JP2002536346A - ｐｐ３２の機能の回復により癌を治療する方法 - Google Patents
ｐｐ３２の機能の回復により癌を治療する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
正常pp32の活性あるいは発現を欠いている細胞において、pp32の機能を回復させることにより、現存する癌を治療するためのあるいは癌形成を防ぐための方法を提供する。方法は、正常pp32を発現するDNAの細胞へのトランスフェクション、pp32活性化の誘導物質の投与および／またはpp32により阻害される核ホスファターゼの阻害のいずれかによるpp32の回復を提供する。
Description
【０００１】 本発明に至る研究は、一部、National Institutes of Healthのグラント番号R
o1 CA 54404により支持を受けた。米国政府は本発明において特定の権利を保有
している。
o1 CA 54404により支持を受けた。米国政府は本発明において特定の権利を保有
している。
【０００２】 背景 発明の属する技術分野 本発明は、形質転換をモジュレートする活性を有する遺伝子ファミリーの様々
な構成員に関し、変異体を基にした診断および遺伝子療法の技術に関する。
な構成員に関し、変異体を基にした診断および遺伝子療法の技術に関する。
【０００３】 関連する技術の概観 前立腺腺癌は、成人男性では最も頻繁な悪性腫瘍であり、毎年約317,000人の
新患が診断される（Parkerら, CA, 46:8-27, 1996）。早期診断および治療が可
能（Potosky, et al., JAMA, 273:548-552, 1995）であるにもかかわらず、前立
腺腺癌は肺癌に次いで男性の癌による死因の2番目を示している。
新患が診断される（Parkerら, CA, 46:8-27, 1996）。早期診断および治療が可
能（Potosky, et al., JAMA, 273:548-552, 1995）であるにもかかわらず、前立
腺腺癌は肺癌に次いで男性の癌による死因の2番目を示している。
【０００４】 現在まで、特異的な遺伝子における変異の研究による、原発性の前立腺癌に対
する影響は特になかった。広く研究されている腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子
における大半の変異は、過剰発現がそれらの症例の50-60％程度に観察されるmyc
遺伝子の場合を（Flemingら, Cancer Res., 46:1535-1538, 1986）除き、原発性
の前立腺癌の20-30％にしか起きていない。競合ゲノムハイブリダイゼーション
により研究される原発性の前立腺癌の40％にまで染色体の異常型が示されるが（
Visakorpiら, Cancer Res., 55:342-347, 1995）、その変異は腫瘍の再発時にさ
らに頻繁に起こり、ホルモン療法に対して難治性となる。そのような変異した座
位における候補（candidate）癌原遺伝子あるいは腫瘍抑制遺伝子の特徴により
、前立腺における腫瘍の進行が最終的に解明されるかもしれない。
する影響は特になかった。広く研究されている腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子
における大半の変異は、過剰発現がそれらの症例の50-60％程度に観察されるmyc
遺伝子の場合を（Flemingら, Cancer Res., 46:1535-1538, 1986）除き、原発性
の前立腺癌の20-30％にしか起きていない。競合ゲノムハイブリダイゼーション
により研究される原発性の前立腺癌の40％にまで染色体の異常型が示されるが（
Visakorpiら, Cancer Res., 55:342-347, 1995）、その変異は腫瘍の再発時にさ
らに頻繁に起こり、ホルモン療法に対して難治性となる。そのような変異した座
位における候補（candidate）癌原遺伝子あるいは腫瘍抑制遺伝子の特徴により
、前立腺における腫瘍の進行が最終的に解明されるかもしれない。
【０００５】 pp32（GenBank HSU73477）は高度に保存された核リンタンパク質である。pp32
あるいは密接に関連する種の発現の増加は、臨床的な癌のよくある特徴である。
例えば、ヒトの前立腺癌では、pp32プローブとハイブリダイズするRNAの高レベ
ルの発現が、その他の腫瘍遺伝子あるいは腫瘍抑制遺伝子の十分に低い頻度の変
異と比較して、臨床的に重大な前立腺癌の90％近くにおいて起きている（本明細
書中で参考文献として援用される、米国特許No. 5,726,018を参照）。
あるいは密接に関連する種の発現の増加は、臨床的な癌のよくある特徴である。
例えば、ヒトの前立腺癌では、pp32プローブとハイブリダイズするRNAの高レベ
ルの発現が、その他の腫瘍遺伝子あるいは腫瘍抑制遺伝子の十分に低い頻度の変
異と比較して、臨床的に重大な前立腺癌の90％近くにおいて起きている（本明細
書中で参考文献として援用される、米国特許No. 5,726,018を参照）。
【０００６】 pp32の分子的特徴および活性 pp32は、成人の前立腺上皮が分化する間に分化-制御型の核リンタンパク質で
ある（Walenskyら, Cancer Res. 53:4720-4726, 1993）。ヒトpp32 cDNA配列（G
en-Bank U73477）は、1052 bpの長さであり、249アミノ酸のタンパク質をコード
している。タンパク質は2つのドメインで構成される：ロイシンジッパーを含有
する両親媒性のアミノ末端のα-ヘリックス領域、および高度に酸性のカルボキ
シル末端領域である。マウスおよびヒトのpp32の型は高度に保存されており、90
％以上の核酸の相同性および95％以上のタンパク質レベルの相同性を有する。
ある（Walenskyら, Cancer Res. 53:4720-4726, 1993）。ヒトpp32 cDNA配列（G
en-Bank U73477）は、1052 bpの長さであり、249アミノ酸のタンパク質をコード
している。タンパク質は2つのドメインで構成される：ロイシンジッパーを含有
する両親媒性のアミノ末端のα-ヘリックス領域、および高度に酸性のカルボキ
シル末端領域である。マウスおよびヒトのpp32の型は高度に保存されており、90
％以上の核酸の相同性および95％以上のタンパク質レベルの相同性を有する。
【０００７】 ヒトpp32は多くのグループにより独自に単離されている。Vaesenら（“Purifi
cation and characterization of two putative HLA class II associated prot
ein: PHAPI and PHAPII.” Biol. Chem. Hoppe-Seyler., 375:113-126, 1994）
は、EBV-形質転換ヒトB-リンパ芽球細胞株から、PHPAIと名付けた必須な等価分
子をクローンした；同様なストラテジーでクローン化されたPHAPIIはpp32とは無
関係である。この研究では、溶液中でのヒトHLAクラスIIタンパク質との結合に
よりPHAPIを同定し、核と同様に膜および細胞質の局在性を示した；遺伝子は蛍
光in situハイブリダイゼーションにより、染色体15q22.3-q23に位置していると
推定される（Finkら, “Localization of the gene encoding the putative hum
an HLA class II-associated protein (PHAPI) to chromosome 15q22.3-q23 by
fluorescence in situ hybridization.” Genomics, 29:309-310, 1995）。さら
に最近、タンパク質ホスファターゼの阻害因子を研究していたグループが、タン
パク質ホスファターゼ2aの阻害因子、I1PP2a、としてpp32を同定した（Liら, “
Molecular Identification of I1PP2A, a novel potent heat-stable inhibitor
protein of protein phosphatase 2A.” Biochemistry 35:6998-7002, 1996）
；もう一つのホスファターゼ阻害因子、I2PP2a、はpp32とは関係ない。興味深い
ことに、もう一つの最近の報告（Ulitzurら, “Biochemical characterization
of mapmodulin, a protein that binds microtubule-associated proteins.” J
ournal of Biological Chemistry 272: 30577-30582, 1997）は、CHO細胞におい
て細胞骨格-関連サイトゾルタンパク質としてpp32を同定した。この発見が系の
違いに由来するのかどうか、あるいはpp32はある環境下では細胞質に位置しうる
のかどうかは明らかではない。pp32は中枢神経系におけるロイシンリッチ核タン
パク質、LANP、としても同定されている（Matsuokaら, “A nuclear factor con
taining the leucine-rich repeats expressed in murine cerebellar neurons.
” Proc Natl Acad Sci USA 91:9670-9674, 1994）。
cation and characterization of two putative HLA class II associated prot
ein: PHAPI and PHAPII.” Biol. Chem. Hoppe-Seyler., 375:113-126, 1994）
は、EBV-形質転換ヒトB-リンパ芽球細胞株から、PHPAIと名付けた必須な等価分
子をクローンした；同様なストラテジーでクローン化されたPHAPIIはpp32とは無
関係である。この研究では、溶液中でのヒトHLAクラスIIタンパク質との結合に
よりPHAPIを同定し、核と同様に膜および細胞質の局在性を示した；遺伝子は蛍
光in situハイブリダイゼーションにより、染色体15q22.3-q23に位置していると
推定される（Finkら, “Localization of the gene encoding the putative hum
an HLA class II-associated protein (PHAPI) to chromosome 15q22.3-q23 by
fluorescence in situ hybridization.” Genomics, 29:309-310, 1995）。さら
に最近、タンパク質ホスファターゼの阻害因子を研究していたグループが、タン
パク質ホスファターゼ2aの阻害因子、I1PP2a、としてpp32を同定した（Liら, “
Molecular Identification of I1PP2A, a novel potent heat-stable inhibitor
protein of protein phosphatase 2A.” Biochemistry 35:6998-7002, 1996）
；もう一つのホスファターゼ阻害因子、I2PP2a、はpp32とは関係ない。興味深い
ことに、もう一つの最近の報告（Ulitzurら, “Biochemical characterization
of mapmodulin, a protein that binds microtubule-associated proteins.” J
ournal of Biological Chemistry 272: 30577-30582, 1997）は、CHO細胞におい
て細胞骨格-関連サイトゾルタンパク質としてpp32を同定した。この発見が系の
違いに由来するのかどうか、あるいはpp32はある環境下では細胞質に位置しうる
のかどうかは明らかではない。pp32は中枢神経系におけるロイシンリッチ核タン
パク質、LANP、としても同定されている（Matsuokaら, “A nuclear factor con
taining the leucine-rich repeats expressed in murine cerebellar neurons.
” Proc Natl Acad Sci USA 91:9670-9674, 1994）。
【０００８】 pp32とより低い程度の相同性を持つ遺伝子産物に関する多くの報告もある。Va
esenグループは、PHAPI2a（EMBL Locus HSPHAI2A）およびPHAPI2b（EMBL Locus
HSPHAPI2B）と名付けた刊行していない一連の配列を同定し、またEBV-形質転換
ヒトB-リンパ芽球細胞株からクローン化した。これらの変異体pp32配列は、本明
細書中で報告した配列とは異なり、かわりにAprilタンパク質を示す。ヒトの膵
臓からクローン化したAprilは、2つのN末端アミノ酸だけPHAPI2aより短い（Menc
ingerら, “Expression analysis and chromosomal mapping of a novel human
gene, APRIL, encoding an acidic protein rich in leucines.” Biochmica et
Biophysica Acta. 1395:176-180, 1998, EMBL Locus HSAPRIL参照）；PHAPI2b
はAPRILのサブセットと同一である。銀染色可能なタンパク質SSP29（未刊行GenB
ank Locus HSU70439）は、HeLa細胞からクローン化され、PHAPI2aと同一である
。
esenグループは、PHAPI2a（EMBL Locus HSPHAI2A）およびPHAPI2b（EMBL Locus
HSPHAPI2B）と名付けた刊行していない一連の配列を同定し、またEBV-形質転換
ヒトB-リンパ芽球細胞株からクローン化した。これらの変異体pp32配列は、本明
細書中で報告した配列とは異なり、かわりにAprilタンパク質を示す。ヒトの膵
臓からクローン化したAprilは、2つのN末端アミノ酸だけPHAPI2aより短い（Menc
ingerら, “Expression analysis and chromosomal mapping of a novel human
gene, APRIL, encoding an acidic protein rich in leucines.” Biochmica et
Biophysica Acta. 1395:176-180, 1998, EMBL Locus HSAPRIL参照）；PHAPI2b
はAPRILのサブセットと同一である。銀染色可能なタンパク質SSP29（未刊行GenB
ank Locus HSU70439）は、HeLa細胞からクローン化され、PHAPI2aと同一である
。
【０００９】 核リンタンパク質pp32は増殖と関連している。Malekおよびその同僚は、様々
な新生物の細胞株が著しく高められた発現レベルを示すこと、および細菌の多糖
類はポリクローナル増殖（polyclonal expansion）をしているBリンパ球によりp
p32エピトープの発現を誘導すること、を報告した（Malekら, J. Biol. Chem.,
265:13400-13409, 1990）。Walenskyおよび同僚は、in situハイブリダイゼーシ
ョンにより測定したpp32の発現レベルは、ヒト前立腺癌のグリーソン分類（Glea
son grade）が増加することに直接関連して増加することを報告した。
な新生物の細胞株が著しく高められた発現レベルを示すこと、および細菌の多糖
類はポリクローナル増殖（polyclonal expansion）をしているBリンパ球によりp
p32エピトープの発現を誘導すること、を報告した（Malekら, J. Biol. Chem.,
265:13400-13409, 1990）。Walenskyおよび同僚は、in situハイブリダイゼーシ
ョンにより測定したpp32の発現レベルは、ヒト前立腺癌のグリーソン分類（Glea
son grade）が増加することに直接関連して増加することを報告した。
【００１０】 pp32 cDNAプローブは前立腺腺癌と強くハイブリダイズするが、正常の前立腺
におけるハイブリダイゼーションシグナルは基底細胞に限定される。ポリクロー
ナル抗pp32抗体はヒト前立腺腺癌の切片と強く反応する。以前の研究において研
究者が使用した抗体およびリボプローブは、全ての報告されたpp32核リンタンパ
ク質ファミリーの構成員と試薬が交差反応することと矛盾していなく、従って、
以前の記載はpp32に焦点を当てていたが、相同なタンパク質が検出されたことを
排除することはできない。
におけるハイブリダイゼーションシグナルは基底細胞に限定される。ポリクロー
ナル抗pp32抗体はヒト前立腺腺癌の切片と強く反応する。以前の研究において研
究者が使用した抗体およびリボプローブは、全ての報告されたpp32核リンタンパ
ク質ファミリーの構成員と試薬が交差反応することと矛盾していなく、従って、
以前の記載はpp32に焦点を当てていたが、相同なタンパク質が検出されたことを
排除することはできない。
【００１１】 発明の概要 本発明は、変異あるいは染色体の欠損などのゲノムに対する構造的な変化を含
まない制御方法を通して、発現が減少したりあるいは無くなることにより、 癌
においてpp32の腫瘍抑制機能が変化する、という事実を基にしている。本発明の
対象は、 i）内因性遺伝子療法の形態として、正常pp32の発現を欠いている癌細胞にお
ける薬理学的あるいは生理学的な手段による内因性pp32遺伝子の誘導；あるいは ii）薬理学的あるいは生理学的な手段によるpp32の機能の回復；あるいは、さ
らに具体的に iii）薬理学的あるいは生理学的な手段による、pp32により阻害可能な核ホス
ファターゼの阻害によるpp32の機能の回復 により、現存する癌の治療あるいは癌形成を妨害するために、pp32の機能を回復
することにより癌を治療する方法である。
まない制御方法を通して、発現が減少したりあるいは無くなることにより、 癌
においてpp32の腫瘍抑制機能が変化する、という事実を基にしている。本発明の
対象は、 i）内因性遺伝子療法の形態として、正常pp32の発現を欠いている癌細胞にお
ける薬理学的あるいは生理学的な手段による内因性pp32遺伝子の誘導；あるいは ii）薬理学的あるいは生理学的な手段によるpp32の機能の回復；あるいは、さ
らに具体的に iii）薬理学的あるいは生理学的な手段による、pp32により阻害可能な核ホス
ファターゼの阻害によるpp32の機能の回復 により、現存する癌の治療あるいは癌形成を妨害するために、pp32の機能を回復
することにより癌を治療する方法である。
【００１２】 本発明は、正常な腫瘍抑制性pp32の正常より低下した発現および／または腫瘍
形成性pp32変異体の過剰発現を示す特定の悪性細胞を治療する方法であって、細
胞に対する腫瘍抑制性pp32の機能を回復させることを含む方法を提供する。本発
明の方法は、腫瘍、神経内分泌性、神経性、間葉性、リンパ性、上皮性、あるい
は生殖細胞由来の腫瘍、特に胸部および前立腺の癌腫を治療することに使用され
うる。
形成性pp32変異体の過剰発現を示す特定の悪性細胞を治療する方法であって、細
胞に対する腫瘍抑制性pp32の機能を回復させることを含む方法を提供する。本発
明の方法は、腫瘍、神経内分泌性、神経性、間葉性、リンパ性、上皮性、あるい
は生殖細胞由来の腫瘍、特に胸部および前立腺の癌腫を治療することに使用され
うる。
【００１３】 特別な態様において、本発明の悪性腫瘍細胞の治療のための方法は、細胞にお
いて正常pp32の発現の増加および／または（1または複数の）腫瘍形成性pp32変
異体の発現の減少を誘導することを含む。正常pp32の発現の増加は、正常pp32を
発現するDNAを細胞にトランスフェクションすることで誘導することができ、あ
るいは正常pp32の発現の増加は、正常pp32発現の誘導物質を投与することで誘導
することができる。典型的に、正常pp32発現の誘導物質は、（生物学的な巨大分
子とは対照的に）小分子であろうし、pp32および／またはその変異体の発現を制
御するための制御機構に影響するであろう。本発明は、化合物がpp32発現の誘導
物質かどうかを決定するために化合物を試験する方法も提供し、その方法には前
記の化合物の存在下および非存在下において培養した細胞により、pp32および／
または一つあるいはそれ以上のその変異体の発現を測定することを含み、本明細
書中において、化合物の存在下において、正常pp32の発現の増加、あるいは（1
または複数の）腫瘍形成性pp32変異体の発現の減少により化合物がpp32の発現の
誘導物質であることが示される。
いて正常pp32の発現の増加および／または（1または複数の）腫瘍形成性pp32変
異体の発現の減少を誘導することを含む。正常pp32の発現の増加は、正常pp32を
発現するDNAを細胞にトランスフェクションすることで誘導することができ、あ
るいは正常pp32の発現の増加は、正常pp32発現の誘導物質を投与することで誘導
することができる。典型的に、正常pp32発現の誘導物質は、（生物学的な巨大分
子とは対照的に）小分子であろうし、pp32および／またはその変異体の発現を制
御するための制御機構に影響するであろう。本発明は、化合物がpp32発現の誘導
物質かどうかを決定するために化合物を試験する方法も提供し、その方法には前
記の化合物の存在下および非存在下において培養した細胞により、pp32および／
または一つあるいはそれ以上のその変異体の発現を測定することを含み、本明細
書中において、化合物の存在下において、正常pp32の発現の増加、あるいは（1
または複数の）腫瘍形成性pp32変異体の発現の減少により化合物がpp32の発現の
誘導物質であることが示される。
【００１４】 もう一つの態様において、本発明は、正常pp32の正常より低下した発現および
／またはpp32変異体の過剰発現を示す悪性細胞を治療する方法を提供し、本明細
書中において当該方法は、細胞におけるタンパク質ホスファターゼ、特に、pp32
の存在により阻害されるタンパク質ホスファターゼを阻害することを含む。タン
パク質ホスファターゼは、タンパク質ホスファターゼ2Aグループの構成員などの
核タンパク質ホスファターゼでありうる。本発明は、化合物の存在下および非存
在下において培養された細胞におけるタンパク質ホスファターゼ活性を、細胞で
のpp32の発現はタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する細胞を使用して測定す
ることを含む、化合物がpp32の機能の誘導物質であるかどうかを決定するために
化合物を試験する方法も提供する。そのような試験における化合物によるタンパ
ク質ホスファターゼ活性の阻害は、その化合物が細胞においてpp32の機能を誘導
することの指標である。タンパク質ホスファターゼは、タンパク質ホスファター
ゼ2Aグループの構成員などの核タンパク質ホスファターゼでありうる。
／またはpp32変異体の過剰発現を示す悪性細胞を治療する方法を提供し、本明細
書中において当該方法は、細胞におけるタンパク質ホスファターゼ、特に、pp32
の存在により阻害されるタンパク質ホスファターゼを阻害することを含む。タン
パク質ホスファターゼは、タンパク質ホスファターゼ2Aグループの構成員などの
核タンパク質ホスファターゼでありうる。本発明は、化合物の存在下および非存
在下において培養された細胞におけるタンパク質ホスファターゼ活性を、細胞で
のpp32の発現はタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する細胞を使用して測定す
ることを含む、化合物がpp32の機能の誘導物質であるかどうかを決定するために
化合物を試験する方法も提供する。そのような試験における化合物によるタンパ
ク質ホスファターゼ活性の阻害は、その化合物が細胞においてpp32の機能を誘導
することの指標である。タンパク質ホスファターゼは、タンパク質ホスファター
ゼ2Aグループの構成員などの核タンパク質ホスファターゼでありうる。
【００１５】 pp32は、グリーソン分類が5以上のほとんど全てのヒト前立腺腺癌に高度に発
現する分化-制御型の核タンパク質の高度に保存されたファミリーの構成員であ
る。これは、癌原遺伝子（proto-oncogene）における分子変異を発現するか、あ
るいは腫瘍抑制性変異あるいは異型接合性の欠失を示す、低いパーセンテージの
前立腺腫瘍と対照的である。3人の個々の患者由来のヒト前立腺腺癌および対と
なる（paired）近接した正常な前立腺の試料の解析により、発明者は正常な前立
腺は継続して正常pp32を発現するが、前立腺腺癌由来のPT-PCR-増幅転写物の3つ
のセットは3つとも複数の癌-関連コード配列変化を示す、ということ明らかにし
ている。癌-関連配列変化は機能的に重要である可能性がある。正常pp32は形質
転換の抑制を通して抗新生物的効果（antineoplastic effects）を発揮する。対
して、癌-関連pp32変異体は、形質転換を抑制するよりはむしろ増大する。
現する分化-制御型の核タンパク質の高度に保存されたファミリーの構成員であ
る。これは、癌原遺伝子（proto-oncogene）における分子変異を発現するか、あ
るいは腫瘍抑制性変異あるいは異型接合性の欠失を示す、低いパーセンテージの
前立腺腫瘍と対照的である。3人の個々の患者由来のヒト前立腺腺癌および対と
なる（paired）近接した正常な前立腺の試料の解析により、発明者は正常な前立
腺は継続して正常pp32を発現するが、前立腺腺癌由来のPT-PCR-増幅転写物の3つ
のセットは3つとも複数の癌-関連コード配列変化を示す、ということ明らかにし
ている。癌-関連配列変化は機能的に重要である可能性がある。正常pp32は形質
転換の抑制を通して抗新生物的効果（antineoplastic effects）を発揮する。対
して、癌-関連pp32変異体は、形質転換を抑制するよりはむしろ増大する。
【００１６】 PC-3ヒト前立腺腺癌細胞株は正常pp32を発現しない。PC-3細胞株に正常pp32を
トランスフェクションすると、細胞周期の阻害が起こる。LNCaPヒト前立腺腺癌
細胞株は正常pp32を発現し、経路のどこかに障害をもっている可能性がある。LN
CaP細胞株に正常pp32をトランスフェクションすると、細胞周期の進行は阻害さ
れない。pp32の発現は、一見すると変異および異型接合性の欠損の過程を通して
欠失していないが、それよりもpp32遺伝子ファミリーの腫瘍形成性構成員の発現
を随伴誘導（concomitant induction）することを用いた他の手段により下方制
御されており、本実験は癌の治療あるいは予防のためのいずれかの方法（上記参
照）により、pp32の機能の回復が可能であることを示す。pp32はあるクラスのホ
スファターゼの阻害により全体的にあるいは一部が作用しうるため、いずれかの
手段によりホスファターゼの阻害を回復させることは、pp32の機能を回復させる
のに十分でありうる。
トランスフェクションすると、細胞周期の阻害が起こる。LNCaPヒト前立腺腺癌
細胞株は正常pp32を発現し、経路のどこかに障害をもっている可能性がある。LN
CaP細胞株に正常pp32をトランスフェクションすると、細胞周期の進行は阻害さ
れない。pp32の発現は、一見すると変異および異型接合性の欠損の過程を通して
欠失していないが、それよりもpp32遺伝子ファミリーの腫瘍形成性構成員の発現
を随伴誘導（concomitant induction）することを用いた他の手段により下方制
御されており、本実験は癌の治療あるいは予防のためのいずれかの方法（上記参
照）により、pp32の機能の回復が可能であることを示す。pp32はあるクラスのホ
スファターゼの阻害により全体的にあるいは一部が作用しうるため、いずれかの
手段によりホスファターゼの阻害を回復させることは、pp32の機能を回復させる
のに十分でありうる。
【００１７】 発明の詳細な説明 本発明者は、pp32における表現型の変化がヒト前立腺癌に共通した特徴である
ことを発見した。以前のデータは、グリーソン分類が5およびそれ以上である前
立腺癌の87％は、pp32あるいは密接に関連する転写物を発現することを示す（米
国特許NO. 5,734,022, 本明細書中で参考文献として援用される）。これは、実
質的に低い割合の症例でしか起こっていない、原発性の前立腺癌において広く研
究されている他の腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における分子変異の頻度と対
照的に驚くべきことである。例えば、myc過剰発現（Flemingら）は症例の約60％
に起こり、p53は原発性腫瘍の約25％のみで異常となっている（Isaacsら, in “
Genetic Alterations in Prostate Cancer.” Cold Spiring Harbor Symposia o
n Quantitative Biology, 59:653-659, 1994）。
ことを発見した。以前のデータは、グリーソン分類が5およびそれ以上である前
立腺癌の87％は、pp32あるいは密接に関連する転写物を発現することを示す（米
国特許NO. 5,734,022, 本明細書中で参考文献として援用される）。これは、実
質的に低い割合の症例でしか起こっていない、原発性の前立腺癌において広く研
究されている他の腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における分子変異の頻度と対
照的に驚くべきことである。例えば、myc過剰発現（Flemingら）は症例の約60％
に起こり、p53は原発性腫瘍の約25％のみで異常となっている（Isaacsら, in “
Genetic Alterations in Prostate Cancer.” Cold Spiring Harbor Symposia o
n Quantitative Biology, 59:653-659, 1994）。
【００１８】 いくつかの証拠の線（line）により、pp32は腫瘍抑制物質として作用しうるこ
とが示唆される。機能的には、pp32はin vitroにて、rasとmyc、変異体p53、Ela
、あるいはjun、あるいはヒト乳腺種ウイルスE6およびE7などの腫瘍遺伝子の対
により形質転換を阻害する（Chenら, “Structure of pp32, an acidic nuclear
protein which inhibits oncogene-induced formation of transformed foci.
