JP2002530105A - ブタ族動物のクローニングの方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はブタ族動物のクローニングのための物質および方法に関する。本発明は部分的に、ブタ族動物をクローニングするのに有用な全能細胞、核移植技術を用いることによりこのような細胞から産生されるブタ族胚およびこのような細胞および胚から生じるブタ族動物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明はブタ族動物のクローニングに関するものである。

【０００２】 （発明の背景） 本発明の背景に関する以下の記述は、単に読者が本発明を理解する助けを提供
するに過ぎず、本発明に対する先行技術を記載または構成するものと理解される
べきではない。

【０００３】 研究者等は過去２０年間にわたり哺乳動物をクローニングする方法を開発して
きた。報告された幾つかの方法は、（１）細胞、大抵は胚性細胞を単離し；（２
）その細胞またはその細胞から単離された核を、除核した卵母細胞（例えば、卵
母細胞の核を前もって摘出した）内に挿入し、そして（３）この胚をインビボで
成熟させる、という工程を含んでいる。

【０００４】 哺乳動物細胞を使用した最初の核転移実験の成功は１９８３年に報告されてお
り、ここでは、マウスの接合子から単離した前核を、除核した卵母細胞内に挿入
し、生きている子孫を得た。McGrathおよびSolter、1983，Science 220:1300-13
02。続いて別の者が、マウスの始原生殖細胞（ＰＧＣ）を用いたキメラマウス胚
（例えば、胚にある他の細胞とは有意に異なる核ＤＮＡを有する細胞のサブセッ
トを含む胚）の生成を記載した。これらの細胞は多能性細胞であり、且つ多能性
細胞を生ずることができる。Matsui等、1992、Cell 70:841-847、およびResnick
等、1992、Nature 359:550；Kato等、1994、Journal of Reproduction and Fert
ility、抄録集、受胎能研究学会、年次総会、サザンプトン、13:38。１９９８年
、研究者等は、クローニングされたマウス族動物を確立するためのクローニング
技術でマウス丘細胞を核ドナーとして使用できることを報告した。Wakayama等、
1998、Nature 394:369-374。

【０００５】 １９８６年に別の核転移実験が報告され、そこでは、クローニングプロセスで
核ドナーとして羊の胚性細胞を使用し、クローン羊が生まれた。より近年になっ
て、羊胚性細胞；血清枯渇体細胞；胚盤から単離された細胞；および乳房の体細
胞から、別の羊がクローニングされたことが報告された。Campbell等、1996、Na
ture 380:64-66；ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２００４２；Wilmut等、1997、Nature 3
85:810-813；およびＰＣＴ公開ＷＯ９６／０７７３２およびＷＯ９７／０７６６
９。羊族動物をクローニングするためのその他のアプローチは、核転移後のイン
ビボ成熟させた卵母細胞の活性化状態を操作することを含んでいた。ＰＣＴ公開
ＷＯ９７／０７６６８。クローン羊を開示している刊行物は、クローニング効率
を、最大でもおよそ０.４％であると報告している。前記の見積りのために算出
されたクローニング効率は、クローニングされた羊の数をその数のクローン羊を
生み出すために使用された核転移の数で除したものに等しい比率である。

【０００６】 さらに別の核転移実験はクローニングされたウシ族動物を生み出したが、ここ
では、２−６４細胞の胚から誘導した胚性細胞を核ドナーとして用いて当該動物
がクローニングされた。このウシ族動物は、米国特許４９９４３８４および５０
５７４２０に開示された核転移技術を利用してクローニングされたと報告された
。別の者は、胚盤胞段階の胚の内細胞塊細胞を核転移法の核ドナーとして利用し
て、クローニングされたウシ胚が生成されたことを報告した。SimsおよびFirst
、1993、Theriogenology 39:313およびKeefer等、1994、Mol.Reprod.Dev. 38:26
4-268。さらに、別の刊行物は、胎児組織から単離されたＰＧＣを核ドナーとし
て利用する核転移技術により、クローニングされたウシ胚が製造されることを報
告した。Delhaise等、1995、Reprod.Fert.Develop. 7:1217-1219；Lavoir 1994
、J.Reprod.Dev. 37:413-424；および「胚性幹細胞様細胞」という標題のＰＣＴ
出願ＷＯ９５／１０５９９。

【０００７】 ブタ族動物に関して、研究者等は、キメラ動物を得る方法、詳細には、除核さ
れた胚細胞内部に核ドナーを入れる、当該方法を報告している。Prather等、198
9、Biology of Reproduction 41:414-418；Piedrahita等、1998、Biology of Re
production 58:1321-1329；およびＷＯ９４／２６８８４，「キメラおよびトラ
ンスジェニック有蹄動物を作製するための胚性幹細胞」、Wheeler、１９９４年
１１月２４日公開。

【０００８】 さらに、研究者は、ブタの核ドナーおよびブタの卵母細胞のための核転移実験
を報告している。例えば、Nagashima等、1997、Mol.Reprod.Dev. 48:339-343；N
agashima等、1992、J.Reprod.Dev. 38:73-78；Prather等、1989、Biol.Reprod.
41:414-419；Prather等、1990、Exp.Zool. 255:355-358；Saito等、1992、Assis
.Reprod.Tech.Andro. 259:257-266；およびTerlouw等、1992、Theriogenology 3
7:309を参照されたい。

【０００９】 加えて、研究者は、ブタの卵母細胞を活性化する方法を報告した。Grocholova
等、1997、J.Exp.Zoology 277:49-56；Schoenbeck等、1993、Theriogenology 40
:257-266；Prather等、1991、Molecular Reproduction and Development 28:405
-409；JolliffおよびPrather、1997、Biol.Reprod. 56:544-548；Mattioli等、1
991、Molecular Reproduction and Development 30:109-125；Terlouw等、1992
、Theriogenology 37:309；Prochazka等、1992、J.Reprod.Fert. 96:725-734；F
unahashi等、1993、Molecular Reproduction and Development 36:361-367；Pra
ther等、Bio.Rep. 50巻追補1:282；Nussbaum等、1995、Molecular Reproduction
and Development 41:70-75；Funahashi等、1995、Zygote 3:273-281；Wang等、
1997、Biology of Reproduction 56:1376-1382；Piedrahita等、1989、Biology
of Reproduction 58:1321-1329；Machaty等、1997、Biology of Reproduction 5
7:85-91；およびMachaty等、1995、Biology of Reproduction 52:753-758。

【００１０】 ブタの核ドナーを用いて有効な核転移を生む材料および方法に対する長く切実
な要求が依然として存在している。この長く切実な要求は、ブタ族動物から臓器
を摘出し、係る臓器を必要とする人間にその臓器を移植するための方法を包含す
る、異種移植として知られる、医学適用の可能性に一部基づいている。米国特許
第５５８９５８２号、Hawley等、１９９１年１２月３１日登録；ＰＣＴ出願ＷＯ
９５／２８４１２、Baetsher等、１９９５年１０月２６日公開；ＰＣＴ出願ＷＯ
９６／０６１６５、Sachs等、１９９６年２月２９日公開；ＰＣＴ出願ＷＯ９３
／１６７２９、Bazin、１９９３年９月２日公開；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１２０
３５、Diamond等、１９９７年４月３日公開；ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１６６３０
、PiedrahitaおよびBazer、１９９８年４月２３日公開。

【００１１】 （要約） 本発明は、部分的には、ブタ族動物のためのクローニング技術に関するもので
ある。本発明はさらに、部分的には、クローニング方法およびブタ族動物の生成
に使用するための全能性細胞および全能性とすることのできる細胞、これらブタ
の細胞から核転移技術を用いて産生された胚、これらの細胞および胚から生まれ
たブタ族動物、ならびに係る細胞、胚、および動物を確立するための方法および
プロセスに関するものである。

【００１２】 本発明は、現在利用されているブタのクローニングのための手段および方法を
上回る数多くの利点を提供する。係る特徴および利点は、以下のものを包含する
： （１）事実上任意の型の細胞からの、クローニングされたブタ族動物の産生。本
発明は、非全能性ブタ細胞を全能性ブタ細胞へと再プログラミングするための材
料および方法を提供する。これらの非全能性ブタ細胞は、非胚起源であってよい
。本発明のこの特徴は、現存するブタ族動物の表現型を評価し、次いでその動物
をクローニングするための全能性セルラインが容易に確立できることを可能にす
る。 （２）事実上任意の型のブタ細胞からの全能性ブタセルラインの確立。本発明の
一つの態様では、非全能性のブタ前駆細胞を全能性細胞へと再プログラミングす
ることができる。これらの非全能性前駆細胞は、非胚性細胞であってよい。確立
された全能性ブタセルラインは、セルライン内部の不均質性が低いため、クロー
ニング効率が高まるという利点を提供する（例えば、セルラインはしばしば一次
細胞よりも低い分化率を示す）。また、全能性セルラインをインビトロで操作し
て、ブタ細胞、胚、およびゲノムが操作された動物（例えばトランスジェニック
）を生成させることができる。さらに、全能性セルラインは、他の型のセルライ
ンよりも容易に保存し、移送し、そして培養中で再確立することができる。 （３）完全なインビトロ胚産生系における、非同期型の且つ核型の点で安定なブ
タセルラインを利用する結果としての、胚クローニングの効率促進。

【００１３】 クローニング効率は、核転移より生ずる胚の数と、その胚を生じさせるために
実施された核転移の数との比によって表すことができる。これとは別に、クロー
ニング効率は、生児出生動物の数と、これらの動物を生むために実施された核転
移の数との比として表現することができる。

【００１４】 本発明に係る培養細胞 第一の態様では、本発明は全能性ブタ細胞を特徴とする。 本明細書中使用する「ブタ」という語は、Ｓｕｉｄａｅ科の任意の動物を指す
ことができる。ブタ族動物とは、イノシシ、家畜としてのブタ、ミニブタ、イボ
イノシシ、ペッカリー、およびバーブーサ（barboosa）を包含する任意の種類の
ブタを指すことができるが、これらに限定される訳ではない。ミニブタの例につ
いては、例えばBustadおよびMcClellan、1968、Lab.Anim.Care. 18:280-287およ
びEnglandおよびPanepinto、1986、「ミニチュアブタの開発の概念上および操作
上の歴史」、Swine in Biomedical Research（M.E.Tubleson編）、Plenum Press
、NY 17-22頁を参照されたく、これらはいずれも、引用により、全ての図面、表
および描画を含めてその全体を本明細書の一部とする。

【００１５】 本明細書中使用する「全能性」という語は、生児出生動物を生じさせる細胞を
指すことができる。「全能性」という語はさらに、特定の動物においてすべての
細胞を生じさせる細胞を意味し得る。全能性細胞は、１またはそれ以上の核転移
工程由来の胚を発生させる方法に利用する時、動物の全細胞を生じさせることが
できる。全能性細胞はまた、臓器の採取に有用な動物といったような、不完全な
動物、例えばホメオ遺伝子の操作により臓器または付属器の成長を排除するよう
な遺伝子改変を有する動物を生み出すために使用することができる。

