JP2002535676A

JP2002535676A - ポリペプチドを同定または特徴付けるための方法およびキット

Info

Publication number: JP2002535676A
Application number: JP2000596369A
Authority: JP
Inventors: ウィリーヴァンサンビヤンヴニュ，; ドゥニフランソワホーホシュトラッサー，; ジャン−シャルルサンチェ，
Original assignee: ユニヴェルシテドゥジュネーブ
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-10-22
Also published as: DE60011390T2; EP1147414A1; DE60011390D1; EP1147414B1; ATE268903T1; WO2000045168A1; US6787330B1; AU766334B2; AU2905600A

Abstract

(57)【要約】ゲル電気泳動によって分離されたポリペプチドは、２つの主な段階を有する手順によって同定され得るかまたは特徴付けられ得る。第１段階において、このゲルは、ポリペプチド切断剤（例えば、酵素）を用いて消化される。この段階は、主に大きなフラグメントを生成し、第２段階において、親水性膜を通して電気的ブロッティングされ、この膜上に、別のポリペプチド切断試薬（例えば、酵素）を疎水性部材上（代表的には、膜（例えば、ＰＶＤＦ））に固定化する。得られたフラグメント（通常は、ペプチド）は、好ましくは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって同定されるか、または性質が、例えば、抗体との相互作用によって決定され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（１．発明の分野）本発明は、代表的にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）からゲル上
で単離された１つ以上のポリペプチドの同定および特徴付け、およびこの方法に
おける使用のためのキットに関する。本発明は、プロテオミクス（タンパク質の
大規模な同定および特徴付け）において特に有用である。

【０００２】（２．関連技術の説明）プロテオミクスにおいて、大規模並列処理のタンパク質の同定および特徴付け
の技術が、必要とされる。単にＰＡＧＥによるタンパク質または他のポリペプチ
ドの同定は、二次元ゲル（２Ｄ−ＰＡＧＥ）を使用してさえも、困難でありかつ
しばしば不確実である。多くの異なる方法が、複雑な生物学的サンプルからタン
パク質を同定し、部分的に特徴付けるために、開発されている。これらのいくつ
かは、マトリクス補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦＭＳ）技術を使用して、酵素を用いてタンパク質を断片化すること
によって生じるペプチド「フィンガープリント」を分析する。いくつかのソフト
ウェアプログラムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ実験から得られたペプチドの質
量スペクトルを、タンパク質からの理論スペクトルと比較するために開発されて
いる。この主題は、Ｍ．ＫｕｓｓｍａｎｎおよびＰ．Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ、Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ１９９８、１４、１〜２７によって総説されている。
これらの著者らは、ゲル電気泳動によって分離されたタンパク質が酵素を用いて
消化されて、フラグメントペプチドを生じ得る３つの方法に注目した：１．消化は、切り取られたゲルの断片（ｐｌｕｇ）において実施され得、そして
ペプチドは、溶出によって回収され得る。これは、この著者ら自身の選択である
。２．タンパク質は、まず、切り取られたゲル断片から電気的溶出（ｅｌｅｃｔｒ
ｏｌｅｌｕｔｅ）され得、次いで、溶液中で消化され得る。３．タンパク質は、膜上に電気的ブロットされ、引き続いてこの膜上で消化され
る。

【０００３】これらの型のプロセスは、同じゲル上で泳動されたポリペプチドの配列決定に
ついて実施できない。なぜなら、ゲルからのポリペプチドバンドの切り取りは、
連続的に行わなければならず、従って、断片は、さらなる分析のためにチューブ
に置かれて得られなければならないからである。また、ポリペプチドがチューブ
の壁に接着される場合に、損失が生じる。

【０００４】本発明者らのうちの２人は、彼らが１工程消化転写（ｏｎｅ−ｓｔｅｐｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＯＳＤＴ）と呼ぶ、異なる方法を用いて
実験した。「Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ」と題される、米国特許出願番号０９／１０７９９１（１９９８年
６月３０日出願）および対応するカナダ国特許出願番号２２４４９４７（１
９９８年９月２４日出願）を参照のこと。これらの開示は、本明細書中で参考と
して援用される。彼らは、ゲル上で分離されたタンパク質または他のポリペプチ
ドが、例えば、酵素を用いる消化によってフラグメントへと切断され得ること、
およびこれらのフラグメントが、切断試薬が親水性膜上に固定化され、そして従
来のポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜として例示される、サンドイッチ
の１つの「スライス」としての分離ゲルと疎水性収集部材との間のブロッティン
グ「サンドイッチ」における「充填物」として、サンドイッチの他の「スライス
」として、挿入される場合に、分析（特に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる）
のために非常に十分であることを示すことを見出した。この方法において、フラ
グメントは、疎水性部材上に収集され、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに適
切な方法において処方される。トランスブロッティングが実施されることが単に
必要であり、その結果、タンパク質は、固定化された切断試薬の近傍に十分に長
い滞留期間を有して、合理的な量のフラグメントが生成されること（しかし、当
然のことながら、望ましくない拡散を生じない限り）を確実にする。電気的ブロ
ッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）（すなわち、電場によって補助
されるブロッティング）を用いて、これは、電気的ブロッティングにおいて使用
される電流を適切に変化させることによって（例えば、電流をパルスすることま
たは非対称の交流を使用することによって）容易に達成可能である。さらに、酵
素が切断剤として使用される場合、および酵素が親水性膜上にしっかりと固定化
される（特に固相に対して共有結合によって）場合、自己消化（酵素自身の消化
）が、阻害される。

【０００５】ＯＳＤＴ方法は、多くのタンパク質について良好な結果を与えるが、非常に強
力な塩基性タンパク質（例えば、リゾチーム）は、好ましい酵素（トリプシン）
の使用に最適である条件下で容易に転写されない。トリプシンは、ｐＨ約８．４
の緩衝液において最善の消化を与える。また、ＯＳＤＴ方法は、非常に高い分子
量のタンパク質の良好な消化を与えない。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、ＯＳＤＴ方法に対する改善であり、そして本発明者らが「完全ゲル
消化（ｉｎｆｕｌｌｇｅｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」（ＩＦＧ）と呼ぶ別の
技術の開発に一部基づく。この手順は、ゲルを脱水し、次いで、このゲルを再水
和すること、ポリペプチド切断試薬（例えば、酵素）を、例えば、再水和緩衝液
中でゲルに添加することを包含する。ＩＦＧの後、次いで、消化されたタンパク
質は、従来の方法において電気的ブロットされる。この技術の１つの弱点は、ゲ
ル中の消化の間の拡散によって、低分子量タンパク質（分子量４０ｋＤａ未満の
タンパク質）が損失することである。

【０００７】ここで、ＩＦＧ手順（必要に応じて改変される）をＯＳＤＴと合わせることに
よって、改善された同定によって達成されたタンパク質（または他のポリペプチ
ド）の十分な消化が、広範な分子量を有するポリペプチドについて達成され得る
ことが、見出される。さらに、高分子量タンパク質は、エピトープとして同定さ
れ得るフラグメントを生じるために、十分にイムノブロットされ得る。

【０００８】好ましい「組み合わせ手順」において、ゲルは、再水和され、そしてポリペプ
チド切断試薬を含む緩衝液を用いて、少なくとも部分的に、好ましくはほんの部
分的に再水和され、ＩＦＧが実施され、これに次いで、ＯＳＤＴが実施される。

【０００９】１つの局面において、本発明は、電気泳動によってゲル上で単離されたポリペ
プチドを同定または特徴付ける方法を提供し、この方法は、以下：ａ）少なくとも１つのポリペプチドが単離されたゲルを提供する工程；ｂ）このゲル中に第１のポリペプチド切断試薬を（好ましくは、このゲルを脱水
し、そしてこのゲルをこのポリペプチド切断試薬を含む緩衝液を用いて少なくと
も部分的に再水和することによって）組み込む工程；ｃ）少なくとも１つの親水性膜をこのゲルに隣接して提供する工程であって、こ
の膜上に、少なくとも１つの第２のポリペプチド切断試薬を固定化する、工程；ｄ）疎水性収集部材（好ましくは、膜）を提供する工程であって、この疎水性収
集部材は、この疎水性収集部材上でトランスブロッティング（好ましくは、電気
的ブロッティング）によってこのゲルから疎水性収集部材に転写されるポリペプ
チドのフラグメントを受けるために適切であって、この疎水性部材は、このポリ
ペプチドのフラグメントの移動の方向に、この親水性膜にわたって位置付けされ
る、工程；ｅ）完全ゲルからこのポリペプチドをトランスブロットする工程であって、第２
のポリペプチド切断試薬によってこのポリペプチドをフラグメントへと切断させ
るに有効な条件下で、この完全ゲル上で、この親水性膜を通してこの疎水性層に
このポリペプチドが単離された、工程；およびｆ）この親水性収集層上で収集されたこのフラグメントを同定または特徴付ける
、工程、を包含する。

