JP2005506837A - 細胞融合のためのノンリニアーな振幅の誘電泳動用波形 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、細胞に細胞融合パルスをかける前に細胞を処理する方法を提供することである。この方法は、細胞が、まず振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形によって並び、次いで振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形によって圧縮され、細胞融合に供される前に細胞膜接触が密になるように、時間に対して非直線的な形式で振幅を変化させる融合前電場波形で細胞を処理するステップを含む。ノンリニアー融合前電場波形は、隣接ステップを有するステップにおける段階的に増加する波形、隣接ステップのないステップにおける段階的に増加する波形、及びノンリニアーなアルゴリズムに従って、段階的に、連続的に、Ｓ字状に変化させることができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年８月３１日に出願された同時係属中の米国仮出願第６０／３１５，９３６号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、生物工学において細胞を互いに融合させる方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、細胞を電場で処理して、細胞を並べ、細胞膜の接触を密とした後、当該細胞を細胞融合に供する方法及び装置を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
中性電荷の細胞が、両方とも平面の１対の電極によって与えられるような均一な電場に置かれた場合、細胞は、両方の電極からの引力が同じなので、どちらの電極方向にも動くことはない。
【０００４】
一方、中性電荷の細胞は、両方が平面ではない２つの電極によって与えられるような不均一な電場に置かれると、図１（従来技術を示す）に示すように、細胞は双極子を形成し、より大きな引力を有する電極に引き付けられてその大きな引力を有する電極の方向に移動する。
【０００５】
このような不均一電場の利用は、誘電泳動において行なわれており、誘電泳動を用いて生細胞を並べ、その後融合／電気穿孔パルスによって細胞を融合させるという考え方は、１９７０年代初期に文献に記載されている。この方法は、治療目的のため、モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを産生するため、核融合のため、或いは他のハイブリッド細胞を産生するために、２つの異なる細胞のハイブリッドを産生するのに用いられている。誘電泳動は、生細胞などの中性電荷の粒子に電気力を付与するプロセスである。誘電泳動による電気力は、不均一な電場をかけることによって生じ、細胞内の電荷を分離させて双極子を形成させる。双極子が形成された後、細胞は、不均一な電場によって、より高い又はより低い電場強度の方向へ移動する。この移動は、培地と細胞若しくは生物学的粒子との相対的な導電率及び誘電率に依存する。誘電泳動力は、電場の２乗の関数であるので、電場極性は重要ではない。この力は、培地と粒子若しくは細胞との相対的な導電率及び誘電率の関数である。また、導電率及び誘電率は、適用した電場の周波数の関数でもある。一般に、正弦波などのＡＣ電圧波は、この交流の電場を生じさせるために電極間にかけられる。正弦波電圧、周波数及び持続時間は、個々の細胞タイプに応じて最適化される。ＡＣ波をかけて細胞を並べた後、一又は複数の融合／電気穿孔パルスをかけて、両細胞の膜が混じり合う細胞膜の通路を形成する。このような通路によって細胞の内容物を混合することを可能とし、ハイブリッド細胞が形成される。融合パルスを実施した後、さらにＡＣ電場をかけて、融合細胞が安定している間にその細胞同士を一緒に保持することができる。いくつかの例で、突発的な電場による細胞の損傷を防止するために、ＡＣ電圧を直線的に増減するものがあった。
【０００６】
細胞融合の適用例は、ハイブリドーマ産生及び核移植である。電気融合の最近の用途は、癌免疫療法のための治療用ハイブリッドを産生することである。これらのハイブリッドは、癌腫瘍細胞と免疫系樹状細胞とから、生体外プロセスによって産生される。其々の治療に多数の生存能のあるハイブリッドが必要なため、ハイブリッド産生プロセスにおいて高効率化に対する新しい要求が生じている。
【０００７】
細胞融合を実施するために利用可能な（電気的、機械的、化学的）技術がいくつかあるが、本発明は、電気的手段に関する。現在の電気技術では、電極装置に接続された電圧波形発生装置が使用されている。関連する既知の電気的、機械的及び化学的な技術に関し、以下の米国特許及び国際公開が特に関係しており、これらを参照により本明細書に援用する。
第４，３２６，９３４号 １９８２年４月２７日、Ｐｏｈｌ
第４，４４１，９７２号 １９８２年４月１０日、Ｐｏｈｌ
第４，７６４，４７３号 １９８８年８月１６日、Ｍａｔｓｃｈｋｅ他
第４，７８４，９５４号 １９８８年１１月１５日、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ
第５，３０４，４８６号 １９９４年４月１９日、Ｃｈａｎｇ
第６，０１０，６１３号 ２０００年１月４日、Ｗａｌｔｅｒｓ他
国際公開公報第００／６００６５号 ２０００年１０月１２日、Ｗａｌｔｅｒｓ他
【０００８】
これらの文献によれば、一定振幅（従来技術図３参照）又は直線的に増加する振幅（従来技術図４参照）のどちらかを有する融合前電場波形（ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｗａｖｅｆｏｒｍｓ）を使用することが知られている。図５は、電場波形を用いて細胞融合を実施する従来技術の一般的な手順の全般を示すものである。この手順においては、融合前電場波形の実施後、融合／電気穿孔パルスが実施され、さらにその後、融合後電場波形が実施される。
【０００９】
それにもかかわらず、融合前電場波形の一定の振幅又は直線的に増加する振幅による細胞融合では、細胞融合の効率が、癌免疫療法で用いられる治療用ハイブリッドの産生といった用途において要求される高い効率には達することができない。この点で、一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形を用いて処理された細胞よりも細胞融合効率の高い融合前電場波形を細胞に付与することが望まれる。
【００１０】
より具体的には、Ｃｈａｎｇの米国特許第５，３０４，４８６号において、Ｃｈａｎｇの図２Ｅに、リニアー低電圧プリサイン（ｐｒｅｓｉｎｅ）ＡＣ波形、リニアー高電圧電気穿孔用ＡＣ波形及びリニアー低電圧ポストポレーション（ｐｏｓｔ−ｐｏｒａｔｉｏｎ）ＡＣ波形が開示されていることが注目される。Ｃｈａｎｇの発明は、唯一、融合／電気穿孔パルスに限定されている。Ｃｈａｎｇは、リニアー低電圧プレサインＡＣ波形のみ開示し、ノンリニアー低電圧プレサインＡＣ波形を開示していない。Ｃｈａｎｇは、プレサインＡＣ波形という言葉を記載する以外、プレサインＡＣ波形には注意を向けていない。
【００１１】
どんな細胞融合システムにおいても第１のプロセスは、細胞を接触させることである。いずれの場合でも、負の表面電荷に打ち勝つのに十分な力を各細胞に加えなければならない。均一な電場を単にかけるだけでは、細胞の実効電荷はゼロなので、細胞は動かない。即ち、下記の電場の定義から、力がかからない。
力＝（電場）×（電荷）
【００１２】
しかし、図１（従来技術を示す）に示すように、不均一な電場は、各細胞内部の正イオンを一方の側に、負イオンを反対側に移動させ、双極子を生成させる。一旦、双極子が誘発されると、電場の強度が一方の側よりももう一方の側でが大きくなるので、これらの究極的な力が細胞に作用する。一方向への細胞の移動によって、細胞はある区域に集中する。細胞はこの時双極子であるので、図２（従来技術を示す）に示すように、１の細胞の負の側が別の細胞の正の側を引き付け、負の表面電荷に打ち勝つ。不均一な電場は電極装置によって作られる。図１及び２（従来技術を示す）に示すように、不均一性は電極構成の関数である。
【００１３】
一般的に、融合させる細胞は、細胞を損傷したり、乱れを生じることにより融合ハイブリッドの数を減少させることがある、抵抗熱を最小限に抑えるため、低導電率培地（０．０１Ｓ／ｍ未満）に置かれる。この点で、細胞の整列及び細胞膜の接触中における加熱を低減するように、細胞融合に供する細胞を処理することが望まれる。
【００１４】
波形発生装置は２つの機能を有する。第１の機能は、ＡＣ電圧波形を生成することであり、このＡＣ電圧波形は、電極装置によってＡＣ電場に変換される。次いで、このＡＣ電場によって、細胞が整列／接触する。第２の機能は、細胞膜を電気穿孔し、細胞を融合させるパルス電圧を発することである。いくつかの事例では、融合産物が生存可能又は安定になるまで細胞を整列させておくために、融合パルスの後にさらにＡＣ電圧をかける。
【００１５】
融合が成功する要因の１つは、隣接細胞間の膜接触である。融合パルスをかける前に、この接触が密なほど、融合効率は高くなる。Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「電場誘導細胞−細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．６７、１６５〜１８２（１９８２）において、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎは、融合パルスの直前にＡＣ波電場強度を増加させることが最適の手法と思われることを指摘している。乱れ又は加熱なしで細胞膜接触を密にする融合前電場波形によって前処理することが、細胞融合を行う細胞にとって望ましいことは明らかである。
【００１６】
また、いくつかの理由から、細胞融合に付する細胞に振幅の大きな整列波形（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗａｖｅｆｏｒｍ）を即時に与えることは望ましくない。その第１の理由は、機械的な理由である。すなわち、振幅の大きな整列波形を即時にかけると、細胞に極大な力が作用し、細胞が電極に向かって急速に移動する。この急速な細胞移動は、細胞を取り巻く培地に乱れの力（ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ ｆｏｒｃｅｓ）を生じさせ、この乱れの力は、細胞の完全なパールチェーンの形成を妨げ、すでに形成されている細胞のパールチェーンを破壊する。
【００１７】
細胞融合に付する細胞に振幅の大きな整列波形を即時に与えることが望ましくない第２の理由は、このような振幅の大きな整列波形によって、細胞が懸濁している培地中で熱が発生することである。加熱によっても、整列した細胞の完全なパールチェーンの形成が妨げられ、すでに形成されているパールチェーンの破壊をもたらす乱れを生じる。加熱された培地中の熱によって、細胞の生存度も低下する。
【００１８】
上記のことを考慮すると、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避することが望まれる。