【００１６】 本明細書中使用する「生児出生」という語は、好ましくは、子宮外で存在する
動物を指す。「生児出生」動物は、母体宿主を出た時から少なくとも１秒間生存
している動物であってよい。「生児出生」動物は、生存のために子宮内環境の循
環系を必要としないかもしれない。「生児出生」動物は歩行可能な動物であるか
も知れない。係る動物は思春期前および思春期後の動物を包含することができる
。前記のように、生児出生動物は、その種類の正常動物に存在するものの一部を
欠失しているかも知れない。

【００１７】 好ましい態様において、全能性細胞は、（１）培養され；（２）セルラインと
して培養され；そして（３）永久セルラインとして培養される。

【００１８】 本明細書中、細胞に関して使用する「培養された」という語は、インビトロ環
境において細胞分裂を受けまたは細胞分裂を受けない１またはそれ以上の細胞を
指すことができる。インビトロ環境は、細胞をインビトロで維持するのに好適な
、当分野で知られる任意の培地、例えば適当な液体培地または寒天とすることが
できる。細胞培養のための好適なインビトロ環境の個別例は、Culture of Anima
l Cells：a manual of basic techniques(第３版)、1994、R.I.Freshney(編)、W
iley-Liss,Inc.；Cells：a laboratory manual(1巻)、1998、D.L.Spector、R.D.
Goldman、L.A.Leinwand(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press；およびAn
imal Cells：culture and media、1994、D.C.Darling、S.J.MorganJohn Wiley a
nd Sons,Ltd.に記載されており、これらの各々は引用により、全ての図面、表お
よび描画を包含するその全体を本明細書の一部とする。細胞は、懸濁液および／
または単層で、１またはそれ以上の実質上類似の細胞と共に培養することができ
る。細胞は、懸濁液および／または単層で、不均質な細胞集団と共に培養するこ
とができる。前文で使用した「不均質な」という語は、例えば細胞型および細胞
周期といったような任意の細胞性質に関係していてよい。細胞は、懸濁液で培養
し、固体支持体に付着した単層として培養し、そして／または例えば支持細胞の
層上で培養することができる。「支持細胞」という語は後に定義する。さらに、
細胞は、細胞対細胞の接触を欠く条件で平板培養することにより、うまく培養す
ることができる。好ましくは、培養された細胞は細胞分裂を受け、少なくとも５
日間、より好ましくは少なくとも１０日間または２０日間、最も好ましくは少な
くとも３０日間培養する。好ましくは、かなりの数の培養細胞は、培養中に終了
しない。「終了する」および「かなりの数」は後に定義する。殆ど任意の型の細
胞を細胞培養条件に置くことができる。培養細胞はセルラインの確立に利用する
ことができる。

【００１９】 本明細書中使用する「セルライン」という語は、少なくとも一回は終了せずに
継代できる培養細胞を指すことができる。本発明は、少なくとも１，２，５，１
０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，８０，１００，および２００回継代
できるセルラインに関するものである。細胞の継代は後に定義する。

【００２０】 本明細書中、培養細胞に関して使用する「終了」および「終了する」という語
は、当業者にとって既知の数多くの技術（例えば、CytoTox96(商標)細胞毒性検
定、Promega,Inc.、カタログ番号Ｇ１７８０；Celltiter96(商標)水性細胞増殖
検定キット、Promega,Inc.、カタログ番号Ｇ３５８０；および細胞毒性検定のた
めのトリパンブルー溶液、Sigma、カタログ番号Ｔ６１４６）を用いて測定する
ことのできる、細胞の死を受ける細胞を意味し得る。終了はまた、当業者にとっ
て既知の数多くの技術（例えばDead End(商標)アポトーシス検出キット、Promeg
a,Inc.、カタログ番号Ｇ７１３０）を用いて測定することのできる、アポトーシ
スの結果であってよい。終了した細胞は、細胞死および／またはアポトーシスを
受け、培養の固体表面から解放された細胞として確認される。加えて、終了した
細胞は、上記の方法により確認し得る無傷の膜を欠失しているかも知れない。ま
た、終了した細胞は代謝活性の低下を示すかも知れず、これは一部には、例えば
ローダミン１，２，３により確認できるミトコンドリア活性の低下により惹起さ
れ得る。さらに、終了は、かなりの数の培養細胞が終了している細胞培養を意味
することができる。先の文中の「かなりの数」という語は、培養中の細胞の約８
０％、好ましくは培養中の細胞の約９０％、より好ましくは培養中の細胞の約１
００％、そして最も好ましくは培養中の細胞の１００％を指す。

【００２１】 本明細書中使用する「懸濁液」という語は、細胞が固体支持体に付着していな
い細胞培養状態を指すことができる。懸濁液中で増殖している細胞は、増殖中、
当業者に周知の器具を用いて攪拌することができる。

【００２２】 本明細書中使用する「単層」という語は、適当な培養状態で増殖させている間
、固体支持体に付着している細胞を指すことができる。適当な増殖条件下に単層
で増殖している細胞の小部分が単層中の細胞に付着していることはあるが、固体
支持体には付着していない。好ましくはこれらの細胞のうち１５％未満が固体支
持体に付着しておらず、より好ましくはこれらの細胞のうち１０％未満が固体支
持体に付着しておらず、そして最も好ましくはこれらの細胞のうち５％未満が固
体支持体に付着していない。

【００２３】 本明細書中、ブタ細胞に関して使用する「実質上類似の」という語は、同じ生
物および同じ組織由来の細胞を指すことができる。「実質上類似の」という語は
さらに、著しく分化していない細胞集団を指すことができる。例えば、好ましく
は細胞集団の１５％未満の細胞が分化しており、より好ましくは細胞集団の１０
％未満の細胞が分化しており、最も好ましくは細胞集団の５％未満の細胞が分化
している。

【００２４】 本明細書中、細胞に関して使用する「平板培養された」または「平板培養して
いる」という語は、細胞培養をインビトロで確立することを意味し得る。例えば
、細胞を細胞培養基で希釈し、次いで細胞培養平板、皿、またはフラスコに加え
ることができる。細胞培養平板は当業者に広く知られている。細胞は様々な濃度
および／または細胞密度で平板培養することができる。

【００２５】 「細胞の平板培養」という語はまた「細胞の継代」という語に拡大することが
できる。本発明に係る細胞は当業者によく知られる細胞培養技術を用いて継代す
ることができる。「細胞の継代」という語は、（１）細胞を固体支持体または基
質から解放し、そしてこれらの細胞を乖離させ、そして（２）その細胞をさらな
る細胞増殖にとって好適な培地で希釈する、という工程を含む技術を指すことが
できる。細胞の継代とはさらに、培養細胞の入った液体培地の一部を取り除き、
元の培養に液体培地を添加して細胞を希釈し、さらなる細胞増殖をさせることを
も意味することができる。加えて、さらなる細胞増殖にとって好適な培地が添加
された新たな培養容器に細胞を添加することもできる。

【００２６】 本明細書中、細胞に関して使用する「増殖」という語は、或る期間にわたり数
を増加させることのできる一群の細胞を指すことができる。

【００２７】 本明細書中使用する「密集」という語は、大多数の細胞が、その群の少なくと
も１個の他の細胞と物理的に接触している、一群の細胞を指すことができる。密
集とはまた、与えられた条件において最大細胞密度にまで成長している細胞の一
群として定義することもできる。例えば、もし一群の細胞が単層で増殖すること
ができ、そしてそれらが適当な増殖培地の入った培養容器に配置されるならば、
この単層が培養容器のかなりの表面積に広がる時、それらは密集となる。細胞に
よって変換された表面積は、好ましくは総表面積の約５０％であり、より好まし
くは総表面積の約７０％であり、そして最も好ましくは総表面積の約９０％とな
る。

【００２８】 本明細書中、ブタ細胞に関して使用する「永久」または「不死化された」とい
う語は、インビトロ環境で培養中に、細胞が終了するまで何回も細胞分裂を受け
、細胞数を倍増させることのできる細胞を指すことができる。永久セルラインは
、かなりの数の細胞が培養中で終了するまでに、１０回にわたり倍増させること
ができる。好ましくは、永久セルラインはかなりの数の細胞が培養中で終了する
までに、２０回または３０回にわたり、倍増させることができる。より好ましく
は、永久セルラインはかなりの数の細胞が培養中で終了するまでに、４０回また
は５０回にわたり、倍増させることができる。最も好ましくは、永久セルライン
はかなりの数の細胞が培養中で終了するまでに、６０回にわたり、倍増させるこ
とができる。「終了する」という語は前に述べた。細胞の倍増は、当業者によく
知られる技術を用いて培養中の細胞数を計数することによって測定できる。細胞
培養の永久性の尺度として、かなりの数の細胞が培養中で終了するまでの倍増の
回数を測定することができる。「かなりの数」という語もまた前に述べた。

【００２９】 永久細胞は、非永久細胞よりも低い密度で継代できることを基礎にして、非永
久細胞と識別することができる。詳細には、永久細胞は、平板培養条件が細胞間
の物理的接触を許容しない場合に、密集状態となるまで（後記）増殖させること
ができる。よって、永久細胞は、細胞を、その細胞が互いに物理的に接触しない
細胞密度で平板培養する時、非永久細胞と識別することができる。

【００３０】 好ましい態様において、（１）全能性細胞はアルカリホスファターゼ陽性では
なく（例えば、細胞はアルカリホスファターゼについて認知し得るほど染色され
ない）；（２）全能性細胞は少なくとも１個の前駆細胞から生じ；（３）前駆細
胞はブタ族動物の任意の領域から単離されそして／または生じ；（４）前駆細胞
は培養中の任意の細胞から単離されそして／または生じ；（５）前駆細胞は、非
胚性細胞、非胎児性細胞、分化した細胞、分化していない細胞、体細胞、胚性細
胞、胎児性細胞、胚性幹細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、丘細胞、羊膜細胞
、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性生殖細胞、成体細胞、非同調的細胞集団から単
離された細胞、および、同調的集団が細胞周期のＧ_０期で停止していない、同調
的細胞集団から単離された細胞、より成る群から選ばれ；（６）全能性細胞は胚
性生殖細胞の形態学を有する。

【００３１】 本明細書中使用する「アルカリホスファターゼ陽性」という語は、検出可能な
細胞のアルカリホスファターゼの存在を指すことができる。アルカリホスファタ
ーゼ陽性でない細胞は、細胞のアルカリホスファターゼを視覚化する方法を用い
て認知し得る程に染色されない。細胞のアルカリホスファターゼの存在を検出す
る方法は当業者によく知られている。例えば、Matsui等、1991、「培養中のマウ
ス始原生殖細胞に及ぼすスティール因子および白血病阻害因子の影響」、Nature
353:750-752を参照されたい。アルカリホスファターゼを認知し得る程染色する
細胞の例は文献中に見いだすことができる。例えば、「多能性胚性幹細胞および
これを製造する方法」と題される、１９９５年９月２６日登録の、Hoganの米国
特許５４５３３５７を参照されたく、これは、引用により、全ての図面、表、お
よび描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。