【００１０】好ましくは、この方法は、以下：ｇ）上記フラグメントが誘導される上記ポリペプチドを同定または特徴付ける工
程、をさらに包含する。

【００１１】本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットを含み、このキット
は、以下：ａ）電気泳動ゲルに組み込むために適切な第１のポリペプチド切断試薬；ｂ）電気泳動ゲル上で分離されたポリペプチドのトランスブロットにおける使用
のために適切な、少なくとも１つの親水性膜であって、この膜は、この膜上に固
定化された少なくとも１つの第２のポリペプチド切断試薬を有する、膜；およびｃ）疎水性収集部材であって、トランスブロッティングによってこの疎水性収集
部材に転写された分離されたポリペプチドのフラグメントをこの疎水性収集部材
上で受けるために適切な、疎水性収集部材を備える。

【００１２】要素ｂ）およびｃ）は、別々の成分（例えば、別々の容器）として、または予
め形成されたアセンブリとして提供され得る。

【００１３】用語「ポリペプチドを切断する」は、本明細書中で使用される場合、基、残基
または基もしくは残基の任意の鎖が、分子の残りから分離される任意の工程をい
う。この用語は、アミノ酸の主鎖または側鎖における切断あるいは任意の末端ま
たは側鎖基もしくは残基の切断を含む。例えば、カルボキシペプチダーゼによる
Ｃ末端アミノ酸の除去、アミノペプチダーゼによるＮ末端アミノ基の除去、グリ
コシダーゼによるグリコシル側鎖の除去が含まれる。

【００１４】本発明の方法は、完全ゲルにおける消化を必要とする。すなわち、この方法は
、このゲルから断片を切断する工程、およびこの切断された断片を酵素において
消化する工程を含まない。

【００１５】脱水されているゲルに対する上記の参照は、単に、このゲルを周囲温度にて空
気中に置くこと、またはこのゲルを脱水するための計画的な工程を得ることによ
って脱水されるようにする。用語「脱水」は、完全な、実質的に完全な、または
部分的な、ゲルからの水の除去を含む。

【００１６】本明細書中で使用される場合、用語「収集部材」は、広範な意味を有する。な
ぜなら、これは、それ自身、本発明に対して重要でないからである。単離におい
て考慮すると、収集部材は、例えば、自己支持膜、フィルム、またはプレートで
あり得るか、あるいは、収集部材は、例えば、コーティングとしての、非自己支
持（例えば、基材上に支持された疎水性層）であり得る。これは、通常、ブロッ
ティング緩衝液に対して多孔性であり、保有されるべき電流または電極からの電
流を可能にするが、あるいは、これは、電極であり得るか、またはこれと直接電
気的に連絡し得る。

【００１７】用語「トランスブロッティング」は、本明細書中で使用される場合、別の表面
（これは、本発明において、疎水性収集部材である）に対してポリペプチドフラ
グメントを転写する任意の操作を包含する。これは、毛管作用または電気的ブロ
ッティングによる転写のプロセスを含む。この明細書において、「トランスブロ
ッティング」は、ポリペプチドに対して適用可能な任意のブロッティング手順の
部分であり得、例えば、イムノブロッティング含む。

【００１８】本明細書中で使用される場合、用語「同定（する）」は、配列を決定すること
と同義ではなく、そして、ポリペプチドを部分的に同定することを含む。さらに
、この用語は、最も可能性のある少数の可能性に基づいて一時的に同定すること
を含む。

【００１９】本明細書中で使用される場合、用語「キット」は、別々の容器中の同定された
成分の組み合わせ、ならびにまた、使用のために準備した親水性膜および疎水性
収集層のアセンブリを含む。キットは、さらに、別々の容器、本発明の方法にお
いて有用な他の試薬（例えば、ゲルを再水和するための緩衝液、ブロッティング
緩衝液、酵素とポリペプチドフラグメントとの反応において補助する試薬など）
を備える。

【００２０】（好ましい実施形態の説明）本発明は、ゲル電気泳動によってすでにゲル上で単離されたポリペプチドを同
定することに関する。同定されるべきポリペプチドの性質は、重大ではない。こ
のポリペプチドは、例えば、天然に存在するタンパク質、組換えＤＮＡ技術によ
って作製されたタンパク質、ペプチド合成によって作製されたポリペプチドまた
は組換えＤＮＡの発現よって作製されたポリペプチドであり得る。簡潔のために
、本発明は、本明細書中で以後、タンパク質に対する参照を用いて説明される。
他のポリペプチドに対する外挿は、以下の説明全体にわたって理解されかつ援用
されるように考慮される。

【００２１】タンパク質が単離されるゲルの種類は重要でないが、通常は、ポリアクリルア
ミドゲルである。従来のゲルおよび分離条件のいずれか（還元条件を含む）が、
使用され得る。これらは、一次元ゲルまたは二次元ゲルであり得る（２Ｄゲルに
おいて、タンパク質などは、それらの電荷によって一方の次元に、そしてそれら
の分子量によって他方の次元に分離される）。

【００２２】本発明は、同じゲル上に同時に存在する複数のタンパク質（例えば、３〜３０
００、より通常は３０〜３０００、および好ましくは、５０〜１５００のタンパ
ク質）に、通常は、適用されるべきである。これは、１Ｄゲル上での異なる分子
量の分離物または類似の分子量の分離物で存在するが、１Ｄゲル上の平行するレ
ーンまたはトラック中に存在するタンパク質、ならびに２Ｄゲル電気泳動によっ
て分離されたタンパク質を含む。しかし、本発明はまた、単一のポリペプチドが
同定または特徴付けられることが必要とされるゲルにも適用する。特に、高分子
量（例えば、１５０〜２５０ｋＤａ）のタンパク質のイムノブロッティングに対
して、その高分子量のタンパク質を、エピトープがイムノブロッティングで認識
され得るフラグメントに分割するために有用である。

【００２３】本発明の方法の第１段階は、タンパク質が分離されたゲルと同じゲル内でのタ
ンパク質の消化を包含する。この段階において、好ましくは３つの主要な操作が
存在する。第１の操作は、ゲルを脱水することである。ゲルは、必要とされるタ
ンパク質消化量に依存して、完全または部分的に脱水され得る。脱水が多いほど
、その後にゲルが第１のポリペプチド切断試薬を含む溶液を吸収する能力が高く
なり、従って、消化がより多くなる。脱水は完全であり得るか、実質的に完全（
例えば、元の水分量の９０〜９９重量％の除去によって）あり得るか、またはよ
り好ましくは、部分的（例えば、同基準で、２５〜９０重量％、好ましくは、４
０〜７０重量％の除去によって）であり得る。もちろん、完全に乾燥されたゲル
を再水和することはより困難である。脱水の方法は重要ではない。周囲温度（す
なわち、１５〜２５℃）での風乾が好ましい。低圧下で４〜１０℃でのゲルの単
なる放置は、別の方法である。風乾して、その後、放置することは、さらなる方
法である。

【００２４】次の操作は、再水和および第１のポリペプチド切断試薬の再水和緩衝液中の組
み込みである。ポリペプチド切断試薬は、好ましくは、酵素（例えば、トリプシ
ンまたはＬｙｓ−Ｃ）であるが、化学切断試薬（例えば、ＣＮＢｒ）が、代替的
に使用され得る。他の酵素および化学切断試薬の例は、第２のポリペプチド切断
試薬の議論と関連して、後で示される。本明細書中以降、酵素とは、以下の記載
において、必要な変更を加えて理解および組み込まれるように扱われる、他のポ
リペプチド切断試薬に対する外挿に対して言及される。第１の酵素は、トランス
ブロッティング工程で使用される第２の酵素と同じであってもよく、異なっても
よい。トランスブロッティングにおける使用について以下に記載される任意の酵
素が、完全ゲル消化において使用され得る。