【００１９】
以上、上述の従来技術の本文で、電気穿孔パルスを用いて細胞融合を実施する前に融合前電場波形を使用することが周知であることを示したが、上述の従来技術は、以下の望ましい特徴が組み合わされた細胞融合用誘電泳動波形を教示又は示唆していない。
（１）一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形を用いて処理された細胞よりも細胞融合効率が高い融合前電場波形を細胞に与える。
（２）細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避する。
（３）細胞融合に供する前に、細胞配列を整え、細胞膜接触を密にするために、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱を低減する。
（４）細胞融合を行う前に、融合前電場波形によって処理された細胞間の細胞膜接触を密にする。
以上の所望の諸特性は、本発明における細胞融合用の独自のノンリニアー誘電泳動波形によって提供されるものであり、それらは以下の記述によって明らかになるであろう。従来技術に優る本発明の他の利点も、明確になるであろう。
【００２０】
その他の重要な米国特許としては以下のものが挙げられる。
第４，５６１，９６１号 １９８５年１２月３１日、Ｈｏｆｍａｎｎ
第５，００１，０５６号 １９９１年３月１９日、Ｓｎｙｄｅｒ他
第５，５８９，０４７号 １９９６年１２月３１日、Ｃｏｓｔｅｒ他
第５，６５０，３０５号 １９９７年７月２２日、Ｈｕｉ他
【００２１】
その他の参考文献としては以下のものが挙げられる。
１． Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ他、「電気融合によって産生されるヒトハイブリドーマ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．１４７、６４〜６８（１９８２）．
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３． Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｎ他、「生物学的誘電泳動：不均一電場における孤立細胞の挙動（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｌｏｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｎｏｎ−ｕｎｉｆｏｒｍ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ）」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２３８、１７６〜１８５（１９７４）．
４． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における絶縁破壊の直接的証明（Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ）」Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．３０ｃ、７７〜７９、１９７５．
５． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における絶縁破壊：エネルギー散逸の役割（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．３８２、４１０〜４１８、１９７５．
６． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における電気的破壊の機構（Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２２、７３〜９０、１９７５．
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８． Ａ．Ｒ．Ｍｕｒｃｈ他、「炎症性多核巨細胞が融合によって生成される直接証拠（Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉ−Ｎｕｃｌｅａｔｅ Ｇｉａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｒｍ ｂｙ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｇｒ．Ｂｒｉｔ．Ｉｒｅ．１３７、１７７〜１８０（１９８２）．
９． Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｂ他、「Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにかけられた高い電気インパルスによって誘導される細胞融合（Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｉｍｐｕｌｓｅｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）」、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６７、４１４、１９８０．
１０． Ｐｅｔｒｕｃｃｉ、一般化学： 原理及び最近の応用例（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、４ｔｈ ｅｄ．、ｐ．６２１、１９８５（月なし）．
１１． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、電場によって誘導される細胞−細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６７、ｐｐ．１６５〜１８２（１９８２）（月なし）．
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１３． Ｈ．Ａ．Ｐｏｈｌ、「誘電泳動の生物物理学的側面（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１、１〜１６（１９７３）．
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２０． Ｈ．Ｗｅｂｅｒ他、「電場効果による酵母プロトプラスト融合の促進（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ａ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｙｅａｓｔｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、Ｊｕｌ．８０．
２１． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「電場によって媒介される融合及び関連する電気的現象（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｆｉｅｌｄ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．６９４、２２７〜２７７．１９８２．
２２． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｕ．他「電気的破壊によるカラスムギ葉肉プロトプラストの融合（Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ａｖｅｎａ Ｓａｔｉｖａ Ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ Ｐｒｏｐｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．６４１、１６０〜１６５、１９８１．１９８２．
２３． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「植物プロトプラストからの葉緑体の電場誘導放出（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）」、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎ ６９、４５１（１９８２）．
２４． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「電場によって媒介される細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１０、４３〜５０（１９８２）．
２５． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、「機能が操作された細胞：細胞生物学、医薬品及び技術の新しい展望（Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ： Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０、３２５〜３４４（１９８１）．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、現行技術を改良したものである。本発明によれば、一又は複数の細胞融合／電気穿孔パルスをかける前に、細胞に、振幅が非直線的に変化するノンリニアー電圧波形をかける。本発明では、最初に、ノンリニアー電圧波をかけることによって、隣接細胞間の接線膜接触及び整列を生じさせ若しくは強制する。本発明では、次に、ノンリニアー電圧波形をさらにかけることによって、隣接細胞間の密な膜接触を生じさせ若しくは強制する。この点に関し、細胞１０は、振幅が非直線的に変化する波形の影響下で互いに圧縮される。細胞は、同様の真核細胞でもよく、異なる真核細胞でもよい。
【００２３】
振幅が非直線的に変化する融合前ノンリニアー電圧波形は、ノンリニアーＡＣ電圧波形とすることができる。ＡＣ電場波形には正弦波が含まれる。融合プロセスが細胞タイプに応じて最適化されるように、波形の振幅を変化させるノンリニアーなパラメータを設定することができる。ＡＣ波形の振幅が経時的に非直線的に変わることによって、細胞は一列に並び、より低いエネルギー（より少ない加熱）かつより高い融合効率で融合される。
【００２４】
融合前電場波形は、振幅の比較的小さい長時間の電場波形と、それに続く比較的短時間の振幅の大きい電場波形を含むことが好ましい。より具体的には、振幅の比較的小さい長時間の電場波形によって、乱れ又は細胞死を生じることなく、細胞のパールチェーンの形成及び整列が徐々に促進される。細胞が一列に並び、パールチェーンの状態になった後、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形が細胞にかけられる。細胞はすでに整列しており、短時間で、加熱が生じる前に、乱れを生じることなく細胞圧縮が起こる。
【００２５】
融合前電場波形振幅は、時間に対して段階的に非直線的な形式で変化させることができる。融合前電場波形は、時間に対して連続的に非直線的な形式で振幅を変化させることができる。
【００２６】