【００３２】 本明細書中使用する「前駆細胞」または「前駆細胞群」という語は、培養され
たブタ細胞または培養されたブタセルラインの確立に使用される細胞または細胞
群を指すことができる。前駆細胞または同細胞群は、ほぼ任意の細胞実体から単
離することができる。例えば、前駆細胞または同細胞群は、胚盤胞、胚、胎児、
およびセルライン（例えば、胚性細胞から確立されたセルライン）から単離する
ことができ、好ましくは胎児および／または胎児細胞から確立されたセルライン
から単離でき、そしてより好ましくは子宮外動物および／または細胞培養および
／または係る子宮外動物から確立されたセルラインから単離できる。子宮外動物
は、新生児動物（例えば生後５日）、青年期動物（例えば思春期前の動物）、思
春期の動物（例えば排卵または生存精子の産生後）、および成体動物（例えば思
春期後）として存在することができる。子宮外動物は生存しているまたは死後の
動物であってよい。前駆細胞は、培養され、または培養されていなくともよい。
さらに、前駆細胞は、同時に低温保存または凍結することができる（例えば、低
温保存細胞は細胞培養を確立するための前駆細胞として利用することができる）
。これらの例は限定を意図するものではなく、これらの例示的前駆細胞のさらな
る説明を以下に供する。

【００３３】 本明細書中使用する「から生ずる」という語は、１またはそれ以上の細胞が、
少なくとも１つの異なる性質を有する１またはそれ以上の細胞に変換することを
指すことができる。例えば、（１）非全能性前駆細胞は、後述する本発明に係る
特徴を利用することにより、全能性細胞に変換することができ；（２）前駆細胞
は、胚性生殖細胞の細胞形態を発達させることができ；（３）前駆細胞は培養細
胞を生ずることができ；（４）前駆細胞は培養セルラインを生ずることができ；
（５）前駆細胞は培養前駆細胞セルラインを生ずることができる。変換プロセス
は再プログラミング工程と称することができる。加えて、「から生ずる」という
語は、後述する核転移プロセスを用いることにより、本発明に係る全能性細胞か
ら全能性胚を確立することを指すことができる。

【００３４】 本明細書中使用する「再プログラミング」または「再プログラムされた」とい
う語は、細胞を少なくとも１つの異なる性質を有する別の細胞に変換することの
できる材料および方法を指すことができる。また、係る材料および方法は、細胞
を、その細胞のライフサイクル中に典型的には発現されない別の細胞型に再プロ
グラムまたは変換することができる。例えば、（１）非全能性細胞は全能性細胞
へと再プログラムされることができ；（２）前駆細胞は、ＥＧ細胞の形態学を有
する細胞へと再プログラムされることができ；そして（３）前駆細胞は全能性細
胞へと再プログラムされることができる。前駆細胞をＥＧ細胞の形態学を有する
全能性細胞へと変換するための材料および方法の例は後述する。

【００３５】 本明細書中使用する「単離された」という語は、別の細胞群から機械的に分離
されている細胞を指すことができる。細胞群の例は、発育しつつある細胞塊、細
胞培養、セルライン、および動物である。これらの例は限定を意図するものでは
なく、本発明は任意の細胞群に関連するものである。１またはそれ以上の細胞を
他の細胞群から単離する方法は当分野でよく知られている。例えば、Culture of
Animal Cells：a manual of basic techniques(第３版)、1994、R.I.Freshney(
編)、Wiley-Liss,Inc.；Cells：研究マニュアル(１巻)、1998、D.L.Spector、R.
D.Goldman、L.A.Leinwand(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press；および
Animal Cells；culture and media、1994、D.C.Darling、S.J.Morgan、John Wil
ey and Sons,Ltd.を参照されたい。

【００３６】 本明細書中使用する「非胚性細胞」という語は、胚から単離されない細胞を指
すことができる。非胚性細胞は分化していても、または分化していなくともよい
。非胚性細胞は殆ど任意の体細胞、例えば子宮外動物から単離された細胞を指す
ことができる。これらの例は限定を意図するものではない。

【００３７】 本発明の目的のため、本明細書中使用する「胚」または「胚性」という語は、
母体宿主の子宮膜内に着床していない、発育しつつある細胞塊を指すことができ
る。よって、本明細書中使用する「胚」という語は、授精した卵母細胞、サイブ
リッド（本明細書中に定義する）、前胚盤胞段階の発育しつつある細胞塊、およ
び／または、母体宿主の子宮膜内への着床前の発生段階にある、その他の発育し
つつある細胞塊を指すことができる。本発明に係る胚は生殖隆起を表さないかも
知れない。よって、「胚性細胞」は、胚から単離され、そして／または胚から生
ずる。

【００３８】 胚は細胞発生の複数の段階を表し得る。例えば、一細胞の胚は接合子と呼ぶこ
とができ、開裂した胚から生じた充実した細胞の球塊は桑実胚と呼ぶことができ
、そして胞胚腔を有する胚は胚盤胞と呼ぶことができる。

【００３９】 本明細書中使用する「胎児の」という語は、母体宿主の子宮膜内に着床した発
育しつつある細胞塊を指すことができる。胎児は、例えば生殖隆起のような明確
な特徴を包含し得る。生殖隆起は当業者には容易に同定される特徴であり、殆ど
の動物種の胎児で認識可能な特徴である。本明細書中使用する「胎児細胞」とい
う語は、胎児から単離され、そして／または胎児から生じた、または胎児から誘
導された任意の細胞を指すことができ、羊膜細胞を包含する。「非胎児細胞」と
いう語は、胎児から誘導されないまたは単離されない細胞である。

【００４０】 前駆細胞が胎児から単離される時、係る前駆細胞は、好ましくはブタ胎児から
単離され、ここでこの胎児は、２０日および分娩の間、３０日および１００日の
間、より好ましくは３５日および７０日ならびに４０日および６０日の間、そし
て最も好ましくは約５５日の胎児である。胎齢は、胎児へと発育する胚が確立さ
れた時期によって決定することができる。例えば、二細胞胚は、一日胚と称され
、これは５４日胎児へと発育し得る。胎児に関する「約」という語は、プラスま
たはマイナス５日間を指すことができる。

【００４１】 本明細書中使用する「分娩」という語は、胎児が雌性レシピエントから娩出さ
れる時期を指すことができる。胎児は、流産、帝王切開、または誕生によって雌
性レシピエントから娩出される。

【００４２】 本明細書中使用する「始原生殖細胞」という語は、生殖細胞になることのでき
る二倍体前駆細胞を指すことができる。始原生殖細胞は発育しつつある細胞塊中
の任意の組織から単離することができ、好ましくは発育しつつある細胞塊の生殖
隆起細胞から単離される。生殖隆起は、当業者によく知られる発育しつつある細
胞塊の一部である。例えば、Strelchenko、1996、Theriogenology 45:130-141お
よびLavoir 1994、J.Reprod.Dev. 37:413-424を参照されたい。

【００４３】 本明細書中使用する「胚性幹細胞」という語は、インビトロ細胞培養中に維持
される胚から単離された多能性細胞を指すことができる。胚性幹細胞は支持細胞
と共にまたは支持細胞なしで培養することができる。胚性幹細胞は、胚盤胞段階
の胚および前胚盤胞期の胚を包含する任意の発育段階の胚から単離された胚性細
胞から確立することができる。胚性幹細胞は丸い細胞形態を持ち、支持層上で丸
い細胞凝集塊に増殖し得る。胚性幹細胞は当業者にはよく知られている。例えば
、「有蹄類の胚から誘導された内細胞塊セルラインの培養」と題されたSticeお
よびGoluekeのＷＯ９７／３７００９（１９９７年１０月９日公開）、およびYan
gおよびAnderson、1992、Theriogenology 38:315-335を参照されたく、これらは
それぞれ引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書
の一部とする。例えば、Piedrahita等、1998、Biol.Reprod. 58:1321-1329；Wia
nny等、1997、Biol.Reprod. 57:756-764；MooreおよびPiedrahita、1997、In Vi
tro Cell Biol.Anim. 33:62-71；MooreおよびPiedrahita、1996、Mol.Reprod.De
v. 45:139-144；Wheeler、1994、Reprod.Fert.Dev. 6:563-568；Hochereau-de R
eviersおよびPerreau、Reprod.Nutr.Dev. 33:475-493；Strojek等、1990、Theri
ogenology 33:901-903；Piedrahita等、1990、Theriogenology 34:879-901；お
よびEvans等、1990、Theriogenology 33:125-129を参照されたく、これらはそれ
ぞれ引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一
部とする。

【００４４】 本明細書中使用する「分化した細胞」という語は、特化していない表現型から
特化した表現型へと発育した前駆細胞を指すことができる。例えば、胚性細胞は
、腸管の内側を覆う上皮細胞へと分化することができる。本発明に係る材料およ
び方法は、分化した細胞を全能性細胞へと再プログラムすることができる。分化
した細胞は、例えば胎児または生児出生動物から単離することができる。

【００４５】 本明細書中使用する「分化していない細胞」という語は、特化していない表現
型を有し、分化することのできる前駆細胞を指すことができる。分化していない
細胞の例は幹細胞である。

【００４６】 本明細書中使用する「非同調的集団」という語は、細胞周期のいかなる段階に
も停止していない細胞を指すことができる。多くの細胞は細胞周期に沿って進む
ことができ、いかなる一つの段階にもとどまっていないが、幾つかの細胞は或る
期間、細胞周期の一つの段階にとどまるようになり得る。知られている幾つかの
細胞周期の段階は、Ｇ_１，Ｓ、Ｇ_２およびＭである。細胞の非同調的集団が操作
されてこれらの相のうちいずれか一つに、またはこれらの相のうち主としていず
れか一つに同調することはない。例えばコルセミド曝露といったような当分野で
既知の数多くの技術を利用することにより、細胞を、細胞周期のＭ期で止めるこ
とができる。細胞を細胞周期の一つの段階で止めるための方法の例は、「核転移
のための休止細胞集団」と題されるＷＯ９７／０７６６９に論ぜられており、こ
れは引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一
部とする。

【００４７】 本明細書中使用する「同調的集団」および「同調している」という語は、細胞
周期の同じ段階内にある、集団内の一部分の細胞を指すことができる。好ましく
は、細胞集団の約５０％の細胞が細胞周期の一つの段階にとどまっており、より
好ましくは細胞集団の約７０％の細胞が細胞周期の一つの段階にとどまっており
、そして最も好ましくは細胞集団の約９０％の細胞が細胞周期の一つの段階にと
どまっている。細胞周期の段階は、細胞の相対的大きさによって、および当業者
により知られる様々な細胞マーカーによって識別することができる。例えば、細
胞は、当業者によく知られるフローサイトメトリー技術を用いて係るマーカーに
より識別することができる。これとは別に、細胞は、例えば光学顕微鏡およびミ
クロメーターの利用により、当業者によく知られる技術を利用して、大きさによ
って識別することができる。好ましい態様において、細胞は、細胞周期の或る個
別的段階にとどまらせる（すなわち、細胞は分裂しない）ことによって同調化す
る。

