A; WO2000060049A1; AU763480B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erzeugung von Ultraschall von mehr oder weniger starker Leistung in einem Behälter bei einer aufzulösenden Probe in Anwesenheit oder Abwesenheit von Glasperlen in ihrem Inneren. Der Ultraschallfrequenzbereich variiert von ungefähr 20 bis 50 Kilohertz (kHz).
Der Stand der Technik setzt sich im Wesentlichen aus zwei Techniken zusammen, die in der Biologie Ultraschall als Methode zur Lyse von Mikroorganismen verwenden.
Die erste Technik besteht aus der direkten Sonifikation durch das Tauchen der Sonotrode in die aufzulösende flüssige Probe. Das in diesem Fall angewandte Prinzip besteht aus dem direkten Zusammenbringen der Sonotrode mit der Flüssigkeit und dem kontinuierlichen oder impulsartigen Erzeugen von Ultraschall von starker Leistung, wobei in dem Medium eine sehr starke Kavitation induziert wird. Die verwendeten Sonotroden weisen im Allgemeinen eine starke Leistung (100 bis 1000 Watt (W)) auf und ermöglichen das Auflösen innerhalb sehr kurzer Zeit (in etwa einer Minute) von sehr unterschiedlichen Proben, die als schwer auflösbar gelten.
Zwei wichtige Nachteile schränken die Verwendung dieser Technik jedoch ein.
Zunächst ist, da das Kavitationsphänomen ein sehr schwer kontrollierbares Phänomen ist, der Lyse-Prozentgehalt bei einer großen Anzahl von Versuchen also nicht reproduzierbar.
Des Weiteren induziert diese sehr starke Kavitation eine starke, nicht kontrollierte Spaltung der Nukleinsäuren, was dann ein Problem darstellen kann, wenn der Benutzer versucht, einige zehn oder hundert Mikroorganismen per Millimeter (sehr schwache Konzentration) aufzulösen, zu erfassen und zu amplifizieren.
Schließlich ist diese Technik, da die Sonotrode sich in direktem Kontakt mit der Probe befindet, hinsichtlich von Probenahmen an Patienten nicht auf automatisierte Weise anwendbar, es sei denn, es wird ein Schritt der Reinigung dieser Sonotrode vorgesehen, wobei die Umsetzung dieses Schrittes in einem Automaten lang und kostenintensiv ist.
Es bestehen noch weitere Nachteile bezüglich der oben beschriebenen Probleme. Folglich bedingt die Kavitation die Kondensation eines Teils der Probe, was den Feinheitsgrad der durchgeführten Analyse noch weiter herabsetzt. Zuletzt, falls die Schalleistung zu wichtig ist, kann die übermäßige Erwärmung des Röhrchens zu Abnutzungen und sogar zum Schmelzen des Röhrchens führen.
Die zweite Technik besteht aus der Sonikation im Bad, die im Patent US-5,374,522 gut dargelegt ist. Das Prinzip besteht in der Verwendung eines mit Wasser gefüllten Ultraschall-Reinigungsbads, in dem der untere Teil des die aufzulösenden Proben enthaltenden Röhrchens schwimmt. Die Proben werden während einer Zeitdauer von ungefähr 15 Minuten (min) einem im Allgemeinen konstanten Ultraschallfeld unterzogen. Die in den Röhrchen vorhandenen Perlen werden also einer heftigen Agitation unterzogen, was Erschütterungen und Scherspannungen, die ausreichen, um die Mikroorganismen aufzulösen, nach sich zieht. Im Gegensatz zur ersten, oben dargelegten Technik bedarf diese zweite Technik der Verwendung von Glasperlen, um eine befriedigende Lysewirksamkeit zu erhalten. Im Vergleich zur vorhergehenden Technik der direkten Sonikation ermöglicht diese Technik das Lösen einiger der vorher erwähnten Probleme.
Folglich, wenn die Proben in einem geschlossenen Röhrchen enthalten sind, kommt keine Kontamination des Vibrationselements vor, da der Ultraschall über Wasser (das ein ausgezeichnetes Ultraschall-Kopplungsmittel ist) vom Boden der Schale bis zum Inneren des Probenröhrchens übertragen wird.
Außerdem ist die Energievolumendichte (in Watt per Milliliter (W/ml) ausgedrückt), die in dem Medium freigesetzt wird, ungefähr 300-mal schwächer für dieselbe Frequenz, wobei das Kavitationsphänomen weniger wichtig ist.
Der Hauptnachteil dieser Technik liegt in der Schwierigkeit, diese in Anbetracht der Verwaltung der Flüssigkeit (das Auffüllen und Entleeren der Schale), der notwendigen Entgasung vor der Sonikation und der Verwaltung der feuchten Röhrchen nach der Sonikation, welche tropfen, was der Reinlichkeit schadet, zu automatisieren.
Es bestehen noch weitere Nachteile. Demnach sind die Ergebnisse nicht reproduzierbar, da die Schalleistung nicht in allen Zonen des Behälters, der das Bad für die Sonifikation empfängt, gleich ist. Dem liegt die Konstruktion selbst der Ultraschallbäder zugrunde, die unter der Schale einen oder mehrere Wandler beinhalten. Nun strahlt das Ultraschallfeld aber mit Hilfe eines Wandlers, was im Raum nicht homogen ist. Folglich ist der Grad an Lyse der Mikroorganismen oder die Spaltung der Nukleinsäuren von einer Probe zur anderen äußerst heterogen und ist nicht kontrollierbar.
Trotzdem existieren Sonikationstechniken durch direkten Kontakt der Sonotrode mit dem Inhalt der aufzulösenden biologischen Probe. Dies ist beispielsweise der Fall in der Patentanmeldung EP A-0.337.690 .
Dennoch setzt sich der Kontakt zwischen dem Behälter und der Sonotrode aus einer ebenen Fläche, die keine Sicherstellung einer homogenen Lyse in der gesamten aufzulösenden Probe ermöglicht, zusammen. Derartige Einrichtungen entsprechen nicht den Lysat-Qualitätsanforderungen, die für die Freisetzung von Nukleinsäuren notwendig sind. Die einzige Lösung besteht also darin, die Dauer dieser Lyse wesentlich, mindestens um das Doppelte der Zeit, zu verlängern, mit dem Risiko der Denaturierung, wenn nicht Zerstörung, der Nukleinsäuren, die dieser heterogenen Sonikation am meisten ausgesetzt sind.
Ein Vergleich der Energiedichte (W/ml) ermöglicht das Verständnis des großen Unterschieds zwischen den beiden oben vorgelegten Techniken des Stands der Technik. Die Energiedichte kann mit dem Zeitintegral der der Probe zugeführten Leistung geteilt durch das Volumen der Probe definiert werden. Diese Dichte kann experimentell evaluiert werden, indem der in einer gegebenen Zeit erhaltene Temperaturanstieg für diese beiden Techniken gemessen wird.
Die in den Röhrchen durchgeführten Temperaturmessungen nach 15 min Sonikation im Bad ermöglichen eine Evaluierung der der Probe zugeführten Leistung. T0 min = 21 C T15 min = 40,6 Csei es, dass Δt = 19,6°C und DW = Δt × 0,3 ml –19,6 × 0,3 = 5,88 cal/15 min also Wt = (5,88 × 4,18)/(60 × 15) = 0,027 W
Die Energiedichte D (in W/ml) in einem Ultraschallbad der Art Sonifikation im Bad ist: D = 0,027/0,3 = 0,09 W/ml
Es ist gut ersichtlich, dass die Energiedichte ungefähr dreihundertmal schwächer ist als diejenige, die mit einer Sonotrode, die direkt in das Medium getaucht wurde, erhalten wurde, da die Energiedichte, gemäß Literatur, im Allgemeinen mindestens 30 W beträgt. Die in dem Dokument US-A-5,374,522 über die Sonikation im Bad gegebenen Informationen bestätigen diesen Wert.
Erfindungsgemäß gestattet die vorgeschlagene Vorrichtung das Lösen der Gesamtheit der oben dargelegten Probleme durch das Kontrollieren der Spaltung der Nukleinsäuren, während die Integrität des die Probe enthaltenden Röhrchens erhalten bleibt. Die Sauberkeit des Ganzen ist perfekt, da zwischen dem Äußeren des Röhrchens und einer beliebigen Flüssigkeit kein Kontakt besteht, wobei der Inhalt des Röhrchens gänzlich vom Äußeren isoliert ist. Diese Isolation verbietet die Projektierungen zum Äußeren, wenn das Röhrchen der Sonifikation unterzogen wird, und beschränkt die Kondensation und Verdampfung erheblich.
Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung, die eine Sonotrode umfasst, die dafür bestimmt ist, Ultraschall von mehr oder weniger starker Leistung in mindestens einer biologischen Probe, die aufzulösende Zellen enthält, zu erzeugen, wobei die Probe in mindestens einem Behälter, der zweckgemäß ausgeführt ist, enthalten ist, wobei die Sonotrode direkt mit dem/den Behälter(n), der/die die aufzulösende Probe enthält/enthalten, in Kontakt ist, wenn sich zwischen den Flächen, die mit der Sonotrode und dem Behälter in Kontakt sind, kein Fluid befindet, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonotrode eine wirksame Fläche aufweist, die sich der Form des gesamten oder eines Teils jedes Behälters, der die aufzulösende Probe enthält, anpasst; wobei die wirksame Fläche der Sonotrode, die mit dem Behälter in Kontakt ist, eine konkave Form aufweist.
In einer anderen Ausführungsform weist die wirksame Fläche der Sonotrode, die mit dem Behälter in Kontakt ist, eine konvexe Form auf.
Wenn die wirksame Fläche konvex ist, ist die Fläche des Behälters, die mit der Sonotrode zusammenwirkt, biegsam, so dass sie sich an die wirksame Fläche der Sonotrode anpasst.
Bei allen Figuren wirkt die Sonotrode mit mindestens einer Glasperle, die sich in der in einem Behälter enthaltenen Probe befindet, zusammen.
Jede Glasperle weist, im Falle einer Lyse von Bakterien, einen Durchmesser von 90 bis 150 und vorzugsweise von 100 Mikrometern (μm) auf und, im Falle einer Lyse von Hefepilzen, einen Durchmesser von 150 bis 1500 und vorzugsweise von 500 μm. Diese Werte sind nicht theoretisch und sind bereits Gegenstand gründlicher von der Anmelderin durchgeführter Nachforschungsarbeiten gewesen, welche zur Einreichung einer Patentanmeldung PCT/IB98/01475, eingereicht am 23. September 1998, unter französischer Priorität des 23. Septembers 1997, führten. Die Originalität dieses Prinzips beruht auf der Tatsache, dass diese Werte auch auf die Technik der direkten Sonikation anwendbar sind.
Gemäß einer besonders interessanten, alternativen Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung mindestens zwei Sonotroden.
Des Weiteren ist jeder Behälter mit der/den Sonotrode(n) mittels eines Mittels zur Unter-Druck-Setzung in physikalischem Kontakt.
Jede Sonotrode weist eine Ultraschallsendefrequenz von zwischen 20 und 50 kHz, genauer zwischen 30 und 40 kHz und vorzugsweise von ungefähr 35 kHz auf.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Lyse von Zellen durch Ultraschall, die in einer biologischen Probe, welche in einem Behälter vorliegt, enthalten sind, das mindestens eine Sonotrode verwendet. Gemäß einer ersten Implementierung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es aus Folgendem besteht:

– Positionieren des Behälters in direkten Kontakt mit der wirksamen Fläche der Sonotrode(n) und
– Aktivieren der Sonotrode(n) während eines Zeitraums, der ausreicht, um die in der Probe enthaltenen Zellen aufzulösen, indem die freigesetzten DNA und/oder RNA konserviert werden, um die nachträgliche Verwendung, beispielsweise in einem Amplifikationsschritt, zu ermöglichen.

Gemäß einer zweiten Implementierung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es aus Folgendem besteht:

– Positionieren des Behälters in direkten Kontakt mit der wirksamen Fläche der Sonotrode(n),
– Aktivieren der Sonotrode(n) während eines Zeitraums, der ausreicht, um die in der Probe enthaltenen Zellen aufzulösen, indem die freigesetzten DNA und/oder RNA gespalten werden, während ihre nachträgliche Verwendung, beispielsweise in einem Amplifikationsschritt, ermöglicht wird.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der beiden vorhergehenden Implementierungen und vor der Aktivierung der Sonotrode(n), wird der Behälter gegen die wirksame Fläche der Sonotrode(n) gepresst.
Die Aktivierung jeder Sonotrode wird unter folgenden Bedingungen vorgenommen:

– Dauer der Sonikation 10 bis 15 Minuten,
– Tastverhältnis zwischen 40 und 60% und vorzugsweise 50% und
– Leistung 10 bis 30W.