【００２５】原理的には、どの段階で第１の酵素がゲル中に導入されるか、そしてそれがゲ
ル中で遊離形態または固定化形態のどちらで存在するかは重要でない。しかし、
電気泳動の開始からゲル中に存在する場合、その酵素またはゲルを泳動する条件
が、ゲルが泳動中に第１の酵素を不活性にするよう選択されない限り、その第１
の酵素は、通常、タンパク質分離パターンを乱す。この不活性化は、泳動緩衝液
に、酵素の可逆的インヒビターを添加することによって達成され得る。例えば、
酵素がトリプシンである場合、可逆性インヒビター（例えば、ベンズアミジン）
が適切である。条件は、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｊｅｆｆｃｏａｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ．Ｍｅｔａｂ．１９７４３８，１５５−１５７に記載
されるようなものである。次いで、ゲルを泳動し、タンパク質の分離を生じた後
、再水和工程の部分としてゲルを洗浄し、インヒビターの除去、従って酵素の再
活性化を生じる。

【００２６】酵素は、通常、タンパク質の単離後にゲルに添加される。これは、溶液または
ゲルを浸透する微細な懸濁液として添加され、そしてゲル固体に良好に吸収され
る。原理的には、酵素は、任意の意図的な再水和工程の前、または再水和がもた
らされた後（例えば、濃縮された溶液中）でさえ、添加され得る。しかし、原理
的には、このような技術は、最良の消化を付与するようではない。通常、酵素は
、緩衝化された再水和溶液中に存在する。好ましくは、ゲルは、酵素を含む再水
和緩衝液と共に、例えば、３５℃で３０分間、インキュベートされる。時間およ
び温度は、所望のフラグメントのサイズに従って、変更され得る。再水和は、部
分的、完全、またはタンパク質がゲル上を泳動されたときよりも多くの水を、ゲ
ルが含有する程度でさえあり得る。トランスブロッティングを可能にするために
適切な、任意の程度の再水和が許容可能である。原理的には、ゲルを過剰な再水
和溶液で処理すること、およびその過剰分を除去することが簡便である。さもな
ければ、所望でないタンパク質の拡散またはゲルの過剰な膨張が、生じ得る。

【００２７】この段階で、ゲルは、部分的に消化されたタンパク質由来の、多くの誤った切
断によるペプチドを含む。高分子量および塩基性のタンパク質のフラグメントが
、完全な分子と比較して、電気的ブロッティングによってより容易にゲルから抽
出可能である。

【００２８】本発明の方法の第２段階は、トランスブロッティング（好ましくは、電気的ブ
ロッティング）を含む。通常、電気的ブロッティングは、タンパク質が負に荷電
するので、全体としてカソードからアノードへの方向で生じる。使用される電気
的ブロッティング緩衝液のｐＨに依存して、正に荷電したフラグメントおよび負
に荷電したフラグメントは、反対の方向（それぞれ、カソードおよびアノードへ
）で獲得され得、そして移動し得る。図面の図１および図２は、電気的ブロッテ
ィングのためのいくつかのサンドイッチを例示する。図１は、カソード収集層（
好ましくは、従来のＰＶＤＦ膜である）が提供された実験的配置を示し、まさに
、これらの条件下では、交流電界（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇｆｉｅｌｄ）が適
用された（従って、電極を反転させる）にも関わらず、タンパク質はこの膜に移
動しなかったことを示す。異なるｐＨ条件下では、いくつかのフラグメントが、
カソード収集層で生成され得ることが理解される。従って、本発明は、アノード
収集層およびカソード収集層に、それらの各々と分離ゲル層との間に挿入された
疎水性膜を提供する可能性を含む。図１において、単一の疎水性膜（好ましくは
、改変ＰＶＤＦ膜である）が存在し、これは、その上に固定化された適切なタン
パク質切断試薬（通常、プロテアーゼ酵素（例えば、トリプシン）を有し、ゲル
層とタンパク質フラグメントが収集されるアノード収集層（最も簡便には、従来
のＰＶＤＦ膜）との間に挿入される。図２において、カソード収集層は存在しな
いが、２つの連続した疎水性膜（好ましくは、改変ＰＶＤＦ膜）が存在し、これ
らは各々、その上に固定化されたトリプシンを有し、ゲル層とアノード収集層（
また、好ましくは、従来のＰＶＤＦ膜である）との間に配置される。

【００２９】より詳細には、アノードおよびカソードは、吸収性の層によってサンドイッチ
の残部から分離され、この吸収性の層は、液体を電極との電気的接触中に維持し
ながら、ブロッティング液を吸い上げ、そして簡便には、濾紙である。配置に使
用される電極および吸収性の層の種類は重要でなく、そして電気的ブロッティン
グに従来使用される任意のものであり得る。

【００３０】アノード収集層（およびカソード収集層（使用される場合））もまた重要でな
く、従って、電気的ブロッティングに使用される任意の従来の疎水性膜（例えば
、ＰＶＤＦ（従来の、または正に荷電した）、ナイロンまたはニトロセルロース
のような）であり得る。

【００３１】サンドイッチの「充填」は、十分に疎水性の１以上の膜（上記のように定義さ
れる）の形態をとり得、この特徴において、膜のタンパク質およびフラグメント
は、膜上で固着する傾向になくなる。この膜は、任意の薄い部材から形成され得
、この部材は、電気的ブロッティング液に対して多孔性であり、そしてその上（
電気的ブロッティング液（従って、切断されるべきポリペプチド）にアクセス可
能な隙間内のその表面上またはその中の微小腔内のいずれか）でポリペプチド切
断試薬を固定化し得る。それは、代表的には、１００〜６００μｍ厚である。通
常、このような膜の数は、１〜３個である。膜の従来の厚さ（例えば、好ましい
「ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＡＶ」ＰＶＤＦ膜におけるような、１３０〜１５０μｍ
）を有する、２つの膜が、しばしば使用される。これらは、交互に隣接して直接
的に、最良に配置される（すなわち、一方が、他方の上にある）。好ましくは、
第２のポリペプチド切断試薬は、疎水性膜に共有結合される。この目的のために
、疎水性膜は、好ましくは、切断試薬（例えば、酵素）に存在するアミノ基と反
応性の、「活性カルボニル」またはカルボン酸基あるいはそれらの誘導体を提供
される。「活性カルボニル」改変型ＰＶＤＦ膜またはカルボキシル改変型ＰＶＤ
Ｆ膜が、特に好ましい。

【００３２】膜の表面上に存在する活性な基の全てを酵素と反応させることは困難であるの
で、そしてポリペプチドがこれらの遊離の活性な基と反応するのを許容すること
は望ましくないので、好ましくは、膜を使用する前に、（さもなければ、遊離で
あろう）残りの活性な基がキャップされる。このキャップは、例えば、エタノー
ルアミンによって行われ、従って、比較的疎水性の−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂ −ＯＨのような末端を提供する。他の疎水性キャップ基は、当業者に示唆される
。

【００３３】あるいは、ＰＶＤＦ膜またはガラスファイバー紙は、イソチオシアネートによ
って官能化され得る。このイソチオシアネートは、酵素中のＮ末端アミノ基およ
び／またはリジン残基のε−アミノ基との反応を可能にする。この目的のために
、ＰＶＤＦ膜は、ＮａＯＨで前処理され、ＨＦの分子の除去によってポリマー鎖
中に炭素−炭素エチレン二重結合を提供する。次いで、この前処理したＰＶＤＦ
膜を、塩基性条件下で、二求核試薬（ｄｉｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）（例えば、
エチレンジアミン、１，１０−ジアミノデカンまたは２−アミノエタンチオール
）と反応させ、これによって、ポリマー中の水素原子が、−Ｘ−（ＣＨ₂）_n−Ｎ
Ｈ₂基（ここで、−Ｘ−は−Ｓ−または−ＮＨ−であり、そしてｎは２または１
０である）で置換される。次いで、アミン末端化側鎖を有するこのポリマーを、
１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）または３，５−ジクロロ
−１，４−フェニレンジイソシアネート（ＤＣＤＩＴＣ）と反応させ、必要とさ
れるイソチオシアネート末端化側鎖を、好収率で生じる。ＤＩＴＣ反応化ガラス
ファイバー紙は、別の形態の膜を提供する。例えば、Ｒ．Ｈ．Ａｅｂｅｒｓｏｌ
ｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２９１，４２２９−４３３８を参照
のこと。