” Molecular Biology of the Cell. 7:2045-2056, 1996）。pp32は軟寒天上で
形質転換された細胞の増殖も阻害する（Chenら）。もう一つの系では、正常ヒト
pp32を過剰発現させるために以前にトランスフェクションしたras-トランスフェ
クションNIH3T3細胞は、in vitroでは細胞増殖巣を形成せず、あるいは予備試験
的には、対照細胞と異なり、ヌードマウスに腫瘍を形成しない。対して、同じ系
において、アンチセンスpp32発現構築物による内因性pp32のノックアウトでは、
顕著に腫瘍形成性が増大する（以下の実施例12）。
とが示唆される。機能的には、pp32はin vitroにて、rasとmyc、変異体p53、Ela
、あるいはjun、あるいはヒト乳腺種ウイルスE6およびE7などの腫瘍遺伝子の対
により形質転換を阻害する（Chenら, “Structure of pp32, an acidic nuclear
protein which inhibits oncogene-induced formation of transformed foci.
” Molecular Biology of the Cell. 7:2045-2056, 1996）。pp32は軟寒天上で
形質転換された細胞の増殖も阻害する（Chenら）。もう一つの系では、正常ヒト
pp32を過剰発現させるために以前にトランスフェクションしたras-トランスフェ
クションNIH3T3細胞は、in vitroでは細胞増殖巣を形成せず、あるいは予備試験
的には、対照細胞と異なり、ヌードマウスに腫瘍を形成しない。対して、同じ系
において、アンチセンスpp32発現構築物による内因性pp32のノックアウトでは、
顕著に腫瘍形成性が増大する（以下の実施例12）。
【００１９】 臨床的な前立腺癌において、状態ははじめ直観に反しているようだ。大半のヒ
ト前立腺癌は、in situハイブリダイゼーション（以下の実施例1を参照）および
抗pp32抗体を濃く用いた染色により、高レベルのpp32が発現しているようだ。pp
32は腫瘍遺伝子-媒介形質転換を阻害するので（Chenら）、癌におけるその逆説
的発現が配列レベルで調べられた。なぜ前立腺癌は高レベルの抗-腫瘍遺伝子タ
ンパク質を発現するようにみえるのかという逆説的な質問が、3人の患者の対と
なる正常前立腺および近接する前立腺癌由来のpp32種ならびに4つの前立腺癌細
胞株からpp32種の配列および機能を比較することにより提出された。pp32は良性
の前立腺で発現するが、異なる染色体上に位置して密接に関連する遺伝子である
pp32r1およびpp32r2は前立腺癌で発現する。pp32は腫瘍抑制物質であるが、pp32
r1およびpp32r2は腫瘍形成性物質である。従って、pp32、pp32r1、およびpp32r2
遺伝子を代替的に使用することにより、ヒト前立腺癌での腫瘍遺伝子の潜在性を
モジュレートする。前立腺癌はほとんどあるいは全くpp32を発現せず、別々の染
色体上の遺伝子によりコードされるpp32ファミリーの他の構成員を発現する。前
立腺癌で発現する代替的pp32遺伝子は、pp32とは明らかに対照的に、腫瘍形成性
である。pp32は密接に関連する遺伝子ファミリーの構成員であり、異なる染色体
上に位置するこれらの密接に関連する遺伝子の代替的発現は、ヒト前立腺癌にお
ける腫瘍遺伝子の潜在性をモジュレートするということが、本明細書中で示され
る。前立腺癌で発現する変異体pp32種はpp32と密接に関連する。
ト前立腺癌は、in situハイブリダイゼーション（以下の実施例1を参照）および
抗pp32抗体を濃く用いた染色により、高レベルのpp32が発現しているようだ。pp
32は腫瘍遺伝子-媒介形質転換を阻害するので（Chenら）、癌におけるその逆説
的発現が配列レベルで調べられた。なぜ前立腺癌は高レベルの抗-腫瘍遺伝子タ
ンパク質を発現するようにみえるのかという逆説的な質問が、3人の患者の対と
なる正常前立腺および近接する前立腺癌由来のpp32種ならびに4つの前立腺癌細
胞株からpp32種の配列および機能を比較することにより提出された。pp32は良性
の前立腺で発現するが、異なる染色体上に位置して密接に関連する遺伝子である
pp32r1およびpp32r2は前立腺癌で発現する。pp32は腫瘍抑制物質であるが、pp32
r1およびpp32r2は腫瘍形成性物質である。従って、pp32、pp32r1、およびpp32r2
遺伝子を代替的に使用することにより、ヒト前立腺癌での腫瘍遺伝子の潜在性を
モジュレートする。前立腺癌はほとんどあるいは全くpp32を発現せず、別々の染
色体上の遺伝子によりコードされるpp32ファミリーの他の構成員を発現する。前
立腺癌で発現する代替的pp32遺伝子は、pp32とは明らかに対照的に、腫瘍形成性
である。pp32は密接に関連する遺伝子ファミリーの構成員であり、異なる染色体
上に位置するこれらの密接に関連する遺伝子の代替的発現は、ヒト前立腺癌にお
ける腫瘍遺伝子の潜在性をモジュレートするということが、本明細書中で示され
る。前立腺癌で発現する変異体pp32種はpp32と密接に関連する。
【００２０】 前立腺癌は変異体pp32転写物を発現するが、近接する正常前立腺は正常pp32を
発現することを、本発明のデータは示す。異なる染色体上の代替的遺伝子の発現
は変異あるいは択一的スプライシング（alternate splicing）よりは表現型スイ
ッチを導くことができることを、2つの例は明らかに示す。この分子表現型にお
ける切り替えは、機能的なpp32の表現型スイッチを随伴する。正常pp32は、腫瘍
遺伝子-媒介形質転換を促進する癌原遺伝子変異体転写物とは対照的に、特徴的
には抗-腫瘍性の特徴を有する。この高頻度の異常性により、変異体pp32種の発
現はヒト前立腺癌の発生において病因的な役割をしうることが示唆される。加え
て、これらの知見は診断および予後に重要な意味をもつ。
発現することを、本発明のデータは示す。異なる染色体上の代替的遺伝子の発現
は変異あるいは択一的スプライシング（alternate splicing）よりは表現型スイ
ッチを導くことができることを、2つの例は明らかに示す。この分子表現型にお
ける切り替えは、機能的なpp32の表現型スイッチを随伴する。正常pp32は、腫瘍
遺伝子-媒介形質転換を促進する癌原遺伝子変異体転写物とは対照的に、特徴的
には抗-腫瘍性の特徴を有する。この高頻度の異常性により、変異体pp32種の発
現はヒト前立腺癌の発生において病因的な役割をしうることが示唆される。加え
て、これらの知見は診断および予後に重要な意味をもつ。
【００２１】 定義 本発明の記載では、次の用語は以下に述べる定義に従って使用される。 核酸 特定の二本鎖DNA分子の構造を議論する場合、配列は、転写されないDNA鎖（す
なわち、mRNAと相同な配列をもつ鎖）に沿った5'から3'方向の配列のみを与える
通常の慣例に従って、本明細書中で記載されうる。
なわち、mRNAと相同な配列をもつ鎖）に沿った5'から3'方向の配列のみを与える
通常の慣例に従って、本明細書中で記載されうる。
【００２２】 DNA配列は、遺伝的コードに従ったDNA配列の翻訳によりアミノ酸配列が生ずる
（すなわち、DNA配列がアミノ酸配列を“コード”する）場合に、アミノ酸配列
と“対応”する；一つのDNA配列は、二つの配列が同じアミノ酸配列をコードす
る場合に、もう一つのDNA配列と“対応”する。
（すなわち、DNA配列がアミノ酸配列を“コード”する）場合に、アミノ酸配列
と“対応”する；一つのDNA配列は、二つの配列が同じアミノ酸配列をコードす
る場合に、もう一つのDNA配列と“対応”する。
【００２３】 二つのDNA配列は、規定された長さのDNA配列にわたり少なくとも約90％（好ま
しくは少なくとも約94％、および最も好ましくは少なくとも約96％）のヌクレオ
チドが合致するとき、“実質的に同種”である。実質的に同種な配列は、以下に
記載するアッセイの手順により、あるいはDNA分子の単離および配列決定により
同定できる。例えば、以下のManiatisら、以下のDNA Cloning, vols 1およびII
；以下のNucleic Acid Hybridizationを参照。
しくは少なくとも約94％、および最も好ましくは少なくとも約96％）のヌクレオ
チドが合致するとき、“実質的に同種”である。実質的に同種な配列は、以下に
記載するアッセイの手順により、あるいはDNA分子の単離および配列決定により
同定できる。例えば、以下のManiatisら、以下のDNA Cloning, vols 1およびII
；以下のNucleic Acid Hybridizationを参照。
【００２４】 DNA構築物の“異種な（heterologous）”領域あるいはドメインは、現存する
より大きな分子との関係が全く見つけられないより大きなDNA分子中において、D
NAの同定が可能な部分である。従って、異種領域が哺乳類の遺伝子をコードする
とき、遺伝子は通常、もとの生物のゲノムにおいて哺乳類のゲノムDNAと隣接し
ないDNAが隣接するであろう。異種領域の他の例は、コード配列自身が全く見つ
からない構造である（例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含むcDNAや、
あるいはもとの遺伝子と異なるコドンをもつ合成配列）。アリル的な（allelic
）変化あるいは自然発生的な変異の事例は、本明細書中で定義するような異種の
DNA領域を生じさせない。
より大きな分子との関係が全く見つけられないより大きなDNA分子中において、D
NAの同定が可能な部分である。従って、異種領域が哺乳類の遺伝子をコードする
とき、遺伝子は通常、もとの生物のゲノムにおいて哺乳類のゲノムDNAと隣接し
ないDNAが隣接するであろう。異種領域の他の例は、コード配列自身が全く見つ
からない構造である（例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含むcDNAや、
あるいはもとの遺伝子と異なるコドンをもつ合成配列）。アリル的な（allelic
）変化あるいは自然発生的な変異の事例は、本明細書中で定義するような異種の
DNA領域を生じさせない。
【００２５】 “コード配列”あるいは“オープンリーディングフレーム”は、（遺伝的コー
ドを考慮すると）タンパク質あるいはペプチド配列と対応するあるいはコードす
るコドンのイン・フレームの配列である。二つのコード配列は、その配列あるい
はそれらの相補的な配列が同じアミノ酸配列をコードする場合に、互いに対応す
る。適当な制御配列と関連するコード配列は、in vivoで転写されてポリペプチ
ドに翻訳されうる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は通常、コード
配列の3'に位置するであろう。“プロモーター配列”は、細胞においてRNAポリ
メラーゼが結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始することができる
DNA制御領域である。プロモーター配列は典型的に、コード配列の転写に影響す
る制御分子（例えば、転写因子）が結合するためのさらなる部位を含む。コード
配列は、RNAポリメラーゼが細胞においてプロモーター配列と結合してmRNAにコ
ード配列を転写され、そして次にコード配列によりコードされるタンパク質に翻
訳される場合に、プロモーター配列の“調節下”にあるか、あるいはプロモータ
ーと“機能的に連結”している。
ドを考慮すると）タンパク質あるいはペプチド配列と対応するあるいはコードす
るコドンのイン・フレームの配列である。二つのコード配列は、その配列あるい
はそれらの相補的な配列が同じアミノ酸配列をコードする場合に、互いに対応す
る。適当な制御配列と関連するコード配列は、in vivoで転写されてポリペプチ
ドに翻訳されうる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は通常、コード
配列の3'に位置するであろう。“プロモーター配列”は、細胞においてRNAポリ
メラーゼが結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始することができる
DNA制御領域である。プロモーター配列は典型的に、コード配列の転写に影響す
る制御分子（例えば、転写因子）が結合するためのさらなる部位を含む。コード
配列は、RNAポリメラーゼが細胞においてプロモーター配列と結合してmRNAにコ
ード配列を転写され、そして次にコード配列によりコードされるタンパク質に翻
訳される場合に、プロモーター配列の“調節下”にあるか、あるいはプロモータ
ーと“機能的に連結”している。
【００２６】 ベクターは、DNA、RNAあるいはタンパク質などの外来物質を生物に導入するた
めに使用される。典型的なベクターは、（DNAのためには）組換えウイルスおよ
び（タンパク質のためには）リポソームを含む。“DNAベクター”は、プラスミ
ド、ファージあるいはコスミドなどのレプリコンであり、それに対してもう一つ
のDNA部分が接着することで、接着部分の複製が引き起こされうる。“発現ベク
ター”はDNAベクターであり、適当な宿主細胞によりタンパク質合成を指示する
であろう制御配列を含む。これは通常、RNAポリメラーゼが結合してmRNAの転写
を開始するためのプロモーター、ならびにポリペプチドへのmRNAの翻訳を指示す
るためのリボソーム結合部位および開始シグナルを意味する。適当な部位および
正しいリーディングフレームにおける発現ベクターへのDNA配列の取り込みに続
いて、ベクターによる適切な宿主細胞の形質転換を起こすことにより、前記のDN
A配列によりコードされるタンパク質の産生を可能にする。
めに使用される。典型的なベクターは、（DNAのためには）組換えウイルスおよ
び（タンパク質のためには）リポソームを含む。“DNAベクター”は、プラスミ
ド、ファージあるいはコスミドなどのレプリコンであり、それに対してもう一つ
のDNA部分が接着することで、接着部分の複製が引き起こされうる。“発現ベク
ター”はDNAベクターであり、適当な宿主細胞によりタンパク質合成を指示する
であろう制御配列を含む。これは通常、RNAポリメラーゼが結合してmRNAの転写
を開始するためのプロモーター、ならびにポリペプチドへのmRNAの翻訳を指示す
るためのリボソーム結合部位および開始シグナルを意味する。適当な部位および
正しいリーディングフレームにおける発現ベクターへのDNA配列の取り込みに続
いて、ベクターによる適切な宿主細胞の形質転換を起こすことにより、前記のDN
A配列によりコードされるタンパク質の産生を可能にする。
【００２７】 発現ベクターは代替的にアンチセンス配列を含有してもよく、そこでは全ての
あるいは一部のmRNA配列に対応する小さなDNA断片が、プロモーターの後にベク
ターの中に逆方向で挿入される。結果として、挿入DNAは転写されて、相補的でm
RNAと結合あるいはハイブリダイズできるRNAを産生するであろう。mRNAに結合す
るとすぐに、mRNAの翻訳は妨げられて、結果的にmRNAによってコードされるタン
パク質は産生されない。アンチセンス発現ベクターの産生および使用は、米国特
許5,107,065（植物における遺伝子のアンチセンス制御を記載して例示する）お
よび米国特許5,190,931（原核生物および真核生物の両方における遺伝子のアン
チセンス制御を記載し、原核生物を例示する）により詳細に記載され、それらの
両方とも本明細書中で参考文献として援用される。
あるいは一部のmRNA配列に対応する小さなDNA断片が、プロモーターの後にベク
ターの中に逆方向で挿入される。結果として、挿入DNAは転写されて、相補的でm
RNAと結合あるいはハイブリダイズできるRNAを産生するであろう。mRNAに結合す
るとすぐに、mRNAの翻訳は妨げられて、結果的にmRNAによってコードされるタン
パク質は産生されない。アンチセンス発現ベクターの産生および使用は、米国特
許5,107,065（植物における遺伝子のアンチセンス制御を記載して例示する）お
よび米国特許5,190,931（原核生物および真核生物の両方における遺伝子のアン
チセンス制御を記載し、原核生物を例示する）により詳細に記載され、それらの
両方とも本明細書中で参考文献として援用される。
【００２８】 核酸配列の“増幅”は、特定の核酸配列の複数のコピーのin vitroでの産生で
ある。増幅配列は通常DNAの形をとる。そのような増幅を実行するための様々な
技術は、Van Brunt（1990, Bio/Technol., 8(4):291-294）によるレビュー記事
に記載される。ポリメラーゼ連鎖反応あるいはPCRは核酸増幅の基本型であり、
本明細書中でのPCRの使用はその他の適した増幅技術の典型と考えられるべきで
ある。
ある。増幅配列は通常DNAの形をとる。そのような増幅を実行するための様々な
技術は、Van Brunt（1990, Bio/Technol., 8(4):291-294）によるレビュー記事
に記載される。ポリメラーゼ連鎖反応あるいはPCRは核酸増幅の基本型であり、
本明細書中でのPCRの使用はその他の適した増幅技術の典型と考えられるべきで
ある。
【００２９】 ポリペプチド 本発明を明確にする目的のため、二つのタンパク質は、各々のアミノ酸配列に
おけるアミノ酸の80％が同じであれば、相同である；異なる長さのタンパク質に
ついては、配列は共通する配列（すわなち、より短いタンパク質長）にわたり少
なくとも80％が同じであろう。
おけるアミノ酸の80％が同じであれば、相同である；異なる長さのタンパク質に
ついては、配列は共通する配列（すわなち、より短いタンパク質長）にわたり少
なくとも80％が同じであろう。
【００３０】 二つのアミノ酸配列は、規定された長さのアミノ酸配列にわたり少なくとも約
87％のアミノ酸が合致するとき、好ましくは少なくとも約89％、さらに好ましく
は少なくとも約95％が合致するとき、“実質的に同種”である。典型的に、同種
の二つのアミノ酸配列は保存的な置換のみによる違いであろう。
87％のアミノ酸が合致するとき、好ましくは少なくとも約89％、さらに好ましく
は少なくとも約95％が合致するとき、“実質的に同種”である。典型的に、同種
の二つのアミノ酸配列は保存的な置換のみによる違いであろう。
【００３１】 “保存的アミノ酸置換”は、同じ特性のもう一つのアミノ酸残基による配列内
での一つのアミノ酸残基の置換であり、結果として生じるペプチドの二次および
三次構造は実質的に同じとなる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸が置換される
アミノ酸と実質的に同じ電荷あるいは疎水性をもち、置換がタンパク質の局所的
な構造に著しい効果を持たないときに起こる。互いに保存的な置換をしうるアミ
ノ酸の組は当業者によく知られている。
での一つのアミノ酸残基の置換であり、結果として生じるペプチドの二次および
三次構造は実質的に同じとなる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸が置換される
アミノ酸と実質的に同じ電荷あるいは疎水性をもち、置換がタンパク質の局所的
な構造に著しい効果を持たないときに起こる。互いに保存的な置換をしうるアミ
ノ酸の組は当業者によく知られている。
【００３２】 本発明のポリペプチドは、pp32r1およびpp32r1類似体、pp32r2およびpp32r2類
似体、ならびにpp32およびそれらの類似体の他の変異体を含む。pp32r1およびpp
32r2は自然に発生し、成熟（mature）タンパク質であり、さらにはpp32r1および
pp32r2の全ての前駆体およびアリル的変異体を含み、ならびにin vivoでの一定
しない（inconsistent）過程から生じうる異なる分子量の形態を含む。pp32r1配
列の例を図3の上列に示す。“pp32r1類似体”は： 1）“pp32r1のアリル的変異体”、これはpp32r1と実質的に同種なポリペプチ
ドである。好ましくは、アリル的変異体のアミノ酸配列は、300のヌクレオチド
のうち一つのヌクレオチドがpp32r1の配列と異なる核酸配列によりコードされる
； 2）“短縮型（truncated）pp32r1ペプチド”、これは好ましくは(i) pp32r1に
独特なアミノ酸配列、(ii) pp32r1に独特なエピトープあるいは(iii) pp32r1活
性、のいずれかを保有するpp32あるいはpp32r1のアリル的変異体のいずれかの断
片を含む； 3）“pp32r1融合タンパク質”、これは異種なアミノ酸配列のいずれかと融合
する上記ポリペプチド（pp32r1、pp32r1のアリル的変異体あるいは短縮型pp32r1
ペプチド）の一つで構成される異種なポリペプチドを含む； を含む一つのクラスのペプチドである。
似体、ならびにpp32およびそれらの類似体の他の変異体を含む。pp32r1およびpp
32r2は自然に発生し、成熟（mature）タンパク質であり、さらにはpp32r1および
pp32r2の全ての前駆体およびアリル的変異体を含み、ならびにin vivoでの一定
しない（inconsistent）過程から生じうる異なる分子量の形態を含む。pp32r1配
列の例を図3の上列に示す。“pp32r1類似体”は： 1）“pp32r1のアリル的変異体”、これはpp32r1と実質的に同種なポリペプチ
ドである。好ましくは、アリル的変異体のアミノ酸配列は、300のヌクレオチド
のうち一つのヌクレオチドがpp32r1の配列と異なる核酸配列によりコードされる
； 2）“短縮型（truncated）pp32r1ペプチド”、これは好ましくは(i) pp32r1に
独特なアミノ酸配列、(ii) pp32r1に独特なエピトープあるいは(iii) pp32r1活
性、のいずれかを保有するpp32あるいはpp32r1のアリル的変異体のいずれかの断
片を含む； 3）“pp32r1融合タンパク質”、これは異種なアミノ酸配列のいずれかと融合
する上記ポリペプチド（pp32r1、pp32r1のアリル的変異体あるいは短縮型pp32r1
ペプチド）の一つで構成される異種なポリペプチドを含む； を含む一つのクラスのペプチドである。
【００３３】 本発明に従ったpp32r1変異体の“独特”な配列、アミノ酸配列あるいはそれら
をコードする核酸配列のいずれか、はpp32r1ポリペプチドの配列と同じであるが
、ヒトpp32（Genbank Locus HSU73477）、マウスpp32（Genbank Locus MMU73478
）、ヒト小脳ロイシンリッチ酸性核タンパク質（LANP）（Genbank Locus AF0256
84）、マウスLANP（Genbank Locus AF022957）、I1PP2aあるいはヒト強力熱安定
性タンパク質ホスファターゼ2a阻害物質（Genbank Locus HSU60823）、SSP29（G
enbank Locus HSU70439）、HLA-DR関連タンパク質I（Genbank Locus HSPPHAPI,
寄託番号X75090）、PHAPI2a（EMBL Locus HSPHAPI2A, Genbank寄託番号Y07569）
、PHAPI2b（EMBL Locus HSPHAPI2B, Genbank寄託番号Y07570）、およびApril（E
MBL Locus HSAPRIL）の配列と少なくとも一つのアミノ酸あるいはヌクレオチド
残基が異なり、好ましくは、ヒトのゲノムにおいてどこにも見あたらない配列で
ある（これらの配列のリストは表3Aに提供する）。同様に、エピトープは、pp32
r1ポリペプチドに見出されるが、上記のリストのタンパク質の組のいずれの構成
員にも見出されない場合に、pp32r1ポリペプチドに“独特”である。pp32r2およ
び独特なpp32r2配列の類似体は同様に定義される。もちろん、pp32r1の独特な配
列はpp32r2には見出されず、逆もまた同様である。
をコードする核酸配列のいずれか、はpp32r1ポリペプチドの配列と同じであるが
、ヒトpp32（Genbank Locus HSU73477）、マウスpp32（Genbank Locus MMU73478
）、ヒト小脳ロイシンリッチ酸性核タンパク質（LANP）（Genbank Locus AF0256
84）、マウスLANP（Genbank Locus AF022957）、I1PP2aあるいはヒト強力熱安定
性タンパク質ホスファターゼ2a阻害物質（Genbank Locus HSU60823）、SSP29（G
enbank Locus HSU70439）、HLA-DR関連タンパク質I（Genbank Locus HSPPHAPI,
寄託番号X75090）、PHAPI2a（EMBL Locus HSPHAPI2A, Genbank寄託番号Y07569）
、PHAPI2b（EMBL Locus HSPHAPI2B, Genbank寄託番号Y07570）、およびApril（E
MBL Locus HSAPRIL）の配列と少なくとも一つのアミノ酸あるいはヌクレオチド
残基が異なり、好ましくは、ヒトのゲノムにおいてどこにも見あたらない配列で
ある（これらの配列のリストは表3Aに提供する）。同様に、エピトープは、pp32
r1ポリペプチドに見出されるが、上記のリストのタンパク質の組のいずれの構成
員にも見出されない場合に、pp32r1ポリペプチドに“独特”である。pp32r2およ
び独特なpp32r2配列の類似体は同様に定義される。もちろん、pp32r1の独特な配
列はpp32r2には見出されず、逆もまた同様である。
【００３４】 “pp32の変異体”は、少なくとも2つのアミノ酸がpp32と異なる相同なタンパ
ク質である。特に、pp32と変異体の配列比較により、配列において少なくとも二
つ(2)のアミノ酸が異なる10のアミノ酸部分が少なくとも一つ示されるであろう
。さらに典型的には、変異体はその10のアミノ酸部分を少なくとも二つ示すであ
ろう。好ましくは、本発明に従ったpp32の変異体は、機能的な活性においてpp32
と異なることを示すであろう。特に、pp32r1およびpp32r2は、その活性が本明細
書中で記載されるラットの線維芽細胞形質転換アッセイにおいて形質転換の刺激
を含むpp32の変異体である。
ク質である。特に、pp32と変異体の配列比較により、配列において少なくとも二
つ(2)のアミノ酸が異なる10のアミノ酸部分が少なくとも一つ示されるであろう
。さらに典型的には、変異体はその10のアミノ酸部分を少なくとも二つ示すであ
ろう。好ましくは、本発明に従ったpp32の変異体は、機能的な活性においてpp32