Gemäß einer bevorzugten Implementierungsform des Verfahrens besteht die Aktivierung jeder Sonotrode aus einer Impulsfolge, deren Dauer zwischen 5 und 20 Sekunden und vorzugsweise zwischen 10 und 15 Sekunden liegt.
Die beigefügten Figuren sind nur als erläuterndes Beispiel gegeben und dienen nicht der Einschränkung. Sie tragen zum besseren Verständnis der Erfindung bei.
1 stellt eine Sonotrode von 20 kHz in einer Verwendungskonfiguration mit einem Röhrchen dar.
2 stellt eine Sonotrode von 35 kHz gemäß der Erfindung in einer Verwendungskonfiguration mit einem Röhrchen, bevor dieses für die Sonikation platziert wird, dar.
3 stellt eine Sonotrode von 35 kHz gemäß 2 dar, die aber mit zwölf Röhrchen verwendet werden kann.
4 stellt eine Karte in horizontaler Position dar, deren Inhalt einer Lyse durch direkte Sonikation gemäß der Erfindung unterzogen wird.
5 stellt eine Karte in vertikaler Position dar, deren Inhalt einer Lyse durch direkte Sonikation gemäß der Erfindung unterzogen wird.
6 stellt eine detailliertere Ansicht der 4 dar und zeigt die Verhaltensweise der Flüssigkeit und der Glasperlen während der direkten Sonikation.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Einrichtung zur Lyse von Mikroorganismen durch Ultraschall ohne Verwendung von Kopplungsflüssigkeit zwischen dem Ultraschallsender und der biologischen Probe. Die Einrichtung ist hinsichtlich der Freisetzung von Nukleinsäuren unter Steuerung ihrer Spaltung und unter Maximierung der Menge an freigesetztem genetischem Material verwendbar.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht aus einem neuen Sonikationsprinzip, dessen Originalität von der Tatsache herrührt, dass die Transduktion, die auch direkte Sonikation genannt wird, direkt durchgeführt wird. Sie besteht aus dem direkten Koppeln des Röhrchens oder der Röhrchen oder eines vollkommen anderen adaptierten Behälters, das/die/der die aufzulösende Probe enthält/enthalten, mit einer der Form des Röhrchens oder der Röhrchen adaptierten Sonotrode. In diesem Fall ist also keine Kopplungsflüssigkeit mehr vorhanden.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht im Finden von Sonikationsparametern, die das Auflösen der Probe auf effiziente Weise, mit einer kontrollierten Spaltung der freigesetzten Nukleinsäuren in dem Medium, ermöglichen.
1) VERSCHIEDENE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER LYSEVORRICHTUNG
A – Erste Ausführungsform
Es wurde eine erste Lysevorrichtung 1 evaluiert. Diese Art von Vorrichtung 1 ist gut in 1 dargestellt.
Die Vorrichtung 1 beinhaltet eine bei 20 kHz laufende Sonotrode 2 des Modells V1A, deren Durchmesser an ihrem Ende 4 Millimeter (mm) beträgt. Der zur Anregung der Sonotrode 2 verwendete Erzeuger 3 ist ein Erzeuger 3 von 300 W (BioBlock, Typ VibraCell, Modell 72401), der kontinuierlich oder impulsartig laufen kann. Die Ausgangsleistung sowie das Tastverhältnis der Impulse (10 bis 90%) sind regulierbar. Das Tastverhältnis ist wie folgt definiert: Tastverhältnis (%) = Ton/(Ton + Toff)wobei Ton und Toff einen Impulsbetrieb definieren, bei dem Ton die Dauer der Erzeugung von Ultraschall und Toff die Dauer der Pause zwischen zwei Ton ist.
Das Röhrchen 4, welches die aufzulösende Probe 5 enthält, dient als Behälter, ist auf dem Ende der Sonde 2 positioniert und wird durch Unter-Druck-Setzung mit Hilfe der oberen Platte 6 aufrechterhalten. Ein auf die Platte 6 gesetztes Gewicht 7 ermöglicht eine mehr oder weniger wichtige Kopplung zwischen dem Ende der Sonotrode 2 und dem Röhrchen 4, entsprechend der Masse des Gewichts 7. Die bei allen Versuchen verwendeten Röhrchen 4 sind Typ Cryo Tube NUNC 1,8 ml mit einem hemisphärischen Boden, der im Wesentlichen U-förmig ist. Es können ebenfalls andere Röhrchenformen oder -marken verwendet werden.
Sobald die Anordnung in Position ist, wird das Röhrchen 4 während einer variablen Zeitdauer von im Allgemeinen zwischen 1 und 15 Minuten (min) Ultraschall ausgesetzt.
Aus den Versuchen ergab sich, dass die Einstellungen zwischen den verschiedenen Parametern (Leistung, Dauer, Testverhältnis, Menge der Glasperlen, Kopplungsgewicht auf der Platte...) das Erhalten einer befriedigenden Lyse von Mikroorganismen ohne Abnutzung des Röhrchens und mit einer variablen Bewahrung der Nukleinsäuren nach den gewählten Parametern ermöglichen.
Die Berechnung der auf das Röhrchen 4 übertragenen Leistungsdichte ermöglicht die Evaluierung der etwaigen Abnutzung der Röhrchen 4 sowie die Bedeutung der Kavitation. Leistungsdichte Ld (W/cm2) = eL (W) × η/Kf (cm2)wobei,
eL: vom Erzeuger gelieferte elektrische Leistung (in W),
n: Umrechnungsfaktor der elektrischen Leistung in Schalleistung (ohne Dimension)
Kf: Kontaktfläche zwischen Sonotrode und Röhrchen (in cm²)
Die auftreffende elektrische Leistung beträgt im Allgemeinen 20 W (15 bis 35 W getestet), der Ertrag der elektroakustischen Umwandlung kann auf 80% geschätzt werden, sei es im Fall dieser Vorrichtung 1, Ld = 20 × 0,8/(3,14 × 0,2²) = 127 W/cm².
B – Zweite Ausführungsform
Eine zweite Lysevorrichtung 1 wurde verwirklicht und diese betrifft ein System der direkten Sonikation bei 35 kHz anstelle von 20 kHz. Diese Vorrichtung 1 ist in 2 dargestellt. Selbst wenn die äußere Struktur dieser beiden Sonotroden von 20 bzw. 35 kHz identisch ist, weist die Sonotrode von 35 kHz viele Vorteile auf.
Erstens ermöglicht sie bei gleicher Leistung das Vermindern der Bedeutung des Kavitationsphänomens. Die Kavitationsschwelle, das heißt die Grenze der Leistung zwischen zwei Bereichen mit oder ohne Kavitation, steigt wesentlich auf parabolische Weise entsprechend der Frequenz. Somit ist die Kavitation bei gleicher absorbierter Schalleistung etwas weniger wichtig bei 35 kHz als bei 20 kHz.
Zweitens minimiert sie aufgrund ihrer starken Schwingungsamplitude die bei der Sonotrode von 20 kHz festgestellten Projektierungen der Probe (welche die Wiedergewinnung des Lysats hindern).
Schließlich und drittens reduziert sie die Blockierung des Systems, da die Länge der Elemente, aus welchen sich die Sonotrode 2 zusammensetzt, abnimmt, wenn die Frequenz zunimmt.
Diese Sonotrode 2, die mit 35 kHz arbeitet, wird von einem Erzeuger 3 von 500 W Typ MW 1000 GSIP (Gesellschaft SODEVA) gespeist. Dieselbe Platte 6 ermöglicht das Unter-Druck-Setzen des Röhrchens 4, so dass die Kopplung zwischen dem Röhrchen 4 und der Sonotrode 2 angepasst wird.
Was auch immer für eine Sonotrode 2 verwendet wird, 20 oder 35 kHz, ermöglicht die Verwendung eines Boosters 9 nach seinem Flächenverhältnis und der Position, in der er sich befindet, die Amplifikation oder Abschwächung der Schwingungsamplitude an dem Ende der Sonde 2. Diese Amplifikation oder Abschwächung ist direkt proportional zum Dimensionsverhältnis des Röhrchens 4 oder jedes anderen verwendeten Behälters. So ermöglicht zum Beispiel eine Herabsetzung des Durchmessers des Röhrchens von 15 auf 12 mm die Multiplikation der Schwingungsamplitude um 15/12 –1,25.
Tatsächlich setzt sich der Booster 9 aus einem metallenen Zylinder zusammen, der aus einem gleichen Material wie der Rest der Sonde gefertigt ist, im Allgemeinen Titan oder Aluminium. Dieser beinhaltet eine progressive Durchmesseränderung in seinem Mittelteil. Die Länge des Boosters 9 entspricht der Hälfte der Schallwellenlänge in Sachen akustischer Anpassung.
Die Rolle des Boosters 9 besteht in der Amplifikation der Schwingungsamplitude an dem Ende der Sonde und somit folglich der dem Medium zugeführten Schalleistung. Diese Schwingungsamplifikation ist direkt proportional zum Verhältnis der beiden Durchmesser des Boosters 9.
2 beschreibt die unterschiedlichen Elemente der Sonde 2, wobei der mechanische Träger und die unter Druck setzende Platte 6 nicht dargestellt sind.
Zur Schätzung der Leistungsdichte berechnet man die Kontaktfläche einer Hemisphäre. Kf = 2πR2 = 2 × 3,14 × 0,62 = 2,26 cm2 und zwar nimmt man die auffallenden elektrischen 20 W und einen Umrechnungsfaktor von 80% und erhält im Falle der zweiten Vorrichtung 1: Ld = 20 × 0,8/2,26 = 7,1 W/cm2 das heißt eine Leistungsdichte, die achtzehnmal schwächer ist als für die erste Vorrichtung 1.
Diese viel schwächere Leistungsdichte ermöglicht, dass das Röhrchen 4 einer größeren Leistung ausgesetzt werden kann, ohne dass sich dieses abnutzt.
C – Dritte Ausführungsform
Dieses Verfahren kann auch bei mehreren Röhrchen 4 umgesetzt werden. Somit ist es möglich, eine dritte Ausführungsform der Vorrichtung 1 zu erhalten, die es ermöglicht, den Inhalt von mindestens zwei Röhrchen gleichzeitig aufzulösen, wie dies in 3 dargestellt ist. Die Frequenz ist identisch und die Form der Kopplung ist der zweiten Vorrichtung 1 von 35 kHz ähnlich, deren wirksame Fläche hemisphärisch ist, wie nachfolgend beschrieben werden wird. Ein Federsystem ermöglicht das individuelle Anpassen des auf jedes Röhrchen 4 ausgeübten Drucks, um eine für alle Positionen der Sonotrode 2 identische Kopplungskraft zu erhalten.
II) VERSCHIEDENE AUSFÜHRUNGSFORMEN DES DIE ZU BEHANDELNDE PROBE ENTHALTENDEN BEHÄLTERS
A – Erste Ausführungsform
Es versteht sich, dass sich die erste Ausführungsform aus einem vollständig klassischen Röhrchen 4 zusammensetzt, wie das in 1 bis 3 gut dargestellt ist. Jedoch ist die Form der in diesen Figuren dargestellten Röhrchen 4 nicht einschränkend und die Erfindung kann viele andere, mehr oder weniger erweiterte Formen, mit einer oder ohne mindestens eine kegelstumpfartige Zone, die umgekehrt ist oder nicht, usw., verwenden.
In diesem Fall ist die erste Lysevorrichtung 1 weniger wirksam als die zweite. Infolgedessen wird die Kopplung bei der zweiten Lysevorrichtung zwischen der Sonotrode 2 und dem Röhrchen 4 durch die Verwirklichung eines konkaven Endes, das an die U-Form des Röhrchens 4 angepasst ist, verbessert. Da die Schalleistung über eine größere Kontaktfläche hindurch übertragen wird, kann also ein breiterer Leistungsbereich verwendet werden ohne das Röhrchen 4 wegen einer Dissipation durch den exzessiven Joule-Effekt aufgrund einer zu hohen Leistungsdichte abzunutzen, wobei die Kontaktfläche zu reduziert ist.
Außerdem ermöglicht diese Form, da die wirksame Fläche 8 der Sonotrode 2 U-förmig ist, dass der Behälter 4 hinsichtlich der Sonotrode 2 eine perfekte und konstante Position aufweist, was eine bessere Reproduzierbarkeit von einem Versuch zum anderen gestattet. Mit der ersten Vorrichtung war diese Reproduzierbarkeit der Ergebnisse schwieriger zu kontrollieren.
Außerdem ermöglicht diese Form auch das Verteilen des Ultraschalls auf eine viel homogenere Weise und somit das Erhalten einer besseren Agitation in dem Behälter oder dem Röhrchen 4. Es ist möglich und sogar vorzuziehen, dass der Behälter 4 Perlen 9 aufweist. Auch hier ist das Ergebnis der Lyse reproduzierbar.
B – Zweite Ausführungsform
Diese Ausführungsform ist in den 4 bis 6 dargestellt. Es handelt sich um eine Karte 10 aus Kunststoffmaterial, die mindestens ein Querloch oder eine Grube 13, welche die Karte 10 durchquert, beinhaltet. Die Grube 13 ist an ihren beiden Öffnungen durch Filme 12 aus einem im Allgemeinen nachgiebigen und durchsichtigen Material umgrenzt, was eine Kavität abgrenzt, bei der die Sonikation durchgeführt werden kann.
In diesem Fall kann die Sonde konvex sein, so dass ihre Auftragung auf einen der Filme 12 eine Verformung des betroffenen Films 12 induziert und die Kopplung erhöht, was einer Verbesserung der Lyse gleichkommt.
VERSUCHSERGEBNISSE
Die Untersuchung erstreckte sich auf zwei Arten von Sonotroden, wobei eine bei 20 kHz und die andere bei 35 kHz schwang. Diese Sonotroden wurden entweder mit herkömmlichen Röhrchen (im Handel erhältlich) oder mit Verbrauchsmaterialien im Kartenformat verwendet.
Zur Bewertung der unterschiedlichen Sonotroden wurden zwei Bewertungsmodelle ausgewählt:

– Bakterien (Straphylococcus epidermidis, als Modell), welche die in den zu analysierenden Probenahmen meist gesuchte Art von Mikroorganismen darstellen.
– Hefepilze (Candida krusei, als Modell), die als besonders schwer aufzulösen gelten und ebenfalls in den zu analysierenden Probenahmen gesucht sind.