【００４８】 本明細書中使用する「胚性生殖細胞」および「ＥＧ細胞」という語は、はっき
りした扁平な形態を有する培養された細胞であり、培養中で単層で増殖すること
ができる。ＥＧ細胞は線維芽細胞と区別することができる。このＥＧ細胞の形態
は、丸い形態を持ち支持層上で多層の凝集塊を形成する細胞とは対照的である。
ブタ胚性生殖細胞は、細胞培養条件に支持層の存在または成長因子の存在を必要
としないかも知れない。ブタ胚性生殖細胞はさらに、これらの細胞が培養平板上
で密集に近づくと、倍加速度が低下して増殖する。本発明に係るブタ胚性生殖細
胞は全能性であり得る。本発明に係るブタ胚性生殖細胞は、アルカリホスファタ
ーゼについて認知し得る程には染色されないかも知れない。好ましくは、ブタ胚
性生殖細胞は、本明細書に記載のように、かなりの濃度のグルコースを含有する
培養基で確立する。

【００４９】 ブタ胚性生殖細胞は、殆ど任意の型のブタ前駆細胞の細胞培養から確立するこ
とができる。前駆細胞の例は本明細書に記載しており、ブタ胚性生殖細胞培養を
確立するための好ましい前駆細胞は、胎児由来の生殖隆起細胞である。生殖隆起
細胞は、好ましくはブタ胎児から単離され、ここでこの胎児は、２０日および分
娩の間、３０日および１００日の間、より好ましくは３５日および７０日ならび
に４０日および６０日の間、そして最も好ましくは約５５日の胎児である。胎齢
は前記のように決定することができる。胎児に関する「約」という語は、プラス
またはマイナス５日間を指すことができる。本明細書に記載のように、ＥＧ細胞
は、細胞の一次培養から物理的に単離でき、この単離されたＥＧ細胞を利用して
細胞培養を確立し、それは最終的に均質または殆ど均質なＥＧ細胞のセルライン
を形成する。

【００５０】 本明細書中使用する「形態学」および「細胞形態」という語は、細胞の形態、
構造、および物理的性質を指すことができる。例えば、或る細胞形態はかなりの
レベルのアルカリホスファターゼであり、そしてこの細胞形態は、細胞がアルカ
リホスファターゼについて認識し得る程染色されるかどうかを決定することによ
り、同定することができる。細胞形態の別の例は、細胞を支持細胞層の表面また
は存在下に培養する時、その細胞が扁平であるか丸いかである。他の多くの細胞
形態が当業者に知られており、細胞形態は当業者によく知られる材料および方法
を用いて容易に同定可能である。例えば、Culture of Animal Cells:a manual o
f basic techniques(第3版)、1994、R.I.Freshney(編)、Wiley-Liss,Inc.を参照
されたい。

【００５１】 本明細書中使用する「丘細胞」という語は、卵母細胞を取り巻く組織および／
または細胞から単離される、任意の培養されたまたは培養されていない細胞を指
すことができる。当業者は丘細胞を容易に同定することができる。丘細胞を単離
および培養するための方法の例は、Damiani等、1996、Mol.Reprod.Dev. 45:521-
534；Long等、1994、J.Reprod.Fert. 102:361-369；およびWakayama等、1998、N
ature 394:369-373に記載されており、これらの各々は、引用により、全ての図
面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。

【００５２】 本明細書中使用する「羊膜細胞」という語は、羊水または羊水と接触している
組織から単離された培養または非培養細胞を指すことができる。当業者は羊膜細
胞を容易に同定することができる。羊膜細胞を単離し培養するための方法の例は
、Bellow等、1996、Theriogenology 45:225；GarciaおよびSalaheddine、1997、
Theriogenology 47:1003-1008；LeiboおよびRail、1990、Theriogenology 33:53
1-552；およびVos等、1990、Vet.Rec. 127:502-504に記載されており、これらの
各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書
の一部とする。

【００５３】 本明細書中使用する「胎児線維芽細胞」という語は、線維芽細胞の外観を有す
る任意の分化したブタ胎児細胞を指すことができる。線維芽細胞は培養基平板上
で培養するとき扁平な外観を有し得る。胎児線維芽細胞はまた、紡錘様形態、増
殖のために限定された密度を有し、そしておよそ５０世代という有限の培養寿命
を有し得る。加えて、胎児線維芽細胞は二倍体の染色体含有量を堅固に維持して
おり、Ｉ型コラーゲンを生成することができる。線維芽細胞の記述については、
例えばCulture of Animal Cells：a manual of basic techniques(第3版)、1994
、R.I.Freshney(編)、Wiley-Liss,Inc.を参照されたい。

【００５４】 本明細書中使用する「成体細胞」という語は、成体のブタ族動物から単離され
た任意の細胞を指すことができる。このような成体細胞は、耳由来の皮膚、腹部
由来の皮膚、腎臓、肝臓、心臓、および肺を包含するブタ族動物の任意の部分か
ら単離することができるが、これらに限定される訳ではない。係る成体細胞を培
養するための方法は本明細書に開示する。

【００５５】 好ましい態様において、（１）本発明に係る全能性ブタ細胞は、改変された核
ＤＮＡを含み；（２）改変された核ＤＮＡは組換え生成物をコードしているＤＮ
Ａ配列を包含し；（３）組換え生成物はポリペプチドであり；（４）組換え生成
物はリボザイムであり；（４）組換え生成物は生物学的流体または組織中で発現
され；（５）組換え生成物は１またはそれ以上の疾病に対する抵抗性を付与し、
または部分的に付与し；（６）組換え生成物は１またはそれ以上の寄生虫に対す
る抵抗性を付与し、または部分的に付与し；（７）改変された核ＤＮＡは、調節
要素として機能し得る少なくとも１個の他のＤＮＡ配列を含み；（８）調節要素
は、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、およびレプレッサーより成
る群から選ばれ；そして（９）調節要素は、乳汁蛋白プロモーター、尿蛋白プロ
モーター、血液蛋白プロモーター、涙管蛋白プロモーター、滑液蛋白プロモータ
ー、下顎腺蛋白プロモーター、カゼインプロモーター、β−カゼインプロモータ
ー、メラノコルチンプロモーター、乳汁血清蛋白プロモーター、α−ラクトアル
ブミンプロモーター、ホエー酸蛋白プロモーター、ウロプラキンプロモーター、
α−アクチンプロモーターより成る群から選ばれる。

【００５６】 本明細書中使用する「改変された核ＤＮＡ」という語は、１またはそれ以上の
組換えＤＮＡ技術により操作された、本発明に係る細胞、胚、胎児、または動物
の核デオキシリボ核酸配列を指すことができる。組換えＤＮＡ技術の例は当業者
によく知られており、（１）別の生物（例えば人間）由来のＤＮＡ配列を標的の
核ＤＮＡ中に挿入すること、（２）標的の核ＤＮＡから１またはそれ以上のＤＮ
Ａ配列を除去すること、および、（３）標的の核ＤＮＡ中に１またはそれ以上の
塩基突然変異（例えば位置指定突然変異）を導入することを包含し得る。改変さ
れた核ＤＮＡを伴う細胞は、本発明の目的のため、「トランスジェニック細胞」
と称することができる。トランスジェニック細胞は、本明細書に記載の核転移ク
ローニング技術のための材料として有用となり得る。

【００５７】 哺乳動物細胞の核ＤＮＡの挿入、除去、および突然変異のための方法および器
具は当業者によく知られている。Molecular Cloning,a Laboratory Manual、第2
版、1989、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Cold Spring Harbor Laborato
ry Press；米国特許５６３３０６７、「トランスジェニックウシまたはトランス
ジェニックウシの胚を生成する方法」、DeBoer等(1997年5月27日登録)；米国特
許５６１２２０５，「哺乳動物細胞のホモローガスな組換え」、Kay等(1997年3
月18日登録)；およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２２４３２、「トランスジェニック
着床前胚の同定の方法」；ＷＯ９８／１６６３０，PiedrahitaおよびBazer、199
8年４月２３日公開、「始原生殖細胞およびトランスジェニック動物種の生成の
ための方法」を参照されたく、これらの各々は、引用により、全ての図面、描画
、および表を包含する全内容を本明細書の一部とする。これらの方法は、外来Ｄ
ＮＡフラグメントを用いて細胞をトランスフェクトするための技術、および、外
来ＤＮＡフラグメントが標的ＤＮＡゲノムの挿入、除去、および／または突然変
異を実行するような、外来ＤＮＡフラグメントの適切な設計を含んでいる。

【００５８】 トランスジェニック細胞は様々な方法で取得することができる。例えば、トラ
ンスジェニック細胞は、トランスジェニック動物から単離することができる。ト
ランスジェニックブタ族動物の例は当分野でよく知られている。トランスジェニ
ック動物から単離された細胞は、本明細書に記載の材料および方法を用いること
により、全能性細胞に変換することができる。別の例では、トランスジェニック
細胞は本発明に係る全能性細胞から確立することができる。非トランスジェニッ
ク細胞をトランスジェニック細胞に変換するための材料および方法は、前述のよ
うに当分野において既知である。

【００５９】 本明細書で定義されるいかなる細胞型も、改変された核ＤＮＡを有するように
変化させることができる。例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎児細胞、およ
び本明細書に定義する任意の全能性細胞は、改変された核ＤＮＡを有するよう、
変化させることができる。

【００６０】 挿入、除去、および／または突然変異により標的ＤＮＡゲノムを改変する方法
の例は、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモ
ーターを用いる無作為挿入、ホモローガスな組換え、遺伝子標的化、転移因子、
および／または外来ＤＮＡを導入するためのその他の任意の方法である。当業者
によく知られるその他の改変技術は、ゲノムからのＤＮＡ配列の除去、および／
または核ＤＮＡ配列の変更を包含する。核ＤＮＡ配列を変化させる技術の例は、
位置指定突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応の方法である。故に、本発明
は、一部には、同時に全能性且つトランスジェニックであるブタ細胞に関するも
のである。係るトランスジェニックな且つ全能性の細胞は、クローニングされた
トランスジェニックブタ族動物を生成するためのドナー細胞のほぼ無限の供給源
としての役割を有し得る。

【００６１】 本明細書中使用する「組換え生成物」という語は、改変された核ＤＮＡの少な
くとも一部分を含むＤＮＡ配列から生成された生成物を指すことができる。この
生成物は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、蛋白、酵素、抗体、抗体フラグメ
ント、調節要素（後に記載する用語）に結合しているポリペプチド、構造蛋白、
ＲＮＡ分子、および／またはリボザイムであってよい。これらの生成物は当分野
で明確に定義されている。この生成物の列挙は例示のみの目的であり、本発明は
他の型の生成物にも関連している。