と異なることを示すであろう。特に、pp32r1およびpp32r2は、その活性が本明細
書中で記載されるラットの線維芽細胞形質転換アッセイにおいて形質転換の刺激
を含むpp32の変異体である。
【００３５】 選択された成分Aを含む組成物において、成分Aが成分AおよびBの混合重量の重
量で少なくとも約75％を構成するとき、もう一つの成分Bは“実質的に無い（fre
e）”ことになる。好ましくは、選択された成分Aは混合重量の重量で少なくとも
約90％、最も好ましくは混合重量の重量で少なくとも約99％を含む。選択された
生物学的活性タンパク質を含み、汚染するタンパク質が実質的に無い組成物の場
合、目的のタンパク質の活性を有する組成物が単一の分子量のみを有する種を含
有することは（すなわち、“相同な”組成物）、時として好ましい。
量で少なくとも約75％を構成するとき、もう一つの成分Bは“実質的に無い（fre
e）”ことになる。好ましくは、選択された成分Aは混合重量の重量で少なくとも
約90％、最も好ましくは混合重量の重量で少なくとも約99％を含む。選択された
生物学的活性タンパク質を含み、汚染するタンパク質が実質的に無い組成物の場
合、目的のタンパク質の活性を有する組成物が単一の分子量のみを有する種を含
有することは（すなわち、“相同な”組成物）、時として好ましい。
【００３６】 本明細書中で使用されるように、“生物学的試料”は個人から単離された組織
あるいは液体の試料のことをいい、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮
膚、呼吸路、腸管、および尿生殖路の外側切片、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器
官、およびin vivoでの細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中の細胞、推定さ
れるウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞成分の成長を引き起こす調節培
地を含むが、これらには限定されない）も含むが、これらには限定されない。
あるいは液体の試料のことをいい、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮
膚、呼吸路、腸管、および尿生殖路の外側切片、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、器
官、およびin vivoでの細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中の細胞、推定さ
れるウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞成分の成長を引き起こす調節培
地を含むが、これらには限定されない）も含むが、これらには限定されない。
【００３７】 “ヒト組織”は固体の塊を構成しうるヒト細胞の集塊である。この用語は、血
球、あるいはヒト細胞株などのヒト細胞の懸濁液も含む。 “免疫グロブリン分子”という用語は、四つの免疫グロブリンペプチド鎖、二
つの重鎖および二つの軽鎖で構成される抗体全体、ならびに免疫グロブリン断片
を含む。“免疫グロブリン断片”は抗体と関連するタンパク質分子であり、それ
らは、Fab、F(ab)'2、Fvなど、もとの抗体のエピトープへの結合特異性を有する
ことが知られている。二つのポリペプチドは、両方のポリペプチドが同じモノク
ローナル抗血清と反応するときに“免疫学的な交差反応性”である。
球、あるいはヒト細胞株などのヒト細胞の懸濁液も含む。 “免疫グロブリン分子”という用語は、四つの免疫グロブリンペプチド鎖、二
つの重鎖および二つの軽鎖で構成される抗体全体、ならびに免疫グロブリン断片
を含む。“免疫グロブリン断片”は抗体と関連するタンパク質分子であり、それ
らは、Fab、F(ab)'2、Fvなど、もとの抗体のエピトープへの結合特異性を有する
ことが知られている。二つのポリペプチドは、両方のポリペプチドが同じモノク
ローナル抗血清と反応するときに“免疫学的な交差反応性”である。
【００３８】 一般的な方法 本発明の実施は、他に表示がない場合は、当該技術内の従来の分子生物学、微
生物学、および組換えDNA技術を使用する。そのような技術は当業者によく知ら
れており、文献に完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambro
ok, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Pra
ctical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover, ed., 1985); "Oligonucle
otide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B
.D. Hames & S.J. Higgins, ed., 1985); "Transcription and Translation" (B
.D. Hames & S.J. Higgins, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshn
ey, ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Pe
rbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)、およびSambrookら,
“Molecular Cloning: a Laboratory Manual” (1989)を参照。
生物学、および組換えDNA技術を使用する。そのような技術は当業者によく知ら
れており、文献に完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambro
ok, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Pra
ctical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover, ed., 1985); "Oligonucle
otide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B
.D. Hames & S.J. Higgins, ed., 1985); "Transcription and Translation" (B
.D. Hames & S.J. Higgins, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshn
ey, ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Pe
rbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)、およびSambrookら,
“Molecular Cloning: a Laboratory Manual” (1989)を参照。
【００３９】 pp32関連ゲノムDNA ヒトpp32 cDNAから生じさせたプローブを用いたバクテリオファージにおける
ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングは、pp32と相同なタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含有する新たな配列を産生した（実施例2
を参照；Chenら, Mol. Biol. Cell, 7:2045-2056, 1996に報告されるpp32r2配列
）。pp32r1およびpp32r2配列（図2および5を参照）は実質的にpp32と相同である
が、複数の単一ヌクレオチド塩基の変化および短い欠失により、それらはpp32遺
伝子と異なる遺伝子によりコードされることが示唆される。pp32ファミリーは、
他で報告される実質的に相同なポリペプチド：HLA-DR関連タンパク質I（Vaesen,
1994）、ロイシン-リッチ酸性核タンパク質（Matsuoka, 1994）、およびタンパ
ク質ホスファターゼ2A阻害因子（Li, 1996）、も含む。
ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングは、pp32と相同なタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含有する新たな配列を産生した（実施例2
を参照；Chenら, Mol. Biol. Cell, 7:2045-2056, 1996に報告されるpp32r2配列
）。pp32r1およびpp32r2配列（図2および5を参照）は実質的にpp32と相同である
が、複数の単一ヌクレオチド塩基の変化および短い欠失により、それらはpp32遺
伝子と異なる遺伝子によりコードされることが示唆される。pp32ファミリーは、
他で報告される実質的に相同なポリペプチド：HLA-DR関連タンパク質I（Vaesen,
1994）、ロイシン-リッチ酸性核タンパク質（Matsuoka, 1994）、およびタンパ
ク質ホスファターゼ2A阻害因子（Li, 1996）、も含む。
【００４０】 特異的な配列を有するDNA部分あるいはオリゴヌクレオチドは、いくつかのア
プローチの一つにより化学的に合成されるかあるいは単離されうる。所望するDN
A配列の同定、増幅および単離、ならびにそれらを組み立てて、所望する順序で
所望する配列ドメインを含むより大きなDNA分子にするための基本的なストラテ
ジーは、当業者によく知られている。例えば、Sambrookら, (1989)；B. Perbal,
(1984)を参照。好ましくは、pp32r1の全てあるいは一部のcDNAあるいはゲノム
配列に対応するDNA部分は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個々に単離されう
る（M.A.Innisら, “PCR protocols: A Guide To Methods and Applications,”
Academic Press, 1990）。完全は配列は、標準的な方法で調製したオリゴヌク
レオチドを重複させることで組み立てることができ、完全なコード配列となるよ
うに組み立てることができる。例えば、Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair
ら(1984) Science 223: 1299; Jayら(1984) J. Bio. Chem., 259:6311を参照。
プローチの一つにより化学的に合成されるかあるいは単離されうる。所望するDN
A配列の同定、増幅および単離、ならびにそれらを組み立てて、所望する順序で
所望する配列ドメインを含むより大きなDNA分子にするための基本的なストラテ
ジーは、当業者によく知られている。例えば、Sambrookら, (1989)；B. Perbal,
(1984)を参照。好ましくは、pp32r1の全てあるいは一部のcDNAあるいはゲノム
配列に対応するDNA部分は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個々に単離されう
る（M.A.Innisら, “PCR protocols: A Guide To Methods and Applications,”
Academic Press, 1990）。完全は配列は、標準的な方法で調製したオリゴヌク
レオチドを重複させることで組み立てることができ、完全なコード配列となるよ
うに組み立てることができる。例えば、Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair
ら(1984) Science 223: 1299; Jayら(1984) J. Bio. Chem., 259:6311を参照。
【００４１】 組み立てられた配列は適当なベクターあるいはレプリコン内でクローン化する
ことができ、そこで組み立てられた配列を含有しないベクターを実質的に含まな
い組成物として維持することができる。これは組み立てられた配列のリザーバー
を提供し、部分あるいは全配列は、制限酵素を用いてリザーバー物質内のDNAか
ら切り出すことにより、あるいはPCR増幅によりリザーバーから抽出できる。多
くのクローニングベクターは当業者に知られており、適当なクローニングベクタ
ーの選択は選択対象の種類（choice）の問題である（例えば、本明細書中で参考
文献として援用されるSambrookら、を参照）。適当なDNA配列により連結する所
望するDNA部分を含むベクターの構築は、部分を構築するために使用されるもの
と同様な技術により成し遂げられる。これらのベクターは、（原核生物宿主と哺
乳類宿主の間をシャトルするための）シャトルベクターを作製するためのバクテ
リア複製開始点などの、さらなるDNA部分を含有するように構築することができ
る。
ことができ、そこで組み立てられた配列を含有しないベクターを実質的に含まな
い組成物として維持することができる。これは組み立てられた配列のリザーバー
を提供し、部分あるいは全配列は、制限酵素を用いてリザーバー物質内のDNAか
ら切り出すことにより、あるいはPCR増幅によりリザーバーから抽出できる。多
くのクローニングベクターは当業者に知られており、適当なクローニングベクタ
ーの選択は選択対象の種類（choice）の問題である（例えば、本明細書中で参考
文献として援用されるSambrookら、を参照）。適当なDNA配列により連結する所
望するDNA部分を含むベクターの構築は、部分を構築するために使用されるもの
と同様な技術により成し遂げられる。これらのベクターは、（原核生物宿主と哺
乳類宿主の間をシャトルするための）シャトルベクターを作製するためのバクテ
リア複製開始点などの、さらなるDNA部分を含有するように構築することができ
る。
【００４２】 定義された配列のタンパク質を構築するあるいは発現する手順は、当該技術分
野ではよく知られている。pp32r1、pp32r2、あるいはpp32r1あるいはpp32r2のい
ずれかの類似体をコードするDNA配列は、プライマー伸長、リンカー挿入およびP
CRを含むいくつかのアプローチの一つにより、化学的に合成するかあるいは野生
型配列から調製することができる（例えば、Sambrookら、を参照）。野生型配列
における付加、欠失、置換を有する変異体は、これらの技術により調製できる。
変異体を試験して、配列解析および／または以下に記載するアッセイにより、そ
れらが所望する配列であることを確かめることは好ましい。試験する変異体タン
パク質は、プロモーターの調節下でベクター内にポリペプチドのコード配列を配
置することにより調製することができ、それによりDNA配列は、この（発現）ベ
クターにより形質転換される宿主細胞においてRNAに転写されてタンパク質に翻
訳される。変異体タンパク質は、ポリペプチドが発現する条件下で、変異体のコ
ード配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションされる宿主細胞が成長
することで産生されうる。適当な成長条件の選択は当該技術分野内にある。
野ではよく知られている。pp32r1、pp32r2、あるいはpp32r1あるいはpp32r2のい
ずれかの類似体をコードするDNA配列は、プライマー伸長、リンカー挿入およびP
CRを含むいくつかのアプローチの一つにより、化学的に合成するかあるいは野生
型配列から調製することができる（例えば、Sambrookら、を参照）。野生型配列
における付加、欠失、置換を有する変異体は、これらの技術により調製できる。
変異体を試験して、配列解析および／または以下に記載するアッセイにより、そ
れらが所望する配列であることを確かめることは好ましい。試験する変異体タン
パク質は、プロモーターの調節下でベクター内にポリペプチドのコード配列を配
置することにより調製することができ、それによりDNA配列は、この（発現）ベ
クターにより形質転換される宿主細胞においてRNAに転写されてタンパク質に翻
訳される。変異体タンパク質は、ポリペプチドが発現する条件下で、変異体のコ
ード配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションされる宿主細胞が成長
することで産生されうる。適当な成長条件の選択は当該技術分野内にある。
【００４３】 組み立てられた配列は適当なベクターあるいはレプリコンのいずれかの中でク
ローン化することができ、そこで組み立てられた配列を含有しないベクターを実
質的に含まない組成物として維持することができる。これは組み立てられた配列
のリザーバーを提供し、部分あるいは全配列は、制限酵素を用いてリザーバー物
質内のDNAから切り出すことによりあるいはPCR増幅によりリザーバーから抽出で
きる。多くのクローニングベクターは当業者に知られており、適当なクローニン
グベクターの選択は選択対象の種類（choice）の問題である（例えば、本明細書
中で参考文献として援用されるSambrookら、を参照）。適当なDNA配列により連
結する所望するDNA部分を含むベクターの構築は、部分を構築するために使用さ
れるものと同様な技術により成し遂げられる。これらのベクターは、（原核生物
宿主と哺乳類宿主の間を往復するための）シャトルベクターを構築するためのバ
クテリア複製開始点などの、さらなるDNA部分を含有するために構築されうる。
ローン化することができ、そこで組み立てられた配列を含有しないベクターを実
質的に含まない組成物として維持することができる。これは組み立てられた配列
のリザーバーを提供し、部分あるいは全配列は、制限酵素を用いてリザーバー物
質内のDNAから切り出すことによりあるいはPCR増幅によりリザーバーから抽出で
きる。多くのクローニングベクターは当業者に知られており、適当なクローニン
グベクターの選択は選択対象の種類（choice）の問題である（例えば、本明細書
中で参考文献として援用されるSambrookら、を参照）。適当なDNA配列により連
結する所望するDNA部分を含むベクターの構築は、部分を構築するために使用さ
れるものと同様な技術により成し遂げられる。これらのベクターは、（原核生物
宿主と哺乳類宿主の間を往復するための）シャトルベクターを構築するためのバ
クテリア複製開始点などの、さらなるDNA部分を含有するために構築されうる。
【００４４】 組換えペプチドの産生 好ましくは、選択されたクローン由来のDNAは、発現ベクター内でサブクロー
ニングされるべきであり、ベクターを用いて形質転換された細胞により発現した
タンパク質は、以下に記載されるように調製される本発明の組換えタンパク質に
対する抗体を用いて免疫反応性を試験されるべきである。そのようなサブクロー
ニングは、本開示を考慮すると容易に当業者の技術内のものとなる。本発明のDN
A配列のアミノ酸コード領域は、DNA配列により発現する組換えペプチドが、pp32
r1、pp32r2、あるいは他の所望されるpp32変異体と特異的に免疫反応する抗体と
交差反応するエピトープを少なくとも一つ保持する限りは、開示された配列のコ
ード領域よりも長くても、あるいは短かくてもよい。pp32r1あるいはpp32r2の全
てのあるいは一部の配列に対応するDNA配列を含有する選択されたクローンの調
製は、本明細書で提供する情報に加えて従来の分子生物学的な技術を用いて、当
業者によって成し遂げられうる。
ニングされるべきであり、ベクターを用いて形質転換された細胞により発現した
タンパク質は、以下に記載されるように調製される本発明の組換えタンパク質に
対する抗体を用いて免疫反応性を試験されるべきである。そのようなサブクロー
ニングは、本開示を考慮すると容易に当業者の技術内のものとなる。本発明のDN
A配列のアミノ酸コード領域は、DNA配列により発現する組換えペプチドが、pp32
r1、pp32r2、あるいは他の所望されるpp32変異体と特異的に免疫反応する抗体と
交差反応するエピトープを少なくとも一つ保持する限りは、開示された配列のコ
ード領域よりも長くても、あるいは短かくてもよい。pp32r1あるいはpp32r2の全
てのあるいは一部の配列に対応するDNA配列を含有する選択されたクローンの調
製は、本明細書で提供する情報に加えて従来の分子生物学的な技術を用いて、当
業者によって成し遂げられうる。
【００４５】 適当な組織／液体源から、pp32に特異的な抗体と交差反応するpp32r1などのpp
32変異体タンパク質を精製することは可能である；しかし、交差反応性pp32変異
体、あるいはその類似体も、そのようなタンパク質あるいはポリペプチドをコー
ドするDNA配列から組換え法により産生されうる。本発明の組換えタンパク質に
対応するポリペプチドは、本明細書中で記載されるように、哺乳類（好ましくは
ヒト）ライブラリーから選択されたクローン由来のDNAを含有す発現ベクターを
用いて細胞を形質転換することで得ることができる。適した発現ベクターおよび
宿主細胞の系は当業者によく知られており、例えば、Sambrookら, 1989に教示さ
れる。ペプチドは、クローン化されたDNAが発現する条件下で培養した形質転換
細胞を成長させることで得ることができる。もちろん、クローンにより発現する
ペプチドは、ペプチドが免疫学的に交差反応する限りにおいて、pp32r1あるいは
pp32r2よりも長くても、あるいは短かくてもよい。選択された発現ベクターによ
って、ペプチドは、分泌されるかあるいは細胞内に保持される融合タンパク質、
あるいは成熟タンパク質（mature protein）として、あるいは封入タンパク質（
inclusion protein）として発現しうる。所望するポリペプチドは、細胞破壊の
有無に関わらず、ペプチドの発現様式により、遠心分離、濾過、抽出などのよく
知られた手順により培養物から回収することができる。粗製の水性溶液あるいは
懸濁液は、当業者によく知られているタンパク質精製技術により、所望するペプ
チドを濃縮することができる。ポリペプチドの調製は、培養後処理（post-cultu
re processing）により除去されうる外来の配列を含むタンパク質の生合成を含
みうる。
32変異体タンパク質を精製することは可能である；しかし、交差反応性pp32変異
体、あるいはその類似体も、そのようなタンパク質あるいはポリペプチドをコー
ドするDNA配列から組換え法により産生されうる。本発明の組換えタンパク質に
対応するポリペプチドは、本明細書中で記載されるように、哺乳類（好ましくは
ヒト）ライブラリーから選択されたクローン由来のDNAを含有す発現ベクターを
用いて細胞を形質転換することで得ることができる。適した発現ベクターおよび
宿主細胞の系は当業者によく知られており、例えば、Sambrookら, 1989に教示さ
れる。ペプチドは、クローン化されたDNAが発現する条件下で培養した形質転換
細胞を成長させることで得ることができる。もちろん、クローンにより発現する
ペプチドは、ペプチドが免疫学的に交差反応する限りにおいて、pp32r1あるいは
pp32r2よりも長くても、あるいは短かくてもよい。選択された発現ベクターによ
って、ペプチドは、分泌されるかあるいは細胞内に保持される融合タンパク質、
あるいは成熟タンパク質（mature protein）として、あるいは封入タンパク質（
inclusion protein）として発現しうる。所望するポリペプチドは、細胞破壊の
有無に関わらず、ペプチドの発現様式により、遠心分離、濾過、抽出などのよく
知られた手順により培養物から回収することができる。粗製の水性溶液あるいは
懸濁液は、当業者によく知られているタンパク質精製技術により、所望するペプ
チドを濃縮することができる。ポリペプチドの調製は、培養後処理（post-cultu
re processing）により除去されうる外来の配列を含むタンパク質の生合成を含
みうる。
【００４６】 本明細書中で開示されるヌクレオチド配列およびそれらから発現するポリペプ
チドを使用することで、pp32r1あるいはpp32r2に対して高い結合親和性をもつが
、pp32および／またはpp32の他の変異体に対してはかなり低い親和性をもつ抗体
を得ることができる。そのような抗体は、モノクローナルあるいは精製されたポ
リクローナル抗体のどちらかであるかに関わらず、pp32r1あるいはpp32r2を特異
的に検出するために使用することができる。pp32の検出に適した診断的アッセイ
、ならびに診断的手順に使用するためのポリペプチド、抗体および核酸プローブ
を調製する技術は、米国特許番号5,726,018および5,734,022に記載されて、本明
細書中で参考文献として援用され、これらの技術は本明細書中で開示される核酸
配列の置換によりpp32r1あるいはpp32r2に適用されうる。同様な置換はpp32の他
の変異体に対しても適用されうる。
チドを使用することで、pp32r1あるいはpp32r2に対して高い結合親和性をもつが
、pp32および／またはpp32の他の変異体に対してはかなり低い親和性をもつ抗体
を得ることができる。そのような抗体は、モノクローナルあるいは精製されたポ
リクローナル抗体のどちらかであるかに関わらず、pp32r1あるいはpp32r2を特異
的に検出するために使用することができる。pp32の検出に適した診断的アッセイ
、ならびに診断的手順に使用するためのポリペプチド、抗体および核酸プローブ
を調製する技術は、米国特許番号5,726,018および5,734,022に記載されて、本明
細書中で参考文献として援用され、これらの技術は本明細書中で開示される核酸
配列の置換によりpp32r1あるいはpp32r2に適用されうる。同様な置換はpp32の他
の変異体に対しても適用されうる。
【００４７】 pp32r1プロモーター配列 pp32r1コード領域から上流のゲノム配列に見出される、活性化ステロイド受容
体に結合する複数のコンセンサス配列は、遺伝子発現のホルモン制御と一致する
。コンセンサス配列は、ステロイドホルモンによる発現の誘導および抑制の両方
に関連した。陽性および陰性の作用をする要素の両方の組み合わせにより、pp32
r1発現の複雑な制御が示唆される。
体に結合する複数のコンセンサス配列は、遺伝子発現のホルモン制御と一致する
。コンセンサス配列は、ステロイドホルモンによる発現の誘導および抑制の両方