Zur Durchführung dieser Untersuchung wurden zwei Arten von Ansätzen gewählt:

1 – Untersuchung von verschiedenen Kombinationen von Sonikationsparametern zur Identifizierung der optimalen Lysebedingungen: Die Analyse der Lysate besteht aus dem Messen der optischen Dichten zur Bewertung des Lyseprozentsatzes und dem Durchführen einer Migration auf Agarosegel, um die Freisetzung der Nukleinsäuren sowie deren Spaltungszustand zu bewerten. Was die Elektrophoresen auf Agarosegelen betrifft, ist aufgrund der Probleme bei der Reproduktion durch Fotokopie keine Fotografie beigefügt, dennoch werden die erhaltenen Ergebnisse besprochen.
2 – Untersuchung der Empfindlichkeit: Bestimmung der minimalen Menge der aufgelösten Mikroorganismen, deren Nukleinsäuren durch jede beliebige Amplifikationstechnik, namentlich durch PCR, mit der optimalen Einstellung der Parameter, die in dem ersten Schritt bestimmt wurden, amplifiziert und erfasst werden können.

III) SONIKATION DURCH SONOTRODEN FÜR REAGENZRÖHRCHEN
A – Sonotrode 20 kHz
Die für diese Untersuchung verwendete Einrichtung ist sehr gut im Kapitel I-A „Erste Ausführungsform" der Lysevorrichtung, sowie in 1 beschrieben. Diese Einrichtung beinhaltet also eine von einem Erzeuger gespeiste Sonotrode von 20 kHz, auf der ein Lyseröhrchen positioniert ist, und ein Gewicht, das den Kontakt zwischen Sonotrode und Röhrchen herstellt.
1) Ermittlung der optimalen Einstellung der Parameter
Die Hefepilze Candida krusei wurden durch direkte Sonikation mit der oben beschriebenen Einrichtung behandelt, indem unterschiedliche Parameter des Protokolls variiert wurden, und mit dem Ziel, deren Lyse und die Freisetzung der Nukleinsäuren zu maximieren und die Spaltung dieser Nukleinsäuren zu minimieren.
Versuchsbedingungen
Bei allen Versuchen lag die Schalleistung zwischen Ps = 0,8 × 25 = 20 W und Ps = 0,8 × 35 = 28 W. In beiden Fällen beträgt der Umrechnungsfaktor n 80%. Man kann annehmen, dass insgesamt die dem Röhrchen zugeführte Energie in allen Versuchen ähnlich war. Diese Anpassung der Leistung ermöglicht lediglich das Erhalten einer befriedigenden Agitation, wenn die Perlenmenge wichtiger ist.
Die festen Parameter sind die Folgenden:

– Sonotrode von 20 kHz mit dem Erzeuger Bioblock 300 W, einem Gewicht von 1430 g und einem Röhrchen NUNC 1,8 ml,
– die Probe ist eine Suspension der Hefepilze Candida krusei (Stamm Nr. 9604058, Sammlung bioMérieux) mit ungefähr 10⁷ Hefepilzen/ml (oD bei 550 nm von 0,600), in einem Puffer mit dem pH-Wert 8,5, der 80 mM HEPES, 1 mM EDTA und 2% Lithiumlaurylsulfat enthielt,
– Probenvolumen = 600 μl und
– Glasperlen mit einem Durchmesser von 425 μm – 600 μm (acidwashed, Sigma).

Die variablen Parameter sind in Tabelle Nr. 1 angegeben

– die zugeführte Leistung = Ps in Watt,
– das Tastverhältnis in %,
– die Dauer der Sonikation in Minuten und
– die Menge an Glasperlen in μl.

Die Ergebnisse sind durch Folgendes evaluiert

– Beobachtung der Agitation der Perlen: darf weder zu schwach (keine Bewegung) noch zu stark (einhergehend mit einer übermäßigen Erwärmung der Probe) sein, und
– Analyse von 20 μl Lysat per Elektrophorese in Agarosegel 0,8 und Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr); durch Identifizierung der Bänder der freigesetzten Nukleinsäuren in intakter Form (Genom-DNA, rRNA 18S und 26S) aufgrund eines Molekulargewicht-Markers.

Ergebnisse
Tabelle 1 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz, Lyse von Hefepilzen im Röhrchen und Einfluss der Schalleistung, des Testverhältnisses und der Anzahl Glasperlen auf ihre Agitation sowie auf die Freisetzung von Hefepilz-Nukleinsäuren

Agitation der Perlen:	(+) schwach, + korrekt
Freisetzung intakter Nukleinsäuren:	– abwesend, (+) schwach, + sichtbar,
	++ sichtbar, intensiv

Für jede Versuchsbedingung wurden zwei Versuche durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass:

– die Agitation der Glasperlen perfekt kontrolliert werden kann, indem die dem Röhrchen zugeführte Leistung (Ps) eingestellt wird,
– die Hefepilze aufgelöst werden konnten und die Nukleinsäuren in nicht gespaltener Form freigesetzt werden konnten: Anwesenheit von Signalen auf dem Agarosegel in Form von Bändern, die der Genom-DNA und den ribosomalen RNA entsprechen (namentlich für die Bedingungen Nr. 3 und 4), und
– die Einstellung der Parameter eine direkte Wirkung auf die Menge und die Spaltung der freigesetzten Nukleinsäuren hat:

*Tastverhältnis:	eine zu schwache Einstellung (20%) setzt nicht genug Material frei
	eine zu starke Einstellung (80%) erzeugt auch schwache Signale aufgrund einer zu starken Spaltung der Nukleinsäuren und
*Anzahl an Perlen:	eine größere Anzahl an Perlen (60 μl anstatt 30 μl) bei korrekter Agitation ermöglicht das Freisetzen von mehr Material.

Die interessantesten zurückbehaltenen Bedingungen für die Folge der Experimente sind also diejenigen, die für die Versuche Nr. 4 dieser Tabelle Nr. 1 beschrieben sind.
2) Untersuchung der Empfindlichkeit
Die Untersuchung der Empfindlichkeit wurde über einen Verdünnungsbereich von Hefepilzen von 10⁷ bis 10² Hefepilzen/Versuch durchgeführt. Diese Hefepilze wurden durch direkte Sonikation unter in dem ersten Teil bestimmten, optimalen Bedingungen behandelt. Im Vergleich wurde derselbe Verdünnungsbereich durch eine Referenzlysemethode, dem Vortex, das in der Patentanmeldung FR97/12164 der Anmelderin beschrieben ist, behandelt.
Versuchsbedingungen

Nach der Präparierung der Hefepilzsuspensionen in Wasser bei 10², 10³, 10⁴ und 10⁵ Hefepilzen/Versuch wurden diese mit Folgendem behandelt:

– direkte Sonikation:	vorhergehend beschriebene Bedingungen in der Tabelle Nr. 1, Bedingungen Nr. 4,
– Vortex:	Röhrchen Falcon 5 ml, 600 μl der Probe, 150 μl Glasperlen mit einem Durchmesser von 425–600 μm, drei Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm, fünf Eisenperlen mit einem Durchmesser von 1,5 mm, Vortex während 12 min bei maximaler Leistung.

Die Lysate werden auf Sephadex G-50 Säulen (Quick Spin columns for DNA purification, Boehringer Mannheim) gemäß dem Protokoll der Lieferfirma gereinigt, dann wird eine Amplifikation von 10 μl Lysat per PCR gemäß dem von Makimura et al. (J. Med. Microbiol., 1994; 40: 35& 364) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Anschließend werden 20 μl PCR-Produkt durch Elektrophorese auf Agarosegel 1,2% und Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr) analysiert. Ergebnisse
Tabelle 2
Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz, Lyse im Röhrchen – Empfindlichkeit der Erfassung von Hefepilzen durch PCR danach gemäß zwei Lysebehandlungen
Die beiden Lysearten sind wie folgt:

– Lyse durch direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz und
– Lyse durch Vortex.

Signal auf dem Gel: – nicht sichtbar, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv
Für jede Versuchsbedingung wurden zwei Versuche durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass:

– die durch direkte Sonikation erhaltenen Lysate unter den optimalen Bedingungen gut durch PCR amplifiziert werden können: Anwesenheit von sichtbaren und intensiven Bändern, die gut der Größe des gesuchten PCR-Produkts entsprechen, und
– die Empfindlichkeit der Erfassung durch dieser Methode der PCR nach der Lyse durch direkte Sonikation sowie durch Vortex 10⁴ Hefepilze/Versuch ist. Die Lyse durch Sonikation ermöglicht also das Erhalten desselben Leistungsverhaltens wie eine Referenzlysemethode.