【００３４】別の形態の疎水性膜は、アリールアミン基で官能化されたＰＶＤＦであり、こ
れは、酵素のカルボン酸側鎖またはカルボキシル末端と、好ましくはカルボジイ
ミド（例えば、１−（３−ジメチルアミンプロピル）−３−エチルカルボジイミ
ド）の存在下で反応する。

【００３５】サンドイッチ充填物として使用され得る別の形態の疎水性膜は、アガロースゲ
ルの薄層またはコーティングである。Ｎ末端アミノ基および／または酵素中のリ
ジン残基のε−アミノ基（反応の選択性に従って）を処理して、アミノオキシ基
を得て、このアミノオキシ基は、アガロースゲルの穏やかな酸化によって生成さ
れるアルデヒド基と反応し、従って、酵素をアガロース（ａｇａｒａｏｓｅ）に
共有結合させる。

【００３６】疎水性膜のさらなる種は、ポリアクリルアミドゲルの１以上の薄層またはコー
ティングを含み得、これは、固定化ｐＨ勾配電気泳動（ＩＰＧ）において使用さ
れる厚さと類似の厚さであるが、トリプシン化されている。これは、トリプシン
とアクリロイルクロリドとを反応させて、Ｎ−アクリロイルトリプシンを形成す
ることによってなされ得、このＮ−アクリロイルトリプシンは、次いで、アクリ
ルアミドコポリマーゲルの調製において、アクリルアミドとコポリマー化される
。

【００３７】なお別の形態の疎水性膜は、ガラスフィルター紙であり、これは、アミノ基を
ジアゾ結合を含む基（例えば、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’
−イソシアネート基）によって置換するように改変されている。この目的に必要
とされる反応は、Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎｇら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ１９７７
，８４，１８７−１９０によって記載されている。

【００３８】膜上に固定化される切断試薬は、通常および好ましくは、共有結合によって固
定化される。しかし、他の形態の固定化は、その酵素が電気的ブロッティング液
中の溶液中で自己消化を受けるように十分に遊離せずにある限り、本発明におけ
る使用から排除されない。（自己消化された酵素フラグメントの存在は、分析さ
れるべきタンパク質由来のフラグメントの分析を乱し得ることが理解される）。
従って、例えば、酵素は、疎水性ポリマーの多孔性シートの孔内に物理的に捕捉
され得る。あるいは、膜は、親和性結合を包含する（親和性結合からなるか、ま
たは親和性結合を含む）手段によって、酵素を膜上に固定化させ得る。従って、
酵素は、アビジンまたはストレプトアビジンに共有結合され得、そして生じた結
合体は、アビジン／ストレプトアビジンとビオチンとの間の親和性結合によって
、ビオチン化膜に結合され得る。あるいは、アビジンまたはストレプトアビジン
が膜に結合され得、そして酵素は、アビジンまたはストレプトアビジンが結合さ
れた膜との反応のためにビオチニル末端化を提供するように反応され得る。

【００３９】好ましくは、ポリペプチド切断試薬のいずれかまたはその両方は、酵素を含む
。両方が酵素を含む場合、この酵素は同じであってもよいし、異なっていてもよ
い。最も好ましくは、そして通常は、この酵素は、ポリペプチドの主鎖を切断し
（すなわち、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテイナーゼである）、特にト
リプシンである。トリプシンは、多くのリジンおよびアルギニンのＣ末端側でタ
ンパク質を切断する。他のあまり特異的でないエンドプロテアーゼ（例えば、ペ
プシンまたは例えばキモトリプシンのようなもの）は、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａ
ｒｇ−ＣまたはＧｌｕ−Ｃのような高度に特異的な酵素と同様に使用可能である
。リンタンパク質については、ホスホリラーゼが有用である。酵素のいずれかま
たはその両方は、タンパク質の側鎖を切断するか、または末端に作用するエキソ
酵素であり得る。１つより多くの酵素がゲル中に組み込まれ得る。１つより多く
の酵素は、膜上に固定化され得る。例えば、これは、例えば、エンドプロテイナ
ーゼとともに、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼを用いて、ポ
リペプチドの１つ以上の側鎖を切断するために有用であり得る。カルボキシペプ
チダーゼＹは、特に有用なこのような酵素の１つである。

【００４０】タンパク質中の側鎖（例えば、グリコシル、Ｎ−アセチル−Ｏ−グルコサミニ
ルおよびシアリル）の存在を調べるために、それらの鎖を切断する酵素（例えば
、それぞれ、グリコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラミ
ニダーゼ）が本発明において有用である。

【００４１】以下のチャートは、組み合わせて使用され得る酵素の型についての種々の可能
性を示す：

【００４２】

【表２】切断試薬は、酵素に制限されない。試薬のいずれかまたはその両方が、化学的
試薬（例えば、臭化シアン、２−ヨードソ安息香酸もしくはそれらの誘導体、ま
たはヒドロキシルアミン）であり得る。このような試薬は、Ｅ．Ａ．Ｃａｒｒｅ
ｙ、「ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐ
ｒｏａｃｈ」Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８９の
１１７〜１２１頁「ＰｅｐｔｉｄｅＭａｐｐｉｎｇ」に記載される。第２のポ
リペプチド切断剤として使用するために、この化学的試薬は、疎水性膜に適切に
固定化される。従って、臭化シアンは、疎水性膜の孔内での捕捉により物理的に
固定化され得る。２−ヨードソ安息香酸は、好ましくは、ＣＯＯＨ基において、
例えば、アルキレンジアミン（特に１，６−ヘキサンジアミン）で誘導体化され
、遊離のアミノ基を残し、次いで、膜上の官能基（例えば、上記の活性なカルボ
キシル基）と反応する。

【００４３】異なる切断試薬が異なる特性を有し、そして特定の場合においては、小フラグ
メントがないこと（切断がないことを示す）は、同定または特徴付けのために有
用であり得ることが理解される。

【００４４】電気的ブロッティングに適用される電流は、好ましくは、直流の連続電流では
なく、パルスされるか（すなわち、電流が流れない間隔がある直流）または交流
のいずれかである。電流は、カソードからアノードの方向へバイアスされなくて
もよいし、バイアスされてもよい（すなわち、主にカソードからアノードへの電
流であるが、電流が反対の方向に流れている間隔を有する）。これらのレジメに
対するバリエーションは、通常の電気的ブロッティングよりもゆっくりと行うと
いう考え方の一般的な意図の範囲内で可能であり、このことによって、分離ゲル
から収集膜へのタンパク質フラグメントのゆっくりとしたこのような移動（これ
は、側方への拡散を生じ、分離の喪失を引き起こす）を避けつつ、十分な時間で
切断が疎水性膜上で生じることを可能にする。

【００４５】電気的ブロッティング液は、タンパク質フラグメント化、従って有用な同定の
いくらかの形態を得ることに対して重大ではない。この液は、通常は緩衝化され
、そしてこの目的のために、従来のいずれかの緩衝液（例えば、メタノール含有
Ｔｒｉｓ／グリシンまたはメタノール含有３−（シクロヘキシルアミノ）−１−
プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））であり得る。フラグメントの移動の方向は、
本質的には、緩衝液のｐＨに依存する。大部分の目的については、アルカリ性緩
衝液が適切である。なぜなら、多くの酵素は、アルカリ性ｐＨで最も良好に作用
するからである。特に、トリプシンの場合においては、緩衝液は、好ましくは、
８．０〜９．０、そして最も特に８．２〜８．６のｐＨを有することが好ましく
、ｐＨ約８．４の半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液（ｈａｌｆＴｏｗｂｉｎ’ｓｂ
ｕｆｆｅｒ）が最適であると考えられる。いくつかの他の酵素（例えば、エンド
プロテイナーゼＶ８）は、酸性ｐＨを要求する。このような条件下では、フラグ
メントは、カソードへ移動する。

【００４６】少量の従来の界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）を緩衝液中に組み込んで、ミセル
（負に荷電した凝集物）を形成させることは望ましいことが見出された。