に関連した。陽性および陰性の作用をする要素の両方の組み合わせにより、pp32
r1発現の複雑な制御が示唆される。
【００４８】 pp32r1発現の可能なステロイドホルモン制御は、前立腺癌に関して重要である
。治療した患者の約半数は最初アンドロゲン除去に反応するが、続くホルモン反
射（refraction）および継続する攻撃的な腫瘍の成長は共通である（Garnick, M
.B., “Prostate Cancer,” in Scientific American Medicine, Dale, D.C. an
d Federman, D.D. Eds., Scientific American Inc., New York, 1995）。多く
の異なるステロイドホルモンは前立腺癌細胞の成長を制御する（Hugginsら, “S
tudies on prostate cancer: I. The effect of castration, of estrogen, and
of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of
the prostate,” Cancer Res., I:293, 1941）。これらの知見により、転移前立
腺癌の治療のためのアンドロゲン除去療法の基礎が確立された。
。治療した患者の約半数は最初アンドロゲン除去に反応するが、続くホルモン反
射（refraction）および継続する攻撃的な腫瘍の成長は共通である（Garnick, M
.B., “Prostate Cancer,” in Scientific American Medicine, Dale, D.C. an
d Federman, D.D. Eds., Scientific American Inc., New York, 1995）。多く
の異なるステロイドホルモンは前立腺癌細胞の成長を制御する（Hugginsら, “S
tudies on prostate cancer: I. The effect of castration, of estrogen, and
of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of
the prostate,” Cancer Res., I:293, 1941）。これらの知見により、転移前立
腺癌の治療のためのアンドロゲン除去療法の基礎が確立された。
【００４９】 本発明は、図2のゲノム配列の上流部分に基づくアンドロゲン活性化プロモー
ターを提供する。本発明により提供されるプロモーター配列は、コード配列の翻
訳開始コドンのそばの3'末端に結合し、上流（5'方向）に伸長して、少なくとも
バックグラウンドより上のレベルで転写を開始するために必要な数の塩基あるい
は要素を含む。プロモーター配列内には、（ヌクレアーゼS1を用いたマッピッン
グにより都合よく定義される）転写開始部位、一般的にTATAボックスという転写
開始部位の約100塩基上流内にあるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列
）（TATAボックス結合タンパク質およびRNAポリメラーゼのための結合部位）、
およびTATAボックスの上流にあり、転写開始部位およびTATAボックスの基本的な
転写活性をモジュレーションする様々な他のタンパク質結合ドメイン（コンセン
サス配列）が見出されるであろう。好ましくは、様々な他のタンパク質結合ドメ
インは、(1)アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受
容体、およびプロゲステロン受容体；(2) Fos、Jun、JunB、およびMycを含むが
、これらには限定されない、ロイシンジッパーモチーフを含有する転写因子；お
よび、(3) GATA-1およびGATA-2を含むが、これらには限定されない、特定の組織
特異的転写因子、を結合するための、表1に示される認識配列を含有する。TATA
ボックス上流の様々な他のタンパク質結合ドメインは、プロモーターの特異性（
組織特異的発現）、正確性（正しい開始）、および強さ（転写頻度）に寄与しう
る。プロモーター要素はオーバーラップする機能を供給し、そのためプロモータ
ーはこれらの要素のサブセットがない場合に機能しうる。
ターを提供する。本発明により提供されるプロモーター配列は、コード配列の翻
訳開始コドンのそばの3'末端に結合し、上流（5'方向）に伸長して、少なくとも
バックグラウンドより上のレベルで転写を開始するために必要な数の塩基あるい
は要素を含む。プロモーター配列内には、（ヌクレアーゼS1を用いたマッピッン
グにより都合よく定義される）転写開始部位、一般的にTATAボックスという転写
開始部位の約100塩基上流内にあるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列
）（TATAボックス結合タンパク質およびRNAポリメラーゼのための結合部位）、
およびTATAボックスの上流にあり、転写開始部位およびTATAボックスの基本的な
転写活性をモジュレーションする様々な他のタンパク質結合ドメイン（コンセン
サス配列）が見出されるであろう。好ましくは、様々な他のタンパク質結合ドメ
インは、(1)アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受
容体、およびプロゲステロン受容体；(2) Fos、Jun、JunB、およびMycを含むが
、これらには限定されない、ロイシンジッパーモチーフを含有する転写因子；お
よび、(3) GATA-1およびGATA-2を含むが、これらには限定されない、特定の組織
特異的転写因子、を結合するための、表1に示される認識配列を含有する。TATA
ボックス上流の様々な他のタンパク質結合ドメインは、プロモーターの特異性（
組織特異的発現）、正確性（正しい開始）、および強さ（転写頻度）に寄与しう
る。プロモーター要素はオーバーラップする機能を供給し、そのためプロモータ
ーはこれらの要素のサブセットがない場合に機能しうる。
【００５０】 療法 いずれかの手段によりpp32の変異体を前形質転換する（protransforming）機
能を阻害することは、療法の達成方法として期待されるであろう。代替遺伝子の
使用によるpp32における表現型的な変化は、ヒト前立腺癌の共通した特徴であり
、pp32の表現型における変化は、腫瘍遺伝子の潜在性の変化を伴う。代替遺伝子
の使用による腫瘍遺伝子の潜在性のモジュレーションは、興味深い意味をもつ。
pp32および変異体pp32種のエネルギー最少化プログラムにより予想される構造の
予備的な比較により、pp32および変異体pp32種における異なる機械的な経路との
相互作用の基礎を形成しうる重大な構造的な違いが示唆される。時間的な観点か
ら、新生物的な過程の初期においてpp32ファミリーの代替pp32遺伝子の使用がど
の程度起こるかはまだ明らかではない。前立腺癌における代替pp32遺伝子使用に
共通なできごとは、それが腫瘍形成では初期の重要なできごとでありうることを
示唆する。
能を阻害することは、療法の達成方法として期待されるであろう。代替遺伝子の
使用によるpp32における表現型的な変化は、ヒト前立腺癌の共通した特徴であり
、pp32の表現型における変化は、腫瘍遺伝子の潜在性の変化を伴う。代替遺伝子
の使用による腫瘍遺伝子の潜在性のモジュレーションは、興味深い意味をもつ。
pp32および変異体pp32種のエネルギー最少化プログラムにより予想される構造の
予備的な比較により、pp32および変異体pp32種における異なる機械的な経路との
相互作用の基礎を形成しうる重大な構造的な違いが示唆される。時間的な観点か
ら、新生物的な過程の初期においてpp32ファミリーの代替pp32遺伝子の使用がど
の程度起こるかはまだ明らかではない。前立腺癌における代替pp32遺伝子使用に
共通なできごとは、それが腫瘍形成では初期の重要なできごとでありうることを
示唆する。
【００５１】 代替遺伝子使用は潜在的に可逆的であり、さらなる重要な臨床的なおよび機械
的な意味をもつ。腫瘍細胞の悪性の潜在性は、内在性遺伝子療法の形式において
pp32ファミリーの構成員の発現パターンを操作することで修飾されうる。いくつ
かの可能性が存在する。一つの可能性は、15q22.3-q23に位置するpp32の変異お
よび異型接合性の欠失（LOH）が、どういうわけかpp32r1およびpp32r2の発現の
増加を誘導する、というものである。しかし、15q22.3-q23の染色体欠失は前立
腺癌に共通な特徴ではないため、LOHはありそうにない。病原的および療法的な
観点の両方からさらに興味深いことは、制御の異常型を伴う可能性である。後生
的な制御は、メチル化および脱メチル化などの手段により、pp32遺伝子の不活性
化およびpp32r1およびpp32r2遺伝子の随伴した活性化を誘導しうる。もう一つの
機構は、pp32r1およびpp32r2を誘導する間に、ディファレンシャルに作用してpp
32を抑制する一つあるいはそれ以上の転写因子による制御を伴う可能性がある。
最終的には、後-転写機構（post-transcriptional mechanisms）も引き出されう
るが、それによりディファレンシャルな発現はmRNAあるいはタンパク質の安定性
における変化によって制御されるであろう。発癌の観点から、後者の機構の全て
は、ゲノムにおいて不可逆的な構造的変化より、形成的（plastic）で潜在的な
可逆的な制御の変化によって腫瘍形成に寄与するだろう。従って、前立腺癌にお
いて薬理学的な予防的および療法的ストラテジーの標的として最終的にpp32ファ
ミリーを使用することは想像できる。
的な意味をもつ。腫瘍細胞の悪性の潜在性は、内在性遺伝子療法の形式において
pp32ファミリーの構成員の発現パターンを操作することで修飾されうる。いくつ
かの可能性が存在する。一つの可能性は、15q22.3-q23に位置するpp32の変異お
よび異型接合性の欠失（LOH）が、どういうわけかpp32r1およびpp32r2の発現の
増加を誘導する、というものである。しかし、15q22.3-q23の染色体欠失は前立
腺癌に共通な特徴ではないため、LOHはありそうにない。病原的および療法的な
観点の両方からさらに興味深いことは、制御の異常型を伴う可能性である。後生
的な制御は、メチル化および脱メチル化などの手段により、pp32遺伝子の不活性
化およびpp32r1およびpp32r2遺伝子の随伴した活性化を誘導しうる。もう一つの
機構は、pp32r1およびpp32r2を誘導する間に、ディファレンシャルに作用してpp
32を抑制する一つあるいはそれ以上の転写因子による制御を伴う可能性がある。
最終的には、後-転写機構（post-transcriptional mechanisms）も引き出されう
るが、それによりディファレンシャルな発現はmRNAあるいはタンパク質の安定性
における変化によって制御されるであろう。発癌の観点から、後者の機構の全て
は、ゲノムにおいて不可逆的な構造的変化より、形成的（plastic）で潜在的な
可逆的な制御の変化によって腫瘍形成に寄与するだろう。従って、前立腺癌にお
いて薬理学的な予防的および療法的ストラテジーの標的として最終的にpp32ファ
ミリーを使用することは想像できる。
【００５２】 本明細書中で参考文献として受け入れられる米国特許番号5,726,018は、本明
細書中で開示されるヌクレオチドおよびタンパク質配列に基づいて、当業者に適
用されうる様々な療法的な方法を記載する。特別な態様において、pp32r1あるい
はpp32r2の全てあるいは一部の配列はアンチセンス方向で供給され、癌、特に前
立腺癌に見出される変異体の発現を阻害しうる。アンチセンス発現ベクターの調
製およびアンチセンス療法の投与のために適した方法は、本明細書中で参考文献
として援用される米国特許番号5,756,676に見出すことができる。特定のpp32変
異体を発現する腫瘍を有する患者を同定するために、本明細書中で記載される診
断的方法を使用して患者集団をプレスクリーニングすることは好ましい。
細書中で開示されるヌクレオチドおよびタンパク質配列に基づいて、当業者に適
用されうる様々な療法的な方法を記載する。特別な態様において、pp32r1あるい
はpp32r2の全てあるいは一部の配列はアンチセンス方向で供給され、癌、特に前
立腺癌に見出される変異体の発現を阻害しうる。アンチセンス発現ベクターの調
製およびアンチセンス療法の投与のために適した方法は、本明細書中で参考文献
として援用される米国特許番号5,756,676に見出すことができる。特定のpp32変
異体を発現する腫瘍を有する患者を同定するために、本明細書中で記載される診
断的方法を使用して患者集団をプレスクリーニングすることは好ましい。
【００５３】 前立腺癌における療法的効果を有する化合物のスクリーニングも、本発明によ
り容易となりうる。候補の化合物をスクリーニングするために使用されうる研究
は、本明細書中で参考文献として援用される米国特許番号5,756,676に記載され
ており、pp32の特定の変異体を発現する細胞株の使用により修飾される（以下の
実施例を参照）。ステロイド依存性タンパク質発現に影響する化合物も、その発
現を検出することができるDNA配列と機能的にカップリングして、本明細書中で
提供されるアンドロゲン-活性化プロモーターを使用する同様なスクリーニング
研究により、本発明に従って検出されうる。（マーカー配列は当該技術分野でよ
く知られており、例えば、Sambrookらを参照、適当な検出可能な発現マーカーの
選択は当業者にとっては日常的なことである。）適当な対照を用いて、機能的に
発現マーカーとカップリングするアンドロゲン-活性化プロモーターを有する発
現ベクターを含有する組換え細胞に対する、候補の化合物の効果を試験すること
によるスクリーニングは、本明細書中で提供されるプロモーター配列を考慮する
と、当該技術分野の範囲内にある。一つの観点において、本発明は、(1)タンパ
ク質コード配列の少なくとも一つのエクソンを含むオープンリーディングフレー
ムと機能的に連結する、アンドロゲン-活性化転写プロモーターを含有するDNA分
子をトランスフェクションされた細胞を培養すること、および(2)化合物の存在
下および非存在下においてオープンリーディングフレームの発現を決定すること
、による薬理学的な活性のために候補の化合物をスクリーニングする方法を提供
する。好ましい態様において、アンドロゲン活性化プロモーターは翻訳開始部位
の上流の図2における配列の部分であってもよく、あるいはアンドロゲン活性化
プロモーターは翻訳開始部位から2700 bp上流であってもよい。潜在的な療法的
な化合物のスクリーニングのための同様な実験は、本明細書中に記載されるおよ
び／または本明細書中で参考文献として援用される国際特許公開（Internationa
l Patent Publication）WO 99/29906, Jun 17, 1999に記載されるスクリーニン
グ方法に従って、pp32r1あるいはpp32r2などのpp32変異体を発現する細胞株を使
用して行われうる。
り容易となりうる。候補の化合物をスクリーニングするために使用されうる研究
は、本明細書中で参考文献として援用される米国特許番号5,756,676に記載され
ており、pp32の特定の変異体を発現する細胞株の使用により修飾される（以下の
実施例を参照）。ステロイド依存性タンパク質発現に影響する化合物も、その発
現を検出することができるDNA配列と機能的にカップリングして、本明細書中で
提供されるアンドロゲン-活性化プロモーターを使用する同様なスクリーニング
研究により、本発明に従って検出されうる。（マーカー配列は当該技術分野でよ
く知られており、例えば、Sambrookらを参照、適当な検出可能な発現マーカーの
選択は当業者にとっては日常的なことである。）適当な対照を用いて、機能的に
発現マーカーとカップリングするアンドロゲン-活性化プロモーターを有する発
現ベクターを含有する組換え細胞に対する、候補の化合物の効果を試験すること
によるスクリーニングは、本明細書中で提供されるプロモーター配列を考慮する
と、当該技術分野の範囲内にある。一つの観点において、本発明は、(1)タンパ
ク質コード配列の少なくとも一つのエクソンを含むオープンリーディングフレー
ムと機能的に連結する、アンドロゲン-活性化転写プロモーターを含有するDNA分
子をトランスフェクションされた細胞を培養すること、および(2)化合物の存在
下および非存在下においてオープンリーディングフレームの発現を決定すること
、による薬理学的な活性のために候補の化合物をスクリーニングする方法を提供
する。好ましい態様において、アンドロゲン活性化プロモーターは翻訳開始部位
の上流の図2における配列の部分であってもよく、あるいはアンドロゲン活性化
プロモーターは翻訳開始部位から2700 bp上流であってもよい。潜在的な療法的
な化合物のスクリーニングのための同様な実験は、本明細書中に記載されるおよ
び／または本明細書中で参考文献として援用される国際特許公開（Internationa
l Patent Publication）WO 99/29906, Jun 17, 1999に記載されるスクリーニン
グ方法に従って、pp32r1あるいはpp32r2などのpp32変異体を発現する細胞株を使
用して行われうる。
【００５４】 pp32遺伝子ファミリーに基づいた診断的方法 一つの観点において、本発明はpp32遺伝子ファミリーの構成員を検出および識
別する方法を提供する。本明細書中で説明されるように、遺伝子ファミリーの一
つあるいはそれ以上の構成員の存在は、共通あるいは同様な配列に起因する構成
員間での共通構造に基づいたアッセイを使用して検出されうる。例えば、pp32に
より誘導されるポリクローナル抗体は、これらのpp32変異体の様々なアリルを含
むpp32r1およびpp32r2、と交差反応をするだろう。同様に、pp32 cDNAの完全な
コード領域は、pp32r1あるいはpp32r2のどちらかのアリル的形態を含有すること
が結果的に示された腫瘍切片における変異体のin situ検出によって示されるよ
うに、変異体のいずれかをコードする核酸と適した条件下でハイブリダイズする
であろう（実施例1）。そのような検出に必要な免疫交差反応性あるいは交差ハ
イブリダイゼーションを促進する条件の選択は、本明細書中で提供される実施例
を考慮すると当該技術分野の範囲内にある。例えば、ハイブリダイゼーション実
験において大型のヌクレオチドプローブを使用することにより、配列の一つある
いは数個の違いの効果は克服されうる、すなわちより大型のプローブは、より同
様でない標的配列に結合するであろうし、対して、より短いプローブは各々のヌ
クレオチドが親和性により大きなパーセンテージで寄与するであろうし、一つの
ヌクレオチドの変異がハイブリダイゼーション効率においてより大きな相対的減
少を起こすであろう。50あるいはそれ以上のヌクレオチドの典型的なプローブを
与えられた配列に対する相同体を見つけるために使用して、そして実施例1に報
告される研究では、プローブとしてpp32の全配列を使用してpp32以外の遺伝子フ
ァミリーの相同な構成員を発現する細胞を見つけた。同様に、複数のエピトープ
を有する抗体に対して誘導化するポリクローナル抗体は、多くの異なるエピトー
プに加えて数個の同じエピトープを有する二次抗原との交差反応をより起こしそ
うであるが、一方モノクローナル抗体あるいは精製したポリクローナル抗血清で
さえ二次抗原と結合しないかもしれない。
別する方法を提供する。本明細書中で説明されるように、遺伝子ファミリーの一
つあるいはそれ以上の構成員の存在は、共通あるいは同様な配列に起因する構成
員間での共通構造に基づいたアッセイを使用して検出されうる。例えば、pp32に
より誘導されるポリクローナル抗体は、これらのpp32変異体の様々なアリルを含
むpp32r1およびpp32r2、と交差反応をするだろう。同様に、pp32 cDNAの完全な
コード領域は、pp32r1あるいはpp32r2のどちらかのアリル的形態を含有すること
が結果的に示された腫瘍切片における変異体のin situ検出によって示されるよ
うに、変異体のいずれかをコードする核酸と適した条件下でハイブリダイズする
であろう（実施例1）。そのような検出に必要な免疫交差反応性あるいは交差ハ
イブリダイゼーションを促進する条件の選択は、本明細書中で提供される実施例
を考慮すると当該技術分野の範囲内にある。例えば、ハイブリダイゼーション実
験において大型のヌクレオチドプローブを使用することにより、配列の一つある
いは数個の違いの効果は克服されうる、すなわちより大型のプローブは、より同
様でない標的配列に結合するであろうし、対して、より短いプローブは各々のヌ
クレオチドが親和性により大きなパーセンテージで寄与するであろうし、一つの
ヌクレオチドの変異がハイブリダイゼーション効率においてより大きな相対的減
少を起こすであろう。50あるいはそれ以上のヌクレオチドの典型的なプローブを
与えられた配列に対する相同体を見つけるために使用して、そして実施例1に報
告される研究では、プローブとしてpp32の全配列を使用してpp32以外の遺伝子フ
ァミリーの相同な構成員を発現する細胞を見つけた。同様に、複数のエピトープ
を有する抗体に対して誘導化するポリクローナル抗体は、多くの異なるエピトー
プに加えて数個の同じエピトープを有する二次抗原との交差反応をより起こしそ
うであるが、一方モノクローナル抗体あるいは精製したポリクローナル抗血清で
さえ二次抗原と結合しないかもしれない。
【００５５】 pp32遺伝子ファミリーの一つあるいはそれ以上の構成員の存在を決定すること
に加えて、本発明は構成員間の識別をする方法も提供する。例えば、組織試料に
おいて形質転換促進性あるいは抑制性変異体が存在するかどうかを決定するため
に、どのpp32変異体が有用でありうるかということを決定する。識別のために適
した方法は、免疫アッセイおよび核酸結合アッセイの両方を含む。標的分析物（
analyte）のための検出リガンド（例えば、抗体あるいはオリゴヌクレオチド）
の親和性において、10倍の差異を検出できる方法が好ましい。そのような方法は
他の系でよく記述されており、それを採用することで、本明細書中で提供される
ガイダンスを考慮すると、そのような方法の日常的な修飾によってpp32変異体間
を識別することができる。
に加えて、本発明は構成員間の識別をする方法も提供する。例えば、組織試料に
おいて形質転換促進性あるいは抑制性変異体が存在するかどうかを決定するため
に、どのpp32変異体が有用でありうるかということを決定する。識別のために適
した方法は、免疫アッセイおよび核酸結合アッセイの両方を含む。標的分析物（
analyte）のための検出リガンド（例えば、抗体あるいはオリゴヌクレオチド）
の親和性において、10倍の差異を検出できる方法が好ましい。そのような方法は
他の系でよく記述されており、それを採用することで、本明細書中で提供される
ガイダンスを考慮すると、そのような方法の日常的な修飾によってpp32変異体間
を識別することができる。
【００５６】 タンパク質レベルのアッセイは、一つの変異体についてもう一つと比べて相対
的に大きな親和性のモノクローナルあるいは精製したポリクローナル抗体に依存
する（例えば、Smithら（抗体-ハプテン相互作用を支配する変化する主要な動態
は複合体の解離速度であり、抗体-ハプテン関係の強さは解離の活性化エネルギ
ーにより原則的に決定されている、ということを示す、“Kinetics in interact
ions between antibodies and haptens,” Biochemistry, 14(7):1496-1502, 19
75）、およびPontarottiら（様々な二量体アルカロイドを結合し、特定の二量体
アルカロイドに対する様々なモノクローナル抗体の異なる相対的な親和性のため
に、アルカロイドハプテンの識別ができるモノクローナル抗体の組を記載する、
“Monoclonal antibodies to antitumor Vinca alkaloids: thermodynamics and
kinetics,” Molecular Immunology, 22(3):277-84, 1985）を参照、これらの
各々は本明細書中で参考文献として援用される）。異なる親和性を有するモノク
ローナル抗体の相対的な親和性を強調するための免疫アッセイの条件に適した修
飾も、米国特許番号5,759,791に議論されており、本明細書中で参考文献として
援用される。
的に大きな親和性のモノクローナルあるいは精製したポリクローナル抗体に依存
する（例えば、Smithら（抗体-ハプテン相互作用を支配する変化する主要な動態
は複合体の解離速度であり、抗体-ハプテン関係の強さは解離の活性化エネルギ
ーにより原則的に決定されている、ということを示す、“Kinetics in interact
ions between antibodies and haptens,” Biochemistry, 14(7):1496-1502, 19
75）、およびPontarottiら（様々な二量体アルカロイドを結合し、特定の二量体
アルカロイドに対する様々なモノクローナル抗体の異なる相対的な親和性のため
に、アルカロイドハプテンの識別ができるモノクローナル抗体の組を記載する、
“Monoclonal antibodies to antitumor Vinca alkaloids: thermodynamics and
kinetics,” Molecular Immunology, 22(3):277-84, 1985）を参照、これらの
各々は本明細書中で参考文献として援用される）。異なる親和性を有するモノク
ローナル抗体の相対的な親和性を強調するための免疫アッセイの条件に適した修
飾も、米国特許番号5,759,791に議論されており、本明細書中で参考文献として
援用される。
【００５７】 配列において一つ程度のヌクレオチドが異なる核酸配列間の識別を可能にする
多くの方法が利用できる。例えば、リガーゼ連鎖反応を使用して、様々な遺伝子
において点変異を検出している（例えば、Abravayaら, “Detection of point m
utations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR),” Nucleic Acid
s Research, 23(4): 675-82, 1995、あるいはPfefferら, “A ligase chain rea