3) Schlussfolgerung
Diese Versuche haben das Aufzeigen der Durchführbarkeit der Lyse durch direkte Sonikation bei 20 kHz ermöglicht. Sie haben auch gezeigt, dass es möglich ist, die Sonikationsparameter anzupassen, um die Freisetzung von Hefepilznukleinsäuren zu maximieren und ihre Spaltung zu minimieren. Schließlich ermöglichen diese Parameter das Erhalten der durch die PCR amplifizierbaren Nukleinsäuren und das Erreichen einer Erfassungsempfindlichkeit, die derjenigen der Referenzlysemethode entspricht.
B – Sonotrode 35 kHz
Die verwendete Sonikationseinrichtung ist in 2 dargestellt und ist sehr gut im Kapitel I-B "Zweite Ausführungsform" der Lysevorrichtung beschrieben. Die Vorteile einer Sonikation bei 35 kHz anstatt 20 kHz sind in demselben Kapitel erläutert. Außerdem weist diese Lyseeinrichtung eine größere Kontaktfläche zwischen Röhrchen und Sonotrode auf; die Vorteile davon sind in dem Kapitel II-A "Erste Ausführungsform" des die zu behandelnde Probe enthaltenden Behälters erklärt.
1) Ermittlung der optimalen Einstellung der Parameter
Das Ziel bestand darin, die Sonikationsparameter zu identifizieren, die die Maximierung der Lyse von Bakterien und Hefepilzen und somit die Maximierung der Freisetzung der Nukleinsäuren unter perfekter Kontrolle ihrer Spaltung ermöglichen.
Versuchsbedingungen
Für die folgenden Versuche wird die Schalleistung durch die Schwingungsamplitude des von der Sonotrode erzeugten Ultraschalls definiert. Diese Amplitude wird im Prozentsatz der Leistung des Erzeugers, der dem Sonikator elektrische Energie zuführt, gegeben.
Die festen Parameter sind die Folgenden:

– Sonotrode von 35 kHz mit dem Erzeuger SODEVA 500 W, einem Gewicht von 1430 g und einem Röhrchen NUNC 1,8 ml,
– Probe: – für die Versuche auf Hefepilzen: Suspension der Hefepilze Candida krusei (Stamm Nr. 9604058, Sammlung bioMérieux) mit ungefähr 2 × 10⁷ Hefepilzen/ml (oD bei 550 nm von 0,950), in einem Puffer mit dem pH-Wert 8,5, der 80 mM HEPES, 1 mM EDTA und 2% Lithiumlaurylsulfat enthielt, und – für die Versuche auf Bakterien: Suspension der Bakterien Staphylococcus epidermidis (Stamm Nr. A054, Sammlung bioMérieux) mit ungefähr 10⁹ Bakterien/ml (oD bei 550 nm von 0,900), in einem Puffer mit dem pH-Wert 7,2, der 30 mM Tris, 5 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt,
– Probenvolumen = 600 μl und
– Glasperlen: – für die Versuche auf den Hefepilzen: 90 μl Perlen mit einem Durchmesser von 425 μm–600 μm (acid-washed, Sigma), und – für die Versuche auf den Bakterien: 120 μl Perlen mit einem Durchmesser von 106 μm (VIA I).

Die variablen Parameter sind in Tabellen Nr. 2 und Nr 3 angeqeben:

– Schwingungsamplitude in %,
– die zugeführte Leistung = Ps in Watt, die direkt mit der Amplitude verbunden ist,
– die Dauer der Sonikationsimpulse (Ton) und die Ruhedauer (Toff) in Minuten, wobei diese Zeitdauern das Tastverhältnis definieren: Ton(Ton + Toff), und
– die Gesamtdauer der Sonikation in Minuten.

Die Ergebnisse sind durch Folgendes evaluiert:

– Beobachtung der Agitation der Perlen,
– Messung der optischen Dichte bei 550 nm der Zellsuspensionen vor den Lysebehandlungen, sowie nach der Lyse. Der ungefähre Prozentsatz der Lyse ist durch Folgendes bestimmt: (oD_550nm nach der Lyse)/(oD_550nm vor der Lyse) × 100), und
– Analyse von 20 μl Lysat durch Elektrophorese in Agarosegel 0,8 und Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr); durch Identifizierung der Bänder der freigesetzten Nukleinsäuren in intakter Form (Genom-DNA, rRNA 18S und 26S) aufgrund eines Molekulargewicht-Markers. Die gespaltenen Nukleinsäuren treten unter diesen Bändern auf.

Freisetzung der intakten Nukleinsäuren:

– abwesend, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv, +++ sichtbar und sehr intensiv

Für jede Versuchsbedingung wurden zwei Versuche durchgeführt. Ergebnisse Versuche auf Bakterien
Tabelle 4 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 35 kHz, Lyse im Röhrchen – Einfluss der Schalleistung. des Tastverhältnisses und der Dauer der Sonikation auf den Prozentsatz der Lyse von Bakterien sowie auf die Freisetzung von Nukleinsäuren und deren Spaltungszustand

Freisetzung der intakten Nukleinsäuren: – abwesend, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv, +++ sichtbar und sehr intensiv
Für jede Versuchsbedingung wurden zwei Versuche durchgeführt.
Ergebnisse betreffend die Agitation der Perlen
Leistung 15 W (Amplitude 50%): homogene Agitation der Perlen in der unteren Hälfte des Volumens der Flüssigkeit unter Bildung einer Agitationskuppe im Zentrum. Die Perlen werden kleinen Bewegungen unterzogen, wobei sie aneinander reiben.
Leistung 20 W (Amplitude 80%): heftigere Agitation; die Perlen vollziehen umfangreichere Bewegungen, wobei sie ein größeres Volumen der Flüssigkeit einnehmen. Die Erwärmung der Flüssigkeit ist ebenfalls höher.
Die Ergebnisse betreffend die Agitation zeigen, dass

– eine Leistung von 15 W ausreicht, um eine korrekte Agitation der Glasperlen zu erzeugen,
– mit Bezug auf die Sonotrode von 20 kHz, diejenige von 35 kHz eine geringere Leistung erfordert, um eine korrekte Agitation der Glasperlen (15 W anstatt 20 W) zu erzeugen, und dies für eine größere Menge von Perlen (90 μl und 120 μl anstatt 60 μl), und
– aufgrund einer Übertragung des Ultraschalls durch eine größere Fläche (den gesamten Boden des Röhrchens) die Agitation der Perlen homogener und die Erwärmung der Flüssigkeit geringer ist.

Die Ergebnisse betreffend die Lyse zeigen, dass:

– die Bakterien und die Hefepilze aufgelöst werden konnten und ihre Nukleinsäuren freigesetzt werden konnten,
– die Einstellung der Parameter eine direkte Wirkung auf die Menge und die Spaltung der freigesetzten Nukleinsäuren hat:

Leistung: (Amplitude)	– eine erhöhte Schwingungsamplitude (80%) ermöglicht das leichte Erhöhen des Prozentsatzes der Lyse und der Menge an freigesetzten Nukleinsäuren und sie ruft eine starke Spaltung hervor.
	– eine Amplitude von 50% setzt eine befriedigende Menge an Nukleinsäuren frei, während die Genom-DNA vollständig und die ribosomalen RNA teilweise erhalten bleiben,
Tastverhältnis:	ein erhöhtes Tastverhältnis (Ton 10 Sek./Toff 10 Sek.) hat dieselbe Wirkung wie eine erhöhte Amplitude,
Dauer der Sonikation:	eine lange Dauer (15 min) ermöglicht das Erhöhen des Prozentsatzes der Lyse und der Menge an freigesetzten Nukleinsäuren, ohne dass ihr Spaltungszustand beeinflusst wird,

– die zurückgehaltene Bedingung zum Erhalten eines Maximums an Nukleinsäuren in nicht gespaltener Form eine lange Sonikation mit schwacher Amplitude und schwachem Tastverhältnis (Bedingungen Nr. 2, Tabellen Nr. 2 und Nr. 3) ist und
– die zurückgehaltene Bedingung zum Erhalten eines Maximums an Nukleinsäuren in gespaltener Form eine lange Sonikation mit hoher Amplitude (Bedingung Nr. 5, Tabelle Nr. 2) ist.

2) Untersuchung der Empfindlichkeit
Die Untersuchung der Empfindlichkeit wurde über einen Verdünnungsbereich von Hefepilzen von 10⁶ bis 10² Hefepilzen/Versuch durchgeführt. Diese Hefepilze wurden durch direkte Sonikation unter unterschiedlichen, in dem ersten Teil evaluierten Bedingungen behandelt:

1. die zurückgehaltene Bedingung zum Erhalten eines Maximums an Nukleinsäuren in nicht gespaltener Form,
2. dieselbe Bedingung, lediglich unter Erhöhung des Tastverhältnisses,
3. immer noch Bedingung Nr. 1, aber lediglich unter Erhöhung der Amplitude.