【００６２】 本明細書中使用する「リボザイム」という語は、特異的な領域で他のＲＮＡ分
子を開裂することのできるリボ核酸分子を指すことができる。リボザイムはＲＮ
Ａ分子上の別々の領域に結合し、次いでその結合領域内またはその結合領域に隣
接する領域を特異的に開裂することができる。それによってリボザイム技術は、
かつて無傷であったメッセージＲＮＡ分子から翻訳されるポリペプチドの量を低
減させることができる。リボザイムの詳細な説明については、「共有結合の生成
なしに基質ＲＮＡを開裂するＲＮＡリボザイム」と題するCech等の米国特許５３
５４８５５（１９９４年１０月１１日登録）、および「ＲＮＡリボザイムポリメ
ラーゼ、デホスホリラーゼ、制限エンドリボヌクレアーゼおよび方法」と題する
Cech等の米国特許５５９１６１０（１９９７年１月７日登録）を参照されたく、
これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を
本明細書の一部とする。

【００６３】 本明細書中使用する「生物学的流体」または「組織」という語は、生体中の任
意の流体または組織を指すことができる。流体は、涙液、唾液、乳汁、尿、羊水
、精液、血漿、卵管液、および滑液を包含するが、これらに限定される訳ではな
い。組織は、肺、心臓、血液、肝臓、筋肉、脳、膵臓、皮膚、等を包含するが、
これらに限定されない。

【００６４】 本明細書中使用する「抵抗性を付与する」という語は、疾病の症状または寄生
状態を完全に排除し、または部分的に軽減する、組換え生成物の能力を指すこと
ができる。よって、或る疾病が例えば炎症に関連している場合、組換え生成物の
発現時に炎症が低減したならば、その組換え生成物はその炎症に対する抵抗性を
付与することができる。組換え生成物は、もしそれが炎症に寄与しているポリペ
プチドをコードしているｍＲＮＡ分子に特異的に結合するアンチセンスＲＮＡで
あるならば、疾病または寄生状態に対する抵抗性を付与、または部分的に付与す
ることができる。疾病または寄生虫に対する抵抗性を付与する他の例は後述する
。加えて、疾病の例は後述する。

【００６５】 寄生虫の例およびこれらの寄生虫に対する抵抗性を付与するための戦略を後述
する。これらの例は、蠕虫、線虫、昆虫、無脊椎動物、細菌、ウイルス、および
真核生物寄生虫を包含するが、これらに限定される訳ではない。これらの寄生虫
は本発明に係る材料および方法によって制御できる疾病状態を導き得る。

【００６６】 本明細書中使用する「調節因子」という語は、別のＤＮＡ配列から生成される
生成物の量を増加させ、または低下させることのできるＤＮＡ配列を指すことが
できる。調節要素は生成物の構成的産生をもたらし得る（例えば、生成物が絶え
ず発現され得る）。これとは別に、調節要素は、組換え生成物の産生を誘導的に
増強または減少させることができる（例えば、生成物は特異的シグナルに応答し
て発現され得る）。調節要素は、例えば栄養によって、光によって、またはトラ
ンスジェニック生物の系に或る物質を添加することによって制御され得る。当業
者によく知られる調節要素の例は、プロモーター、エンハンサー、インスレータ
ー、およびレプレッサーである。例えば、Transgenic Animals, Generation and
Use、1997、L.M.Houdebine編、Hardwood Acedemic Publishers、オーストラリ
ア、を参照されたく、これは、引用により、全ての図面、表、および描画を包含
する全内容を本明細書の一部とする。

【００６７】 本明細書中使用する「プロモーター群」または「プロモーター」という語は、
組換え生成物をコードしているＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指す
ことができる。プロモーターは好ましくは隣接ＤＮＡ配列と機能的に結合してい
る。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される
組換え生成物の量に比べ、ＤＮＡ配列から発現される組換え生成物の量を増加さ
せる。或る生物種由来のプロモーターを利用して、別の生物種に由来するＤＮＡ
配列からの組換え生成物の発現を増強することができる。加えて、一つのプロモ
ーター要素が、縦列的に結合した複数のＤＮＡ配列について発現される組換え生
成物の量を増加させることができる。よって、一つのプロモーター要素が１また
はそれ以上の組換え生成物の発現を増強することができる。多数のプロモーター
要素が、当業者によく知られている。プロモーター要素の例は後述する。

【００６８】 本明細書中使用する「エンハンサー群」または「エンハンサー」という語は、
組換え生成物をコードしているＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指す
ことができる。エンハンサー要素は典型的にはプロモーター要素の上流に位置し
、またはコード化ＤＮＡ配列（例えば、組換え生成物（群）へと転写または翻訳
されるＤＮＡ配列）の下流に位置することができる。よって、エンハンサー要素
は、組換え生成物をコードしているＤＮＡ配列の１００塩基対、２００塩基対、
または３００もしくはそれ以上の塩基対分だけ上流に位置することができる。エ
ンハンサー要素は、プロモーター要素によって与えられる増加した発現以上にＤ
ＮＡ配列から発現される組換え生成物の量を増加させることができる。多数のエ
ンハンサー要素が当業者にとって容易に入手可能である。

【００６９】 本明細書中使用する「インスレーター群」または「インスレーター」という語
は、組換え生成物をコードしているＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡ配列を指すこと
ができる。インスレーター要素は生体の特異的組織に対して組換え生成物の発現
を指令することができる。多数のインスレーター要素が当業者によく知られてい
る。例えば、Geyer、1997、Curr.Opin.Genet.Dev. 7:242-248を参照されたく、
これは、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書
の一部とする。

【００７０】 本明細書中使用する「レプレッサー」または「レプレッサー要素」という語は
、組換え生成物をコードしているＤＮＡ配列の近傍に位置するＤＮＡ配列を指す
ことができ、ここでレプレッサー配列は、そのＤＮＡ配列から発現される組換え
生成物の量を減少させることができる。レプレッサー要素は、特異的分子または
特異的分子群をレプレッサー要素ＤＮＡ配列に結合させることによって制御され
得る。これらの分子はレプレッサー要素の活性化または不活性化のいずれかを行
うことができる。多数のレプレッサー要素が当業者にとって入手可能である。

【００７１】 「乳汁蛋白プロモーター」、「尿蛋白プロモーター」、「血液蛋白プロモータ
ー」、「涙管蛋白プロモーター」、「滑液蛋白プロモーター」、および「下顎腺
蛋白プロモーター」という語は、動物において、特記された流体または腺または
細胞型内部の蛋白の特異的発現を調節するプロモーター要素を指す。例えば、乳
汁蛋白プロモーターは、動物の乳汁で発現される蛋白の発現を制御できる調節要
素である。その他のプロモーター、例えばカゼインプロモーター、α−ラクトア
ルブミンプロモーター、ホエー酸蛋白プロモーター、ウロプラキンプロモーター
、およびα−アクチンプロモーターは当業者によく知られている。

【００７２】 好ましい態様において、（１）全能性ブタ細胞は操作を受け；（２）その操作
は、全能性ブタ細胞を核転移方法に利用する工程を含み；（３）その操作は全能
性細胞を低温保存する工程を含み；（４）その操作は全能性細胞を融解させる工
程を含み；（５）その操作は全能性細胞を継代する工程を含み；（６）その操作
は全能性細胞を同調化する工程を含み；（７）その操作は全能性細胞を外来ＤＮ
Ａでトランスフェクトさせる工程を含み；そして（８）その操作は細胞を別の細
胞または細胞群から乖離させる工程を含む。

【００７３】 本明細書中使用する「操作」という語は、何らかの目的に向けた管理または取
り扱いという、当該用語の一般的な用法を指すことができる。操作の例は本明細
書に記載する。

【００７４】 本明細書中使用する「核転移」という語は、或る細胞から、除核した細胞に、
核ＤＮＡの完全体を導入することを意味し得る。核転移法は当業者によく知られ
ている。例えば、Nagashima等、1997、Mol.Reprod.Dev. 48:339-343；Nagashima
等、1992、J.Reprod.Dev. 38:73-78；Prather等、1989、Biol.Reprod. 41:414-4
19；Prather等、1990、Exp.Zool. 255:355-358；Saito等、1992、Assis.Reprod.
Tech.Andro. 259:257-266；およびTerlouw等、1992、Theriogenology 37:309を
参照されたく、これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包
含する全内容を本明細書の一部とする。核転移は、透明帯で取り囲まれていない
卵母細胞を用いて達成することができる。

【００７５】 本明細書中使用する「低温保存」という語は、本発明に係る細胞、胚、または
動物を冷凍することを指すことができる。本発明に係る細胞、胚、または動物の
一部は、好ましくは０℃以下、より好ましくは−８０℃以下、そして最も好まし
くは−１９６℃以下の温度で冷凍する。本発明に係る細胞および胚は無期限に低
温保存できる。生物学的材料は５０年間以上低温保存でき、且つ依然として生存
していることが知られている。例えば、５０年以上低温保存されているウシの精
液を利用して雌ウシを人工授精し、生きている子孫の誕生をもたらすことができ
る。低温保存の方法および器具は当業者によく知られている。例えば、「胚の直
接転移のための低温保存プロセス」と題したVoelkelの米国特許第５１６０３１
２号（１９９２年１１月３日登録）を参照されたい。

【００７６】 本明細書中使用する「融解する」という語は、低温保存された細胞、胚、また
は動物の一部分の温度を上げるプロセスを指すことができる。低温保存された材
料を、融解プロセス後にそれらが活性であるように融解する方法は、当業者によ
く知られている。

【００７７】 本明細書中使用する「トランスフェクトされた」および「トランスフェクショ
ン」という語は、外因性ＤＮＡを細胞中に到達させる方法を指す。これらの方法
は、例えば高濃度の塩、電場、リポソーム、ポリカチオン性ミセル、または洗浄
剤で細胞を処理して、宿主細胞の外膜または壁を、興味の持たれる核酸分子に対
して透過性とする、といったような様々な技術を含む。これら詳述した方法は限
定的なものではなく、本発明は当業者によく知られる任意の形質転換技術に関連
するものである。例えば、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、第2版、1
989、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess、およびTransgenic Animals, Generation and Use、1997、L.M.Houdebine編
、Hardwood Acedemic Publishers、オーストラリア、を参照されたく、これらは
いずれも引用により、前に本明細書の一部とされた。

【００７８】 本明細書中使用する「外来ＤＮＡ」という語は、標的細胞中にトランスフェク
トされ得るＤＮＡを指すことができ、ここで外来ＤＮＡは、標的生物の核ＤＮＡ
に比べて少なくとも１塩基対の改変を有している。外来ＤＮＡおよびトランスフ
ェクションは先に述べた「改変された核ＤＮＡ」という語と結びつけてさらに理
解され且つ定義され得る。