ction targeting two adjacent nucleotides allows the differentiation of c
owpox virus from other Orthopoxvirus species,” Journal of Virological M
ethods, 49(3):353-60, 1994、参照、それらの各々は本明細書中で参考文献とし
て援用される）。PCRによる配列の増幅も使用して、適したプライマー、例えば
、短いプライマー、好ましくは10-15が合致するヌクレオチド（ここでプライマ
ーの少なくとも一つが一つの変異体とは合致するが他の変異体とは合致しない独
特な塩基を3'末端にもつ）を選択すること、および独特な塩基を有するプライマ
ーが、完全に合致する変異体と完全には合致しない変異体との間において解離速
度に少なくとも10倍の差異をもつアニーリング条件を使用することにより配列を
識別しうる。同様な識別は、短いプローブ（典型的には50 bp以下、好ましくは2
5 bpあるいはそれ以下、さらに好ましくは20 bp以下あるいはさらに10-12 bp）
を使用すること、完全に合致する変異体と完全には合致しない変異体との間のプ
ローブについて、解離速度に少なくとも10倍の差異が達成されるようにハイブリ
ダイゼーション反応の条件を調節すること、によりハイブリダイゼーションに依
存した他の方法においても達成されうる。切断酵素断片長多型も使用することが
でき、以下の特定の実施例は、本明細書中で提供される配列を考慮すると、当業
者が他の切断酵素の日常的な選択により同様な研究を設定できるガイダンスを提
供する。
多くの方法が利用できる。例えば、リガーゼ連鎖反応を使用して、様々な遺伝子
において点変異を検出している（例えば、Abravayaら, “Detection of point m
utations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR),” Nucleic Acid
s Research, 23(4): 675-82, 1995、あるいはPfefferら, “A ligase chain rea
ction targeting two adjacent nucleotides allows the differentiation of c
owpox virus from other Orthopoxvirus species,” Journal of Virological M
ethods, 49(3):353-60, 1994、参照、それらの各々は本明細書中で参考文献とし
て援用される）。PCRによる配列の増幅も使用して、適したプライマー、例えば
、短いプライマー、好ましくは10-15が合致するヌクレオチド（ここでプライマ
ーの少なくとも一つが一つの変異体とは合致するが他の変異体とは合致しない独
特な塩基を3'末端にもつ）を選択すること、および独特な塩基を有するプライマ
ーが、完全に合致する変異体と完全には合致しない変異体との間において解離速
度に少なくとも10倍の差異をもつアニーリング条件を使用することにより配列を
識別しうる。同様な識別は、短いプローブ（典型的には50 bp以下、好ましくは2
5 bpあるいはそれ以下、さらに好ましくは20 bp以下あるいはさらに10-12 bp）
を使用すること、完全に合致する変異体と完全には合致しない変異体との間のプ
ローブについて、解離速度に少なくとも10倍の差異が達成されるようにハイブリ
ダイゼーション反応の条件を調節すること、によりハイブリダイゼーションに依
存した他の方法においても達成されうる。切断酵素断片長多型も使用することが
でき、以下の特定の実施例は、本明細書中で提供される配列を考慮すると、当業
者が他の切断酵素の日常的な選択により同様な研究を設定できるガイダンスを提
供する。
【００５８】 本発明の診断的方法は、本明細書中で記載されるように予防的な目的および患
者の識別のために使用されうる。特に、本発明の方法は、図7に開示される様々
な配列から発現する産物の識別を可能にする。pp32、pp32r1、および／またはpp
32r2間の検出および／または識別の方法は好ましい方法である。pp32変異体間の
識別が有益であろう状況は、本開示を考慮すると、熟練の臨床家にとって既に明
らかであろう。本発明により提供され、望ましい利益を達成するために適した技
術の診断的方法の選択は、熟練の臨床家にとっては日常的なことである。
者の識別のために使用されうる。特に、本発明の方法は、図7に開示される様々
な配列から発現する産物の識別を可能にする。pp32、pp32r1、および／またはpp
32r2間の検出および／または識別の方法は好ましい方法である。pp32変異体間の
識別が有益であろう状況は、本開示を考慮すると、熟練の臨床家にとって既に明
らかであろう。本発明により提供され、望ましい利益を達成するために適した技
術の診断的方法の選択は、熟練の臨床家にとっては日常的なことである。
【００５９】
本発明のより完全な理解を促すため、多数の実施例を以下に提供する。しかし
ながら、本発明の範囲は本実施例に開示される特定の態様に限定されず、それら
は例証のみを目的とする。
ながら、本発明の範囲は本実施例に開示される特定の態様に限定されず、それら
は例証のみを目的とする。
【００６０】 実施例1 pp32を発現する細胞の位置 pp32プローブを用いるin situハイブリダイゼーションにより、ストリンジェ
ント条件下で、pp32 mRNAを検出することができる。
ント条件下で、pp32 mRNAを検出することができる。
【００６１】 in situハイブリダイゼーション pp32 cDNA配列の塩基1-298（GenBank HSU73477）を、標準的手法によりBluesc
riptベクターにサブクローニングした。ジゴキシゲニンラベルされたアンチセン
ス及びセンスRNAプローブは、市販のキット（Boehringer Mannheim）を使用して
作成した。BamHl及びXholにより線状にしたベクターDNAを、それぞれアンチセン
ス及びセンスのプローブ作成のための鋳型として用いた。1μgの鋳型DNA、2 U/
μlのT3またはT7 RNAポリメラーゼのどちらか、1 U/μlのリボヌクレアーゼ阻害
剤、各1 mMのATP、CTP、GTP、0.65 mMのUTP、0.35 mMジゴキシゲニン-11-UTP、4
0 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM NaCl、10 mM DTT、6 mM MgCl2、及び、2 mMスペ
ルミジンを含む終容量20μlにおいて、37℃、2時間in vitro転写を行った。0.2
M EDTA、pH 8.0を2μl加えて反応を停止し、次に、合成した転写物を2.2μlの4
M LiCl及び前もって冷却したエタノール75μlを用い、-70℃、30分で沈澱させた
。遠心してRNAをペレットにし、80％エタノールで洗浄し、穏やかに乾燥させ、
そして、100μlのDEPC処理水に溶解した。ラベルされたプローブの収量を市販の
キット（Boehringer Mannheim）を使用し酵素結合免疫検定法（enzyme linked i
rrimunoassay）により決定した。in vitro転写により作成したアンチセンス及び
センスpp32 RNAプローブを用いて、非放射活性in situハイブリダイゼーション
を行なった（参考文献として本明細書中に援用される、アメリカ合衆国特許番号
5,726,018参照）。図1Aは、正常の前立腺基底細胞は陽性であり、一方、透明な
（clear）分化した腺細胞は陰性であることを示す。反対に前立腺腺癌は、左に
示すように著しく陽性である。本発明で検出されるのはタンパク質ではなくmRNA
であるため、シグナルは細胞質にあることに注意せよ。
riptベクターにサブクローニングした。ジゴキシゲニンラベルされたアンチセン
ス及びセンスRNAプローブは、市販のキット（Boehringer Mannheim）を使用して
作成した。BamHl及びXholにより線状にしたベクターDNAを、それぞれアンチセン
ス及びセンスのプローブ作成のための鋳型として用いた。1μgの鋳型DNA、2 U/
μlのT3またはT7 RNAポリメラーゼのどちらか、1 U/μlのリボヌクレアーゼ阻害
剤、各1 mMのATP、CTP、GTP、0.65 mMのUTP、0.35 mMジゴキシゲニン-11-UTP、4
0 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM NaCl、10 mM DTT、6 mM MgCl2、及び、2 mMスペ
ルミジンを含む終容量20μlにおいて、37℃、2時間in vitro転写を行った。0.2
M EDTA、pH 8.0を2μl加えて反応を停止し、次に、合成した転写物を2.2μlの4
M LiCl及び前もって冷却したエタノール75μlを用い、-70℃、30分で沈澱させた
。遠心してRNAをペレットにし、80％エタノールで洗浄し、穏やかに乾燥させ、
そして、100μlのDEPC処理水に溶解した。ラベルされたプローブの収量を市販の
キット（Boehringer Mannheim）を使用し酵素結合免疫検定法（enzyme linked i
rrimunoassay）により決定した。in vitro転写により作成したアンチセンス及び
センスpp32 RNAプローブを用いて、非放射活性in situハイブリダイゼーション
を行なった（参考文献として本明細書中に援用される、アメリカ合衆国特許番号
5,726,018参照）。図1Aは、正常の前立腺基底細胞は陽性であり、一方、透明な
（clear）分化した腺細胞は陰性であることを示す。反対に前立腺腺癌は、左に
示すように著しく陽性である。本発明で検出されるのはタンパク質ではなくmRNA
であるため、シグナルは細胞質にあることに注意せよ。
【００６２】 pp32はin vivoにおいて特有の発現パターンをみせる（Chen、ら；Malek、ら、
“Identification and preliminary characterization of two related prolife
ration-associated nuclear phosphoproteins.”Journal of Biological Chemis
try, 265:13400-13409, 1990; Walensky、ら、“A novel M(r) 32,000 nuclear
phosphoprotein is selectively expressed in cells competent for self-rene
wal,”Cancer Research 53:4720-4726, 1993）。正常末梢組織においては、腸の
クリプト上皮細胞、及び、皮膚の基底上皮といった幹様細胞集団に発現が限定さ
れ；成人の中枢神経系においては、大脳皮質のニューロン、及び、プルキンエ細
胞もまたpp32を発現する。正常前立腺においては、基底細胞がpp32を発現し、一
方分化した腺細胞ではpp32のmRNAはin situハイブリダイゼーションにより検出
することができない（図1A）。対照に、ほぼ全ての臨床的に重要なヒト前立腺腺
癌において、pp32プローブに強いin situハイブリダイゼーションがみとめられ
た。55人の患者の調査においてGleasonスコア4及びそれより下の前立腺癌では11
％のみであるのに対して、Gleasonスコアが5及びそれより上のヒト前立腺腺癌の
87％がpp32に対するプローブと強くハイブリダイゼーションするmRNAを発現する
。
“Identification and preliminary characterization of two related prolife
ration-associated nuclear phosphoproteins.”Journal of Biological Chemis
try, 265:13400-13409, 1990; Walensky、ら、“A novel M(r) 32,000 nuclear
phosphoprotein is selectively expressed in cells competent for self-rene
wal,”Cancer Research 53:4720-4726, 1993）。正常末梢組織においては、腸の
クリプト上皮細胞、及び、皮膚の基底上皮といった幹様細胞集団に発現が限定さ
れ；成人の中枢神経系においては、大脳皮質のニューロン、及び、プルキンエ細
胞もまたpp32を発現する。正常前立腺においては、基底細胞がpp32を発現し、一
方分化した腺細胞ではpp32のmRNAはin situハイブリダイゼーションにより検出
することができない（図1A）。対照に、ほぼ全ての臨床的に重要なヒト前立腺腺
癌において、pp32プローブに強いin situハイブリダイゼーションがみとめられ
た。55人の患者の調査においてGleasonスコア4及びそれより下の前立腺癌では11
％のみであるのに対して、Gleasonスコアが5及びそれより上のヒト前立腺腺癌の
87％がpp32に対するプローブと強くハイブリダイゼーションするmRNAを発現する
。
【００６３】 免疫組織化学 ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織を4μMの切片にし、脱パラフィン
化し、水和し、熱誘導性抗原回復のため、0.01 Mクエン酸緩衝液、pH 6.0中、95
℃で20分処理し（Cattoretti、ら、“Antigen unmasking on formalinfixed, pa
raffin-embedded tissue sections,”Journal of Pathology 171: 83-98,1993）
、その後、抗pp32抗体の1/20希釈液で室温、一晩インキュベートした。洗浄に続
き、スライドを連続的に1/100希釈したビオチン化ブタ抗ウサギIgG抗体（Dako）
、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Dako）、及び、ジアミノベンジジンを
用いて発色した。図1Bは、アフィニティー精製したウサギ抗pp32ポリクローナル
抗体で染色された典型的な高グレードのヒト前立腺癌を示す（Gusev、ら、“pp3
2 overexpression induces nuclear pleomorphism in rat prostatic carcinoma
cells,”Cell Proliferation 29: 643-653, 1996）。左側のパネルは250×の代
表的視野を示し、長方形は右側のパネルにコンピューターで作成した細部が示さ
れている領域を示す。強くハイブリダイゼーションしている腫瘍はpp32抗体で強
い免疫陽性を示し、pp32あるいは免疫学的に関連のあるタンパク質を発現してい
ることを示した（図1A及び1B）。
化し、水和し、熱誘導性抗原回復のため、0.01 Mクエン酸緩衝液、pH 6.0中、95
℃で20分処理し（Cattoretti、ら、“Antigen unmasking on formalinfixed, pa
raffin-embedded tissue sections,”Journal of Pathology 171: 83-98,1993）
、その後、抗pp32抗体の1/20希釈液で室温、一晩インキュベートした。洗浄に続
き、スライドを連続的に1/100希釈したビオチン化ブタ抗ウサギIgG抗体（Dako）
、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Dako）、及び、ジアミノベンジジンを
用いて発色した。図1Bは、アフィニティー精製したウサギ抗pp32ポリクローナル
抗体で染色された典型的な高グレードのヒト前立腺癌を示す（Gusev、ら、“pp3
2 overexpression induces nuclear pleomorphism in rat prostatic carcinoma
cells,”Cell Proliferation 29: 643-653, 1996）。左側のパネルは250×の代
表的視野を示し、長方形は右側のパネルにコンピューターで作成した細部が示さ
れている領域を示す。強くハイブリダイゼーションしている腫瘍はpp32抗体で強
い免疫陽性を示し、pp32あるいは免疫学的に関連のあるタンパク質を発現してい
ることを示した（図1A及び1B）。
【００６４】 表面上は、図1A及び1Bに示された局在のデータは、形質転換といった腫瘍形成
機能のその阻害能にも関わらず、pp32は、正常及び腫瘍性前立腺上皮細胞の両方
で発現することを示した。この明らかに一致しない発現に対する説明は、前立腺
の腫瘍はpp32を全体的に発現しないが、形質転換を阻害するかわりに、それを促
進するpp32の変異種を、むしろ発現するということである。
機能のその阻害能にも関わらず、pp32は、正常及び腫瘍性前立腺上皮細胞の両方
で発現することを示した。この明らかに一致しない発現に対する説明は、前立腺
の腫瘍はpp32を全体的に発現しないが、形質転換を阻害するかわりに、それを促
進するpp32の変異種を、むしろ発現するということである。
【００６５】 実施例2 pp32に対応するEST 可能性のあるいくつかのpp32変異種はthe NCI's Cancer Genome Anatomy Proj
ectの前立腺癌発現配列タグ（expressed sequence tag）ライブラリーから同定
された。クローン588488はAPRILと96％の同一性をもつタンパク質をコードする
が、クローン全体の回復及び配列決定はなく、ESTクローン全体がpp32関連配列
をコードするか見分けることは不可能で；この分子の生物学的機能を調べること
も現時点では不可能である。それにもかかわらず、その配列決定された部分がpp
32と高い相同性をもつタンパク質をコードすることは明らかである。このESTは
正常な前立腺のデータベースにはない。前立腺癌から取り出されたpp32変異種と
同様に、変異によるこの分子の作成は複雑な機構を必要とするだろう。
ectの前立腺癌発現配列タグ（expressed sequence tag）ライブラリーから同定
された。クローン588488はAPRILと96％の同一性をもつタンパク質をコードする
が、クローン全体の回復及び配列決定はなく、ESTクローン全体がpp32関連配列
をコードするか見分けることは不可能で；この分子の生物学的機能を調べること
も現時点では不可能である。それにもかかわらず、その配列決定された部分がpp
32と高い相同性をもつタンパク質をコードすることは明らかである。このESTは
正常な前立腺のデータベースにはない。前立腺癌から取り出されたpp32変異種と
同様に、変異によるこの分子の作成は複雑な機構を必要とするだろう。
【００６６】 pp32関連遺伝子は他の生物にも存在する。げっ歯類におけるpp32遺伝子ファミ
リーの存在は、ヒトにおける匹敵するサイズのファミリーの存在と矛盾しないだ
ろう。マウスpp32（GenBank U73478）はpp32と89％のアミノ酸同一性をもつが、
pp32r1及びAPRILとの同一性は少ない（マウス小脳ロイシンリッチ酸性核タンパ
ク質はマウスpp32と比較して1つのアミノ酸の置換をもつ）。我々はさらに、予
想されるオープンリーディングフレームの148アミノ酸にわたり、85％同一性で
、APRILタンパク質と最も高い同一性をもつ、マウスEST、GenBank AA066733を同
定した。いくつかの他のマウスEST、AA212094及びW82526は、pp32ファミリーと
密接な関連性があるが、pp32、pp32r1あるいはAPRILのいずれかと著しくより関
連性があることはない。前記遺伝子のヒトホモログは、この遺伝子ファミリーの
4番目のメンバーをコードすることが予測され得る。我々はpp32関連タンパク質
をコードすることが予測されるESTを、線虫（C. elegans）、住血吸虫、ゼブラ
フィッシュ、及び、ショウジョウバエで同定した（データは示さない）。しかし
ながら、これらの配列はこれらの生物においてpp32遺伝子ファミリーの全部の範
囲を示すことができず、また、従って、ほ乳類のpp32遺伝子ファミリーの適当な
サイズについての情報を与えない。
リーの存在は、ヒトにおける匹敵するサイズのファミリーの存在と矛盾しないだ
ろう。マウスpp32（GenBank U73478）はpp32と89％のアミノ酸同一性をもつが、
pp32r1及びAPRILとの同一性は少ない（マウス小脳ロイシンリッチ酸性核タンパ
ク質はマウスpp32と比較して1つのアミノ酸の置換をもつ）。我々はさらに、予
想されるオープンリーディングフレームの148アミノ酸にわたり、85％同一性で
、APRILタンパク質と最も高い同一性をもつ、マウスEST、GenBank AA066733を同
定した。いくつかの他のマウスEST、AA212094及びW82526は、pp32ファミリーと
密接な関連性があるが、pp32、pp32r1あるいはAPRILのいずれかと著しくより関
連性があることはない。前記遺伝子のヒトホモログは、この遺伝子ファミリーの
4番目のメンバーをコードすることが予測され得る。我々はpp32関連タンパク質
をコードすることが予測されるESTを、線虫（C. elegans）、住血吸虫、ゼブラ
フィッシュ、及び、ショウジョウバエで同定した（データは示さない）。しかし
ながら、これらの配列はこれらの生物においてpp32遺伝子ファミリーの全部の範
囲を示すことができず、また、従って、ほ乳類のpp32遺伝子ファミリーの適当な
サイズについての情報を与えない。
【００６７】 実施例3 pp32ファミリーの関連物（relative）をコードする遺伝子構造 バクテリオファージに組み込まれたヒトゲノムライブラリーを、ヒトpp32 cDN
Aから作成したプローブを用いてスクリーニングし、pp32と相同なタンパク質を
コードするオープンリーディングフレームを含む、新しい配列を得た。
Aから作成したプローブを用いてスクリーニングし、pp32と相同なタンパク質を
コードするオープンリーディングフレームを含む、新しい配列を得た。
【００６８】 バクテリオファージに組み込まれたヒトゲノムライブラリーのpp32 cDNAに対
するスクリーニング Lambda Fix IIベクターに組み込まれたヒト胎盤由来のゲノムライブラリーをE
. coli株XL-1 Blue MRA（Stratagene #946206）に発現させた。pp32 cDNAと相同
性なDNAインサートを含む、バクテリオファージクローンのスクリーニングは日
常的な方法に従った（Sambrook、ら）。簡単に記載すると、バクテリオファージ
プラーク上にのせておいたニトロセルロースフィルターをP-32ラベルしたpp32 c
DNAに対するプローブとハイブリダイゼーションした。プローブはpp32 cDNAを鋳
型として用いて、ランダムプライマー法（Stratagene #300385）により調製した
（Chen、ら、Molec. Biol. Cell, 7: 2045-2056, 1996）。反応性のバクテリオ
ファージは打ち抜き（plug）、そして、そのバクテリオファージを溶出し、再発
現させ、そして、pp32 cDNAプローブを用い純粋になるまで再スクリーニングし
た。バクテリオファージDNAはプレートライセート法（Sambrook、ら）により調
製した。
するスクリーニング Lambda Fix IIベクターに組み込まれたヒト胎盤由来のゲノムライブラリーをE
. coli株XL-1 Blue MRA（Stratagene #946206）に発現させた。pp32 cDNAと相同
性なDNAインサートを含む、バクテリオファージクローンのスクリーニングは日
常的な方法に従った（Sambrook、ら）。簡単に記載すると、バクテリオファージ
プラーク上にのせておいたニトロセルロースフィルターをP-32ラベルしたpp32 c
DNAに対するプローブとハイブリダイゼーションした。プローブはpp32 cDNAを鋳
型として用いて、ランダムプライマー法（Stratagene #300385）により調製した
（Chen、ら、Molec. Biol. Cell, 7: 2045-2056, 1996）。反応性のバクテリオ
ファージは打ち抜き（plug）、そして、そのバクテリオファージを溶出し、再発
現させ、そして、pp32 cDNAプローブを用い純粋になるまで再スクリーニングし
た。バクテリオファージDNAはプレートライセート法（Sambrook、ら）により調
製した。
【００６９】 pp32 cDNAと相同な配列を含む、バクテリオファージDNA内の制限断片の同定 pp32 cDNA配列を含むバクテリオファージクローン由来のDNAをHind IIIで消化
した。日常的な方法を用い、制限断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、
アルカリ性緩衝液中で陽性の電荷を帯びたナイロンフィルターにトランスファー
し、そして、pp32 cDNAの5'及び3'端に選択的なプローブとハイブリダイゼーシ
ョンした（Sambrook、ら）。5'及び3'プローブは、ラベリング反応の鋳型として
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の産物を用いたことを除いては、上に記載した通
りに調製した（Saiki、ら、Science, 239: 487-491,1988）。1つのPCR産物は、
ヌクレオチド32から279を含む、249塩基対のpp32 cDNAの一部分だった。それはp
p32 cDNA鋳型、及び、プライマー 5'-TATGCTAGCG GGTTCGGGGT TTATTG-3'及び 5'-GATTCTAGAT GGTAAGTTTG CGATTGAGG-3'（プライマーセットA） を使用した反応の結果であった。もう一方の産物はヌクレオチド677から938を含
む、263塩基対のpp32 cDNAの一部分だった。それはpp32 cDNA鋳型、及び、プラ
イマー 5'-GAATCTAGAA GGAGGAGGAA GGTGAAGAG-3'及び 5'-CTATCTAGAT TCAGGGGGCA GGATTAGAG-3'（プライマーセットB） を使用した反応の結果であった。PCR反応は、95℃で1分間の変性、50℃で1分間
のプライマーのアニーリング、72℃で1分間の伸長を1サイクルとして35サイクル
を含んだ（サイクリングプログラムA）。5'プローブとはハイブリダイゼーショ