【００４７】タンパク質フラグメント（タンパク質の主鎖に由来するペプチドであるか、ま
たは側鎖の残基であるかに拘わらず）は、収集層上で収集される。次いで、それ
らは、好ましくはマトリクス補助レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）または
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）に基づく分光学的方法により分析される
。好ましい手順は、飛行時間型（ＴＯＦ）分析を伴うＭＡＬＤＩである（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦＭＳとしても公知）。これは、例えば、文献に記載されるように
、膜上にマトリクスを形成すること（用いられる特定の波長で強く入射光を吸収
する薬剤を有する）を包含する。サンプルを、ＭＡＬＤＩ質量分析機中でＵＶま
たはＩＲレーザー光で気相へと励起する。イオンを蒸発により生成し、そしてイ
オンプルームを形成する。このイオンを電場中で加速し、そして所定の距離に沿
ったそれらの移動時間に従って分離し、非常に正確かつ感度の高い質量／電荷（
ｍ／ｚ）読みとりを与える。ＭＡＬＤＩ分光器は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販
されており、そして文献中に記載される（例えば、Ｍ．Ｋｕｓｓｍａｎｎおよび
Ｐ．Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆ（上記で引用））。

【００４８】本発明において、上記の方法は、一度に多くのタンパク質のフラグメントのス
キャニングに適用される。従って、多くのタンパク質がポリアクリルアミドゲル
上で同時に泳動され得、本発明の方法に供されて、収集膜上にスポットのアレイ
を生成し、そしてこのアレイは、以下のように分析される。ＰＶＤＦ膜または他
の疎水性収集層は、染色され、その一片が切断され、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳサ
ンプルプレート（例えば、シリコングリース）上に固定される。有機性のマトリ
クス形成試薬が、サンプルプレート上の膜に添加され、次いで、サンプルは、風
乾されて、マトリクスを形成する。このサンプルプレートは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
分光器中に挿入される。アレイ中の個々のスポットをレーザーと整列するための
、サンプルプレートの第１の位置から第２の位置、および引き続く位置への自動
化された移動は、コンピュータープログラムにより準備されている。各位置で、
ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルが生成され、このスペクトル情報をデジタル形態で
収集し、そしてこのデータをＥｘＰＡＳｙデータベースリサーチプログラム（Ｐ
ｒｐｔＩｄｅｎｔ）にダウンロードする。

【００４９】次いで、現在ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳについて使用されているように、Ｅｘ
ＰＡＳｙサーバを使用することによりこの結果の自動化された出力を提供するこ
とおよびコンピューターにより操作可能な形態にデータを生成することは比較的
単純である。

【００５０】従って、本発明は、例えば、プロテオミクス研究において、タンパク質の自動
化された同定および／または部分的特徴付けについて非常に大きな潜在性を有す
ることは明らかである。要するに、本発明は、好ましい実施形態において、この
目的のための「分子スキャナ」を提供する。

【００５１】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの質量の正確性および感度を改善するための他の技
術を用いて、収集膜上で得られるタンパク質のフラグメントを分析し得る。これ
らとしては、遅延イオン抽出（ｄｅｌａｙｅｄｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
）、エネルギー反射器およびイオン捕捉モジュール（ｉｏｎ−ｔｒａｐｍｏｄ
ｕｌｅ）の使用が挙げられる。さらに、ポストソース崩壊（ｐｏｓｔｓｏｕｒ
ｃｅｄｅｃａｙ）およびＭＳ−ＭＳ分析は、さらなる構造的分析を提供するた
めに有用である。ＥＳＩを用いると、サンプルは液相中にあり、そして分析は、
イオン捕捉、ＴＯＦ、単一の四重極または多重の四重極の質量分析器による分析
であり得る。このようなデバイス（単一の四重極以外）の使用は、ＭＳ−ＭＳま
たはＭＳⁿ分析を行うことを可能にする。

【００５２】分析のなお他の方法は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体および
ホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｉｎｇ）を用いるイムノブロッ
ティングを含む。

【００５３】必要に応じて、他の構成成分がキット中に含められ得、特に以下のうちのいず
れか１つ以上が含められ得る：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのためのマトリクス形成試薬
、再水和緩衝液、電気的ブロッティング緩衝液、収集層（例えば、カチオン性膜
およびＰＡＧＥ材料）。イムノブロッティングの場合において、このキットは、
１つ以上の抗体（特にモノクローナル抗体の範囲）をさらに含み得る。上記に定
義されるキット（しかしさらに、上記の必要に応じた構成成分のうちの１つ、２
つ、またはそれ以上を含む）は、本発明の範囲内にあることが、本明細書により
具体的に明らかにされる。キットの全ての構成成分は、別々の容器で供給され得
るが、キットとして全体がパッケージングされ得る。

【００５４】以下の実施例は、本発明を例示する。用語「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ」、「Ｔｒａ
ｎｓ−Ｂｌｏｔ」、「Ｔｒｉｚｍａ」、「Ｔｗｅｅｎ」および「Ｖｏｙａｇｅｒ
」は、商標であり、そして／または登録商標である。

【００５５】（実施例）（材料および方法）化学物質。「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ」ＡＶ型（ＩＡＶ）膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ａｃｒｙｌｏｇｅｌ−Ｐ
ＩＰ２．６％Ｃ溶液は、ＢＤＨ（Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から購入した
。広帯域ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準ＰＶＤＦ膜を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、「Ｔｒｉｚｍ
ａ塩基」（Ｔｒｉｓ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン
酸（ＣＡＰＳ）およびトリプシン（ブタ膵臓由来のＩＸ型（透析および凍結乾燥
された））をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ア
セトニトリル（分離用ＨＰＬＣグレード）、塩化カルシウム、エタノールアミン
、グリシンおよびα−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）を、
Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｌａｎｄ）から購入した。

【００５６】１２．５％、２．６％Ｃリニアゲル（自作）。ＰＩＰ（ＰＩＰ＝Ｎ，Ｎ’−
ジアシロイルピペラジン）で架橋した、１２．５％Ｔ、２．６％Ｃリニアポリ
アクリルアミドゲルを生成するために、８ｍｌのＡｃｒｙｌｏｇｅｌ−ＰＩＰ
２．６％Ｃストック溶液を５ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）
および６．６ｍｌの脱イオン水と混合した。ゲルの重合化を、２０μｌのＴＥＭ
ＥＤおよび１００μｌのＡＰＳ（１０％ｗ／ｖ）で誘導した。この溶液を脱気
し、そしてそしてＢｉｏ−Ｒａｄｍｉｎｉ−２Ｄゲル支持体に充填した。雰囲
気からゲルを保護するために、０．５ｍｌの水で飽和したｓｅｃ−ブタノールを
ゲルの上部に添加した。３０分後に、ゲルを、４％濃縮用ゲルの引き続く充填の
ために洗浄した。４％濃縮用ゲルを、２．６ｍｌのＡｃｒｙｌｏｇｅｌ−ＰＩＰ
２．６％ストック溶液、５ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ、ｐＨ８．８
）、１２．３ｍｌの脱イオン水、２０μｌのＴＥＭＥＤおよび１００μｌのＡＰ
Ｓ（１０％ｗ／ｖ）の混合物から得た。この溶液を脱気し、そしてゲルの上部
に充填した。コームを、ゲルが重合する前に挿入して、１５のサンプルウェルを
作製した。このゲルを重合化の３０分後に直接使用し得る。

【００５７】１−ＤＰＡＧＥ。１−ＤＰＡＧＥ法のために、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａ
ｎＩＩ電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を
用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、本質的には、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従い、１２
．５％Ｔ、２．６％Ｃポリアクリルアミドゲルを用いて行った。使用したタン
パク質サンプルは、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準物質であった。それ
らは、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（６．５ｋＤａ）、ニワトリリゾチーム
（１４．３ｋＤａ）、ダイズトリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、ウシ
カルボニックアンヒドラーゼ（２８．９ｋＤａ）、ニワトリオボアルブミン（４
２．７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．４ｋＤａ）、およびウサギホスホ
リラーゼｂ（９７．２ｋＤａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（１１６
．４ｋＤａ）およびウサギミオシン（約２００ｋＤａ）であった。タンパク質の
移動は、２００Ｖで４０〜５０分間単一のレーンで行った。