【００７９】 本明細書中使用する「乖離する」という語は、細胞を他の細胞から分離するの
に有用な材料および方法を指すことができ、ここでその細胞は元々互いに接触し
ている。例えば、卵割球（即ち、桑実胚期の胚の細胞成員）は、当業者によく知
られる技術および装置により、発育しつつある細胞塊の残部から引き離すことが
できる。例えば、「ウシ胚の増殖」と題される米国特許４９９４３８４（１９９
１年２月１９日登録）を参照されたく、これは引用により、全ての図面、表、お
よび描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。別法として、培養中で増殖
している細胞を互いに分離して、本明細書に記載のＥＧ細胞の継代および形成と
いったようなプロセスを容易にすることができる。さらに、培養細胞の群からの
１個の培養細胞の乖離は、後述する核転移のプロセスの第一工程として有用とな
り得る。細胞を胚から乖離させる時、乖離は、再クローニング、本明細書に記載
のプロセス、ならびに幾つかの胚を増幅するための工程といったようなプロセス
にとって有用となり得る。

【００８０】 別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１個の前駆細胞を単離し；そして
（ｂ）この前駆細胞を細胞培養基中で培養する［ここで、培養基中の少なくとも
１個の細胞は胚性生殖細胞の形態を発達させる］工程を含むプロセスによって製
造される、全能性ブタ細胞を特徴とする。好ましい態様において、（１）該プロ
セスは、前駆細胞を全能性ブタ細胞に変換する刺激を前駆細胞に導入する工程を
含み；（２）該プロセスは、かなりの濃度の少なくとも一つの炭水化物を含む細
胞培養基中で前駆細胞を培養する工程を含み；（３）その炭水化物はグルコース
であり；そして（４）細胞培養基は１またはそれ以上の抗生物質を含む。

【００８１】 本明細書中使用する「変換する」という語は、前駆細胞が全能性となる現象を
指すことができる。「変換する」という語は、前駆細胞が非全能性細胞である場
合、本明細書中使用する「再プログラムする」という語と同義である。前駆細胞
は様々な割合で全能性細胞に変換することができる。例えば、前駆細胞の小部分
のみを全能性細胞に変換することが可能である。

【００８２】 本明細書中使用する「刺激」という語は、前駆細胞を全能性細胞に変換するの
に有用な材料および／または方法を指すことができる。刺激とは、例えば電気的
、機械的、温度関連の、および／または化学的なものとすることができる。刺激
は１またはそれ以上の異なる型の刺激の組み合わせであってよい。刺激は前駆細
胞から全能性細胞への変換を達成できる任意の時間、前駆細胞に導入することが
できる。

【００８３】 本明細書中、刺激に関連して使用する「導入する」という語は、前駆細胞を刺
激と接触させる工程または工程群を指すことができる。刺激の性格が例えば化学
的である場合、係る刺激は、この刺激を細胞培養基と混合することにより、前駆
細胞に導入することができる。

【００８４】 本明細書中使用する「かなりの濃度の少なくとも一つの炭水化物」という語は
、培養細胞を溶解または萎縮させない濃度で少なくとも一つの炭水化物を含む細
胞培養基を指すことができる。培養細胞は、培養基の浸透圧が大きすぎる時、溶
解または萎縮し得る。細胞は広範囲の容量オスモル濃度（例えば、２６０mOsm/k
gおよび３２０mOsm/kgの間）を寛容することができる。培養基中の炭水化物濃度
の増大は、培養基の浸透圧を劇的に増加させ、それは細胞の生存能力に影響し得
る。例えば、Cells：a laboratory manual(1巻)、1998、D.L.Spector、R.D.Gold
man、L.A.Leinwand(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたく
、これは引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書
の一部とする。

【００８５】 炭水化物は、当分野で既知の任意の単糖類、二糖類、または多糖類とすること
ができる。炭水化物の例は、グルコース、マンノース、デキストロース、マンノ
ース、イドース、ガラクトース、タロース、グロース、アルトロース、アロース
、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリスロー
ス、グリセルアルデヒド、スクロース、ラクトース、マルトース、セルロース、
およびグリコーゲンを包含するが、これらに限定される訳ではない。特に好まし
い炭水化物はグルコースである。細胞培養基中の好ましいグルコース濃度は、１
mM以上のグルコース、より好ましくは５mM以上のグルコース、１０mMのグルコー
ス、および１５mMのグルコース、そして最も好ましくは約１７mMのグルコースで
ある。グルコース濃度に関連して使用する「約」という語は、プラスまたはマイ
ナス２mMのグルコースを指すことができる。

【００８６】 本明細書中使用する「抗生物質」という語は、細菌、酵母、真菌、糸状菌、ま
たはその他の細胞培養中の夾雑物の増殖速度を低下させる任意の分子を指すこと
ができる。抗生物質は細胞培養基の自由選択成分である。抗生物質の例は当分野
でよく知られている。SigmaおよびDIFCO社のカタログを参照されたい。

【００８７】 好ましい態様において、（１）前駆細胞は支持細胞と共に培養し；（２）前駆
細胞は支持細胞と共に培養せず；（３）支持細胞は胎児細胞から確立し；（４）
胎児細胞は、いかなる細胞型もその胎児から除去されていない胎児から生じ（例
えば、胎児全体を乖離し、細胞培養系中に入れる）；（５）胎児細胞は、１また
はそれ以上の細胞型がその胎児から除去されている胎児から生じ（例えば、頭領
域を除去し、胎児の残部を乖離し細胞培養系中に入れる）；（６）刺激を支持細
胞によって前駆細胞に導入し；（７）支持細胞は刺激の唯一の供給源であり；（
８）刺激は機械的様式で前駆細胞に導入し；（９）前駆細胞に導入される唯一の
刺激が機械的様式で導入され；（１０）刺激が支持細胞により機械的様式で前駆
細胞に導入され；（１１）刺激は前駆細胞をレセプターリガンド混合物と共にイ
ンキュベートする工程を含み；（１２）前駆細胞は有蹄動物、好ましくはブタ族
動物から単離し；（１３）前駆細胞は、非胚性細胞、非胎児細胞、分化した細胞
、分化していない細胞、体細胞、胚性細胞、胎児細胞、胚性幹細胞、始原生殖細
胞、生殖隆起細胞、丘細胞、羊膜細胞、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性生殖細胞
、成体細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、および同調的細胞集団から
単離された細胞［ここで、同調的集団は細胞周期のＧ_０期で停止していない］；
（１４）レセプターリガンド混合物は、サイトカイン、成長因子、栄養因子、お
よび神経栄養因子、ＬＩＦ、およびＦＧＦより成る群から選ばれる少なくとも１
個の成分を含み；（１５）ＬＩＦはヒトＬＩＦのアミノ酸配列と実質上類似のア
ミノ酸配列を持ち；そして（１６）ＦＧＦはウシｂＦＧＦのアミノ酸配列と実質
上類似のアミノ酸配列を持つ。

【００８８】 本明細書中使用する「機械的様式」および「機械的刺激」という語は、刺激を
細胞に導入すること［ここでこの刺激は支持細胞によっては導入されない］を指
すことができる。例えば、精製したＬＩＦおよびｂＦＧＦ（後に定義する）は、
これらの精製した生成物を、前駆細胞が増殖しつつある細胞培養基に添加するこ
とによって、前駆細胞への刺激として導入することができる。これもまた本明細
書中で説明したことであるが、かなりの量のグルコースを、細胞への刺激として
培養基に添加することができる。

【００８９】 本明細書中使用する「支持細胞」という語は、培養中に維持され標的細胞と共
に培養される細胞を指すことができる。標的細胞は、例えば前駆細胞、胚性幹細
胞、胚性生殖細胞、培養細胞、および全能性細胞であってよい。支持細胞は、例
えばペプチド、ポリペプチド、電気的シグナル、有機分子（例えばステロイド）
、核酸分子、成長因子（例えばｂＦＧＦ）、その他の因子（例えば、ＬＩＦおよ
びスティール因子のようなサイトカイン）、および標的細胞に対する代謝栄養素
を提供できる。或る細胞、例えば胚性生殖細胞、培養細胞、および全能性細胞は
、健康な増殖のために支持細胞を必要としないかも知れない。支持細胞は好まし
くは単層で増殖させる。

【００９０】 支持細胞は多数の細胞型から確立できる。これらの細胞型の例は、胎児細胞、
マウス細胞、バッファローラット肝細胞、および卵管細胞である。これらの例は
限定を意図するものではない。組織試料を破壊して、当分野で周知の方法により
、支持細胞セルラインを確立することができる（例えばブレンダーを使用するこ
とにより）。支持細胞は、前駆細胞と同じまたは異なる動物種を起源とすること
ができる。支持細胞は、有蹄動物胎児細胞、ブタ胎児細胞、およびマウス胎児細
胞から確立することができる。１またはそれ以上の細胞型を胎児から取り除き（
例えば、始原生殖細胞、頭領域の細胞、および体腔領域の細胞）、これらの取り
除いた細胞から、または手足を切断した残りの胎児の細胞から、支持層を確立す
ることができる。胎児支持細胞の確立に胎児全体を利用する場合、支持細胞（例
えば線維芽細胞）および前駆細胞（例えば始原生殖細胞）は同じ起源から生じ得
る（例えば１個の胎児）。

【００９１】 本明細書中使用する「レセプターリガンド混合物」という語は、１またはそれ
以上のレセプターリガンドの混合物を指すことができる。レセプターリガンドと
は、細胞の外部または内部に位置するレセプター蛋白に結合する任意の分子を意
味することができる。レセプターリガンドは、サイトカインファミリーのリガン
ド、神経栄養因子ファミリーのリガンド、成長因子ファミリーのリガンド、およ
びマイトジェンファミリーのリガンドの分子から選択でき、これらは全て当業者
によく知られている。レセプター／リガンド対の例は：表皮成長因子レセプター
／表皮成長因子、インスリンレセプター／インスリン、ｃＡＭＰ依存性蛋白キナ
ーゼ／ｃＡＭＰ、成長ホルモンレセプター／成長ホルモン、およびステロイドレ
セプター／ステロイドである。或るレセプターは交差反応性を表すことが示され
ている。例えば、ヘテロローガスなレセプター、例えばインスリン様成長因子１
（ＩＧＦＲ１）およびインスリン様成長因子レセプター２（ＩＧＦＲ２）は共に
ＩＧＦ１に結合する。レセプターリガンド混合物が刺激を含む場合、このレセプ
ターリガンド混合物は当業者に知られる様々なやり方で前駆細胞に導入すること
ができる。