ンするが、3'プローブとはしない、4.7 kbのHind III制限断片、及び、3'プロー
ブとはハイブリダイゼーションするが、5'プローブとはしない、0.9 kbのHind I
II制限断片を、日常的な方法（Sambrook、ら）によりpBluescript（Gibco）にサ
ブクローニングした。インサートを含む、精製したプラスミドDNAの両鎖のヌク
レオチド配列を自動化した方法により決定した（DNA Analysis Facility, Johns
Hopkins University School of Medicine）。
した。日常的な方法を用い、制限断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、
アルカリ性緩衝液中で陽性の電荷を帯びたナイロンフィルターにトランスファー
し、そして、pp32 cDNAの5'及び3'端に選択的なプローブとハイブリダイゼーシ
ョンした（Sambrook、ら）。5'及び3'プローブは、ラベリング反応の鋳型として
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の産物を用いたことを除いては、上に記載した通
りに調製した（Saiki、ら、Science, 239: 487-491,1988）。1つのPCR産物は、
ヌクレオチド32から279を含む、249塩基対のpp32 cDNAの一部分だった。それはp
p32 cDNA鋳型、及び、プライマー 5'-TATGCTAGCG GGTTCGGGGT TTATTG-3'及び 5'-GATTCTAGAT GGTAAGTTTG CGATTGAGG-3'（プライマーセットA） を使用した反応の結果であった。もう一方の産物はヌクレオチド677から938を含
む、263塩基対のpp32 cDNAの一部分だった。それはpp32 cDNA鋳型、及び、プラ
イマー 5'-GAATCTAGAA GGAGGAGGAA GGTGAAGAG-3'及び 5'-CTATCTAGAT TCAGGGGGCA GGATTAGAG-3'（プライマーセットB） を使用した反応の結果であった。PCR反応は、95℃で1分間の変性、50℃で1分間
のプライマーのアニーリング、72℃で1分間の伸長を1サイクルとして35サイクル
を含んだ（サイクリングプログラムA）。5'プローブとはハイブリダイゼーショ
ンするが、3'プローブとはしない、4.7 kbのHind III制限断片、及び、3'プロー
ブとはハイブリダイゼーションするが、5'プローブとはしない、0.9 kbのHind I
II制限断片を、日常的な方法（Sambrook、ら）によりpBluescript（Gibco）にサ
ブクローニングした。インサートを含む、精製したプラスミドDNAの両鎖のヌク
レオチド配列を自動化した方法により決定した（DNA Analysis Facility, Johns
Hopkins University School of Medicine）。
【００７０】 PCR産物のダイレクトシークエンシングによるシークエンシングの完了 4.7及び0.9 kbのHind III制限断片の配列とpp32 cDNAとを並べると（alignmen
t）、4.7 kb断片の3'端とpp32 cDNAの5'領域との間、及び、0.9 kb断片の5'端と
pp32 cDNAの3'領域との間は、約90％の相同性を示した。制限断片の両端の間に
はpp32 cDNAと一致しない199塩基対のギャップがあった。プライマーを、その配
列ギャップの両サイドの、関連するpp32配列に特異的にアニールするように設計
した。プライマー配列は 5'-GAGGTTTATT GATTGAATTC GGCT-3'及び 5'-CCCCAGTACA CTTTTCCCGT CTCA-3'（プライマーセットC）であった。プライマ
ーセットC、及び鋳型として精製したバクテリオファージDNAを用い、サイクリン
グプログラムAでポリメラーゼ連鎖反応を次に行った。アガロースゲルの臭化エ
チジウム染色により、943塩基対産物が示され、低融点アガロース（NuSieve）電
気泳動ゲルから切り出した断片から抽出し、そして、先に記載した通り、自動化
された方法でシークエンシングした。
t）、4.7 kb断片の3'端とpp32 cDNAの5'領域との間、及び、0.9 kb断片の5'端と
pp32 cDNAの3'領域との間は、約90％の相同性を示した。制限断片の両端の間に
はpp32 cDNAと一致しない199塩基対のギャップがあった。プライマーを、その配
列ギャップの両サイドの、関連するpp32配列に特異的にアニールするように設計
した。プライマー配列は 5'-GAGGTTTATT GATTGAATTC GGCT-3'及び 5'-CCCCAGTACA CTTTTCCCGT CTCA-3'（プライマーセットC）であった。プライマ
ーセットC、及び鋳型として精製したバクテリオファージDNAを用い、サイクリン
グプログラムAでポリメラーゼ連鎖反応を次に行った。アガロースゲルの臭化エ
チジウム染色により、943塩基対産物が示され、低融点アガロース（NuSieve）電
気泳動ゲルから切り出した断片から抽出し、そして、先に記載した通り、自動化
された方法でシークエンシングした。
【００７１】 pp32 cDNAと相同な部分を含むヒト胎盤のゲノムライブラリーバクテリオファ
ージクローンから、5,787塩基の配列が得られた（図2）。この配列はGenbankに
受託番号U71084、Locus HSU71084として寄託されていた。配列はヌクレオチド4,
453から5,154にわたるオープンリーディングフレームをもつ。オープンリーディ
ングフレームの上流ヌクレオチド配列の分析により活性ステロイドホルモンレセ
プターのコンセンサス配列が20ポジション以上見つかった（表1）。
ージクローンから、5,787塩基の配列が得られた（図2）。この配列はGenbankに
受託番号U71084、Locus HSU71084として寄託されていた。配列はヌクレオチド4,
453から5,154にわたるオープンリーディングフレームをもつ。オープンリーディ
ングフレームの上流ヌクレオチド配列の分析により活性ステロイドホルモンレセ
プターのコンセンサス配列が20ポジション以上見つかった（表1）。
【００７２】 オープンリーディングフレームの配列解析は、pp32と94％の配列相同性を示し
た（図3）。オープンリーディングフレーム配列とpp32 cDNAとのアラインメント
により33の点在する単独の塩基の違い、及び、2及び7塩基のクラスター化した違
いが明らかになった。3及び9塩基の2つの内部欠失があった。オープンリーディ
ングフレームはpp32とタンパク質レベルで88％相同性をもつ234アミノ酸残基を
含むポリペプチドをコードした（図4）。翻訳された配列とpp32アミノ酸配列と
を並べることにより18の点在する単独のアミノ酸残基の違い、及び、2残基のク
ラスターに3つの違い、及び、4残基のクラスターに1つの違いが明らかになった
。1及び3残基の2つの内部欠失、及び、11残基の末端欠失があった。翻訳された
配列はpp32より26少ない、69酸性残基を含んだ。
た（図3）。オープンリーディングフレーム配列とpp32 cDNAとのアラインメント
により33の点在する単独の塩基の違い、及び、2及び7塩基のクラスター化した違
いが明らかになった。3及び9塩基の2つの内部欠失があった。オープンリーディ
ングフレームはpp32とタンパク質レベルで88％相同性をもつ234アミノ酸残基を
含むポリペプチドをコードした（図4）。翻訳された配列とpp32アミノ酸配列と
を並べることにより18の点在する単独のアミノ酸残基の違い、及び、2残基のク
ラスターに3つの違い、及び、4残基のクラスターに1つの違いが明らかになった
。1及び3残基の2つの内部欠失、及び、11残基の末端欠失があった。翻訳された
配列はpp32より26少ない、69酸性残基を含んだ。
【００７３】 実施例4 pp32rlの染色体マッピング NIGMS単染色体（monochromosomal）パネル2（Drwinga、ら、“NIGMS human/ro
dent somatic cell hybrid mapping panels 1 and 2,”Genomics 16: 311314,19
93）のPCRに続きPCR産物のシークエンシングにより決定された通り、pp32r1遺伝
子は第4染色体に位置する。興味深いことに、開始ATGの5'側のシークエンスの43
64ヌクレオチドを含むpp32r1の全体の配列は、冗長のない（non-redundant）Gen
Bankデータベースのblastnサーチにおいて400以上の一致するものを含んだ。こ
れら一致したものは、逆のオリエンテーションにおいてリピートを示す、約278
及び252塩基対（ヌクレオチド674-952及び2542-2794）の短い2つの領域とであっ
た。このリピートは、多くの染色体におけるエレメントと著しく関連する。
dent somatic cell hybrid mapping panels 1 and 2,”Genomics 16: 311314,19
93）のPCRに続きPCR産物のシークエンシングにより決定された通り、pp32r1遺伝
子は第4染色体に位置する。興味深いことに、開始ATGの5'側のシークエンスの43
64ヌクレオチドを含むpp32r1の全体の配列は、冗長のない（non-redundant）Gen
Bankデータベースのblastnサーチにおいて400以上の一致するものを含んだ。こ
れら一致したものは、逆のオリエンテーションにおいてリピートを示す、約278
及び252塩基対（ヌクレオチド674-952及び2542-2794）の短い2つの領域とであっ
た。このリピートは、多くの染色体におけるエレメントと著しく関連する。
【００７４】 ヒトpp32遺伝子は、蛍光in situハイブリダイゼーションにより、染色体15q22
.3-q23にマップされた（Fink、ら）。pp32（Hs.76689;HLA-DR関連タンパク質1）
への単一遺伝子のエントリーは、この遺伝子に相当する93のESTをリストし、そ
の中の12はマップされた配列タグ部位（sequence-tagged site）（STS）を含む
。電気的PCRにより解析した多くのpp32 EST同様、これらSTS部位は全て染色体15
にマップすることが報告されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。APRILタ
ンパク質もまた染色体15q25にマップされた（Mencingerら; GenBank Y07969）。
.3-q23にマップされた（Fink、ら）。pp32（Hs.76689;HLA-DR関連タンパク質1）
への単一遺伝子のエントリーは、この遺伝子に相当する93のESTをリストし、そ
の中の12はマップされた配列タグ部位（sequence-tagged site）（STS）を含む
。電気的PCRにより解析した多くのpp32 EST同様、これらSTS部位は全て染色体15
にマップすることが報告されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。APRILタ
ンパク質もまた染色体15q25にマップされた（Mencingerら; GenBank Y07969）。
【００７５】 実施例5 pp32r2の配列分析 pp32関連配列（pp32r2と表示される）は、染色体4に見い出された、特有のイ
ントロンのないpp32関連遺伝子pp32r1を単離するために実施例2に記載したもの
と類似の方法で、染色体12上に同定された。染色体12の配列は短縮化タンパク質
をコードしており、偽遺伝子を表しているかもしれないと当初は考えられていた
；しかしながら、その解釈は本知見を考慮して再調査された。その配列はpp32r2
と名付けられ、Genbankにlocus AF008216として登録される；pp32r2の配列は図5
に示す。BESTFIT分析（Genetics Computer Group, Inc., Wisconsin Package, v
ersion 9.1, Madison, WI, 1997）により、pp32r2はFT1.11、FT2.4、及びT1と99
.5％同一であり、配列の845ヌクレオチドのオーバーラップにわたり、4ヌクレオ
チドの違いが示され；この多様性のレベルは多型と矛盾しない。同様にBESTFIT
分析は、PP32R1がFT3.3と99.6％同一、また、FT2.2と99.4％であることを示し、
それぞれ4及び5ヌクレオチドの違いを見せる（図7下を参照）。
ントロンのないpp32関連遺伝子pp32r1を単離するために実施例2に記載したもの
と類似の方法で、染色体12上に同定された。染色体12の配列は短縮化タンパク質
をコードしており、偽遺伝子を表しているかもしれないと当初は考えられていた
；しかしながら、その解釈は本知見を考慮して再調査された。その配列はpp32r2
と名付けられ、Genbankにlocus AF008216として登録される；pp32r2の配列は図5
に示す。BESTFIT分析（Genetics Computer Group, Inc., Wisconsin Package, v
ersion 9.1, Madison, WI, 1997）により、pp32r2はFT1.11、FT2.4、及びT1と99
.5％同一であり、配列の845ヌクレオチドのオーバーラップにわたり、4ヌクレオ
チドの違いが示され；この多様性のレベルは多型と矛盾しない。同様にBESTFIT
分析は、PP32R1がFT3.3と99.6％同一、また、FT2.2と99.4％であることを示し、
それぞれ4及び5ヌクレオチドの違いを見せる（図7下を参照）。
【００７６】 実施例6 多様なクローンの配列比較 Lambda Fix IIベクター（Stratagene #946206）に組み込まれたヒト胎盤ゲノ
ムライブラリーをpp32 cDNAに対するP-32ラベルしたプローブでスクリーニング
し、約23 kbのクローンを得た。このクローンの4.7 kb及び0.9 kbのHind III制
限断片をpp32 cDNAに対するプローブとハイブリダイゼーションした。4.7 kbク
ローンはpp32 cDNA配列の5'部分と並べ、0.9 kb断片は3'端と並べた。橋渡しを
するPCR産物から0.2 kbの小さな切れ目がシークエンスされた。イントロンは同
定されなかった。
ムライブラリーをpp32 cDNAに対するP-32ラベルしたプローブでスクリーニング
し、約23 kbのクローンを得た。このクローンの4.7 kb及び0.9 kbのHind III制
限断片をpp32 cDNAに対するプローブとハイブリダイゼーションした。4.7 kbク
ローンはpp32 cDNA配列の5'部分と並べ、0.9 kb断片は3'端と並べた。橋渡しを
するPCR産物から0.2 kbの小さな切れ目がシークエンスされた。イントロンは同
定されなかった。
【００７７】 ヒト全胚の株FSH173WE、及び、前立腺癌細胞株PC-3及びLNCaP（American Type
Culture Collection）を含む培養細胞を推奨される組織培養条件下生育させた
。Poly A＋RNAをオリゴdT吸着（MicroFasTrack, Invitrogen）により調製し、そ
して、逆転写酵素及びランダムヘキサマー（GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elme
r）を用いる反応によりcDNAを生成するための、鋳型として使用した。オープン
リーディングフレームをコードするcDNA配列を、pp32配列を含むゲノム配列に特
に選択的なプライマーを使用したnested PCRにより増幅した。298塩基対の最終
産物がアガロース電気泳動ゲルの臭化ブロマイド染色で見られた。
Culture Collection）を含む培養細胞を推奨される組織培養条件下生育させた
。Poly A＋RNAをオリゴdT吸着（MicroFasTrack, Invitrogen）により調製し、そ
して、逆転写酵素及びランダムヘキサマー（GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elme
r）を用いる反応によりcDNAを生成するための、鋳型として使用した。オープン
リーディングフレームをコードするcDNA配列を、pp32配列を含むゲノム配列に特
に選択的なプライマーを使用したnested PCRにより増幅した。298塩基対の最終
産物がアガロース電気泳動ゲルの臭化ブロマイド染色で見られた。
【００７８】 ほとんどの場合、nestedプライマーが必要ないことを除いて、実施例3に記載
したものと同様の方法を用いて、DU-145細胞及び多数の患者由来の転写物を、上
記の試料からの転写物との比較のため、シークエンシングした。結果は表2に示
す。様々な転写物間の同一性の度合いの概要を表3に提供する。
したものと同様の方法を用いて、DU-145細胞及び多数の患者由来の転写物を、上
記の試料からの転写物との比較のため、シークエンシングした。結果は表2に示
す。様々な転写物間の同一性の度合いの概要を表3に提供する。
【００７９】 実施例7 異なる細胞株及び腫瘍組織からの個々の単離物の配列多様性 癌において明らかに一致しないpp32の発現に対する説明は、前立腺腫瘍が全体
にpp32を発現せず、しかしむしろ、形質転換を阻害するかわりにそれを促進する
、pp32変異種を発現することである。
にpp32を発現せず、しかしむしろ、形質転換を阻害するかわりにそれを促進する
、pp32変異種を発現することである。
【００８０】 RT-PCR及びCFLP Titan One-Tube RT-PCRキット（Boehringer）とともにフォワードプライマー
としてHSU73477の32〜52の塩基を、また、リバースプライマーとして同配列の91
9〜938を用い、配列を逆転写し増幅した。逆転写は50℃45分実行し、次に94℃2
分間インキュベートした；続くPCRは、PTC 100サーモサイクラー（MJ Research
）で、92℃で45秒、55℃で45秒、及び68℃で1分を1サイクルとして45サイクルを
行い、最終の伸長68℃で10分を行った。鋳型RNAは、細胞株あるいは凍結腫瘍標
本から、RNAゾルB（Tel-Test）を製造業者による使用法に従って使用して単離し
、その後RNAse-free DNAse I（Boehringer）で消化した。pCMV32を逆転写せずに
陽性対照として用いた。製造業者による仕様書（Life Technologies）に従い、5
5℃で10分間、0.2 mM MnCl2で消化して、切断アッセイを行い、6％変性ポリアク
リルアミドシークエンシングゲルで電気泳動した。
としてHSU73477の32〜52の塩基を、また、リバースプライマーとして同配列の91
9〜938を用い、配列を逆転写し増幅した。逆転写は50℃45分実行し、次に94℃2
分間インキュベートした；続くPCRは、PTC 100サーモサイクラー（MJ Research
）で、92℃で45秒、55℃で45秒、及び68℃で1分を1サイクルとして45サイクルを
行い、最終の伸長68℃で10分を行った。鋳型RNAは、細胞株あるいは凍結腫瘍標
本から、RNAゾルB（Tel-Test）を製造業者による使用法に従って使用して単離し
、その後RNAse-free DNAse I（Boehringer）で消化した。pCMV32を逆転写せずに
陽性対照として用いた。製造業者による仕様書（Life Technologies）に従い、5
5℃で10分間、0.2 mM MnCl2で消化して、切断アッセイを行い、6％変性ポリアク
リルアミドシークエンシングゲルで電気泳動した。
【００８１】 RT-PCRのレベルでは、対となる正常前立腺、及び、3人の患者由来の前立腺腺
癌から、889から909 bpの範囲の増幅産物（図6A）が得られた。反応にはpp32、
及び、近い関係にあるイントロンのない2つのゲノム配列pp32r1及びpp32r2から
のコーディング配列の全長を増幅することができるコンセンサスプライマーを使
った。唯一の注目された違いは、癌と比較して正常組織からのアンプリコンの収
量が少ないことだった。4つのヒト前立腺腺癌細胞株DU-145、LNCaP、PC-3、及び
、TSUPR-1もまた同様の産物を得た。
癌から、889から909 bpの範囲の増幅産物（図6A）が得られた。反応にはpp32、
及び、近い関係にあるイントロンのない2つのゲノム配列pp32r1及びpp32r2から
のコーディング配列の全長を増幅することができるコンセンサスプライマーを使
った。唯一の注目された違いは、癌と比較して正常組織からのアンプリコンの収
量が少ないことだった。4つのヒト前立腺腺癌細胞株DU-145、LNCaP、PC-3、及び
、TSUPR-1もまた同様の産物を得た。
【００８２】 図6Aは、RT-PCRにより増幅されたヒト前立腺及び前立腺癌細胞株由来のDNAを
示す。レーンaは消化されていない対照で、バンドは消化産物より実質上遅く移
動しており；他のすべてのレーンの試料は記載した通り、切断により消化した。
レーンは：1 kbラダー（Life Technologies）、A; pCMV32、B; DU-145、C; LNCa
P、D; PC-3、E; TSUPr-1、F;逆転写なしの代表的な試料であるFT-1、G; FN-1、H
; FT-1、I; FN-2、J; FT-2、K; FN-3、L; FT-3、M;鋳型なしの陰性対照、を示す
。FNは凍結良性前立腺を示し、また、数は患者を示す；FTは凍結前立腺腺癌をを
示し、また、数は患者を示す。図の左側の脇の数は参照する1 kb DNAラダー（Li
fe Technologies）のサイズをkbで示す。
示す。レーンaは消化されていない対照で、バンドは消化産物より実質上遅く移
動しており；他のすべてのレーンの試料は記載した通り、切断により消化した。
レーンは：1 kbラダー（Life Technologies）、A; pCMV32、B; DU-145、C; LNCa
P、D; PC-3、E; TSUPr-1、F;逆転写なしの代表的な試料であるFT-1、G; FN-1、H
; FT-1、I; FN-2、J; FT-2、K; FN-3、L; FT-3、M;鋳型なしの陰性対照、を示す
。FNは凍結良性前立腺を示し、また、数は患者を示す；FTは凍結前立腺腺癌をを
示し、また、数は患者を示す。図の左側の脇の数は参照する1 kb DNAラダー（Li
fe Technologies）のサイズをkbで示す。
【００８３】 RT-PCR産物をサブクローニングし、そして、切断断片長多型分析（CFLP）、及
び、配列分析により分析すると、正常と新生物の組織との間の質的な違いが明ら
かになり始めた。図6Bは、正常pp32 cDNA配列由来のプライマーを使用し、ヒト
前立腺腺癌、隣接する正常前立腺、及び、ヒト前立腺腺癌細胞株からのRT-PCRに
より増幅され、クローン化したcDNAの切断断片長多型分析を示す。レーンは、DU
-145、LNCaP、PC-3及びTSUPr1細胞株からの、凍結前立腺癌（FT）からの、及び
、凍結正常前立腺（FN）からの、それぞれのRT-PCR由来のクローンを示す：a、
未消化正常pp32 cDNA；b、正常pp32 cDNA；c、DU-145-1；d、DU-145-3；e、DU-1
45-5；f、LNCaP-3；g、PC3-3；h、PC3-8；I、TSUPr1-1；j、TSUPr1-3；k、TSUPr
1-6；l、FT1.11；m、FT1.7；n、FT2.2；o、FT2.4；p、FT3.18；q、FT3.3；r、FN
3.17；s、FN2.1。LNCaPは正常pp32を発現する。バンドのシフトは配列の違いに
相当する。正常前立腺組織由来のRT-PCR産物のすべてのクローンは、クローン化
pp32 cDNA鋳型から得られたものと正確に一致する、正常のCFLPパターンを見せ
る（GenBank HSU73477、図6B）。前立腺腺癌は同様の分析において4つの異なるC
FLPパターンを得、そのうち3つは特有のものであり、そして、一つは正常のpp32
パターンと似ていた。DU-145、PC-3、及び、TSUPR-1細胞株の検査では、大体同
じ結果が得られたが、LnCaPでは正常pp32 CFLPパターンのみを得た。配列レベル
のさらなる分析により、正常前立腺、及び、LnCaPは正常pp32転写物のみを含む
ことを確認した。
び、配列分析により分析すると、正常と新生物の組織との間の質的な違いが明ら
かになり始めた。図6Bは、正常pp32 cDNA配列由来のプライマーを使用し、ヒト
前立腺腺癌、隣接する正常前立腺、及び、ヒト前立腺腺癌細胞株からのRT-PCRに
より増幅され、クローン化したcDNAの切断断片長多型分析を示す。レーンは、DU
-145、LNCaP、PC-3及びTSUPr1細胞株からの、凍結前立腺癌（FT）からの、及び
、凍結正常前立腺（FN）からの、それぞれのRT-PCR由来のクローンを示す：a、
未消化正常pp32 cDNA；b、正常pp32 cDNA；c、DU-145-1；d、DU-145-3；e、DU-1
45-5；f、LNCaP-3；g、PC3-3；h、PC3-8；I、TSUPr1-1；j、TSUPr1-3；k、TSUPr
1-6；l、FT1.11；m、FT1.7；n、FT2.2；o、FT2.4；p、FT3.18；q、FT3.3；r、FN
3.17；s、FN2.1。LNCaPは正常pp32を発現する。バンドのシフトは配列の違いに
相当する。正常前立腺組織由来のRT-PCR産物のすべてのクローンは、クローン化
pp32 cDNA鋳型から得られたものと正確に一致する、正常のCFLPパターンを見せ
る（GenBank HSU73477、図6B）。前立腺腺癌は同様の分析において4つの異なるC
FLPパターンを得、そのうち3つは特有のものであり、そして、一つは正常のpp32
パターンと似ていた。DU-145、PC-3、及び、TSUPR-1細胞株の検査では、大体同
じ結果が得られたが、LnCaPでは正常pp32 CFLPパターンのみを得た。配列レベル
のさらなる分析により、正常前立腺、及び、LnCaPは正常pp32転写物のみを含む
ことを確認した。
【００８４】 前立腺腺癌、及び、ほとんどの細胞株から得られる転写物は、近い関係にある
pp32の変異種を示し、表1に概説した。これらの転写物は、正常pp32 cDNAと92.4
％から95.9％の様々なヌクレオチド同一性をもつ（Genetics Computer Group, I