【００５８】トリプシンの共有結合およびＩＡＶ膜のブロック。ＩＡＶ膜は、活性化カル
ボキシル化基を有する市販の改変ＰＶＤＦ膜であった。これらの基は、求核剤（
例えば、タンパク質またはペプチドに由来するアミン基）に対して反応性である
。上記に引用される「ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＡＶ」に対するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ
技術文書に基づいて、トリプシンをこの膜に固定化した（図１）。

【００５９】１０×１２ｃｍのＩＡＶ膜を回転ハイブリダイザーＨＢ−２Ｄ（Ｔｅｃｈｎ
ｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中で、２０ｍｌのトリプシン溶液（
２．５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中
）とともに、室温で３時間インキュベートした。次いで、この膜を、迅速かつ徹
底的に、２０ｍｌのＰＢＳ−「Ｔｗｅｅｎ」２０溶液（２０ｍＭのリン酸二水素
ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．５％「Ｔｗｅｅｎ」２０
、ｐＨ７．４）で３回洗浄して、未反応のトリプシンを除去した。この膜を、２
０ｍｌの１Ｍエタノールアミン（１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．５）中
）とともに、４℃で３時間インキュベートして、膜の残りの活性なカルボキシル
基をブロックした。このキャッピング工程の後に、この膜を、迅速かつ徹底的に
、２０ｍｌのＰＢＳ−「Ｔｗｅｅｎ」２０溶液で３回洗浄し、次いで、２０ｍｌ
のＰＢＳ−「Ｔｗｅｅｎ」溶液で３０分間、２回洗浄した。この膜を、４６ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．１５ｍＭ塩化カルシウム、０．１％アジ化ナトリ
ウム緩衝溶液（ｐＨ８．１）中に保存した。

【００６０】（ＩＡＶ膜に共有結合した酵素の活性測定）ＩＡＶ−トリプシン膜のトリプシン活性を、トリプシンアッセイ試薬ＴＡＭＥ
を用いて測定した。１〜２ｃｍ²のＩＡＶ−トリプシン膜を、２．６ｍｌの４６
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１１．５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．１）、０．
３ｍｌの１０ｍＭＴＡＭＥ溶液、および０．１ｍｌの１ｍＭＨＣｌ溶液の混
合物に浸した。４０秒の激しい攪拌の後、この溶液の吸光度を、ＵＶ−可視分光
光度計（ＵｌｔｒｏｓｐｅｃＩＩＩ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、
Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて２４７ｎｍで測定した。第２の測定を
、３分間の一定の攪拌の後行った。１表面単位あたり等量の遊離の活性なトリプ
シンを、２４７ｎｍの吸光度における、１分間あたりの変化から計算した。

【００６１】（完全ゲル（ＩＦＧ）タンパク質消化、および（比較のための）従来の電気的
ブロッティング）ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質分離の直後、ゲルを脱イオン水に５分間にて３回
浸して、ＳＤＳ、グリシン、およびＴｒｉｓを除去した。湿潤ゲルの全体または
このゲルの選択した一部を、室温で８時間または一晩の間、風乾した。このゲル
を再水和させ、ゲルの最初の体積の３〜５倍の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．２）中の０．０５ｍｇ／ｍｌトリプシンの溶液で３０分間、３５℃でイン
キュベートした。過剰のトリプシン溶液を取り除いた。次いで、このゲルを、３
５℃にてさらに３０分間インキュベートして、完全に消化した。ゲル中に含まれ
るタンパク質およびペプチドを、タンク中でＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）、０．
０１％ＳＤＳを用いて、標準的な手順を使用してＰＶＤＦ膜上に電気的ブロット
した。

【００６２】（（比較のための）１工程消化転写（ｏｎｅ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｔｒａｎ
ｓｆｅｒ）（ＯＳＤＴ）電気的ブロッティング）ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質分離の直後、ゲルを脱イオン水に５分間にて３回
浸して、次いで、半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液（１３ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ
グリシン、０．０１％ＳＤＳ、１０％メタノール（ｐＨ８．３））中で１５分間
平衡化させた。電気的ブロッティングは、研究室で作製したセミドライ装置にお
いて半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液中で行った。[注：「セミドライ」法は、周知で
あり、例えば、Ｐ．Ｒ．ＦａｕｓｓｅｔおよびＨ．Ｓ．Ｌｕ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ１９９１，１２，２２−２７を参照のこと]。これを、箱型交
流加電圧（ｓｑｕａｒｅ−ｓｈａｐｅａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇａｐｐｌｉｅ
ｄｖｏｌｔａｇｅ）（周期的に、＋１２．Ｖを１２５ｍｓ間および−５Ｖを１
２５ｍｓ間）を、用いて、室温（２１〜２４℃）で１６時間行った。この加電圧
の形を、図３に示す。ここで、電圧をＹ軸に対してプロットし、そしてミリ秒の
時間をＸ軸に対してプロットする。平均有効電圧Ｕ_eff＝３．７５Ｖであり、そ
して以下の恒等式

【００６３】

【数１】により得られる。ここで、Ｕは、特定の時間点での電圧であり、ｄｔは、積分の極限の間の時間に
おける変化であり、そしてＴは、１周期または期間の総時間＝２５０ｍｓである
。

【００６４】電気的ブロッティングの間にタンパク質の酵素的消化を行うために、二層のＩ
ＡＶ−トリプシン膜を、タンパク質供給源としてのポリアクリルアミドゲルと、
トランスブロット−消化サンドイッチ（ｔｒａｎｓｂｌｏｔ−ｄｉｇｅｓｔｉｏ
ｎｓａｎｄｗｉｃｈ）を作製するための収集表面としてのＰＶＤＦ膜との間に
配置した（図１および２）。

【００６５】電気的ブロッティング転写手順（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇｔｒａｎ
ｓｆｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の後、ＰＶＤＦ収集膜（すなわち、消化したタ
ンパク質のフラグメントが収集される）を、脱イオン水で５〜１５分間洗浄した
。電気的ブロッティング後のゲル中に残留するタンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅＢｌｕｅＲ２５０（０．１％ｗ／ｖ）、メタノール（３０％ｖ／ｖ）
、および酢酸（１０％ｖ／ｖ）で３０分間染色した。ゲルをメタノール（４０
％ｖ／ｖ）、および酢酸（１０％ｖ／ｖ）溶液を用いて繰り返し洗浄するこ
とにより、脱染色した。ＰＶＤＦ収集膜を、ＡｍｉｄｏＢｌａｃｋ（０．５％
ｗ／ｖ）、イソプロパノール（２５％ｖ／ｖ）、および酢酸（１０％ｖ／
ｖ）を用いて、１分間染色し、次いで脱イオン水を用いて繰り返し洗浄すること
により脱染色した。この膜を、光学スキャンの前に風乾した。

【００６６】（ＩＦＧ／ＯＳＤＴ電気的ブロッティング（本発明の組み合わせ方法））この組み合わせ方法において、ＩＦＧ手順を、最初の３０分間のみを再水和お
よび部分的タンパク質消化させることにより改変した。次いで、このゲルを上記
のＯＳＤＴプロセスを用いてＰＶＤＦ膜上にトランスブロットした。電気的ブロ
ット転写を、上記のように０．０１％ＳＤＳを含む半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液中
で実行した。

【００６７】（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置および実験条件）ＰＶＤＦ膜を、３３７ｎｍ窒素レーザーを備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
計「Ｖｏｙａｇｅｒ」Ｅｌｉｔｅ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，ＦｒａｍｉｎｇｈａｍＭＡ，ＵＳＡ）を用いて分析器した。分析を、１８
ｋＶの加速電圧、１００ｎｓのイオン抽出（ｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）の
遅延、および８５０Ｄａで固定した低質量ゲート（ｌｏｗｍａｓｓｇａｔｅ
）にて、リフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）モードにて使用した。レーザ
ー出力を、分子イオン生成に関する閾値をよりわずかに上に設定した。スペクト
ルを、任意の補整手順なしに、１０〜２５６の連続レーザー発射の累加により得
た。染色したタンパク質を含むＰＶＤＦの小片（１×３ｍｍ²）を、ＰＶＤＦ収
集膜から切り取り、そしてシリコンガラスを有する適合性のサンプルＭＡＬＤＩ
プレート上に固定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに必要とされるマトリクスの
沈着のために、３０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ溶液中の４ｍｇ／ｍｌの
α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の１μｌを、アノードのＰＶＤＦ膜に添加し
た。内部較正のために、このマトリクス溶液は、分子量１４９８．８２Ｄａおよ
び２０９５．０８Ｄａの２つのＣ−アミド化合成ペプチドを、それぞれ、２０ｎ
Ｍおよび１００ｎＭ含んだ。