融合前電場波形としては、時間に対して非直線的な形式で振幅が変化するＡＣ電場波形などがある。ＡＣ電場波形の振幅は、ノンリニアーなアルゴリズムに従って時間に対して非直線的な形式で変えることができる。
【００２７】
ＡＣ電場波形は、１０ボルト／ｃｍから１，０００ボルト／ｃｍのＡＣ波形電場強度を有することが好ましい。
【００２８】
振幅が非直線的に段階的に増大する波形を、隣り合うステップ又は隣り合うステップを有しないステップの何れにおいても融合前電場波形としてかけることができる。
【００２９】
細胞に、振幅が非直線的な形式で変化する融合前電場波形をかけた後、細胞融合パルスをかける。また、細胞融合パルスをかけた後に、細胞を、ノンリニアーＡＣ電場波形で処理することができる。
【００３０】
融合前タイプでＡＣ振幅が時間とともに変化するなど、時間に対して非直線的な形式で振幅が変化するノンリニアー波形のいくつかの実施形態を挙げることができる。振幅の経時的な非直線的変化に使用できるアルゴリズムの例としては、指数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）、対数（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）、多項（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ）、べき関数（ｐｏｗｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、階段関数（ｓｔｅｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、シグモイド関数（ｓｉｇｍｏｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎ）、及び一般的なノンリニアーアルゴリズムなどがある。
【００３１】
以上の点から分かるように、本発明の一の目的は、細胞融合前の誘電泳動波形として、振幅が時間に対して非直線的な形式で変化する新しい改良されたノンリニアー融合前電場波形を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形で処理された細胞よりも、細胞にかけるＡＣ電場波形による細胞融合効率を高くする細胞融合用のノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに他の目的は、細胞融合に供する前に細胞配列を整え、細胞膜接触を密にするための、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱が抑えられている新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３４】
本発明のさらに他の目的は、細胞を細胞融合に供したときに、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避する、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに他の目的は、細胞融合を行う前に融合前電場波形で処理した細胞間の細胞膜接触を密にする、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３６】
本発明のこれら及びさらに他の目的は、本発明を特徴付ける新規な様々な特性に従って、特に、本開示に添付されその一部を成す特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明、その操作の利点、及びその使用によって達成される具体的目的をより良く理解するためには、添付した図面及び本発明の好ましい実施形態を示す記述が参照されるべきである。
【００３７】
以下の本発明の詳細な記述を検討することによって、本発明がより良く理解され、上記目的及び上記以外の目的がより明瞭になるであろう。この記述では、添付の図面を参照している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形のための方法及び装置を提供するものである。以下で、本発明の方法及び装置を、図面を参照して説明する。
【００３９】
本発明は、現行技術を改良したものである。本発明によれば、一又は複数の細胞融合パルスを適用する前に、振幅が非直線的に変化するノンリニアー電圧波形が細胞にかけられる。図６に散在する細胞１０を示す。本発明は、最初に、ノンリニアー電圧波形をかけることによって、図７に示すように、隣接細胞間の接線膜接触を生じさせ又は強制する。次いで、本発明は、ノンリニアー電圧波形をかけることによって、図８に示すように、隣接細胞間の密な膜接触を生じさせ又は強制する。図８に示すように、細胞１０は、ノンリニアー電圧波形の影響で互いに圧縮される。
【００４０】
振幅が非直線的な形式で変化するノンリニアー電圧波形は、ノンリニアーＡＣ電圧波形とすることができる。融合プロセスが細胞タイプに応じて最適化されるように、波形の非線形性パラメータを設定することができる。ＡＣ波形の振幅が経時的に非直線的に変化することによって、細胞は一列に並び、より低いエネルギー（より少ない加熱）かつより高い融合効率で融合する。
【００４１】
より具体的には、図１０のノンリニアーＡＣ電圧波形を参照すると、ノンリニアーＡＣ電圧波形は、細胞を密に近接させて整列状態にする第１の波形の部分では、比較的小さなＡＣ電圧振幅を有することが好ましい。次いで、波形の第２の部分では、融合パルスがかけられる直前まで振幅が増大される。この振幅増大によって短時間で強く不均一な電場が形成され、それによって細胞がさらに密に接触するようになる。整列のために使用される電圧が低く、高いＡＣ電圧部分が短時間であるため加熱は低減される。
【００４２】
このタイプの経時的ＡＣ振幅変化の実施形態はいくつかあり、例えば、指数、対数、多項、べき関数、階段関数、シグモイド関数、及び一般的なノンリニアーアルゴリズムなどである。
【００４３】
このノンリニアーな波形の一の実施形態は、以下の数式又はアルゴリズムによって表すことができるべき関数である。
【００４４】
時間の関数としてのＡＣ波形の振幅＝
［（時間／全ＡＣ時間）ｋ×（終了振幅−開始振幅）］−開始振幅
【００４５】
全ＡＣ波形時間、ＡＣ開始振幅、ＡＣ終了振幅及びべき指数「ｋ」はすべて、使用する細胞タイプに対して最適化される。
【００４６】
べき指数「ｋ」を変える効果を、図９のグラフに示す。「ｋ」が２の場合の特定のべき関数グラフを図１０に示す。かくして、本発明では、細胞を一列に並べるため、弱い電場を形成する振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を与え、次いで、ＡＣ波の終了直前かつ細胞融合／電気穿孔パルスの開始直前に、強い電場の振幅を形成する比較的大きい短時間の融合前電場波形を与えて、細胞を強制的に密に接触させる。この本発明による振幅の非直線的な変化手法は、加熱及び乱れも少なく、それによってさらに細胞ハイブリッドの産生及び産生効率も増大する。
【００４７】
上述したように、選択したべき関数定数「ｋ」が２であるべき関数の、融合前電場波形としてかけられる振幅が非直線的に増大する連続波形を図１０に示す。
【００４８】
図１１は、融合前電場波形としてかけられ、振幅が非直線的な形式で変化するＳ字型のノンリニアー波形を示し、この波形においては、比較的小さい長時間の融合前電場波形から、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形へ、比較的ゆっくり移行している。
【００４９】
図１２は、融合前電場波形としてかけられ、振幅が非直線的な形式で変化するＳ字型のノンリニアー波形を示し、この波形においては、振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形へ、比較的素早く移行している。
【００５０】
図１３は、融合前電場波形としてかけられ、その振幅が非直線的な形式で変化し段階的に増大するノンリニアー波形を示す。この波形においては、融合前電場波形が、隣接するステップがないステップとして与えられている。第１の融合前電場波形は振幅が比較的小さく長時間の融合前電場波形であり、オフタイムが設けられ、第２の融合前電場波形は振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形である。
【００５１】
図１４は、融合前電場波形としてかけられ、その振幅が非直線的な形式で変化し段階的に増大するノンリニアー波形を示す。この波形においては、融合前電場波形は隣接するステップを有するステップとして与えられている。第１の融合前電場波形は振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、第２の融合前電場波形は振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形であって、第１の融合前電場波形の直後にかけられる。
【００５２】
本発明は、上述したような融合前電場波形を生じる装置によって実施することができる。この点に関しては、ＰＡ−１０１ ＡＣ波形発生装置を備えたＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ ＰＡ−４０００システムにソフトウエア変更が成された。このＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（米国特許商標庁登録商標）システムソフトウエアは、現在、この波形を発生する（参照により本明細書に援用する米国特許第６，０１０，６１３号を参照されたい）。ノンリニアーＡＣ波形パラメータをユーザーが入力すると、コンピュータはＡＣ波形（融合前電場波形）及び融合パルス波形（電気穿孔波形）を発生する。
【実施例】
【００５３】
実験を実施して、振幅が非直線的な形式で変化する段階的融合前電場波形によって細胞融合が改善されることが示された。
【００５４】
Ａ５４９細胞をＡＴＣＣから購入した。この細胞を解凍し、ＡＴＣＣの推奨する培地を有する組織培養フラスコに入れた。サイトカインの混合物中で末梢血単核球を７日間培養して調製された樹状細胞を融合パートナーとして用いた。
【００５５】
８００万細胞／ミリリットルの各細胞タイプを均等に混合して、混合物中４００万細胞／ミリリットルの最終濃度の各細胞タイプを得た。細胞懸濁液体積３ミリリットルを各融合に使用した。
【００５６】
手順は以下のステップからなった。
細胞を遠心分離して、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ市販Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地（フォーミュラＣ）１０ミリリットルに再懸濁した。細胞を同じ培地で２回洗浄し、洗浄後Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地に再懸濁した。細胞をカウントし、細胞濃度を８００万細胞／ミリリットルに調節した。等体積のＡ５４９細胞と樹状細胞を混合した。細胞懸濁液３ミリリットルを、陰極から４ｍｍの間隔を置いた直径３．９ｃｍの内部円柱状陽極を有する容量６ミリリットルの同軸細胞融合電極中に入れた。
以下の細胞融合プロトコールを用いた。