【００９２】 本明細書中使用する「サイトカイン」という語は、当業者によく知られるレセ
プターリガンドの大きなファミリーを指すことができる。サイトカインファミリ
ーのレセプターリガンドは、白血病阻害因子（ＬＩＦ）；カルジオトロフィン１
（ＣＴ−１）；網様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；スティール因子としても知ら
れる幹細胞因子（ＳＣＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ならびに、ＩＬ−６
，ＩＬ−１１，およびＩＬ−１２を包含するインターロイキン（ＩＬ）ファミリ
ーの任意の成員、といったようなものを包含する。本発明の教示は前駆細胞から
全能性細胞への変換のためにスティール因子（当分野では幹細胞因子としても知
られる）の機械的添加を必要としない。

【００９３】 本明細書中使用する「成長因子」という語は、細胞成長効果を惹起し得る、細
胞増殖効果を惹起し得る、そして／または細胞形態に影響し得る、任意のレセプ
ターリガンドを指すことができる。成長因子の例は当分野でよく知られている。
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、成長因子の一例である。「ｂＦＧＦ」という
語は塩基性ＦＧＦを意味し得る。

【００９４】 本明細書中、アミノ酸配列に関して使用する「実質上類似の」という語は、好
ましくは５０％またはそれ以上のアミノ酸一致、より好ましくは７０％またはそ
れ以上のアミノ酸一致、または最も好ましくは９０％もしくはそれ以上のアミノ
酸一致を有する二つのアミノ酸配列を指すことができる。アミノ酸一致は、それ
らの類似性または関連性を評価するアミノ酸配列の性質である。一致は、二つの
配列中の一致する残基の数を残基の総数で除し、その結果に１００を掛けること
により評価する。したがって、正確に同一の配列を有する２個のコピーは１００
％一致を有し、より高度に保存されていない、そして除去、付加、または置換を
有する配列はより低い程度の一致がある。当業者は、配列比較を行い配列一致を
決定するために、幾つかのコンピュータープログラムが利用できるという事が理
解できるであろう。

【００９５】 前駆細胞をインビトロで培養する場合、前駆細胞に刺激を導入することなしに
、前駆細胞とは異なる細胞形態を有する細胞を生じさせることができるというこ
とが発見された。例えば、前駆体生殖隆起細胞は、この前駆細胞を、支持細胞、
レセプターリガンド、または成長因子と接触させることなく、ＥＧ細胞形態を有
する細胞へと発育できることが見いだされた。したがって、好ましい態様におい
て、（１）前駆細胞は外因性レセプターリガンドと接触させず；（２）前駆細胞
は外因性成長因子と接触させず；（３）前駆細胞は支持細胞と接触させず；（４
）前駆細胞は外因性レセプターリガンドと接触させず、且つ外因性成長因子と接
触させず；（５）前駆細胞は外因性レセプターリガンドと接触させず、且つ支持
細胞と接触させず；（６）前駆細胞は外因性成長因子と接触させず、且つ支持細
胞と接触させず；そして（７）前駆細胞は外因性レセプターリガンドと接触させ
ず、且つ外因性成長因子と接触させず、且つ支持細胞と接触させない。

【００９６】 本明細書中、成長因子またはレセプターリガンドに関連して使用する「外因性
」という語は、標的細胞と接触する基質または培地に添加され得る、レセプター
リガンドおよび／または成長因子の外的供給源を指すことができる。例えば、当
業者が市販品を入手できる精製ｂＦＧＦを、前駆細胞と接触する細胞培養基に添
加することができる。この後者の例において、このような精製ｂＦＧＦを「外因
性ｂＦＧＦ」と呼ぶことができる。多数の外因性レセプターリガンドおよび／ま
たは多数の外因性成長因子またはこれらの組み合わせを、細胞を含有する液体培
地に添加することができる。これとは別に、前述のように、前駆細胞は、外因性
成長因子または外因性レセプターリガンドと接触させる必要がないかも知れない
。

【００９７】 別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、全能性ブタ細胞を製造する
方法を特徴としている：（ａ）１またはそれ以上の前駆細胞を単離し；そして（
ｂ）この前駆細胞に、該前駆細胞を全能性細胞に変換する刺激を導入する。全能
性ブタ細胞に関して本明細書中、先に規定されたいずれの態様も、全能性ブタ細
胞を製造するための方法に関連している。さらに別の態様では、本発明は、以下
の工程を含む、全能性ブタ細胞を製造する方法を特徴としている：（ａ）少なく
とも１個の前駆細胞を単離し；そして（ｂ）この前駆細胞を細胞培養基中で培養
して全能性細胞を確立する［ここで、この全能性細胞は胚性生殖細胞の形態を有
する］。

【００９８】 本発明に係るクローニングされた胚 本発明は、一部には、クローニングされた全能性ブタ胚に関するものである。
よって、本発明の態様は、（１）胚が全能性であり；（２）胚が全能性細胞から
生じ；（３）胚が非胚性ブタ細胞から生じ；そして（４）上記のいずれかの組み
合わせ、である、クローニングされたブタ胚を特徴とする。

【００９９】 本明細書中、胚に関して使用する「全能性」という語は、生児出生ブタ族動物
へと発育できる胚を指すことができる。「生児出生」という語は前に定義した。

【０１００】 本明細書中定義する「クローニングされた」という語は、別の細胞、胚性細胞
、胎児細胞、および／または動物細胞の核ＤＮＡ配列と実質上類似または一致す
る核ＤＮＡを有する細胞、胚性細胞、胎児細胞、および／または動物細胞を指す
ことができる。「実質上類似の」および「一致する」という語は本明細書に記載
してある。クローニングされた胚は１回の核転移プロセスから生じ、またはこれ
とは別に、クローニングされた胚は、少なくとも１回の再クローニング工程を含
むクローニングプロセスから生ずることができる。再クローニング工程は全能性
細胞から生じた胚から単離される胚性細胞を利用できるため、クローニングされ
た胚が少なくとも１回の再クローニング工程を含むクローニング方法から生じる
ならば、そのクローニングされた胚は間接的に全能性細胞から生じ得る。

【０１０１】 好ましい態様において、（１）クローニングされたブタ胚は多数の胚の一員で
あり［ここで、この多数の胚は、実質上類似の核ＤＮＡ配列を共有している］；
（２）クローニングされたブタ胚は多数の胚の一員であり、この多数の胚は同一
の核ＤＮＡ配列を有しており；（３）クローニングされたブタ胚は、生児出生ブ
タ族動物の核ＤＮＡ配列と実質上類似の核ＤＮＡ配列を有し；（４）クローニン
グされたブタ胚の１またはそれ以上の細胞は改変された核ＤＮＡを有し；（５）
クローニングされたブタ胚は操作に付され：（６）この操作は胚を適当な培地で
培養する工程を含み；（７）この培地は支持細胞を含んでいてよく；（８）胚の
操作は、この胚を雌性動物の生殖管に着床させる工程を含み；（９）この雌性動
物は好ましくは有蹄動物、より好ましくはブタ族動物であり；（１０）雌の発情
周期は胚の発生周期と同調させ；そして（１１）この操作は胚を人工環境でイン
キュベートする工程を含む。

【０１０２】 本発明に係る全能性細胞のための改変された核ＤＮＡに関する全ての好ましい
態様は、本発明に係るクローニングされた胚へと拡大させる。加えて、本発明に
係る全能性細胞に関連して記載したいかなる操作も、本発明に係るクローニング
された胚に適用される。

【０１０３】 本明細書中、核ＤＮＡ配列に関して使用する「実質上類似の」という語は、ほ
ぼ一致する二つの核ＤＮＡ配列を指す。二つの配列は、核ＤＮＡの複製中に通常
出現するコピー過誤の相違によって異なっているかも知れない。実質上類似のＤ
ＮＡ配列は、好ましくは９７％以上一致し、より好ましくは９８％以上一致し、
そして最も好ましくは９９％以上一致する。本明細書中、核ＤＮＡ配列に関して
使用する「一致」という語は、本明細書中前述したアミノ酸配列に関する当該語
句の用法を指すことができる。核ＤＮＡ配列はクローニングされた動物について
一致することが好ましく且つそれが予想できる。クローン動物と、それらがクロ
ーニングされた元の細胞が、実質上類似または一致する核ＤＮＡ配列を有するか
どうかを決定する方法の例は、マイクロサテライト分析およびＤＮＡフィンガー
プリント分析である。Ashworth等、1998、Nature 394:329およびSigner等、1998
、Nature 394:329。

【０１０４】 本明細書中、胚に関して使用する「多数」という語は、実質上類似の核ＤＮＡ
配列を有する一組の胚を指すことができる。好ましい態様において、多数とは、
５またはそれ以上の胚、１０またはそれ以上の胚、１５またはそれ以上の胚、２
０またはそれ以上の胚、５０またはそれ以上の胚、７５またはそれ以上の胚、１
００またはそれ以上の胚、および１０００またはそれ以上の胚で構成される。

【０１０５】 本明細書中、胚に関して使用する「培養する」という語は、胚を培養基中に入
れることを含む研究室での操作を指すことができる。胚を適当な時間培養基中に
入れて、胚を静止させ、または胚を培地中で増殖させることができる。胚の培養
に好適な培養基は当業者によく知られている。例えば、Nagashima等、1997、Mol
.Reprod.Dev. 48:339-343；PettersおよびWells、1993、J.Reprod.Fert.(追補)
48:61-73；Reed等、1992、Theriogenology 37:95-109；Dobrinsky等、1996、Bio
l.Reprod. 55:1069-1074；米国特許第５２１３９７９号、First等、「ウシ胚の
インビトロ培養」、１９９３年５月２５日；米国特許第５０９６８２２号、Rose
nkrans,Jr.等、「ウシ胚の培地」、１９９２年３月１７日を参照されたく、これ
らの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明
細書の一部とする。

【０１０６】 本明細書中使用する「適当な培地」という語は、細胞増殖をさせ、または胚の
静止をさせる任意の培地を指すことができる。培地が細胞増殖をさせる場合、適
当な培地は最大の増殖を推進する必要はなく、測定可能な細胞増殖を推進するだ
けでよい。胚の発育にとって適当な培地は、本明細書の実施例により記載される
胚培養基であってよい。「支持細胞」という語は本明細書中、前に定義した。本
発明に係る胚は支持細胞を伴うまたは伴わない培地で培養することができる。別
の好ましい態様では、支持細胞は丘細胞とすることができる。

【０１０７】 本明細書中、胚に関して使用する「着床」という語は、本明細書に記載の胚を
用いて雌性動物を授精させることを意味し得る。着床技術は当業者によく知られ
ている。例えば、PolgeおよびDay、1982、「胚の移植および保存」、Control of
Pig Reproduction、DJA ColeおよびGR Foxcroft編、ロンドン、英国、Butterwo
rths、227-291頁；Gordon、1997、「ブタにおける胚転移および付随技術」、Con
trolled reproduction in pigs(Gordon編)、CAB International、ワリングフォ
ード、英国、164-182頁；およびKojima、1998、「胚転移」、Manual of pig emb
ryo transfer procedures、National Livestock Breeding Center、Japanese So
ciety for Development of Swine Technology、76-79頁を参照されたく、これら
の各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細
書の一部とする。