nc., Wisconsin Package, version 9.1, Madison, WI, 1997）。得られた16の変
異体転写物のうち、15が、正常pp32と89.3％から99.6％の範囲の同一性をもつタ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームをもつ。表は、ヒト前立腺
腺癌及び前立腺癌細胞株から得られた、変異pp32転写物から得たデータを概説す
る。近い関係にある群に入る配列を群の文字（A、B、C）で示す；Uは群にはっき
りと入らない、割り当てられない配列を示す。各配列の起源は：FT、凍結腫瘍、
続いて、患者数、小数点、及び、クローン番号；D、DU-145、続いてクローン番
号（全ての細胞株配列と同様）；P、PC3；及び、T、TSUPrlである。ヌクレオチ
ド同一性、ヌクレオチド配列ギャップ、配列比較、及び、タンパク質同一性は、
pp32 cDNA及びタンパク質配列を用い、BESTFITアラインメントから決定した。形
質転換に対する効果は、：刺激、ras＋myc＋ベクター対照よりも、ras＋mycとト
ランスフェクションしたときにより多くの細胞増殖巣が得られる；不活性、ras
＋myc＋ベクター対照と等しい細胞増殖巣が得られる；及び、抑制、ras＋myc＋
ベクター対照よりも少ない細胞増殖巣が得られる、と記載する。
pp32の変異種を示し、表1に概説した。これらの転写物は、正常pp32 cDNAと92.4
％から95.9％の様々なヌクレオチド同一性をもつ（Genetics Computer Group, I
nc., Wisconsin Package, version 9.1, Madison, WI, 1997）。得られた16の変
異体転写物のうち、15が、正常pp32と89.3％から99.6％の範囲の同一性をもつタ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームをもつ。表は、ヒト前立腺
腺癌及び前立腺癌細胞株から得られた、変異pp32転写物から得たデータを概説す
る。近い関係にある群に入る配列を群の文字（A、B、C）で示す；Uは群にはっき
りと入らない、割り当てられない配列を示す。各配列の起源は：FT、凍結腫瘍、
続いて、患者数、小数点、及び、クローン番号；D、DU-145、続いてクローン番
号（全ての細胞株配列と同様）；P、PC3；及び、T、TSUPrlである。ヌクレオチ
ド同一性、ヌクレオチド配列ギャップ、配列比較、及び、タンパク質同一性は、
pp32 cDNA及びタンパク質配列を用い、BESTFITアラインメントから決定した。形
質転換に対する効果は、：刺激、ras＋myc＋ベクター対照よりも、ras＋mycとト
ランスフェクションしたときにより多くの細胞増殖巣が得られる；不活性、ras
＋myc＋ベクター対照と等しい細胞増殖巣が得られる；及び、抑制、ras＋myc＋
ベクター対照よりも少ない細胞増殖巣が得られる、と記載する。
【００８５】 予想されるタンパク質配列は3つの別々の群に分けられた：［1］pp32のN末131
アミノ酸にわたる短縮化配列で、pp32r2と大体等しい前記配列の一つは、3人の
患者のうち2人、及び、TSUPR-1細胞株から得られた；［2］pp32よりも、異なるp
p32関連遺伝子、pp32r1とより近い相同な配列、及び、［3］外来のpp32関連配列
。分析した3人の患者のうち2人からの腫瘍は検出可能な正常pp32転写物を含まな
かった。3番目の患者の腫瘍由来の12個のクローン化転写物のうちの2つはCFLPパ
ターンにより正常で、1クローンについては配列の正常性も確認した。細胞株由
来の2つのクローンは、CFLPスクリーニングにより正常であったが、のちに変異
配列を表すことが示された。
アミノ酸にわたる短縮化配列で、pp32r2と大体等しい前記配列の一つは、3人の
患者のうち2人、及び、TSUPR-1細胞株から得られた；［2］pp32よりも、異なるp
p32関連遺伝子、pp32r1とより近い相同な配列、及び、［3］外来のpp32関連配列
。分析した3人の患者のうち2人からの腫瘍は検出可能な正常pp32転写物を含まな
かった。3番目の患者の腫瘍由来の12個のクローン化転写物のうちの2つはCFLPパ
ターンにより正常で、1クローンについては配列の正常性も確認した。細胞株由
来の2つのクローンは、CFLPスクリーニングにより正常であったが、のちに変異
配列を表すことが示された。
【００８６】 配列分析によりpp32のみが得られた、両性の前立腺とは反対に、隣接した前立
腺癌はpp32をほとんど、あるいは、全く発現しなかった。代わりに、オープンリ
ーディングフレームをコードする、異なる配列をもつ4つのpp32関連転写物が、
隣接する前立腺癌から得られ、正常pp32 cDNAとのヌクレオチド同一性は92.4％
から95.9％まで様々であった。これらのうち、以前に同定されたpp32関連遺伝子
、pp32r1及びpp32r2の産物に相当する二つの転写物は、患者の試料から多数回得
られ、またそのため、本研究の焦点となった。
腺癌はpp32をほとんど、あるいは、全く発現しなかった。代わりに、オープンリ
ーディングフレームをコードする、異なる配列をもつ4つのpp32関連転写物が、
隣接する前立腺癌から得られ、正常pp32 cDNAとのヌクレオチド同一性は92.4％
から95.9％まで様々であった。これらのうち、以前に同定されたpp32関連遺伝子
、pp32r1及びpp32r2の産物に相当する二つの転写物は、患者の試料から多数回得
られ、またそのため、本研究の焦点となった。
【００８７】 図7A及び7Bは、全ての転写物のヌクレオチド、及び、予想されるタンパク質配
列の多数の対合アラインメントを示した（Smith、ら、“Identification of com
mon molecular subsequences,”J. Mol. Biol., 147: 195-197 1981）。図はGCG
Pileup and Pretty programs（Smith、ら）を用いて編集した。コンセンサス配
列との違いは表示したように示し；コンセンサス配列との一致は空白として示す
。正常ヒトpp32はhpp32と示す。TSUPr1、PC3、及び、DU-145細胞株からの配列は
示す通りである。FTの表示は、凍結ヒト前立腺腺癌由来の配列を示す。正常のpp
32配列、hpp32だけが、腫瘍組織に隣接する正常前立腺から得られた。図8Aはpp3
2及びpp32r1から予想されるアンプリコンを伴うアンプリコンヌクレオチド配列
のアラインメントを示す；図8Bは予想されるタンパク質配列のアラインメントを
示す。2人の別の患者、及び、TSUPR-1細胞株から独立に3回得られた一つの配列
（FT 1.11）は、図表中には1回のみ示す。重ね合わせ（pileup）および対にした
（pairwise）アラインメントはいくつかの重要な点を説明する：［1］ヌクレオ
チド及び予想されるアミノ酸レベルの両方で、高程度に配列が保存されている；
［2］配列の違いは明らかなホットスポットを伴わずに、配列の全長に分布され
ている；［3］配列の違いに明らかなクラスター化または区分化はない；及び［4
］様々な配列は、先に記載した群にあてはまった。これらの点は図8A及び8Bに詳
細がある。
列の多数の対合アラインメントを示した（Smith、ら、“Identification of com
mon molecular subsequences,”J. Mol. Biol., 147: 195-197 1981）。図はGCG
Pileup and Pretty programs（Smith、ら）を用いて編集した。コンセンサス配
列との違いは表示したように示し；コンセンサス配列との一致は空白として示す
。正常ヒトpp32はhpp32と示す。TSUPr1、PC3、及び、DU-145細胞株からの配列は
示す通りである。FTの表示は、凍結ヒト前立腺腺癌由来の配列を示す。正常のpp
32配列、hpp32だけが、腫瘍組織に隣接する正常前立腺から得られた。図8Aはpp3
2及びpp32r1から予想されるアンプリコンを伴うアンプリコンヌクレオチド配列
のアラインメントを示す；図8Bは予想されるタンパク質配列のアラインメントを
示す。2人の別の患者、及び、TSUPR-1細胞株から独立に3回得られた一つの配列
（FT 1.11）は、図表中には1回のみ示す。重ね合わせ（pileup）および対にした
（pairwise）アラインメントはいくつかの重要な点を説明する：［1］ヌクレオ
チド及び予想されるアミノ酸レベルの両方で、高程度に配列が保存されている；
［2］配列の違いは明らかなホットスポットを伴わずに、配列の全長に分布され
ている；［3］配列の違いに明らかなクラスター化または区分化はない；及び［4
］様々な配列は、先に記載した群にあてはまった。これらの点は図8A及び8Bに詳
細がある。
【００８８】 2人の患者から得られた同一のpp32r1配列は、pp32r1ゲノム配列の予想される
産物とは4ヌクレオチドだけ異なった。2人の患者から得られたpp32r2の配列もま
た同一で、かつ、pp32r2ゲノム配列とは3ヌクレオチドだけ異なった。違いの両
方の組は、多型の多様性と矛盾しないとみなされる。図7に予想されるタンパク
質配列の多数の対合アラインメントに示されるように、pp32、pp32r1、及び、pp
32r2は、その全長にわたって配列の変化を示す。体細胞突然変異または択一的ス
プライシングの簡単な方法ではこれらの結果は説明できなかった。その代わり、
先に同定された染色体4及び12上の遺伝子と変異のある配列との対応によれば、
データは選択的な遺伝子発現と矛盾しない。
産物とは4ヌクレオチドだけ異なった。2人の患者から得られたpp32r2の配列もま
た同一で、かつ、pp32r2ゲノム配列とは3ヌクレオチドだけ異なった。違いの両
方の組は、多型の多様性と矛盾しないとみなされる。図7に予想されるタンパク
質配列の多数の対合アラインメントに示されるように、pp32、pp32r1、及び、pp
32r2は、その全長にわたって配列の変化を示す。体細胞突然変異または択一的ス
プライシングの簡単な方法ではこれらの結果は説明できなかった。その代わり、
先に同定された染色体4及び12上の遺伝子と変異のある配列との対応によれば、
データは選択的な遺伝子発現と矛盾しない。
【００８９】 実施例8 ファミリーメンバーを見分ける診断法 ヒト前立腺癌に発現されるpp32ファミリーの3つのメンバーは、pp32、pp32r1
、pp32r2である。pp32はin vitroの形質転換、及び、モデル系におけるin vivo
の腫瘍形成を抑制するが、pp32r1及びpp32r2は同じ系において前形質転換性（pr
o-transforming）であり、また、腫瘍形成性である。実施例7に記載のものと同
様のプロトコルを用いて、3つのメンバーのどれが組織試料に発現しているかを
決定することが可能である。
、pp32r2である。pp32はin vitroの形質転換、及び、モデル系におけるin vivo
の腫瘍形成を抑制するが、pp32r1及びpp32r2は同じ系において前形質転換性（pr
o-transforming）であり、また、腫瘍形成性である。実施例7に記載のものと同
様のプロトコルを用いて、3つのメンバーのどれが組織試料に発現しているかを
決定することが可能である。
【００９０】 フレッシュな凍結ヒト組織及び細胞株からの分析 フレッシュな凍結ヒト組織、または、ヒト癌細胞株から、全RNAを抽出し、逆
転写、及び、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を、3つすべての遺伝子のcDNAの全コー
ディング領域を増幅することができる、一組のプライマーを用いて行う。適切な
一組のプライマーは： 上流側：5'GGGTTCGGGG TTTATTG3'-これはpp32 cDNA配列（Genbank U73477）の
bp 32からbp 48に相当する； 下流側：5'CTCTAATCCT GCCCCCTGAA3'-これはpp32 cDNA配列（Genbank U73477
）のbp 919からbp 938に相当する。このプライマーセットを用いて観察されるア
ンプリコンのサイズは、pp32-907 bp、pp32r1-889 bp及びpp32r2-900 bpである
。3つのcDNA配列は以下の酵素-EcoR I、Hind III、及び、Xho Iを用いる制限酵
素消化により、お互いに区別される。結果として生じる消化物を2.5％アガロー
スゲルで泳動し、3つの異なるcDNAを明確に見分ける。下の表は観察されるバン
ドのサイズを表にする。太字の数は、3つのcDNAの同定に有用なバンドサイズを
示す。
転写、及び、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を、3つすべての遺伝子のcDNAの全コー
ディング領域を増幅することができる、一組のプライマーを用いて行う。適切な
一組のプライマーは： 上流側：5'GGGTTCGGGG TTTATTG3'-これはpp32 cDNA配列（Genbank U73477）の
bp 32からbp 48に相当する； 下流側：5'CTCTAATCCT GCCCCCTGAA3'-これはpp32 cDNA配列（Genbank U73477
）のbp 919からbp 938に相当する。このプライマーセットを用いて観察されるア
ンプリコンのサイズは、pp32-907 bp、pp32r1-889 bp及びpp32r2-900 bpである
。3つのcDNA配列は以下の酵素-EcoR I、Hind III、及び、Xho Iを用いる制限酵
素消化により、お互いに区別される。結果として生じる消化物を2.5％アガロー
スゲルで泳動し、3つの異なるcDNAを明確に見分ける。下の表は観察されるバン
ドのサイズを表にする。太字の数は、3つのcDNAの同定に有用なバンドサイズを
示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】 ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織からの分析 ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織からのpp32、pp32r1、及び、pp32r2転
写物の同定のため、同様のアプローチを次に示す。全RNAを抽出し、逆転写、及
び、PCR増幅を、3つすべてのcDNAから200 bpの長さを増幅することができる、一
組のプライマーを用いて行う。適切な一組のプライマーは： 上流側プライマー-pp32 cDNA配列（Genbank U73477）のbp 394からbp 414 下流側プライマー-pp32 cDNA配列（Genbank U73477）のbp 609からbp 629 3つのcDNA配列は以下の酵素-Hind III、Xho I、及び、BseR Iを用いる制限酵
素消化により、お互いに区別される。結果として生じる消化物を3％アガロース
ゲルで泳動し、3つの異なるcDNAを明確に見分ける。下の表は観察されるバンド
のサイズを表にする。太字の数は、3つのcDNAの同定に有用なバンドサイズを示
す。
写物の同定のため、同様のアプローチを次に示す。全RNAを抽出し、逆転写、及
び、PCR増幅を、3つすべてのcDNAから200 bpの長さを増幅することができる、一
組のプライマーを用いて行う。適切な一組のプライマーは： 上流側プライマー-pp32 cDNA配列（Genbank U73477）のbp 394からbp 414 下流側プライマー-pp32 cDNA配列（Genbank U73477）のbp 609からbp 629 3つのcDNA配列は以下の酵素-Hind III、Xho I、及び、BseR Iを用いる制限酵
素消化により、お互いに区別される。結果として生じる消化物を3％アガロース
ゲルで泳動し、3つの異なるcDNAを明確に見分ける。下の表は観察されるバンド
のサイズを表にする。太字の数は、3つのcDNAの同定に有用なバンドサイズを示
す。
【００９３】
【表２】
【００９４】 実施例9 pp32r1はラット胚線維芽細胞の癌遺伝子を介する形質転換を増加さ
せる pp32r1を真核生物の発現ベクターのCMVプロモーターの下流にサブクローニン
グし、そして、ラット胚線維芽細胞において、ras＋mycを介して形質転換された
細胞増殖巣の形成への、その効果を分析した。pp32r1のコーディング領域全体を
含むゲノム配列をPCRにより増幅し、CMVプロモーターを含む、真核生物のTAクロ
ーニング及び発現ベクター、pCR3.1ベクター（Invitrogen）にサブクローニング
した。5マイクログラムのpEJ-ras、及び／または10マイクログラムのpMLV-c-myc
、pCMV32、PCR3.1に組み込まれたpp32r1、またはPCR 3.1のみを受け取った、各T
75フラスコを用いて、アッセイを記載の通り（Chenら、Mol Biol Cell. 7: 2045
-56,1996）行った。14日後、形質転換されたコロニーを数えた。図8は結果を示
した。データは、2重で行った2回の別の実験、及び、3重で行った1回からなる7
回の繰り返しの平均を示す。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ras＋myc及
び他の癌遺伝子の組み合わせにより誘導される細胞増殖巣形成を、一貫して抑制
するpp32と反対に、pp32r1は、不対合（unpaired）t-検定によりp=0.04で、統計
的に著しい細胞増殖巣形成の刺激をひき起こした。
せる pp32r1を真核生物の発現ベクターのCMVプロモーターの下流にサブクローニン
グし、そして、ラット胚線維芽細胞において、ras＋mycを介して形質転換された
細胞増殖巣の形成への、その効果を分析した。pp32r1のコーディング領域全体を
含むゲノム配列をPCRにより増幅し、CMVプロモーターを含む、真核生物のTAクロ
ーニング及び発現ベクター、pCR3.1ベクター（Invitrogen）にサブクローニング
した。5マイクログラムのpEJ-ras、及び／または10マイクログラムのpMLV-c-myc
、pCMV32、PCR3.1に組み込まれたpp32r1、またはPCR 3.1のみを受け取った、各T
75フラスコを用いて、アッセイを記載の通り（Chenら、Mol Biol Cell. 7: 2045
-56,1996）行った。14日後、形質転換されたコロニーを数えた。図8は結果を示
した。データは、2重で行った2回の別の実験、及び、3重で行った1回からなる7
回の繰り返しの平均を示す。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ras＋myc及
び他の癌遺伝子の組み合わせにより誘導される細胞増殖巣形成を、一貫して抑制
するpp32と反対に、pp32r1は、不対合（unpaired）t-検定によりp=0.04で、統計
的に著しい細胞増殖巣形成の刺激をひき起こした。
【００９５】 実施例10 ラット線維芽細胞形質転換アッセイに対する様々な細胞株由来の転
写物の効果 上に記載した通り、PC-3及びDU-145細胞から調製した発現構築物を、本明細書
中で参考文献として援用される、Chen、ら（Mol Biol Cell., 7: 2045-56,1996
）に記載された、ラット胚線維芽細胞形質転換アッセイにおいて試験した。結果
を図9に示す。形質転換を抑制した正常pp32とは違って、2つの細胞株由来の転写
物は、形質転換されたラット胚線維芽細胞細胞増殖巣のras＋myc誘導を刺激した
。図は、1回の決定を示すDU-145を除いて、平均値＋／−標準偏差を示す。
写物の効果 上に記載した通り、PC-3及びDU-145細胞から調製した発現構築物を、本明細書
中で参考文献として援用される、Chen、ら（Mol Biol Cell., 7: 2045-56,1996
）に記載された、ラット胚線維芽細胞形質転換アッセイにおいて試験した。結果
を図9に示す。形質転換を抑制した正常pp32とは違って、2つの細胞株由来の転写
物は、形質転換されたラット胚線維芽細胞細胞増殖巣のras＋myc誘導を刺激した
。図は、1回の決定を示すDU-145を除いて、平均値＋／−標準偏差を示す。
【００９６】 実施例11 患者の腫瘍由来の様々な単離物の形質転換活性 前立腺癌患者から単離された変異転写物は配列がpp32と著しく異なる。単離さ
れた転写物は形質転換を刺激することがわかった。
れた転写物は形質転換を刺激することがわかった。
【００９７】 形質転換アッセイ ラット胚線維芽細胞に、記載の通り（Chen、ら）、示された構築物をトランス
フェクションし、そして、形質転換された細胞増殖巣を数えた。各実験において
、T75フラスコあたり約1×106の細胞をまき、そして、2から3日インキュベート
し、その後トランスフェクションを行って、約40％コンフレントに達するように
た。初代ラット胚線維芽細胞の各フラスコに、各実験において示されるプラスミ
ドを以下の量加えた：pEJ-ras、5μg；及び、pMLV-c-myc、pCMV32、pCMVneo、あ
るいはpCR3.1（Invitrogen）に組み込まれた変異pp32構築物、10μg。プラスミ
ドを2倍量のLipofectin（μg DNAあたり2μlリポフェクチン）中に調製し、その
後、滅菌15 mlポリスチレンチューブ内で1.5 ml OPTMEM中で上下にして穏やかに
混ぜ、室温で15分間以上インキュベートした。1フラスコ以上を用いる実験のた
め、全ての試薬の混合物は、それぞれのトランスフェクションに必要とされるフ
ラスコの数に比例して増加された。細胞をOPTIMEM（Gibco-BRL）で1回洗浄し、
その後、6 mlのOPTIMEM及び1.5 mlのDNA/Lipofectin混合物を与えた。一晩イン
キュベートした後、細胞を標準の培地で増殖させ、週に2回、フレッシュな培地
を与えた。トランスフェクションの14日後に細胞増殖巣を数えた。図10は4回の
別の実験をまとめる。各データの点は、同時に行ったras＋myc＋ベクターの対照
から得られた細胞増殖巣のパーセントとして表された、それぞれのフラスコから
の結果を示す。
フェクションし、そして、形質転換された細胞増殖巣を数えた。各実験において
、T75フラスコあたり約1×106の細胞をまき、そして、2から3日インキュベート
し、その後トランスフェクションを行って、約40％コンフレントに達するように
た。初代ラット胚線維芽細胞の各フラスコに、各実験において示されるプラスミ
ドを以下の量加えた：pEJ-ras、5μg；及び、pMLV-c-myc、pCMV32、pCMVneo、あ
るいはpCR3.1（Invitrogen）に組み込まれた変異pp32構築物、10μg。プラスミ
ドを2倍量のLipofectin（μg DNAあたり2μlリポフェクチン）中に調製し、その
後、滅菌15 mlポリスチレンチューブ内で1.5 ml OPTMEM中で上下にして穏やかに
混ぜ、室温で15分間以上インキュベートした。1フラスコ以上を用いる実験のた
め、全ての試薬の混合物は、それぞれのトランスフェクションに必要とされるフ
ラスコの数に比例して増加された。細胞をOPTIMEM（Gibco-BRL）で1回洗浄し、
その後、6 mlのOPTIMEM及び1.5 mlのDNA/Lipofectin混合物を与えた。一晩イン
キュベートした後、細胞を標準の培地で増殖させ、週に2回、フレッシュな培地
を与えた。トランスフェクションの14日後に細胞増殖巣を数えた。図10は4回の
別の実験をまとめる。各データの点は、同時に行ったras＋myc＋ベクターの対照
から得られた細胞増殖巣のパーセントとして表された、それぞれのフラスコから
の結果を示す。
【００９８】 図10は、前立腺癌細胞株由来及びヒト前立腺腺癌由来の発現される変異転写物
は、ras及びmycと共トランスフェクションした場合、ras及びmycを空のベクター
とトランスフェクションした場合に得られる細胞増殖巣の数と比較して、形質転
換される細胞増殖巣の数の増加を概して生み出す。DU-145（D3）由来、及び、3
つの前立腺癌（FT 1.7、FT 2.2、及び、FT3.18）由来の変異pp32転写物は、ras
及びmycのみと空のベクターとにより産生されるものを超える、形質転換された
細胞増殖巣の数の増加を得た。これは、一貫して形質転換を抑制する正常pp32と
の明らかな違いがある。これらの活性は、表1にもまた概説される。
は、ras及びmycと共トランスフェクションした場合、ras及びmycを空のベクター
とトランスフェクションした場合に得られる細胞増殖巣の数と比較して、形質転
換される細胞増殖巣の数の増加を概して生み出す。DU-145（D3）由来、及び、3
つの前立腺癌（FT 1.7、FT 2.2、及び、FT3.18）由来の変異pp32転写物は、ras
及びmycのみと空のベクターとにより産生されるものを超える、形質転換された
細胞増殖巣の数の増加を得た。これは、一貫して形質転換を抑制する正常pp32と
の明らかな違いがある。これらの活性は、表1にもまた概説される。
【００９９】 実施例12 in vivoでの腫瘍形成性に対するpp32変異体の効果 in vivoにおける腫瘍形成性への、NIH3T3細胞へのトランスフェクションの効
果を試験する実験は、in vitroにおけるラット胚線維芽細胞での結果と矛盾しな
い。PCR3.1-単一CMV駆動哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）に入れた、表6Aに
示されるpp32種を、lipofectiinにより安定に、NIH3T3細胞にトランスフェクシ
ョンした。これらの実験で使用されるG418耐性クローンは全て、ゲノムPCRによ
り、示されるpp32種を含んでいることを示した。腫瘍形成性の分析において、フ
ェノールレッドを含まない、無添加ダルベッコ修飾イーグル培地100マイクロリ
ットル中の5×106細胞を、非近交系背景で6週齢以上の、胸腺のない、メスヌー
ドマウス（Harlan）の側腹部に注射した。論理的な理由により、多様な群の接種
は7日以上ずらした。各群のマウスを接種の正確に7週後、安楽死させた。マウス
が腫瘍をもつ場合、腫瘍を切除し、測定し、また、重量を測り、そして、表6Aは
、様々なベクターをもつ細胞を注射したマウスにおける腫瘍の平均重量を報告す
る。各群から一つの腫瘍が組織学的に調べられた。全ての腫瘍は線維芽肉腫であ
り、注目すべき炎症の存在はなかった。NIH3T3細胞について得られたデータは様
々なpp32変異種を安定にトランスフェクションされたNIH3T3細胞、P3、P8、FT1.