【００５７】
２つの実験グループ及び１つの対照グループに対するパラメータは以下のとおりである。
グループＡ：（本発明）
第１の融合前電場波形：４５Ｖ〜４５Ｖ、２０秒、０．８ＭＨｚ
第２の融合前電場波形：７５Ｖ〜７５Ｖ、１０秒、０．８ＭＨｚ
融合／電気穿孔パルス １Ｘ８００Ｖ、４０マイクロ秒
融合後／電気穿孔パルス ４５Ｖ〜４５Ｖ、５０秒、０．８ＭＨｚ
【００５８】
グループＢ：（従来技術）
第１の融合前電場波形：７５Ｖ〜７５Ｖ、１０秒、０．８ＭＨｚ
融合／電気穿孔パルス １Ｘ８００Ｖ、４０マイクロ秒
融合後／電気穿孔パルス ４５Ｖ〜４５Ｖ、５０秒、０．８ＭＨｚ
【００５９】
グループＣ：（対照−電気なし）
融合後、細胞を３０分間静置して、融合を成熟させた。１０％ウシ胎児血清を含む組織培養培地３ミリリットルを、細胞融合電極中で細胞懸濁液に添加した。１５分後、細胞を分析するため回収した。
【００６０】
市販のＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｓｈａｎｄｏｎ）遠心分離機を用いて、シラン処理した（ｓｉｌｉｎｉｚｅｄ）顕微鏡用のスライド上に一定分量の細胞を置いた。免疫組織化学によって細胞を同定した。抗ケラチンモノクローナル抗体を用いてＡ５４９細胞を同定し、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体を用いて樹状細胞を同定した。マイヤーヘマトキシレイン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌａｉｎ）を用いて核を対比染色した。褐色ケラチン染色又は赤色ＨＬＡ−ＤＲ染色のどちらか又は両方の細胞を手動でカウントした。
【００６１】
（細胞融合前に本発明の融合前電場波形によって処理した）グループＡのＡ５４９と樹状細胞の混合物、（細胞融合前に従来技術の融合前電場波形によって処理した）グループＢのＡ５４９と樹状細胞の混合物、及び（細胞融合前に融合前電場波形による処理をまったく受けていない）グループＣのＡ５４９と樹状細胞の混合物に対する融合細胞パーセントを示した結果を下表に示す。
【表１】
【００６２】
表について説明すると、第１列には、融合処理にかけたＡ５４９細胞及び樹状細胞（ｄｅｎ．）のそれぞれのグループを示した。第２列には、Ａ５４９細胞と別のＡ５４９細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。第３列には、樹状細胞と別の樹状細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。第４列には、樹状細胞とＡ５４９細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。
【００６３】
各タイプの細胞融合（Ａ５４９／Ａ５４９、ｄｅｎ．／ｄｅｎ．及びｄｅｎ．／Ａ５４９）では、融合細胞の百分率は、（本発明の融合前電場波形を使用する）グループＡが、（従来技術の融合前電場波形を使用する）グループＢ又は（融合前電場波形を全く使用しない）グループＣのどちらよりも大きいことが注目される。より具体的には、７．２％は６．８％よりも大きく、２．２％よりも大きい。また、５．４％は４．０％よりも大きく、２．２％よりも大きい。また、２２．７％は１８．１％よりも大きく、１０．８％よりも大きい。要約すると、本発明の融合前電場波形を使用することによって、従来技術の融合前電場波形を使用するよりも、又は融合前電場波形をまったく使用しないよりも、融合効率が高くなる。
【００６４】
本発明の使用方法及び操作に関しては、以上の開示から同様であることが明らかであり、したがって、使用方法及び操作に関連するこれ以上の考察は不要である。
【００６５】
一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形によって処理された細胞よりも細胞融合効率を高める融合前電場波形を細胞に与えるために有利に使用することができる、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することによって、記載した目的のすべてを本発明が達成できることは上記より明らかである。本発明では、ノンリニアー誘電泳動波形によって、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることから生じる機械的力、乱れ及び加熱が回避される。本発明では、ノンリニアー誘電泳動波形によって、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱が減少し、細胞融合に供する前に、細胞配列が整い細胞膜接触が密になる。本発明によれば、ノンリニアー誘電泳動波形によって、細胞融合を行う前に融合前電場波形によって処理された細胞間の細胞膜接触が密になる。
【００６６】
かくして、本発明を、現時点で本発明の最も実際的で好ましい思われる実施形態との関連において、具体的かつ詳細に図面に示し十分に説明したが、本明細書に記載する原理及び概念から逸脱することなくなされる、サイズ、材料、形状、形式、機能、並びに操作、アセンブリ及び使用の方法の変更を含めて（ただしこれらだけに限定されない）、本発明の多数の変更形態が当業者には明らかなはずである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、非対称電極によって形成される不均一電場の影響下にある細胞における、従来技術による双極子の形成を示す。
【図２】図２は、非対称電極によって形成される不均一電場における、従来技術による細胞移動経路、並びに細胞のパールチェーン配列及び形成を示す。
【図３】図３は、従来技術による、一定振幅の融合前電場波形を示す。
【図４】図４は、従来技術による、振幅が直線的に増加する融合前電場波形を示す。
【図５】図５は、融合前電場波形の後に融合／電気穿孔パルスが続き、さらに融合後電場波形が続く電場波形を用いて細胞融合を実施するための一般的な従来技術の手順全般を示す。
【図６】図６は、本発明のノンリニアー誘電泳動波形をかける前の独立した細胞を示す。
【図７】図７は、本発明の振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を適用している際の、パールチェーン配列状態で接線接触している細胞を示す図である。
【図８】図８は、図７においてかけられた振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を適用した後、本発明の振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形をかけた際の、密に接触し圧縮された細胞を示す。
【図９】図９は、定数「ｋ」が変動するべき関数を用いて細胞にかけられる融合前電場波形の変化を示すグラフである。定数「ｋ」に各々の選択において、振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形部分の後に振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形部分があることに留意されたい。
【図１０】図１０は、図９の選択されたべき関数定数「ｋ」を有するべき関数と同様の融合前電場ＡＣ波形をかけた、選択された「ｋ」で変調された非直線的に増大する連続ＡＣ波形を示すグラフである。振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形部分の後に、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形部分が続いていることが示されている。
【図１１】振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形への移行が比較的遅い、融合前電場波形としてかけられたＳ字状ノンリニアー波形を示す。
【図１２】振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形への移行が比較的速い、融合前電場波形としてかけられたＳ字状ノンリニアー波形を示す。
【図１３】融合前電場波形が隣接するステップのないステップとして与えられ、第１の融合前電場波形が振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、オフタイムが設けられ、第２の融合前電場波形が振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形である、融合前電場波形としてかけられた、段階的に増大するノンリニアー波形を示す。
【図１４】融合前電場波形が隣接するステップを有するステップとして与えられ、第１の融合前電場波形が振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、第２の融合前電場波形が振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形であって第１の融合前電場波形の直後にかけられる、融合前電場波形としてかけられた、段階的に増大するノンリニアー波形を示す。
【０００１】
本願は、２００１年８月３１日に出願された同時係属中の米国仮出願第６０／３１５，９３６号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般的には、生物工学において細胞を互いに融合させる方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、細胞を電場で処理して、細胞を並べ、細胞膜の接触を密とした後、当該細胞を細胞融合に供する方法及び装置を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
中性電荷の細胞が、両方とも平面の１対の電極によって与えられるような均一な電場に置かれた場合、細胞は、両方の電極からの引力が同じなので、どちらの電極方向にも動くことはない。
【０００４】
一方、中性電荷の細胞は、両方が平面ではない２つの電極によって与えられるような不均一な電場に置かれると、図１（従来技術を示す）に示すように、細胞は双極子を形成し、より大きな引力を有する電極に引き付けられてその大きな引力を有する電極の方向に移動する。
【０００５】
このような不均一電場の利用は、誘電泳動において行なわれており、誘電泳動を用いて生細胞を並べ、その後融合／電気穿孔パルスによって細胞を融合させるという考え方は、１９７０年代初期に文献に記載されている。この方法は、治療目的のため、モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを産生するため、核融合のため、或いは他のハイブリッド細胞を産生するために、２つの異なる細胞のハイブリッドを産生するのに用いられている。誘電泳動は、生細胞などの中性電荷の粒子に電気力を付与するプロセスである。誘電泳動による電気力は、不均一な電場をかけることによって生じ、細胞内の電荷を分離させて双極子を形成させる。双極子が形成された後、細胞は、不均一な電場によって、より高い又はより低い電場強度の方向へ移動する。この移動は、培地と細胞若しくは生物学的粒子との相対的な導電率及び誘電率に依存する。誘電泳動力は、電場の２乗の関数であるので、電場極性は重要ではない。この力は、培地と粒子若しくは細胞との相対的な導電率及び誘電率の関数である。また、導電率及び誘電率は、適用した電場の周波数の関数でもある。一般に、正弦波などのＡＣ電圧波は、この交流の電場を生じさせるために電極間にかけられる。正弦波電圧、周波数及び持続時間は、個々の細胞タイプに応じて最適化される。ＡＣ波をかけて細胞を並べた後、一又は複数の融合／電気穿孔パルスをかけて、両細胞の膜が混じり合う細胞膜の通路を形成する。このような通路によって細胞の内容物を混合することを可能とし、ハイブリッド細胞が形成される。融合パルスを実施した後、さらにＡＣ電場をかけて、融合細胞が安定している間にその細胞同士を一緒に保持することができる。いくつかの例で、突発的な電場による細胞の損傷を防止するために、ＡＣ電圧を直線的に増減するものがあった。