Im ersten Teil wurde gezeigt, dass diese beiden letzten Bedingungen zu einem höheren Lyseprozentsatz, aber auch zu einer stärkeren Spaltung der Nukleinsäuren führen. Außerdem wurde derselbe Verdünnungsbereich durch eine Referenzlysemethode, dem Vortex, das in der Patentanmeldung FR97/12164 der Anmelderin beschrieben ist, behandelt.
Versuchsbedingungen

Nach der Präparierung der Hefepilzsuspensionen in Wasser bei 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ und 10⁷ Hefepilzen/Versuch wurden diese mit Folgendem behandelt:

– direkte Sonikation:	Bedingungen Nr. 1, 2 und 3, die in dem ersten Teil, Tabellen Nr. 2 und 3, beschrieben sind,
– Vortex:	Röhrchen Falcon 5 ml, 600 μl Probe, 150 μl Glasperlen mit einem Durchmesser von 425–600 μm, drei Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm, fünf Eisenperlen mit einem Durchmesser von 1,5 mm, Vortex während 12 min bei maximaler Leistung.

Die Lysate werden auf Sephadex G-50 Säulen (Quick Spin columns for DNA purification, Boehringer Mannheim) gemäß dem Protokoll der Lieferfirma gereinigt, dann wird eine Amplifikation von 10 μl Lysat per PCR gemäß dem von Makimura et al. (J. Med. Microbiol., 1994; 40: 358–364) beschriebenen Protokoll durchgeführt. Anschließend werden 20 μl PCR-Produkt durch Elektrophorese auf Agarosegel 1,2% und Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr) analysiert. Ergebnisse
Tabelle 5 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz – Empfindlichkeit der Erfassung von Hefepilzen durch PCR nach unterschiedlichen Lysebehandlungen

Diese unterschiedlichen Lysebehandlungen sind Folgende: – Lyse durch direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz unter drei Bedingungen und – Lyse durch Vortex.

Signal auf dem Gel:

– nicht sichtbar (+), schwach, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv

– die durch direkte Sonikation unter den optimalen Bedingungen erhaltenen Lysate gut durch PCR amplifiziert werden können; es sind sichtbare und intensive Bänder anwesend, die gut der Größe des gesuchten PCR-Produkts entsprechen,
– nach der Lyse durch direkte Sonikation unter drei unterschiedlichen Bedingungen bis zu 10⁴ Hefepilze per Versuch durch PCR erfasst werden; dennoch sind die für 10⁴ Hefepilze per Versuch beobachteten Signale schwächer, wenn die Sonikation unter Bedingungen durchgeführt wird, welche die Nukleinsäuren stärker spalten (Bedingungen Nr. 2 und 3); und
– die nach der Lyse durch direkte Sonikation erhaltene Erfassungsempfindlichkeit sehr nahe bei derjenigen liegt, die nach der Lyse durch eine Referenzmethode, den Vortex, erhalten wird.

3) Schlussfolgerung
Diese Versuche haben die Durchführbarkeit der Lyse durch direkte Sonikation bei 35 kHz auf zwei unterschiedlichen Organismen (Bakterien und Hefepilze) aufgezeigt. Es wurde auch aufgezeigt, dass eine sinnvolle Einstellung von ein paar wichtigen Sonikationsparametern das Maximieren der Lyse dieser Organismen ermöglicht, während der Spaltungszustand der freigesetzten Nukleinsäuren perfekt kontrolliert wird. Diese wichtigen Sonikationsparameter wurden identifiziert und die optimalen Einstellungen wurden bestimmt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Lyse durch direkte Sonikation bei 35 kHz die Freisetzung der durch PCR amplifizierbaren Nukleinsäuren ermöglicht und dass die Sonikationsbedingungen, die als für eine Amplifikation durch PCR förderlich identifiziert wurden, das Erhalten einer Erfassungsempfindlichkeit, die sehr nahe bei derjenigen liegt, die durch eine Referenzmethode, dem Vortex, erhalten wird, ermöglichen. Die Sonikationsbedingungen, welche die Nukleinsäuren stärker spalten, sind etwas weniger förderlich für eine Amplifikation durch PCR. Dennoch kann eine starke Spaltung der Nukleinsäuren für gewisse andere Anwendungen in der Molekularbiologie sehr förderlich sein, wie z. B. für eine Reinigung der Nukleinsäuren unter Verwendung von Hybridisationsprozessen, die durch eine vorherige Fragmentierung der Nukleinsäuren begünstigt werden.
C – Sonotrode 35 kHz Mehrfachröhrchen
Das Konzept einer simultanen, direkten Sonikation mit mehreren Röhrchen ist in 3 dargestellt und ist sehr gut im Kapitel 1-C "Dritte Ausführungsform" der Lysevorrichtung beschrieben. Die folgenden Versuche wurden mit einer Einrichtung durchgeführt, welche die simultane Sonikation von zwölf Röhrchen ermöglicht und die außerdem dieselben Charakteristiken wie die Sonotrode von 35 kHz, die für die Versuche des Teils I-B verwendet wurde (dieselbe Sonikationsfrequenz, dieselbe Kontaktfläche zwischen Röhrchen und Sonotrode usw.), aufweist. Das Merkmal dieser Mehrfachröhrchen-Sonikationseinrichtung besteht in der Möglichkeit, den auf jedes der zwölf Röhrchen ausgeübten Druck anzupassen, um eine gute Reproduzierbarkeit der Kontakte zwischen Röhrchen und Sonotrode und somit der Wirksamkeit der Lyse von einem Röhrchen zum anderen zu erhalten.
1) Anpassung der Röhrchenkopplung – Sonotrode für eine reproduzierbare Sonikation
Der von dem Gewicht auf jedes der zwölf Röhrchen ausgeübte Druck wurde gemessen, dann eingestellt, um einen homogenen Druck für alle Röhrchen zu erhalten. Diese Homogenität wurde durch eine homogene Verhaltensweise der Perlen bei der Sonikation unter den optimalen Bedingungen, die in dem Teil I-B bestimmt wurden, bestätigt.
Versuchsbedingungen
Die auf jedes Röhrchen angewandte Kraft wurde mit Hilfe eines Kraftmessgeräts (Referenz BC302 3KG MVN, Lieferfirma C2AI, Frankreich) in der Form einer Scheibe, mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Stärke von 4,5 mm, die auf einem abgestumpften Röhrchen positioniert ist, so dass die Höhe des Teströhrchens, die mit der Stärke des Kraftmessgeräts zusammenhängt, mit der Höhe der Probenröhrchen identisch ist, gemessen. Das Messgerät ist mit einem digitalen Anzeiger (Typ 48 × 96, programmierbar, Lieferfirma C2AI, Frankreich) verbunden, damit eine Spannung dargestellt werden kann, die für die Druckkraft repräsentativ ist.
Für die Messungen wurden elf Proberöhrchen und das Teströhrchen mit dem Kraftmessgerät auf den zwölf Positionen der Sonotrode positioniert. Das mit dem Messgerät versehene Teströhrchen wird sukzessiv von Position 1 zu Position 2, dann zu Position 3 ... bis zu Position 12 verlagert, um die bei jeder Position auf die Röhrchen angewandte Druckkraft abzulesen. Es wurden drei Messfolgen durchgeführt. Die Art des Abstands der Verteilung der Kopplungskraft, die hinsichtlich des Durchschnitts der drei Messreihen berechnet wurde, zeigt starke Ungleichheiten vor der Einstellung, da der Variationskoeffizient (VK) etwa 10% beträgt (siehe Tabelle 6).
Die Einstellung der Auflagekraft wird anschließend für jede Position in Anwesenheit des Messgeräts durch die Einstellung der Druckfeder jeder Auflageachse vorgenommen.
Nach der Einstellung ist festzustellen, dass der VK der Werte der Druckkräfte auf einen Wert, der unter 1% liegt, zurückgebracht wurde. Ergebnisse
Tabelle 6 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 35 kHz für Mehrfachröhrchen – auf die unterschiedlichen Röhrchen ausgeübter Druck
Charakterisierung der Lysebewegung
Nach der Homogenisierung der auf die zwölf Röhrchen ausgeübten Drücke wurde die mehr oder weniger homogene Charakteristik der Bewegung der Perlen bei der Sonikation visuell evaluiert. Die Sonikation wurde genau wie in Teil III – B beschrieben, durchgeführt, indem die in Tabellen Nr. 3 und 4 beschriebene Bedingung Nr. 2 (die als optimal für eine maximale Lyse und eine maximale Bewahrung der Nukleinsäuren bestimmt wurde) angewandt wurde und indem Wasser als "Probe" verwendet wurde. Außerdem wurde das auf die zwölf Röhrchen wirkende Gewicht graduell erhöht (2,7 kg, 3,7 kg, 4,6 kg, 5,6 kg), was den Kontakt zwischen Röhrchen und Sonotrode erhöht.
Es wurde festgestellt, dass ein zu schwaches Gewicht (2,7 kg) zu einer sehr großen Veränderlichkeit der Bewegung der Perlen von einem Röhrchen zum anderen führt. Tatsächlich reicht dieses Gewicht nicht aus, um einen ausreichenden Kontakt zwischen den zwölf Röhrchen und der Sonotrode herzustellen, da die Perlen in gewissen Röhrchen im Ruhezustand sind.
Hingegen weist die Bewegung der Perlen ab einem Schwellengewicht (3,7 kg) in jedem der zwölf Röhrchen dieselbe Charakteristik auf: homogene Agitation der Perlen in der unteren Hälfte des Volumens der Flüssigkeit unter Bildung einer Agitationskuppe im Zentrum. Die Perlen werden kleinen Bewegungen unterzogen, wobei sie aneinander reiben.
2) Schlussfolgerung
Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, das Prinzip der direkten Sonikation bei 35 kHz mit einer optimalen Kontaktfläche zwischen Röhrchen und Sonotrode (in Teil I-B beschrieben) auf eine simultane Behandlung von mehreren Röhrchen zu transponieren. Des Weiteren ist es möglich, eine homogene Lysebewegung in allen Röhrchen zu erhalten, indem die Kontaktkräfte zwischen Röhrchen und Sonotrode eingestellt werden. Diese beiden Beobachtungen zeigen die Möglichkeit des Verwendens des Prinzips der direkten Sonikation in einem Automaten, um eine gewisse Anzahl an Proben auf eine reproduzierbare Art und Weise zu behandeln, auf.
IV) SONIKATION DURCH SONOTRODEN FÜR VERBRAUCHSMATERIALIEN IM KARTENFORMAT
Sonotrode von 20 kHz für Karten
Die Sonikationseinrichtung als Karte ist in den 4 bis 6 dargestellt. Diese Figuren zeigen auch die beiden Möglichkeiten der Positionierung, sowie die Verhaltensweise der Flüssigkeit und der Perlen während der Sonikation. Die für diese Einrichtung verwendete Sonotrode ist diejenige, die im Kapitel I-A "Erste Ausführungsform" der Lysevorrichtung beschrieben ist, wobei jedoch ein flaches Anschlussstück mit einem Durchmesser von 13 mm angepasst wird. Das Verbrauchsmaterial im Kartenformat ist in Kapitel II-B "Zweite Ausführungsform" des die zu behandelnde Probe enthaltenden Behälters beschrieben. Dieses Verbrauchsmaterial ist aus Polystyrol (es können andere mit den biologischen Analysen kompatible Kunststoffe verwendet werden) mit den Maßen 40 × 40 × 4 mm und verfügt im Zentrum über eine als Grube bezeichnete kreisförmige Öffnung mit variablem Durchmesser, um die Probe und die Glasperlen zu empfangen. Der Boden dieser Grube setzt sich entweder aus Kunststoff mit einer Stärke von 0,3 mm oder aus einem selbsthaftenden Polypropylenfilm zusammen. Dieser Film dient auch dazu, das Verbrauchsmaterial zu schließen.
1) Evaluierung der Parameter, die mit dem Kartenformat verbunden sind
Lediglich die mit der Verwendung von Karten verbundenen Parameter wurden evaluiert, wobei für die anderen Sonikationsparameter, die bereits in Teil I-A untersucht wurden, feste Werte gewählt wurden. Die Lyseversuche wurden mit Hefepilzen und Bakterien durchgeführt und die Wirksamkeit der Lyse sowie der Spaltungszustand der freigesetzten Nukleinsäuren wurden bestimmt.
Versuchsbedingungen
Die festen Parameter sind die Folgenden:

– Sonotrode von 20 kHz mit dem Erzeuger Bioblock 300 W und dem Verbrauchsmaterial, die beide oben beschrieben wurden, wobei die Karte sich in horizontaler Position befindet,
– Leistung: für die Versuche auf den Hefepilzen: 25 W, und für die Versuche auf den Bakterien: 13–14 W,
– Tastverhältnis von 80% und Dauer der Sonikation 5 min,
– Probe: für die Versuche auf Hefepilzen: Suspension der Hefepilze Candida krusei (Stamm Nr. 9604058, Sammlung bioMerieux) mit ungefähr 2 × 10⁷ Hefepilzen/ml (oD bei 550 nm von 0,950), in einem Puffer mit dem pH-Wert 8,5, der 80 mM HEPES, 1 mM EDTA und 2% Lithiumlaurylsulfat enthielt, und für die Versuche auf Bakterien: Suspension der Bakterien Staphylococcus epidermidis (Stamm Nr. A054, Sammlung bioMérieux) bei ungefähr 8,5 × 10⁸ Bakterien/ml (oD bei 550 nm von 0,720) in demselben Puffer, und
– Glasperlen: für die Versuche auf Hefepilzen: Perlen mit einem Durchmesser von 425 μm – 600 μm (acid-washed, Sigma) und für die Versuche auf Bakterien: Perlen mit einem Durchmesser von 106 μm (VIA I).

Die variablen Parameter sind in Tabellen Nr. 6 und Nr. 7 angegeben:

– der Durchmesser der Grube in mm,
– die Beschaffenheit des Bodens der Grube (transparenter nachgiebiger Film oder Boden aus Kunststoff),
– Volumen der Probe in μl und
– Volumen der Glasperlen in μl.

Die Ergebnisse sind durch Folgendes evaluiert:

– Beobachtung der Agitation der Perlen und
– Analyse von 20 μl Lysat per Elektrophorese in Agarosegel 0,8 und Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr); durch Identifizierung der Bänder der freigesetzten Nukleinsäuren in intakter Form (Genom-DNA, rRNA 18S und 26S) aufgrund eines Molekulargewicht-Markers.

Die gespaltenen Nukleinsäuren treten unter diesen Bändern auf. Ergebnisse Versuche auf Bakterien
Tabelle 7 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz, Kartenlyse-Einfluss der Parameter, die mit dem ,Karten'-Format verbunden sind (Größe und Boden der Grube, Volumen der Probe, Menge an Perlen), auf die Lyse von Bakterien; und namentlich die Menge an freigesetzten Nukleinsäuren und deren Spaltungszustand.

Freisetzung der Nukleinsäuren:

– abwesend, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv

Bemerkung: bei der Bedingung Nr. 8 befindet sich die Karte in vertikaler Position. Ergebnisse Versuche auf Hefepilzen
Tabelle 8 Direkte Sonikation mit einer Sonotrode von 20 kHz, Kartenlyse – Einfluss der Parameter, die mit dem "Karten"-Format verbunden sind (Größe und Boden der Grube, Volumen der Probe, Menge an Perlen), auf die Lyse von Bakterien: und namentlich die Menge an freigesetzten Nukleinsäuren und deren Spaltungszustand

Freisetzung der Nukleinsäuren: – abwesend, + sichtbar, ++ sichtbar und intensiv
Bemerkung: bei den Bedingungen Nr. 3 und 4 dauert die Sonikation 10 min.
Ergebnisse betreffend die Agitation
Horizontale Position mit Boden aus nachgiebigem Film: Der von der Sonotrode erzeugte Ultraschall stößt die Flüssigkeit und die Perlen in Richtung des Umkreises der Grube aus (siehe 6). Die Perlen werden kleinen, sehr schnellen Agitationsbewegungen unterzogen, wobei sie aneinander reiben. Diese Agitation geschieht hauptsächlich aufgrund des Ultraschalls, der von dem Film seitlich übertragen wird. Es gibt weder eine Abnutzung des Films, noch eine erwähnenswerte Erwärmung der Flüssigkeit.
Horizontale Position mit Boden aus Kunststoff: Die Flüssigkeit und die Perlen sind auf dieselbe Weise angeordnet wie oben, jedoch ist die Agitation der Perlen deutlich schwächer. Hingegen gibt es eine intensive Erwärmung des Bodens aus Kunststoff und dadurch der Flüssigkeit.
Vertikale Position mit Boden aus nachgiebigem Film: Die Flüssigkeit und die Perlen sind im unteren Teil der Grube, direkt gegenüber der Sonotrode angeordnet und somit in einem kleineren Volumen als in der horizontalen Position. Die Agitation der Perlen ist ziemlich stark, aber es gibt keine erwähnenswerte Erwärmung der Flüssigkeit.
Die Ergebnisse zeigen, dass:

– die Bakterien und die Hefepilze aufgelöst werden konnten und ihre Nukleinsäuren freigesetzt werden konnten,
– die Sonikation in horizontaler Position und mit einem Grubenboden aus nachgiebigem Film eine sehr wirksame Lyse und die Freisetzung einer großen Menge an Nukleinsäuren (sehr intensive Signale auf Gel) ermöglicht, ohne dass sich eine Spaltung der DNA oder der ribosomalen RNA ergibt. Tatsächlich ermöglicht der Film, der sehr dünn, beständig und nachgiebig ist, eine sehr gute Kopplung zwischen der Sonotrode und dem Film und daher eine starke Agitation der Perlen und eine Übertragung von Ultraschall mit relativ wenig Dissipation durch den Joule-Effekt, also wenig Erwärmung. Außerdem reduziert die Abgeschlossenheit der Flüssigkeit an der Peripherie der Grube außerhalb der Schallachse das Phänomen der Kavitation in der Flüssigkeit beträchtlich,
– die Sonikation mit einem Boden aus Kunststoff eine geringere Menge an Nukleinsäuren freisetzt, wobei eine stärkere Spaltung der Nukleinsäuren (DNA und rRNA) hervorgerufen wird. Dies ist deutlich auf die schwächere Agitation der Perlen und auf die starke Erwärmung des Bodens der Karte und der Flüssigkeit zurückzuführen. Diese beiden Phänomene können durch eine schlechte Kopplung zwischen der Sonotrode und dem starren Boden der Karte sowie durch einen größeren Joule-Effekt erklärt werden, und
– je mehr sich der Durchmesser der Lysegrube vergrößert, desto mehr vermindert sich die Wirksamkeit der Lyse und desto weniger Nukleinsäuren werden freigesetzt. Die Entfernung der Flüssigkeit und der Perlen zur Sonotrode im Zentrum ist daher zu vermeiden, da ansonsten die Wirksamkeit des Ultraschalls vermindert wird. Es wird daher empfohlen, Karten mit einer Grube mit einem Durchmesser, der sich demjenigen der Sonotrode annähert, zu verwenden.

2) Schlussfolgerung
Die Durchführbarkeit einer direkten Sonikation in Verbrauchsmaterialien im Kartenformat ist deutlich aufgezeigt worden. Diese Versuche habe auch das Identifizieren der Verwendungsbedingungen von Karten, die zu einer größeren Lysewirksamkeit mit einer gänzlichen Konservierung der freigesetzten Nukleinsäuren (Gruben mit einem Durchmesser, der sich demjenigen der Sonotrode annähert, und Kopplung durch einen dünnen und nachgiebigem Film) führen, ermöglicht. Diese Konservierung der Nukleinsäuren ist sehr vorteilhaft für Molekularbiologie-Analysen, die eines perfekt intakten Zustands der Nukleinsäuren bedürfen. Außerdem ist die Verwendung dieser Art von Verbrauchsmaterial für die direkte Sonikation sehr interessant, da sie die Integrierung etwaiger nachträglicher Behandlungen und Analysen der Probe in derselben Karte ermöglichen würde. Dabei könnten die Lyse von Mikroorganismen und ihre Analyse und Identifizierung in einem einzigen Verbrauchsmaterial durchgeführt werden, was die Kontaminationsgefahr zwischen Proben reduzieren und eine bequeme Automatisierung des Verfahrens ermöglichen würde.
REFERENZEN

1: Vorrichtung
2: Sonotrode oder Sonde
3: Erzeuger
4: Röhrchen oder Behälter
5: In dem Röhrchen 4 oder der Karte 10 enthaltene Probe
6: Mittel zur Unter-Druck-Setzung oder obere Platte
7: Ballastgewicht
8: Wirksame Fläche der Sonotrode 2
9: Booster
10: Karte oder Behälter
11: Glasperlen
12: Filme
13: Grube
14: Flaches Anschlussstück
15: Sonotrode oder Sonde
16: Wirksame Fläche der Sonotrode 15
17: Wandler
18: Basis
19: Trägerplatte
20: Druckplatte
21: Mit einem Röhrchen 4 verbundenes Komprimierungselement
F1: Verlagerung der Probe 5
F2: Schwingungen des Films 12

Claims

Eine Vorrichtung (1), die eine Sonotrode (2) umfasst, die dafür bestimmt ist, Ultraschall von mehr oder weniger starker Leistung in mindestens einer biologischen Probe (5), die aufzulösende Zellen enthält, zu erzeugen, wobei die Probe (5) in mindestens einem Behälter (4), der zweckgemäß ausgeführt ist, enthalten ist, wobei die Sonotrode (2) direkt mit dem/den Behälter(n) (4), der/die die aufzulösende Probe (5) enthält/enthalten, in Kontakt ist, wenn sich zwischen den Flächen, die mit der Sonotrode (2) und dem Behälter (4) in Kontakt sind, kein Fluid befindet, dadurch gekennzeichnet. dass die Sonotrode (2) eine wirksame Fläche (8) aufweist, die sich der Form der Außenfläche des gesamten oder eines Teils jedes Behälters (4), der die aufzulösende Probe enthält, anpasst; wobei die wirksame Fläche (8) der Sonotrode (2), die mit dem Behälter (4) in Kontakt ist, eine konkave Form aufweist.
Eine Vorrichtung, die eine Sonotrode (15) umfasst, die dafür bestimmt ist, Ultraschall von mehr oder weniger starker Leistung in mindestens einer biologischen Probe (5), die aufzulösende Zellen enthält, zu erzeugen, wobei die Probe (5) in mindestens einem Behälter (10), der zweckgemäß ausgeführt ist, enthalten ist, wobei die Sonotrode (15) direkt mit dem/den Behälter(n) (10), der/die die aufzulösende Probe (5) enthält/enthalten, in Kontakt ist, wenn sich zwischen den Flächen, die mit der Sonotrode (15) und dem Behälter (10) in Kontakt sind, kein Fluid befindet, dadurch gekennzeichnet. dass die Sonotrode (15) eine wirksame Fläche (16) aufweist, die sich der Form der Außenfläche des gesamten oder eines Teils jedes Behälters (10), der die aufzulösende Probe enthält, anpasst; wobei die wirksame Fläche (16) der Sonotrode (15), die mit der Außenfläche des Behälters (10) in Kontakt ist, eine konvexe Form aufweist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche des Behälters (10), die mit der Sonotrode (15) zusammenwirkt, biegsam ist, so dass sie sich an die wirksame Fläche (16) der Sonotrode (15) anpasst.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonotrode (2 oder 15) mit mindestens einer Glasperle (11), die sich in der in einem Behälter (4 oder 10) enthaltenen Probe (5) befindet, zusammenwirkt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass jede Perle (11), im Falle einer Lyse von Bakterien, einen Durchmesser von 90 bis 150 und vorzugsweise von 100 Mikrometern (μm) aufweist und, im Falle einer Lyse von Hefepilzen, einen Durchmesser von 150 bis 1500 und vorzugsweise von 500 μm aufweist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Sonotroden (2 oder 15) beinhaltet.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Behälter (4 oder 10) mit der/den Sonotrode(n) (2 oder 15) mittels eines Mittels zur Unter-Druck-Setzung (6) in physikalischem Kontakt ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass jede Sonotrode (2 oder 15) eine Ultraschallsendefrequenz von zwischen 20 und 50 kHz, genauer zwischen 30 und 40 kHz und vorzugsweise von ungefähr 35 kHz aufweist.
Ein Verfahren zur Lyse von Zellen durch Ultraschall, die in einer biologischen Probe (5), welche in einem Behälter (4 oder 10) vorhanden ist, enthalten sind, das mindestens eine Sonotrode (2 oder 15) verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Folgendem besteht: – Positionieren des Behälters (4 oder 10) in direkten Kontakt mit der konkaven oder konvexen wirksamen Fläche der Sonotrode(n) (2 oder 15) und – Aktivieren der Sonotrode(n) (2 oder 15) während eines Zeitraums, der ausreicht, um die in der Probe (5) enthaltenen Zellen aufzulösen, indem die freigesetzten DNA und/oder RNA konserviert werden, um die nachträgliche Verwendung, beispielsweise in einem Amplifikationsschritt, zu ermöglichen.
Ein Verfahren zur Lyse von Zellen durch Ultraschall, die in einer biologischen Probe (5), welche in einem Behälter (4 oder 10) vorhanden ist, enthalten sind, das mindestens eine Sonotrode (2 oder 15) verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Folgendem besteht: – Positionieren des Behälters (4 oder 10) in direkten Kontakt mit der konkaven oder konvexen wirksamen Fläche der Sonotrode(n) (2 oder 15) und – Aktivieren der Sonotrode(n) (2 oder 15) während eines Zeitraums, der ausreicht, um die in der Probe (5) enthaltenen Zellen aufzulösen, indem die freigesetzten DNA und/oder RNA gespalten werden, während ihre nachträgliche Verwendung, beispielsweise in einem Amplifikationsschritt, ermöglicht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Aktivierung der Sonotrode(n) (2 oder 15) der Behälter (4 oder 10) gegen die wirksame Fläche (8 oder 16) der Sonotrode(n) (2 oder 15) gepresst wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung jeder Sonotrode (2 oder 15) unter folgenden Bedingungen vorgenommen wird: – Dauer der Sonikation 10 bis 15 Minuten, – Tastverhältnis zwischen 40 und 60% und vorzugsweise 50 und – Leistung 10 bis 30 W.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung jeder Sonotrode (2 oder 15) aus einer Impulsfolge besteht, deren Dauer zwischen 5 und 20 Sekunden und vorzugsweise zwischen 10 und 15 Sekunden liegt.