【００６８】（スペクトルの処理、およびソフトウェアの使用）検出したピークを、ＥｘＰＡＳｙサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａ
ｓｙ．ｃｈ）に位置付けられる、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ（ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｗｗｗ／ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）において利用
可能であるペプチド質量フィンガープリント検索ツール「ＰｅｐｔＩｄｅｎｔ」
に入力（ｓｕｂｍｉｔ）した。検索を制限するためのｐＩ制限を、導入しなかっ
た。Ｂｉｏ−Ｒａｄ技術情報シート（ｔｅｃｈｎｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎｓｈｅｅｔ）により与えられる、見かけ上の移動質量を、質量値について
２０％の誤差を有する限定条件として、およびタンパク質の種の基点（ｓｐｅｃ
ｉｅｏｒｉｇｉｎ）として用いた。質量許容範囲は、±０．２であった。

【００６９】フラグメント質量を、それらのスペクトル分子量から、フラグメントのアミノ
酸配列を同定するために「ＦｉｎｄＭｏｄ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａ
ｓｙ．ｃｈ／ｗｗｗ／ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）に入力した。ＦｉｎｄＭｏｄは、
タンパク質の可能なシステインおよびメチオニンの改変を考慮に入れるためのオ
プションを有する。

【００７０】（結果）トリプシンを、ＴＡＭＥ試験により決定した場合、ｃｍ²あたり０．６〜１．
２μｇの活性トリプシンの表面酵素密度を有するＩＡＶ膜に共有結合させた。ト
リプシン結合ＩＡＶ膜の活性は、トリプシン結合ＩＡＶ膜をＴｒｉｓ−ＨＣｌ／
ＣａＣｌ₂／ＮａＮ₃溶液中で、４℃にて１ヶ月までの期間保存した場合、安定な
ままであった。トリプシン活性は、本発明の方法における膜の使用後にわずかに
減少したが、別の実験におけるその再使用を損なうのに十分ではない。

【００７１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、上記に規定した９個のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにおける同じトラック上に泳動させ、以下のコントロール電気的ブロッティ
ングおよび３つの異なる消化技術に供した： −消化なしで、標準的なＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）を用いる、タンク法（ｔ
ａｎｋｍｅｔｈｏｄ）における、タンパク質のコントロール電気的ブロッティ
ング、 −ＩＦＧ消化、次いで、ＣＡＰＳ緩衝液を用いるタンク法を使用する、電気的
転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）、 −セミドライ法および半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いるＩＡ
Ｖ膜を介するＯＳＤＴ消化、 −本発明の組み合わせ方法（部分的なＩＦＧに次いでＯＳＤＴ）。

【００７２】図４Ａ〜４Ｄは、示した分子量の９個のタンパク質を有する、消化なしのコン
トロール（Ａ）、ＩＦＧ消化（Ｂ）、ＯＳＤＴ（Ｃ）および本発明の組み合わせ
方法（Ｄ）に対応する、４つのＡｍｉｄｏＢｌａｃｋ染色ＰＶＤＦ膜のトラン
スブロットパターンを示す。図５Ａ〜５Ｄは、ＳＤＳゲル上に残留するタンパク
質のパターンを示す。

【００７３】第１に、半Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液、０．０１％ＳＤＳ（ｐＨ８．４）を用い
るＯＳＤＴを使用するタンパク質転写（図４Ｃ）を、ＣＡＰＳ緩衝液、０．０１
％ＳＤＳ（ｐＨ１１）を用いる標準的な転写（図４Ａ）と比較し得る。１／２Ｔ
ｏｗｂｉｎ’ｓ緩衝液におけるＳＤＳの添加にかかわらず、膵臓トリプシンイン
ヒビター（ｐＩ９．２）およびリゾチーム（ｐＩ９．３）のような塩基性タ
ンパク質は、転写されなかった。緩衝液におけるＳＤＳの影響は、高分子量タン
パク質（例えば、ホスホリラーゼｂ（９７．２ｋＤａ）およびミオシン（約２０
０ｋＤａ））について、より顕著であった（図４Ａおよび４Ｃ）。しかし、大量
のこれらのタンパク質は、電気的ブロット後にゲルの中に残留した（図５Ａおよ
び５Ｃ）。

【００７４】ＩＦＧ消化（図４Ｂ）および組み合わせ方法（図４Ｄ）の場合において、ＰＶ
ＤＦ膜は、９つのタンパク質バンドの全てを示した。ＰＶＤＦパターンは、通常
の転写（図４Ａ）に類似した。これらのＰＶＤＦ膜間の主な差異は、ポリペプチ
ドビーズの強度が、通常のタンパク質転写（図４Ａ）についてより高く、そして
組み合わせ方法（図４Ｄ）についてより低いことであった。このことにより、本
発明の組み合わせ方法が、劣った結果を提供したと解釈されるべきではない。な
ぜならば、タンパク質の消化が、それらの染色特性を改変し得ることに注目すべ
きだからである。ゲルの中に残留するタンパク質は、ＩＦＧ法および組み合わせ
方法の両方において非常に低かった（図５Ｂおよび５Ｄ）。

【００７５】第２の実験では、これらのサンプルを、ペプチド質量フィンガープリンティン
グ検出のためにＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。

【００７６】これらの試験の結果を、表１に要約する。ＯＳＤＴプロセスに基づく最近の結
果は、以前に、塩基性でかつ高分子量のタンパク質の部分的トランスブロットに
関して、上記に指摘した問題を強調した。この場合において、リゾチーム（ｐＩ
９．２）および膵臓トリプシンインヒビター（ｐＩ９．３）ならびにミオシ
ン（分子量約２００ｋＤａ）について、同定を獲得し得なかった。ＩＦＧ消化技
術は、ほとんどのタンパク質を正確に同定するのに十分なペプチドを得るのに十
分ではなかった。部分的ＩＦＧ、次いでＯＳＤＴの組み合わせ方法は、タンパク
質同定に関して全体として最も良い結果を提供した。９個のタンパク質の全てを
、分析したタンパク質のリゾチームの高ｐＩ（図６Ａ〜６ＣにおけるＭＡＬＤＩ
−ＭＳスペクトルを参照のこと）およびミオシンの高分子量（図７Ａ〜７Ｃにお
けるＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを参照のこと）にもかかわらず同定した。図６
Ａ、７Ａは、ＯＳＤＴに関し、図６Ｂ、７Ｂは、ＩＦＧ消化に関し、そして図６
Ｃ、７Ｃは、本発明の組み合わせ方法に関する。組み合わせ手順において、生成
した多数のフラグメント、および内部較正のために用いた分子量（ｍ．ｗ．）１
４９８．８２および２０９５．０８のマーカータンパク質の多数のフラグメント
化に注目のこと。

【００７７】

【表１】１ｐＩおよび分子量は、「ＣｏｍｐｕｔｅｐＩ／Ｍｗ」ツール（ＥｘＰＡＳ
ｙサーバー上で入手可能）を用いて計算した。２ペプチドの数は、（ＦｉｎｄＭｏｄツールにより決定される）試験下のタン
パク質の正確な酵素的残基特異的フラグメントに対応するペプチドの数を同定し
た。３＋／−：ペプチド質量フィンガープリントを用いるタンパク質の正確な同定
／不正確な同定は、ＰｅｐｔＩｄｅｎｔ（ＥｘＰＡＳｙサーバー上で利用可能）
により決定されるように、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルから得た。４ミオシンを、ＴＲＥＭＢＬデータベースを用いて、ウサギ骨格筋から正確に
同定した。

【００７８】従って、本発明の方法は、広範なｐＩ値および分子量を有するタンパク質を同
定し得ることを示した。第１に、トリプシンは、質量および／またはｐＩの制限
なしに、ゲル中でタンパク質を消化した。この工程は、いくつかの失敗した切断
に対応する高い平均分子量のペプチドを生じたが、それらのより低い分子量は、
本来のタンパク質の分子量よりも低かった。いくつかのペプチドについて、ｐＩ
および疎水性はまた、タンパク質の全体よりも低かった。第２に、これらのペプ
チドを、電気的ブロッティングにより容易に抽出し、そしてＯＳＤＴ手順の間に
再び消化した。本方法は、良好な質量スペクトルを与え、そして引き続き９個の
分析したタンパク質から９個について同定した。