【０００６】
細胞融合の適用例は、ハイブリドーマ産生及び核移植である。電気融合の最近の用途は、癌免疫療法のための治療用ハイブリッドを産生することである。これらのハイブリッドは、癌腫瘍細胞と免疫系樹状細胞とから、生体外プロセスによって産生される。其々の治療に多数の生存能のあるハイブリッドが必要なため、ハイブリッド産生プロセスにおいて高効率化に対する新しい要求が生じている。
【０００７】
細胞融合を実施するために利用可能な（電気的、機械的、化学的）技術がいくつかあるが、本発明は、電気的手段に関する。現在の電気技術では、電極装置に接続された電圧波形発生装置が使用されている。関連する既知の電気的、機械的及び化学的な技術に関し、以下の米国特許及び国際公開が特に関係しており、これらを参照により本明細書に援用する。
第４，３２６，９３４号 １９８２年４月２７日、Ｐｏｈｌ
第４，４４１，９７２号 １９８２年４月１０日、Ｐｏｈｌ
第４，７６４，４７３号 １９８８年８月１６日、Ｍａｔｓｃｈｋｅ他
第４，７８４，９５４号 １９８８年１１月１５日、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ
第５，３０４，４８６号 １９９４年４月１９日、Ｃｈａｎｇ
第６，０１０，６１３号 ２０００年１月４日、Ｗａｌｔｅｒｓ他
国際公開公報第００／６００６５号 ２０００年１０月１２日、Ｗａｌｔｅｒｓ他
【０００８】
これらの文献によれば、一定振幅（従来技術図３参照）又は直線的に増加する振幅（従来技術図４参照）のどちらかを有する融合前電場波形（ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｗａｖｅｆｏｒｍｓ）を使用することが知られている。図５は、電場波形を用いて細胞融合を実施する従来技術の一般的な手順の全般を示すものである。この手順においては、融合前電場波形の実施後、融合／電気穿孔パルスが実施され、さらにその後、融合後電場波形が実施される。
【０００９】
それにもかかわらず、融合前電場波形の一定の振幅又は直線的に増加する振幅による細胞融合では、細胞融合の効率が、癌免疫療法で用いられる治療用ハイブリッドの産生といった用途において要求される高い効率には達することができない。この点で、一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形を用いて処理された細胞よりも細胞融合効率の高い融合前電場波形を細胞に付与することが望まれる。
【００１０】
より具体的には、Ｃｈａｎｇの米国特許第５，３０４，４８６号において、Ｃｈａｎｇの図２Ｅに、リニアー低電圧プリサイン（ｐｒｅｓｉｎｅ）ＡＣ波形、リニアー高電圧電気穿孔用ＡＣ波形及びリニアー低電圧ポストポレーション（ｐｏｓｔ−ｐｏｒａｔｉｏｎ）ＡＣ波形が開示されていることが注目される。Ｃｈａｎｇの発明は、唯一、融合／電気穿孔パルスに限定されている。Ｃｈａｎｇは、リニアー低電圧プレサインＡＣ波形のみ開示し、ノンリニアー低電圧プレサインＡＣ波形を開示していない。Ｃｈａｎｇは、プレサインＡＣ波形という言葉を記載する以外、プレサインＡＣ波形には注意を向けていない。
【００１１】
どんな細胞融合システムにおいても第１のプロセスは、細胞を接触させることである。いずれの場合でも、負の表面電荷に打ち勝つのに十分な力を各細胞に加えなければならない。均一な電場を単にかけるだけでは、細胞の実効電荷はゼロなので、細胞は動かない。即ち、下記の電場の定義から、力がかからない。
力＝（電場）×（電荷）
【００１２】
しかし、図１（従来技術を示す）に示すように、不均一な電場は、各細胞内部の正イオンを一方の側に、負イオンを反対側に移動させ、双極子を生成させる。一旦、双極子が誘発されると、電場の強度が一方の側よりももう一方の側でが大きくなるので、これらの究極的な力が細胞に作用する。一方向への細胞の移動によって、細胞はある区域に集中する。細胞はこの時双極子であるので、図２（従来技術を示す）に示すように、１の細胞の負の側が別の細胞の正の側を引き付け、負の表面電荷に打ち勝つ。不均一な電場は電極装置によって作られる。図１及び２（従来技術を示す）に示すように、不均一性は電極構成の関数である。
【００１３】
一般的に、融合させる細胞は、細胞を損傷したり、乱れを生じることにより融合ハイブリッドの数を減少させることがある、抵抗熱を最小限に抑えるため、低導電率培地（０．０１Ｓ／ｍ未満）に置かれる。この点で、細胞の整列及び細胞膜の接触中における加熱を低減するように、細胞融合に供する細胞を処理することが望まれる。
【００１４】
波形発生装置は２つの機能を有する。第１の機能は、ＡＣ電圧波形を生成することであり、このＡＣ電圧波形は、電極装置によってＡＣ電場に変換される。次いで、このＡＣ電場によって、細胞が整列／接触する。第２の機能は、細胞膜を電気穿孔し、細胞を融合させるパルス電圧を発することである。いくつかの事例では、融合産物が生存可能又は安定になるまで細胞を整列させておくために、融合パルスの後にさらにＡＣ電圧をかける。
【００１５】
融合が成功する要因の１つは、隣接細胞間の膜接触である。融合パルスをかける前に、この接触が密なほど、融合効率は高くなる。Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「電場誘導細胞−細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．６７、１６５〜１８２（１９８２）において、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎは、融合パルスの直前にＡＣ波電場強度を増加させることが最適の手法と思われることを指摘している。乱れ又は加熱なしで細胞膜接触を密にする融合前電場波形によって前処理することが、細胞融合を行う細胞にとって望ましいことは明らかである。
【００１６】
また、いくつかの理由から、細胞融合に付する細胞に振幅の大きな整列波形（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗａｖｅｆｏｒｍ）を即時に与えることは望ましくない。その第１の理由は、機械的な理由である。すなわち、振幅の大きな整列波形を即時にかけると、細胞に極大な力が作用し、細胞が電極に向かって急速に移動する。この急速な細胞移動は、細胞を取り巻く培地に乱れの力（ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ ｆｏｒｃｅｓ）を生じさせ、この乱れの力は、細胞の完全なパールチェーンの形成を妨げ、すでに形成されている細胞のパールチェーンを破壊する。
【００１７】
細胞融合に付する細胞に振幅の大きな整列波形を即時に与えることが望ましくない第２の理由は、このような振幅の大きな整列波形によって、細胞が懸濁している培地中で熱が発生することである。加熱によっても、整列した細胞の完全なパールチェーンの形成が妨げられ、すでに形成されているパールチェーンの破壊をもたらす乱れを生じる。加熱された培地中の熱によって、細胞の生存度も低下する。
【００１８】
上記のことを考慮すると、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避することが望まれる。
【００１９】
以上、上述の従来技術の本文で、電気穿孔パルスを用いて細胞融合を実施する前に融合前電場波形を使用することが周知であることを示したが、上述の従来技術は、以下の望ましい特徴が組み合わされた細胞融合用誘電泳動波形を教示又は示唆していない。
（１）一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形を用いて処理された細胞よりも細胞融合効率が高い融合前電場波形を細胞に与える。
（２）細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避する。
（３）細胞融合に供する前に、細胞配列を整え、細胞膜接触を密にするために、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱を低減する。
（４）細胞融合を行う前に、融合前電場波形によって処理された細胞間の細胞膜接触を密にする。
以上の所望の諸特性は、本発明における細胞融合用の独自のノンリニアー誘電泳動波形によって提供されるものであり、それらは以下の記述によって明らかになるであろう。従来技術に優る本発明の他の利点も、明確になるであろう。
【００２０】
その他の重要な米国特許としては以下のものが挙げられる。
第４，５６１，９６１号 １９８５年１２月３１日、Ｈｏｆｍａｎｎ
第５，００１，０５６号 １９９１年３月１９日、Ｓｎｙｄｅｒ他
第５，５８９，０４７号 １９９６年１２月３１日、Ｃｏｓｔｅｒ他
第５，６５０，３０５号 １９９７年７月２２日、Ｈｕｉ他
【００２１】
その他の参考文献としては以下のものが挙げられる。
１． Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ他、「電気融合によって産生されるヒトハイブリドーマ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．１４７、６４〜６８（１９８２）．
２． Ｌ．Ｃｈａｎｇｂｅｎ他、「細胞融合による動物細胞への１２５．ｓｕｂ．Ｉ−ＢＳＡ及び１２５．ｓｕｂ．Ｉ−ＤＮＡの導入のためのヒト赤血球ゴーストの使用（Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｇｈｏｓｔｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ １２５．ｓｕｂ．Ｉ−ＢＳＡ ａｎｄ １２５．ｓｕｂ．Ｉ−ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ）２５、６８０〜８６５（１９８２）．
３． Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｎ他、「生物学的誘電泳動：不均一電場における孤立細胞の挙動（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｌｏｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｎｏｎ−ｕｎｉｆｏｒｍ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ）」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２３８、１７６〜１８５（１９７４）．
４． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における絶縁破壊の直接的証明（Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ）」Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．３０ｃ、７７〜７９、１９７５．
５． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における絶縁破壊：エネルギー散逸の役割（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．３８２、４１０〜４１８、１９７５．
６． Ｃｏｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｌ．及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓの膜における電気的破壊の機構（Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｖａｌｏｎｉａ ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２２、７３〜９０、１９７５．
７． Ｋ．Ｋａｌｅｒ他、「個体生細胞の動的誘電泳動レビテーション（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．８、１８〜３１（１９８０）．
８． Ａ．Ｒ．Ｍｕｒｃｈ他、「炎症性多核巨細胞が融合によって生成される直接証拠（Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉ−Ｎｕｃｌｅａｔｅ Ｇｉａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｒｍ ｂｙ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｇｒ．Ｂｒｉｔ．Ｉｒｅ．１３７、１７７〜１８０（１９８２）．
９． Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｂ他、「Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにかけられた高い電気インパルスによって誘導される細胞融合（Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｉｍｐｕｌｓｅｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）」、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６７、４１４、１９８０．
１０． Ｐｅｔｒｕｃｃｉ、一般化学： 原理及び最近の応用例（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、４ｔｈ ｅｄ．、ｐ．６２１、１９８５（月なし）．
１１． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、電場によって誘導される細胞−細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６７、ｐｐ．１６５〜１８２（１９８２）（月なし）．
１２． Ｐｏｈｌ，Ｈ．「誘電泳動（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９７８．
１３． Ｈ．Ａ．Ｐｏｈｌ、「誘電泳動の生物物理学的側面（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１、１〜１６（１９７３）．
１４． Ｈ．Ａ．Ｐｏｈｌ他、「細胞混合物の連続誘電泳動分離（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）」、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１、１５〜２８（１９７９）．
１５． Ｈ．Ａ．Ｐｏｈｌ他、「誘電泳動力（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｆｏｒｃｅ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．６、１３３（１９７８）．
１６． Ｈ．Ａ．Ｐｏｈｌ他、「微生物の正及び負の連続誘電泳動（Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｐｈｙｓ．９、６７〜８６（１９８１）．
１７． Ｓａｌｅ，Ｊ．Ｈ．及びＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．「微生物に対する高い電場の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．１６３、３７〜４３、１９６８．
１８． Ｓｅｐｅｒｓｕ，Ｅ．Ｈ．、Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｋ．及びＴｓｏｎｇ，Ｔ．Ｙ．「電場による赤血球膜透過性の可逆的及び不可逆的改変（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ）」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．８１２、７７９〜７８５、１９８５．
１９． Ｊ．Ｖｉｅｎｋｅｎ他、「電場によって誘導される融合：ヘテロカリオン細胞の高収率産生のための電気水力学的操作（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｕｓｉｏｎ：Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ）」、Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．１３７、１１〜１３（１９８２）．
２０． Ｈ．Ｗｅｂｅｒ他、「電場効果による酵母プロトプラスト融合の促進（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ａ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｙｅａｓｔｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、Ｊｕｌ．８０．
２１． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．「電場によって媒介される融合及び関連する電気的現象（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｆｉｅｌｄ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．６９４、２２７〜２７７．１９８２．
２２． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｕ．他「電気的破壊によるカラスムギ葉肉プロトプラストの融合（Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ａｖｅｎａ Ｓａｔｉｖａ Ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ Ｐｒｏｐｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．６４１、１６０〜１６５、１９８１．１９８２．
２３． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「植物プロトプラストからの葉緑体の電場誘導放出（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）」、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎ ６９、４５１（１９８２）．
２４． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他、「電場によって媒介される細胞融合（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１０、４３〜５０（１９８２）．
２５． Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、「機能が操作された細胞：細胞生物学、医薬品及び技術の新しい展望（Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ： Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０、３２５〜３４４（１９８１）．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、現行技術を改良したものである。本発明によれば、一又は複数の細胞融合／電気穿孔パルスをかける前に、細胞に、振幅が非直線的に変化するノンリニアー電圧波形をかける。本発明では、最初に、ノンリニアー電圧波をかけることによって、隣接細胞間の接線膜接触及び整列を生じさせ若しくは強制する。本発明では、次に、ノンリニアー電圧波形をさらにかけることによって、隣接細胞間の密な膜接触を生じさせ若しくは強制する。この点に関し、細胞１０は、振幅が非直線的に変化する波形の影響下で互いに圧縮される。細胞は、同様の真核細胞でもよく、異なる真核細胞でもよい。
【００２３】
振幅が非直線的に変化する融合前ノンリニアー電圧波形は、ノンリニアーＡＣ電圧波形とすることができる。ＡＣ電場波形には正弦波が含まれる。融合プロセスが細胞タイプに応じて最適化されるように、波形の振幅を変化させるノンリニアーなパラメータを設定することができる。ＡＣ波形の振幅が経時的に非直線的に変わることによって、細胞は一列に並び、より低いエネルギー（より少ない加熱）かつより高い融合効率で融合される。
【００２４】
融合前電場波形は、振幅の比較的小さい長時間の電場波形と、それに続く比較的短時間の振幅の大きい電場波形を含むことが好ましい。より具体的には、振幅の比較的小さい長時間の電場波形によって、乱れ又は細胞死を生じることなく、細胞のパールチェーンの形成及び整列が徐々に促進される。細胞が一列に並び、パールチェーンの状態になった後、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形が細胞にかけられる。細胞はすでに整列しており、短時間で、加熱が生じる前に、乱れを生じることなく細胞圧縮が起こる。
【００２５】
融合前電場波形振幅は、時間に対して段階的に非直線的な形式で変化させることができる。融合前電場波形は、時間に対して連続的に非直線的な形式で振幅を変化させることができる。
【００２６】