7、FT2.2、及び、FT2.4はヌードマウスに接種されると腫瘍を形成することを示
す。対して、ヒトpp32を発現するように安定にトランスフェクションしたNIH3T3
細胞は、in vivoにおいて、さらにrasと共にトランスフェクションしたときでさ
えも、腫瘍を形成することはなかった。pp32またはpp32-アンチセンスをコード
する発現構築物を安定にトランスフェクションしたNIH3T3細胞の株もまた樹立し
た。pp32の基底発現は、接触阻害及び血清依存的な細胞増殖の維持に必要不可欠
であり；内因性のpp32合成のアンチセンス除去により血清を抜いた後細胞が正常
に増殖することができた。構成的なpp32の過剰発現は、rasを介するNIH3T3細胞
のin vitroにおける形質転換と、in vivoにおける腫瘍形成性を有効に抑制する
。対して、内因性のpp32のアンチセンス除去はrasにより形質転換される細胞増
殖巣の数及びサイズを劇的に増加させ；in vivoにおいてはrasにより形質転換さ
れたアンチセンスpp32細胞から得られた腫瘍は、rasにより形質転換される対照
の細胞から得られた腫瘍の約50倍の大きさであった。
果を試験する実験は、in vitroにおけるラット胚線維芽細胞での結果と矛盾しな
い。PCR3.1-単一CMV駆動哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）に入れた、表6Aに
示されるpp32種を、lipofectiinにより安定に、NIH3T3細胞にトランスフェクシ
ョンした。これらの実験で使用されるG418耐性クローンは全て、ゲノムPCRによ
り、示されるpp32種を含んでいることを示した。腫瘍形成性の分析において、フ
ェノールレッドを含まない、無添加ダルベッコ修飾イーグル培地100マイクロリ
ットル中の5×106細胞を、非近交系背景で6週齢以上の、胸腺のない、メスヌー
ドマウス（Harlan）の側腹部に注射した。論理的な理由により、多様な群の接種
は7日以上ずらした。各群のマウスを接種の正確に7週後、安楽死させた。マウス
が腫瘍をもつ場合、腫瘍を切除し、測定し、また、重量を測り、そして、表6Aは
、様々なベクターをもつ細胞を注射したマウスにおける腫瘍の平均重量を報告す
る。各群から一つの腫瘍が組織学的に調べられた。全ての腫瘍は線維芽肉腫であ
り、注目すべき炎症の存在はなかった。NIH3T3細胞について得られたデータは様
々なpp32変異種を安定にトランスフェクションされたNIH3T3細胞、P3、P8、FT1.
7、FT2.2、及び、FT2.4はヌードマウスに接種されると腫瘍を形成することを示
す。対して、ヒトpp32を発現するように安定にトランスフェクションしたNIH3T3
細胞は、in vivoにおいて、さらにrasと共にトランスフェクションしたときでさ
えも、腫瘍を形成することはなかった。pp32またはpp32-アンチセンスをコード
する発現構築物を安定にトランスフェクションしたNIH3T3細胞の株もまた樹立し
た。pp32の基底発現は、接触阻害及び血清依存的な細胞増殖の維持に必要不可欠
であり；内因性のpp32合成のアンチセンス除去により血清を抜いた後細胞が正常
に増殖することができた。構成的なpp32の過剰発現は、rasを介するNIH3T3細胞
のin vitroにおける形質転換と、in vivoにおける腫瘍形成性を有効に抑制する
。対して、内因性のpp32のアンチセンス除去はrasにより形質転換される細胞増
殖巣の数及びサイズを劇的に増加させ；in vivoにおいてはrasにより形質転換さ
れたアンチセンスpp32細胞から得られた腫瘍は、rasにより形質転換される対照
の細胞から得られた腫瘍の約50倍の大きさであった。
【０１００】 pp32ファミリーメンバーを発現した発癌性能のスイッチは、前立腺癌のpp32表
現型におけるスイッチと同じである。実施例11は、ras及びmycを空のベクターと
トランスフェクションしたときに得られる細胞増殖巣の数と比較して、pp32r1及
びpp32r2を高頻度に発現すると、ras及びmycと共トランスフェクションしたとき
の形質転換された細胞増殖巣形成を阻害できないか、あるいは、ときには刺激す
ることを示す実験を示す。このことは一貫して形質転換を抑制する正常pp32と、
明らかな対比がある。同様に、実施例12は、腫瘍形成性のないpp32に対して、pp
32r1及びpp32r2の両方が、NIH3T3に安定にトランスフェクションした場合腫瘍形
成性があることを示す。
現型におけるスイッチと同じである。実施例11は、ras及びmycを空のベクターと
トランスフェクションしたときに得られる細胞増殖巣の数と比較して、pp32r1及
びpp32r2を高頻度に発現すると、ras及びmycと共トランスフェクションしたとき
の形質転換された細胞増殖巣形成を阻害できないか、あるいは、ときには刺激す
ることを示す実験を示す。このことは一貫して形質転換を抑制する正常pp32と、
明らかな対比がある。同様に、実施例12は、腫瘍形成性のないpp32に対して、pp
32r1及びpp32r2の両方が、NIH3T3に安定にトランスフェクションした場合腫瘍形
成性があることを示す。
【０１０１】 他の観点、利点、及び、修飾は、発明の属する分野の当業者にとって明白だろ
うが、理解を明確にする目的で、前述の発明は、特定の態様とともに説明及び実
施例によりいくつかの詳細について記載した。前述の記載及び実施例は説明を意
図しているが、本発明の範囲を限定しない。医学、免疫学、ハイブリドーマ技術
、薬理学、病理学、及び／または関連する分野の技術者には明らかである、本発
明を実行するための上に記載された方法の修飾は、本発明の範囲内であることを
意図され、追加請求項によってのみ限定される。
うが、理解を明確にする目的で、前述の発明は、特定の態様とともに説明及び実
施例によりいくつかの詳細について記載した。前述の記載及び実施例は説明を意
図しているが、本発明の範囲を限定しない。医学、免疫学、ハイブリドーマ技術
、薬理学、病理学、及び／または関連する分野の技術者には明らかである、本発
明を実行するための上に記載された方法の修飾は、本発明の範囲内であることを
意図され、追加請求項によってのみ限定される。
【０１０２】 本明細書中で述べた全ての発行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業
者のレベルで表示する。全ての発行物及び特許出願は、各発行物あるいは特許出
願が、特に、また、個別に、参考文献として援用されることを示されたのと同じ
範囲で本明細書中で参考文献として援用される。
者のレベルで表示する。全ての発行物及び特許出願は、各発行物あるいは特許出
願が、特に、また、個別に、参考文献として援用されることを示されたのと同じ
範囲で本明細書中で参考文献として援用される。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
【表９】
【０１１８】1 FT1.7、クローン2及びベクター対照、クローン3は、一つの動物群の対側性の両
側（contralateral sides）において試験した。2 D3クローン5は、pp32r1のクローンをトランスフェクションしたNIH3T3細胞を同
時に注入した動物群の対側性の両側において試験した（データは示さない）。D3
クローン６は、pp32r1のクローンをトランスフェクションしたNIH3T3細胞の2番
目のクローンを同時に注入した動物群の対側性の両側において試験した（データ
は示さない）。3 P3、クローン14及びベクター対照、クローン2は、一つの動物群の対側性の両側
において試験した。4 P8、クローン1及びpp32、クローン6は、一つの動物群の対側性の両側において
試験した。5 P8、クローン4及びpp32、クローン5は、一つの動物群の対側性の両側において
試験した。6 この群の0.5gm重量の一つの腫瘍は、死後解剖の後のみに検出された。
側（contralateral sides）において試験した。2 D3クローン5は、pp32r1のクローンをトランスフェクションしたNIH3T3細胞を同
時に注入した動物群の対側性の両側において試験した（データは示さない）。D3
クローン６は、pp32r1のクローンをトランスフェクションしたNIH3T3細胞の2番
目のクローンを同時に注入した動物群の対側性の両側において試験した（データ
は示さない）。3 P3、クローン14及びベクター対照、クローン2は、一つの動物群の対側性の両側
において試験した。4 P8、クローン1及びpp32、クローン6は、一つの動物群の対側性の両側において
試験した。5 P8、クローン4及びpp32、クローン5は、一つの動物群の対側性の両側において
試験した。6 この群の0.5gm重量の一つの腫瘍は、死後解剖の後のみに検出された。
【図１】 図1Aは、良性の前立腺および前立腺癌組織切片におけるpp32-関連mRNAのin si
tuハイブリダイゼーションによる検出を示す。 図1Bは、抗pp32抗体を用いた前立腺癌切片の免疫組織化学的染色を示す。
tuハイブリダイゼーションによる検出を示す。 図1Bは、抗pp32抗体を用いた前立腺癌切片の免疫組織化学的染色を示す。
【図２】 図2は、ヒト胎盤から単離した変異体pp32r1のゲノム配列を示す。
【図３】 図3は、pp32r1（上段）と正常ヒトpp32（下段）の配列の塩基対塩基の比較を
提供する。pp32r1の番号付け体系は図1に一致しており、正常pp32の番号付け体
系はChenらから得たものである。ヌクレオチド塩基の相違はpp32r1配列に下線を
引く。pp32r1に欠けている正常pp32配列内の配列はダッシュで示す。pp32r1のオ
ープンリーディングフレームは上線（overlining）で示す。
提供する。pp32r1の番号付け体系は図1に一致しており、正常pp32の番号付け体
系はChenらから得たものである。ヌクレオチド塩基の相違はpp32r1配列に下線を
引く。pp32r1に欠けている正常pp32配列内の配列はダッシュで示す。pp32r1のオ
ープンリーディングフレームは上線（overlining）で示す。
【図４】 図4は、pp32r1アミノ酸配列（上段）と正常ヒトpp32（下段）の配置（alignme
nt）を示す。残基の変化はpp32r1配列に下線で示す。正常pp32と比較してpp32r1
配列に欠けているアミノ酸はダッシュで示す。
nt）を示す。残基の変化はpp32r1配列に下線で示す。正常pp32と比較してpp32r1
配列に欠けているアミノ酸はダッシュで示す。
【図５】 図5は、変異体pp32r2のゲノム配列を示す。
【図６】 図6Aは、ヒト前立腺癌および前立腺癌細胞株由来のpp32およびpp32変異体のRT
-PCR増幅を示す。 図6Bは、pp32の開裂断片長多型解析によりヒト前立腺癌において変異体pp32の
転写物が検出されることを示す。
-PCR増幅を示す。 図6Bは、pp32の開裂断片長多型解析によりヒト前立腺癌において変異体pp32の
転写物が検出されることを示す。
【図７】 図7は、pp32を用いたヒト前立腺腺癌および前立腺腺癌細胞株由来の核酸（A）
およびアミノ酸（B）配列の配置を示す。
およびアミノ酸（B）配列の配置を示す。
【図８】 図8は、ras＋mycが形質転換細胞増殖巣形成（transformed focus formation）
を誘導したことを示す棒グラフである。pp32発現ベクターとの共トランスフェク
ション（co-transfection）は形質転換を減少させるが、pp32r1発現ベクターと
の共トランスフェクションは形質転換を刺激する。
を誘導したことを示す棒グラフである。pp32発現ベクターとの共トランスフェク
ション（co-transfection）は形質転換を減少させるが、pp32r1発現ベクターと
の共トランスフェクションは形質転換を刺激する。
【図９】 図9は、ras＋mycのpp32r1刺激が形質転換細胞増殖巣形成を誘導したことを示
す棒グラフである。pp32発現ベクターとの共トランスフェクションは形質転換を
減少させるが、前立腺癌細胞株由来pp32r1配列の発現ベクターとの共トランスフ
ェクションは形質転換を刺激する。
す棒グラフである。pp32発現ベクターとの共トランスフェクションは形質転換を
減少させるが、前立腺癌細胞株由来pp32r1配列の発現ベクターとの共トランスフ
ェクションは形質転換を刺激する。
【図１０】 図10は、変異体pp32種をトランスフェクションした細胞についての形質転換ア
ッセイの結果のグラフであり、様々な有効性をもって形質転換が刺激されること
を示す。
ッセイの結果のグラフであり、様々な有効性をもって形質転換が刺激されること
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB24 BB51 CB01 FB02 FB03 FB05 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 CA09 CA12 EA03 HA14 HA17 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ08 QQ33 QR13 QR77 4C084 AA01 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA53 DC32 ZB262 ZC202 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZB26 ZC20
Claims (11)
- 【請求項１】 正常pp32の正常以下の発現あるいはpp32変異体の過剰発現を示
す悪性細胞に対してpp32機能を回復させることを含む、前記の悪性細胞を治療す
る方法。 - 【請求項２】 正常pp32の正常以下の発現あるいはpp32変異体の過剰発現を示
す請求項1の悪性細胞において正常pp32の発現の増加を誘導することを含む、前
記の悪性細胞を治療する方法。 - 【請求項３】 正常pp32の発現の増加が、正常pp32をコードするDNAのトラン
スフェクションにより誘導される、請求項2の方法。 - 【請求項４】 正常pp32の発現の増加が、正常pp32発現の誘導物質を投与する
ことにより誘導される、請求項2の方法。 - 【請求項５】 化合物の存在下におけるpp32の発現の増加が前記の化合物が誘
導物質であることを示すことから、前記の化合物の存在下および非存在下におい
て培養される細胞によるpp32発現を測定すること、 を含む、前記の化合物がpp32発現の誘導物質であるかどうかを決定するためのス
クリーニングの方法。 - 【請求項６】 ホスファターゼがpp32とのインキベーションにより阻害される
ことから、正常pp32の正常以下の発現あるいはpp32変異体の過剰発現を示す悪性
細胞においてタンパク質ホスファターゼを阻害することを含む、前記の悪性細胞
を治療する請求項1の方法。 - 【請求項７】 前記のホスファターゼが核タンパク質ホスファターゼである、
正常pp32の正常以下の発現あるいはpp32変異体の過剰発現を示す悪性細胞を治療
する請求項6の方法。 - 【請求項８】 正常pp32の正常以下の発現あるいはpp32変異体の過剰発現を示
す悪性細胞において、タンパク質ホスファターゼ2Aグループの構成員である核タ
ンパク質ホスファターゼを阻害すること含む、前記の悪性細胞を治療する請求項
7の方法。 - 【請求項９】 化合物の存在下および非存在下において培養される細胞におけ
るpp32の発現がタンパク質ホスファターゼ活性を阻害し、前記の化合物によるタ
ンパク質ホスファターゼの阻害が前記の化合物が前記の細胞におけるpp32機能を
誘導することを示すことから、前記の細胞においてタンパク質ホスファターゼ活
性を測定すること、 を含む、前記の化合物がpp32機能の誘導物質であるかどうかを決定するためのス
クリーニングの方法。 - 【請求項１０】 化合物の存在下および非存在下において培養される細胞にお
けるpp32の発現が核タンパク質ホスファターゼ活性を阻害し、前記の化合物によ
る核タンパク質ホスファターゼの阻害が前記の化合物が前記の細胞におけるpp32
機能を誘導することを示すことから、前記の細胞において核タンパク質ホスファ
ターゼ活性を測定すること、 を含む、化合物がpp32機能の誘導物質であるかどうかを決定するための請求項9
のスクリーニングの方法。 - 【請求項１１】 化合物の存在下および非存在下において培養される細胞にお
けるpp32の発現が、タンパク質ホスファターゼ2Aグループの構成員である核タン
パク質ホスファターゼ活性を阻害し、前記の化合物による核タンパク質ホスファ
ターゼの阻害が、前記の化合物が前記の細胞におけるpp32機能を誘導することを
示すことから、前記の細胞において核タンパク質ホスファターゼ活性を測定する
こと、 を含む、化合物がpp32機能の誘導物質であるかどうかを決定するための請求項10
のスクリーニングの方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11866799P | 1999-02-03 | 1999-02-03 | |
| US60/118,667 | 1999-02-03 | ||
| PCT/US2000/002656 WO2000045852A1 (en) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | Method of treating cancer by restoration of pp32 function |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002536346A true JP2002536346A (ja) | 2002-10-29 |
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ID=22380017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000596971A Pending JP2002536346A (ja) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | ｐｐ３２の機能の回復により癌を治療する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1146909A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002536346A (ja) |
| AU (1) | AU2751900A (ja) |
| CA (1) | CA2361838A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000045852A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010514426A (ja) * | 2006-12-26 | 2010-05-06 | インスティテュート オブ ラジエーション メディシン，アカデミー オブ ミリタリー メディカル サイエンシズ，ピーエルエー | ヘパトポイエチン及びその使用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5734022A (en) * | 1990-08-01 | 1998-03-31 | The Johns Hopkins University | Antibodies to a novel mammalian protein associated with uncontrolled cell division |
| US5700821A (en) * | 1996-07-30 | 1997-12-23 | University Of Pittsburgh | Phosphatase inhibitors and methods of use thereof |
| US5916749A (en) * | 1996-12-13 | 1999-06-29 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human phosphatase inhibitor protein |
| EP1045926B1 (en) * | 1997-12-12 | 2006-06-14 | The Johns Hopkins University | Gene family with transformation modulating activity |
-
2000
- 2000-02-03 JP JP2000596971A patent/JP2002536346A/ja active Pending
- 2000-02-03 CA CA002361838A patent/CA2361838A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-03 WO PCT/US2000/002656 patent/WO2000045852A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 EP EP00905923A patent/EP1146909A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-03 AU AU27519/00A patent/AU2751900A/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010514426A (ja) * | 2006-12-26 | 2010-05-06 | インスティテュート オブ ラジエーション メディシン，アカデミー オブ ミリタリー メディカル サイエンシズ，ピーエルエー | ヘパトポイエチン及びその使用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000045852A1 (en) | 2000-08-10 |
| EP1146909A4 (en) | 2004-12-29 |
| CA2361838A1 (en) | 2000-08-10 |
| AU2751900A (en) | 2000-08-25 |
| EP1146909A1 (en) | 2001-10-24 |
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