【００７９】上記に言及したミオシンタンパク質は、たとえ０．０１％ＳＤＳを有するＣ
ＡＰＳ緩衝液を用いる場合でさえ、従来の方法によりイムノブロットされ得ない
。しかし、ミオシンタンパク質を、上記のトランスブロッティング手順によりイ
ムノブロットし得る。モノクローナル抗体の使用により、ミオシンをＰＶＤＦ膜
上で検出し得る。

【００８０】上記の刊行物の各々は、これらが本明細書に依存する程度まで、本明細書中で
参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明において使用され得る２種類のブロッティング「サンドイッチ
」の模式図である。

【図２】図２は、本発明において使用され得る２種類のブロッティング「サンドイッチ
」の模式図である。

【図３】図３は、時間に対する印加電圧のプロットであり、本発明の方法における電気
的ブロッティングでの使用のための交流電圧の生成を示す。

【図４】図４Ａ〜４Ｄは、収集膜上に存在する染色されたポリペプチドバンドを示し、
このタンパク質およびタンパク質フラグメントは、それぞれ、コントロール（４
Ａ）、ＩＦＧ消化（４Ｂ）、ＯＳＤＴ（４Ｃ）および本発明の組み合わせ方法（
４Ｄ）について、転写された。

【図５】図５Ａ〜５Ｄは、収集膜上に存在する染色されたポリペプチドバンドを示し、
このタンパク質およびタンパク質フラグメントは、それぞれ、コントロール（
５Ａ）、ＩＦＧ消化（５Ｂ）、ＯＳＤＴ（５Ｃ）および本発明の組み合わせ方法
（５Ｄ）について、転写された。

【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（６Ａ）、ＯＳＤＴ（６Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（６Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（６Ａ）、ＯＳＤＴ（６Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（６Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（６Ａ）、ＯＳＤＴ（６Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（６Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（７Ａ）、ＯＳＤＴ（７Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（７Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（７Ａ）、ＯＳＤＴ（７Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（７Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、それぞれ、ＩＦＧ（７Ａ）、ＯＳＤＴ（７Ｂ）および本発明
の組み合わせ方法（７Ｃ）について、ミオシンおよびニワトリリゾチームから得
られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者サンチェ，ジャン−シャルルスイス国セーアッシュ−1208 ジュネーブ，シュマンフランク−トマス 42 Ｆターム(参考） 2G045 BB51 DA36 FB01 FB05 4B033 NA01 NA30 NB25 NB35 NB36 NB63 ND04 ND05 4B063 QA11 QA18 QQ79 QR16 QR82 QS16 QS28 QS39 QX02 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キットであって、以下：ａ）電気泳動ゲルに組み込むために適切な第１のポリペプチド切断試薬；ｂ）電気泳動ゲル上で分離されたポリペプチドのトランスブロッティングにおけ
る使用のために適切な、少なくとも１つの親水性膜であって、該膜は、該膜上に
固定化された少なくとも１つの第２のポリペプチド切断試薬を有する、膜；およ
びｃ）疎水性収集部材であって、トランスブロッティングによって該疎水性収集部
材に転写された分離されたポリペプチドのフラグメントを該疎水性収集部材上で
受けるために適切な、疎水性収集部材を備える、キット。
【請求項２】前記親水性膜および疎水性収集部材が、予め形成されたアセ
ンブリとして提供される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】前記第２のポリペプチド切断試薬が、共有結合によって前記
親水性膜上に固定化される、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】請求項３に記載のキットであって、ここで、前記第２のポリ
ペプチド切断試薬が、（１）活性化カルボニル基、カルボン酸基、およびアミノ
基と反応し得るカルボン酸誘導体基からなる群より選択される、前記親水性部材
上の官能基と、（２）前記ポリペプチド切断試薬のアミノ基との間に形成される
アミド結合を通して固定化される、キット。
【請求項５】前記ポリペプチド試薬が酵素であり、該酵素が同じであって
もよいし、または異なってもよい、請求項１、２、３または４に記載のキット。
【請求項６】各酵素がプロテアーゼを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】前記プロテアーゼがトリプシンを含む、請求項６に記載のキ
ット。
【請求項８】請求項１、２、３、４、５、６または７に記載のキットであ
って、さらに、ｄ）少なくとも１つのポリペプチドが単離されており、そして脱水されているゲ
ルを少なくとも部分的に再水和するために適切な緩衝液、を備える、キット。
【請求項９】前記疎水性収集部材が、自己支持膜である、請求項１、２、
３、４、５、６、７または８に記載のキット。
【請求項１０】電気泳動によってゲル上で単離されているポリペプチドを
同定または特徴付ける方法であって、該方法は、以下の工程：ａ）少なくとも１つのポリペプチドが単離されているゲルを提供する工程；ｂ）該ゲルに第１のポリペプチド切断試薬を組み込む工程；ｃ）少なくとも１つの第２のポリペプチド切断試薬を固定化される、少なくとも
１つの親水性膜を、該ゲルに隣接して提供する工程；ｄ）疎水性収集部材を提供する工程であって、該疎水性収集部材は、該疎水性収
集部材上でトランスブロッティングによって該ゲルから該疎水性収集部材に転写
されたポリペプチドのフラグメントを受けるために適切であって、該疎水性層は
、該ポリペプチドのフラグメントの移動の方向に、該親水性膜にわたって位置付
けされる、工程；ｅ）完全ゲルから該ポリペプチドをトランスブロッティングする工程であって、
該第２のポリペプチド切断試薬によってポリペプチドをフラグメントへと切断さ
せるに有効な条件下で、該完全ゲル上で、該親水性膜を通して該疎水性層に該ポ
リペプチドが単離された、工程；およびｆ）該疎水性収集部材上で収集された該フラグメントを同定または特徴付ける、
工程、を包含する、方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の方法であって、さらに、以下の工程：ｇ）前記フラグメントが由来する前記ポリペプチドを同定または特徴付ける工程
、を包含する、方法。
【請求項１２】請求項１０または１１に記載の方法であって、ここで、前
記第１のポリペプチド切断試薬が、前記ゲルを脱水することによって該ゲルに組
み込まれ、そして次いで、該ゲルを、該ポリペプチド切断試薬を含む緩衝液を用
いて少なくとも部分的に再水和する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】請求項１０、１１または１２に記載の方法であって、ここ
で、前記第２のポリペプチド切断試薬の固定化が、該第２のポリペプチド切断試
薬の前記親水性膜への共有結合による固定化である、方法。
【請求項１４】請求項１０、１１、１２または１３に記載の方法であって
、ここで、両方の前記ポリペプチド切断試薬が酵素であり、該酵素が、同じであ
ってもよいし、または異なってもよい、方法。
【請求項１５】前記酵素のいずれかまたは両方が、前記ポリペプチドの主
鎖において該ポリペプチドを切断する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記酵素のいずれかまたは両方が、前記ポリペプチドの側
鎖において該ポリペプチドを切断する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記両方の酵素がトリプシンであり、そして前記電気的ブ
ロッティングが８〜９のｐＨの緩衝液において実施される、請求項１４に記載の
方法。
【請求項１８】請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または
１７に記載の方法であって、ここで、前記電気的ブロッティングが実施される電
圧が、前記切断試薬の近接において前記ポリペプチドの滞留時間を延長させるた
めに、通常の転写よりもゆっくり提供するように調整される。方法。
【請求項１９】請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
または１８に記載の方法であって、ここで、前記電気的ブロッティングが、（１
）アノードからカソードへの不連続な電流、または（２）カソード方向に対して
該アノードにおいて偏りのある交流、のいずれかを提供する条件下で実施される
、方法。
【請求項２０】請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８または１９に記載の方法であって、ここで、前記フラグメントが、質量分
析によって同定される、方法。
【請求項２１】請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記膜が、マ
トリクス補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型分析法によって直接走査され、
そして該走査により得られたデータが、コンピュータプログラムを使用してデー
タベースと比較されて、自動化ポリペプチド同定を提供する、方法。