融合前電場波形としては、時間に対して非直線的な形式で振幅が変化するＡＣ電場波形などがある。ＡＣ電場波形の振幅は、ノンリニアーなアルゴリズムに従って時間に対して非直線的な形式で変えることができる。
【００２７】
ＡＣ電場波形は、１０ボルト／ｃｍから１，０００ボルト／ｃｍのＡＣ波形電場強度を有することが好ましい。
【００２８】
振幅が非直線的に段階的に増大する波形を、隣り合うステップ又は隣り合うステップを有しないステップの何れにおいても融合前電場波形としてかけることができる。
【００２９】
細胞に、振幅が非直線的な形式で変化する融合前電場波形をかけた後、細胞融合パルスをかける。また、細胞融合パルスをかけた後に、細胞を、ノンリニアーＡＣ電場波形で処理することができる。
【００３０】
融合前タイプでＡＣ振幅が時間とともに変化するなど、時間に対して非直線的な形式で振幅が変化するノンリニアー波形のいくつかの実施形態を挙げることができる。振幅の経時的な非直線的変化に使用できるアルゴリズムの例としては、指数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）、対数（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）、多項（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ）、べき関数（ｐｏｗｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、階段関数（ｓｔｅｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、シグモイド関数（ｓｉｇｍｏｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎ）、及び一般的なノンリニアーアルゴリズムなどがある。
【００３１】
以上の点から分かるように、本発明の一の目的は、細胞融合前の誘電泳動波形として、振幅が時間に対して非直線的な形式で変化する新しい改良されたノンリニアー融合前電場波形を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形で処理された細胞よりも、細胞にかけるＡＣ電場波形による細胞融合効率を高くする細胞融合用のノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに他の目的は、細胞融合に供する前に細胞配列を整え、細胞膜接触を密にするための、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱が抑えられている新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３４】
本発明のさらに他の目的は、細胞を細胞融合に供したときに、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることによって生じる機械的な力、乱れ及び加熱を回避する、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに他の目的は、細胞融合を行う前に融合前電場波形で処理した細胞間の細胞膜接触を密にする、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することである。
【００３６】
本発明のこれら及びさらに他の目的は、本発明を特徴付ける新規な様々な特性に従って、特に、本開示に添付されその一部を成す特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明、その操作の利点、及びその使用によって達成される具体的目的をより良く理解するためには、添付した図面及び本発明の好ましい実施形態を示す記述が参照されるべきである。
【００３７】
以下の本発明の詳細な記述を検討することによって、本発明がより良く理解され、上記目的及び上記以外の目的がより明瞭になるであろう。この記述では、添付の図面を参照している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形のための方法及び装置を提供するものである。以下で、本発明の方法及び装置を、図面を参照して説明する。
【００３９】
本発明は、現行技術を改良したものである。本発明によれば、一又は複数の細胞融合パルスを適用する前に、振幅が非直線的に変化するノンリニアー電圧波形が細胞にかけられる。図６に散在する細胞１０を示す。本発明は、最初に、ノンリニアー電圧波形をかけることによって、図７に示すように、隣接細胞間の接線膜接触を生じさせ又は強制する。次いで、本発明は、ノンリニアー電圧波形をかけることによって、図８に示すように、隣接細胞間の密な膜接触を生じさせ又は強制する。図８に示すように、細胞１０は、ノンリニアー電圧波形の影響で互いに圧縮される。
【００４０】
振幅が非直線的な形式で変化するノンリニアー電圧波形は、ノンリニアーＡＣ電圧波形とすることができる。融合プロセスが細胞タイプに応じて最適化されるように、波形の非線形性パラメータを設定することができる。ＡＣ波形の振幅が経時的に非直線的に変化することによって、細胞は一列に並び、より低いエネルギー（より少ない加熱）かつより高い融合効率で融合する。
【００４１】
より具体的には、図１０のノンリニアーＡＣ電圧波形を参照すると、ノンリニアーＡＣ電圧波形は、細胞を密に近接させて整列状態にする第１の波形の部分では、比較的小さなＡＣ電圧振幅を有することが好ましい。次いで、波形の第２の部分では、融合パルスがかけられる直前まで振幅が増大される。この振幅増大によって短時間で強く不均一な電場が形成され、それによって細胞がさらに密に接触するようになる。整列のために使用される電圧が低く、高いＡＣ電圧部分が短時間であるため加熱は低減される。
【００４２】
このタイプの経時的ＡＣ振幅変化の実施形態はいくつかあり、例えば、指数、対数、多項、べき関数、階段関数、シグモイド関数、及び一般的なノンリニアーアルゴリズムなどである。
【００４３】
このノンリニアーな波形の一の実施形態は、以下の数式又はアルゴリズムによって表すことができるべき関数である。
【００４４】
時間の関数としてのＡＣ波形の振幅＝
［（時間／全ＡＣ時間）ｋ×（終了振幅−開始振幅）］−開始振幅
【００４５】
全ＡＣ波形時間、ＡＣ開始振幅、ＡＣ終了振幅及びべき指数「ｋ」はすべて、使用する細胞タイプに対して最適化される。
【００４６】
べき指数「ｋ」を変える効果を、図９のグラフに示す。「ｋ」が２の場合の特定のべき関数グラフを図１０に示す。かくして、本発明では、細胞を一列に並べるため、弱い電場を形成する振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を与え、次いで、ＡＣ波の終了直前かつ細胞融合／電気穿孔パルスの開始直前に、強い電場の振幅を形成する比較的大きい短時間の融合前電場波形を与えて、細胞を強制的に密に接触させる。この本発明による振幅の非直線的な変化手法は、加熱及び乱れも少なく、それによってさらに細胞ハイブリッドの産生及び産生効率も増大する。
【００４７】
上述したように、選択したべき関数定数「ｋ」が２であるべき関数の、融合前電場波形としてかけられる振幅が非直線的に増大する連続波形を図１０に示す。
【００４８】
図１１は、融合前電場波形としてかけられ、振幅が非直線的な形式で変化するＳ字型のノンリニアー波形を示し、この波形においては、比較的小さい長時間の融合前電場波形から、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形へ、比較的ゆっくり移行している。
【００４９】
図１２は、融合前電場波形としてかけられ、振幅が非直線的な形式で変化するＳ字型のノンリニアー波形を示し、この波形においては、振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形へ、比較的素早く移行している。
【００５０】
図１３は、融合前電場波形としてかけられ、その振幅が非直線的な形式で変化し段階的に増大するノンリニアー波形を示す。この波形においては、融合前電場波形が、隣接するステップがないステップとして与えられている。第１の融合前電場波形は振幅が比較的小さく長時間の融合前電場波形であり、オフタイムが設けられ、第２の融合前電場波形は振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形である。
【００５１】
図１４は、融合前電場波形としてかけられ、その振幅が非直線的な形式で変化し段階的に増大するノンリニアー波形を示す。この波形においては、融合前電場波形は隣接するステップを有するステップとして与えられている。第１の融合前電場波形は振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、第２の融合前電場波形は振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形であって、第１の融合前電場波形の直後にかけられる。
【００５２】
本発明は、上述したような融合前電場波形を生じる装置によって実施することができる。この点に関しては、ＰＡ−１０１ ＡＣ波形発生装置を備えたＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ ＰＡ−４０００システムにソフトウエア変更が成された。このＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（米国特許商標庁登録商標）システムソフトウエアは、現在、この波形を発生する（参照により本明細書に援用する米国特許第６，０１０，６１３号を参照されたい）。ノンリニアーＡＣ波形パラメータをユーザーが入力すると、コンピュータはＡＣ波形（融合前電場波形）及び融合パルス波形（電気穿孔波形）を発生する。
【実施例】
【００５３】
実験を実施して、振幅が非直線的な形式で変化する段階的融合前電場波形によって細胞融合が改善されることが示された。
【００５４】
Ａ５４９細胞をＡＴＣＣから購入した。この細胞を解凍し、ＡＴＣＣの推奨する培地を有する組織培養フラスコに入れた。サイトカインの混合物中で末梢血単核球を７日間培養して調製された樹状細胞を融合パートナーとして用いた。
【００５５】
８００万細胞／ミリリットルの各細胞タイプを均等に混合して、混合物中４００万細胞／ミリリットルの最終濃度の各細胞タイプを得た。細胞懸濁液体積３ミリリットルを各融合に使用した。
【００５６】
手順は以下のステップからなった。
細胞を遠心分離して、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ市販Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地（フォーミュラＣ）１０ミリリットルに再懸濁した。細胞を同じ培地で２回洗浄し、洗浄後Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地に再懸濁した。細胞をカウントし、細胞濃度を８００万細胞／ミリリットルに調節した。等体積のＡ５４９細胞と樹状細胞を混合した。細胞懸濁液３ミリリットルを、陰極から４ｍｍの間隔を置いた直径３．９ｃｍの内部円柱状陽極を有する容量６ミリリットルの同軸細胞融合電極中に入れた。
以下の細胞融合プロトコールを用いた。
【００５７】
２つの実験グループ及び１つの対照グループに対するパラメータは以下のとおりである。
グループＡ：（本発明）
第１の融合前電場波形：４５Ｖ〜４５Ｖ、２０秒、０．８ＭＨｚ
第２の融合前電場波形：７５Ｖ〜７５Ｖ、１０秒、０．８ＭＨｚ
融合／電気穿孔パルス １Ｘ８００Ｖ、４０マイクロ秒
融合後／電気穿孔パルス ４５Ｖ〜４５Ｖ、５０秒、０．８ＭＨｚ
【００５８】
グループＢ：（従来技術）
第１の融合前電場波形：７５Ｖ〜７５Ｖ、１０秒、０．８ＭＨｚ
融合／電気穿孔パルス １Ｘ８００Ｖ、４０マイクロ秒
融合後／電気穿孔パルス ４５Ｖ〜４５Ｖ、５０秒、０．８ＭＨｚ
【００５９】
グループＣ：（対照−電気なし）
融合後、細胞を３０分間静置して、融合を成熟させた。１０％ウシ胎児血清を含む組織培養培地３ミリリットルを、細胞融合電極中で細胞懸濁液に添加した。１５分後、細胞を分析するため回収した。
【００６０】
市販のＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｓｈａｎｄｏｎ）遠心分離機を用いて、シラン処理した（ｓｉｌｉｎｉｚｅｄ）顕微鏡用のスライド上に一定分量の細胞を置いた。免疫組織化学によって細胞を同定した。抗ケラチンモノクローナル抗体を用いてＡ５４９細胞を同定し、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体を用いて樹状細胞を同定した。マイヤーヘマトキシレイン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌａｉｎ）を用いて核を対比染色した。褐色ケラチン染色又は赤色ＨＬＡ−ＤＲ染色のどちらか又は両方の細胞を手動でカウントした。
【００６１】
（細胞融合前に本発明の融合前電場波形によって処理した）グループＡのＡ５４９と樹状細胞の混合物、（細胞融合前に従来技術の融合前電場波形によって処理した）グループＢのＡ５４９と樹状細胞の混合物、及び（細胞融合前に融合前電場波形による処理をまったく受けていない）グループＣのＡ５４９と樹状細胞の混合物に対する融合細胞パーセントを示した結果を下表に示す。
【表１】
表について説明すると、第１列には、融合処理にかけたＡ５４９細胞及び樹状細胞（ｄｅｎ．）のそれぞれのグループを示した。第２列には、Ａ５４９細胞と別のＡ５４９細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。第３列には、樹状細胞と別の樹状細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。第４列には、樹状細胞とＡ５４９細胞との融合によって形成された融合細胞の百分率を示した。
【００６３】
各タイプの細胞融合（Ａ５４９／Ａ５４９、ｄｅｎ．／ｄｅｎ．及びｄｅｎ．／Ａ５４９）では、融合細胞の百分率は、（本発明の融合前電場波形を使用する）グループＡが、（従来技術の融合前電場波形を使用する）グループＢ又は（融合前電場波形を全く使用しない）グループＣのどちらよりも大きいことが注目される。より具体的には、７．２％は６．８％よりも大きく、２．２％よりも大きい。また、５．４％は４．０％よりも大きく、２．２％よりも大きい。また、２２．７％は１８．１％よりも大きく、１０．８％よりも大きい。要約すると、本発明の融合前電場波形を使用することによって、従来技術の融合前電場波形を使用するよりも、又は融合前電場波形をまったく使用しないよりも、融合効率が高くなる。
【００６４】
本発明の使用方法及び操作に関しては、以上の開示から同様であることが明らかであり、したがって、使用方法及び操作に関連するこれ以上の考察は不要である。
【００６５】
一定の振幅又は直線的に増加する振幅の融合前電場波形によって処理された細胞よりも細胞融合効率を高める融合前電場波形を細胞に与えるために有利に使用することができる、新規な改良された細胞融合用ノンリニアー誘電泳動波形を提供することによって、記載した目的のすべてを本発明が達成できることは上記より明らかである。本発明では、ノンリニアー誘電泳動波形によって、細胞融合を行う細胞に振幅の大きい整列波形を即時にかけることから生じる機械的力、乱れ及び加熱が回避される。本発明では、ノンリニアー誘電泳動波形によって、融合前電場波形によって処理される細胞の加熱が減少し、細胞融合に供する前に、細胞配列が整い細胞膜接触が密になる。本発明によれば、ノンリニアー誘電泳動波形によって、細胞融合を行う前に融合前電場波形によって処理された細胞間の細胞膜接触が密になる。
【００６６】
かくして、本発明を、現時点で本発明の最も実際的で好ましい思われる実施形態との関連において、具体的かつ詳細に図面に示し十分に説明したが、本明細書に記載する原理及び概念から逸脱することなくなされる、サイズ、材料、形状、形式、機能、並びに操作、アセンブリ及び使用の方法の変更を含めて（ただしこれらだけに限定されない）、本発明の多数の変更形態が当業者には明らかなはずである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、非対称電極によって形成される不均一電場の影響下にある細胞における、従来技術による双極子の形成を示す。
【図２】図２は、非対称電極によって形成される不均一電場における、従来技術による細胞移動経路、並びに細胞のパールチェーン配列及び形成を示す。
【図３】図３は、従来技術による、一定振幅の融合前電場波形を示す。
【図４】図４は、従来技術による、振幅が直線的に増加する融合前電場波形を示す。
【図５】図５は、融合前電場波形の後に融合／電気穿孔パルスが続き、さらに融合後電場波形が続く電場波形を用いて細胞融合を実施するための一般的な従来技術の手順全般を示す。
【図６】図６は、本発明のノンリニアー誘電泳動波形をかける前の独立した細胞を示す。
【図７】図７は、本発明の振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を適用している際の、パールチェーン配列状態で接線接触している細胞を示す図である。
【図８】図８は、図７においてかけられた振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形を適用した後、本発明の振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形をかけた際の、密に接触し圧縮された細胞を示す。
【図９】図９は、定数「ｋ」が変動するべき関数を用いて細胞にかけられる融合前電場波形の変化を示すグラフである。定数「ｋ」に各々の選択において、振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形部分の後に振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形部分があることに留意されたい。
【図１０】図１０は、図９の選択されたべき関数定数「ｋ」を有するべき関数と同様の融合前電場ＡＣ波形をかけた、選択された「ｋ」で変調された非直線的に増大する連続ＡＣ波形を示すグラフである。振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形部分の後に、振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形部分が続いていることが示されている。
【図１１】振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形への移行が比較的遅い、融合前電場波形としてかけられたＳ字状ノンリニアー波形を示す。
【図１２】振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形から振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形への移行が比較的速い、融合前電場波形としてかけられたＳ字状ノンリニアー波形を示す。
【図１３】融合前電場波形が隣接するステップのないステップとして与えられ、第１の融合前電場波形が振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、オフタイムが設けられ、第２の融合前電場波形が振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形である、融合前電場波形としてかけられた、段階的に増大するノンリニアー波形を示す。
【図１４】融合前電場波形が隣接するステップを有するステップとして与えられ、第１の融合前電場波形が振幅の比較的小さい長時間の融合前電場波形であり、第２の融合前電場波形が振幅の比較的大きい短時間の融合前電場波形であって第１の融合前電場波形の直後にかけられる、融合前電場波形としてかけられた、段階的に増大するノンリニアー波形を示す。
Claims (11)
- 細胞を一又は複数の細胞融合／電気穿孔パルスに供する前の細胞の処理方法であって、
時間に対して非直線的な形式で振幅を変化させた融合前電場波形（ａ ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｗａｖｅｆｏｒｍ）によって、前記細胞を処理するステップを含む、上記処理方法。 - 最初に、前記細胞を並べ、次いで圧縮して、細胞融合に供される前に細胞膜接触を密にする、請求項１に記載の方法。
- 前記融合前電場波形の振幅が、振幅の比較的小さい長時間の電場波形とそれに続く振幅の比較的大きい短時間の電場波形とを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記融合前電場波形の振幅が、時間に対して段階的に非直線的な形式で変化する、請求項１に記載の方法。
- 前記融合前電場波形の振幅が、時間に対して連続的に非直線的な形式で変化する、請求項１に記載の方法。
- 前記融合前電場波形が、時間に対して非直線的な形式で振幅が変化するＡＣ電場波形を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ＡＣ電場波形の振幅が、ノンリニアーアルゴリズムに従って、時間に対して非直線的な形式で変化する、請求項６に記載の方法。
- 前記ＡＣ電場波形のＡＣ波形電場強度が、１０ボルト／ｃｍ〜１，０００ボルト／ｃｍである、請求項６に記載の方法。
- 前記融合前電場波形の振幅が、融合前電場波形として適用される、非直線的に段階的に増大する波形を含み、前記波形が隣り合うステップ（ａｄｊａｃｅｎｔ ｓｔｅｐｓ）又は隣り合うステップの無いステップ（ｎｏｎ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｓｔｅｐｓ）として与えられる、請求項１に記載の方法。
- さらに、前記細胞を細胞融合パルスに供するステップと、
前記細胞融合パルスの後に、ＡＣ電場波形によって前記細胞を処理するステップとを含む、請求項１に記載の方法。 - 細胞を細胞融合に供する前の細胞の処理方法であって、
前記細胞が一列に並び、細胞膜接触が密になり、細胞融合に供される前に互いに圧縮されるように、時間に対して非直線的な形式で変化する電場振幅によって前記細胞を処理するステップを含む、上記処理方法。
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