【０１０８】 胚は子宮内で発育させることができ、または別法として、分娩前に胎児を子宮
環境から取り出すことができる。

【０１０９】 本明細書中、発情周期に関して使用する「同調させた」という語は、当業者に
よく知られる生殖援助技術を指すことができる。これらの技術は前段落に引用し
た文献に詳細が記載されている。典型的には、エストロゲンおよびプロゲステロ
ンホルモンを利用して、雌性動物の発情周期を胚の発育段階と同調させる。本明
細書中使用する「発育段階」という語は、本発明に係る胚ならびに胚の発育中の
形態学的および生化学的変化を指すことができる。この発育プロセスは有蹄類由
来の胚について予測可能であり、レシピエント動物の発情周期と同調させること
ができる。雌性ブタ族動物を同調させる方法は後に開示する。

【０１１０】 「人工環境」という語は、胚またはその他の発育しつつある細胞塊の発育を促
進する環境を指す。人工環境は、発育しつつある細胞塊の種とは異なる種の子宮
環境または卵管環境とすることができる。例えば、発育中のウシ胚を、羊族動物
の子宮または卵管中に入れることができる。SticeおよびKeefer、1993、「多世
代ウシ胚のクローニング」、Biology of Reproduction 48:715-719。別法として
、人工的な発育環境はインビトロで組み立てることもできる。この型の人工子宮
環境は、当分野で既知の生物学的および化学的成分を用いて合成することができ
る。

【０１１１】 別の態様では、本発明は、核転移の工程を含むプロセスにより製造されるクロ
ーニングされた哺乳動物胚［ここでこの胚は全能性である］を特徴とする。好ま
しくは、核転移は、（ａ）核ドナー、および（ｂ）卵母細胞［ここで、この卵母
細胞は胚の形成が可能な段階にある］の間に起こる。

【０１１２】 好ましい態様において、（１）卵母細胞は除核した卵母細胞であり；（２）こ
の卵母細胞は好ましくは有蹄動物を起源とし、より好ましくはブタ族動物を起源
としており；（３）この卵母細胞は成熟しており；（４）この卵母細胞は４８時
間以上成熟しており；（５）この卵母細胞は約５３時間成熟しており；（６）核
ドナーは卵母細胞の卵黄周囲腔に位置し；（７）核転移に利用される核ドナーは
前記の細胞（例えば、非胚性細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、分化した細胞
、胎児細胞、非胎児細胞、非始原生殖細胞、非同調的細胞集団から単離された細
胞、同調的細胞集団から単離された細胞、存在している動物から単離された細胞
、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、羊膜細胞、丘細胞、および胎児線維芽細胞）のい
ずれかから生ずることができ；（８）核転移は、レシピエント卵母細胞中への核
ドナーの転置の工程を含むことができ；（９）この転置は、レシピエント卵母細
胞中への核ドナーの注入の工程を含むことができ；（１０）この転置は核ドナー
および卵母細胞の融合の工程を含むことができ；（１１）融合は、核ドナーおよ
び卵母細胞に１またはそれ以上の電気的パルスを施す工程を含むことができ；（
１２）融合は、核ドナーおよび卵母細胞に少なくとも一つの適当な濃度の融合剤
を到達させる工程を含むことができ；（１３）核転移は核ドナーおよび卵母細胞
の活性化の工程を含むことができ；（１４）活性化は（ｉ）細胞中の二価カチオ
ンの細胞内レベルを増大させ、そして（ii）細胞中の細胞蛋白の燐酸化を低下さ
せる、ことによって達成し；（１５）活性化は（ｉ）細胞に二価イオンイオノフ
ォアを導入し、そして（ii）細胞に蛋白キナーゼインヒビターを導入する、こと
によって達成し；（１６）この二価イオンイオノフォアはＣａ^２＋イオノフォア
であり；（１７）Ｃａ^２＋イオノフォアはイオノマイシンであり；（１８）蛋白
キナーゼインヒビターはＤＭＡＰであり；そして（１９）活性化は、細胞にＤＭ
ＡＰおよびイオノマイシンを導入することにより達成する。

【０１１３】 本明細書中使用する「核ドナー」という語は、核受容体中に転置する、細胞ま
たは細胞由来の核を指すことができる。核ドナーは全能性ブタ細胞であってよい
。さらに、核ドナーは本明細書に記載される任意の細胞であってよく、非胚性細
胞、非胎児細胞、分化した細胞、体細胞、胚性細胞、胎児細胞、胚性幹細胞、始
原生殖細胞、生殖隆起細胞、丘細胞、羊膜細胞、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性
生殖細胞、成体細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、および同調的細胞
集団から単離された細胞［ここで、同調的集団は細胞周期のＧ_０期に停止してい
ない］を包含するが、これらに限定される訳ではない。核ドナー細胞はさらに、
胚性幹細胞から分化した細胞であってよい。例えば、Piedrahita等、1998、Biol
.Reprod. 58:1321-1329；Shim等、1997、Biol.Reprod. 57:1089-1095；Tsung等
、1995、Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28:173-189；およびWheeler、1994、Rep
rod.Fertil.Dev. 6:563-568を参照されたく、これらの各々は、引用により、全
ての図面、描画、および表を包含する全内容を本明細書の一部とする。加えて、
核ドナーは前もって凍結または低温保存された細胞であってよい。

【０１１４】 本明細書中使用する「除核した卵母細胞」という語は、核を除去した卵母細胞
を指すことができる。典型的には、針を卵母細胞中に入れ、核を針の中に吸引す
ることができる。この針は細胞質膜を破らずに卵母細胞から抜き取ることができ
る。この除核技術は当業者によく知られている。米国特許４９９４３８４；米国
特許５０５７４２０；およびWilladsen、1986、Nature 320:63-65を参照された
い。除核した卵母細胞は、好ましくは２４時間以上成熟している、好ましくは３
６時間以上成熟している、より好ましくは４８時間以上成熟している、そして最
も好ましくは約５３時間成熟している卵母細胞から調製する。

【０１１５】 本明細書中使用する「成熟」および「成熟した」という語は、卵母細胞を培地
中インビトロでインキュベートするプロセスを指すことができる。成熟培地は、
ホルモンおよび成長因子を包含する多くの型の成分を含有することができる。成
熟の時間は、卵母細胞が成熟培地に入れられた時間から、卵母細胞が操作（例え
ば、除核、核転移、融合、および／または活性化）に付されるまでの時間で決定
することができる。卵母細胞は当業者によく知られる多くの培地で成熟させるこ
とができる。例えば、Mattioli等、1989、Theriogenology 31:1201-1207；Jolli
ffおよびPrather、1997、Biol.Reprod. 56:544-548；FunahashiおよびDay、1993
、J.Reprod.Fert. 98:179-185；Nagashima等、1997、Mol.Reprod.Dev. 38:339-3
43；Abeydeera等、1998、Biol.Reprod. 58:213-218；Funahashi等、1997、Biol.
Reprod. 57:49-53；およびSawai等、1997、Biol.Reprod. 57:1-6を参照されたく
、これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容
を本明細書の一部とする。卵母細胞は任意の時間成熟させることができる：卵母
細胞は１０時間以上、２０時間以上、２４時間以上、６０時間以上、７２時間以
上、９０時間以上成熟させることができ、好ましくは３６時間以上、より好まし
くは４８時間以上、そして最も好ましくは約５３時間成熟させることができる。
卵母細胞の成熟に関する「約」という語は、プラスまたはマイナス３時間を指す
ことができる。

【０１１６】 卵母細胞はまた、インビボで成熟させることができる。成熟の時間は、卵母細
胞が減数分裂を再開するための適当な刺激を受ける時間から、卵母細胞が操作を
受ける時間までとすることができる。インビトロで成熟させる卵母細胞について
上に述べたものと同様の成熟時間を、インビボ成熟させる卵母細胞に適用する。

【０１１７】 様々な卵母細胞を成熟のために選択することができる。例えば、卵母細胞は、
前青春期のブタ族動物または近青春期の動物（例えば雌豚）から単離できる。と
ころが、前青春期のブタ族動物由来の卵母細胞は、インビトロで自発的な減数分
裂の再開ができないかも知れない。雌豚から単離された卵母細胞を成熟に利用し
、最終的には核転移法に利用することが、本発明の好ましい態様である。 核転移は、１個の核ドナーおよび１個以上の除核卵母細胞を合することにより達
成できる。加えて、核転移は、１個の核ドナー、１またはそれ以上の除核卵母細
胞、および１またはそれ以上の除核卵母細胞の細胞質を合することにより達成で
きる。

【０１１８】 本明細書中使用する「サイブリッド」という語は、核ドナーが内部に挿入され
た卵母細胞を指すことができる。「サイブリッド」という語は、卵母細胞中に転
置された核ドナーを有する卵母細胞を指すことができる。核ドナーは卵母細胞と
融合することができ、「サイブリッド」という語は核ドナーと融合していない卵
母細胞を包含する。

【０１１９】 本発明は、一部には、核ドナーおよび除核されていない卵母細胞の核転移によ
り確立した、クローニングされた哺乳動物胚に関するものである。卵母細胞由来
の核ＤＮＡが複製せず、ドナー細胞由来の核ＤＮＡが細胞分裂中に複製される場
合に、クローン胚が確立され得る。例えば、Wagoner等、1996、「ウシ卵母細胞
の機能的除核；遠沈および紫外光の効果」、Theriogenology 46:279-284を参照
されたい。

【０１２０】 本明細書中使用する「別の有蹄類」という語は、核ドナーが、レシピエント卵
母細胞の起源とは異なる種、族または科の有蹄類に起源を有する状況を指すこと
ができる。例えば、ブタ細胞を核ドナーとして使用し、一方レシピエント卵母細
胞は畜牛から単離することができる。この例は限定を意図している訳ではなく、
核ドナーおよびレシピエント卵母細胞のいかなる種／科の有蹄動物の組み合わせ
も本発明によって予測される。

【０１２１】 本明細書中、核転移に関して使用する「転置」という語は、核ドナーおよびレ
シピエント卵母細胞を合することを意味し得る。転置は、例えば融合および／ま
たは直接注入といったような技術により実施することができる。

【０１２２】 本明細書中、胚に関して使用する「注入」という語は、卵母細胞を針で穿孔し
、針の中にある核ドナーを卵母細胞中に挿入することを意味し得る。好ましい態
様において、核ドナーは卵母細胞の細胞質内部に、または卵母細胞の卵黄周囲腔
に注入することができる。この直接注入のアプローチは、核転移に関して既に本
明細書の一部とされた刊行物により指摘されるように、当業者によく知られてい
る。核転移に向けた直接注入アプローチのために、細胞全体を卵母細胞内部に注
入することができ、または別法として、細胞から単離した核を卵母細胞内部に注
入することもできる。このような単離された核は核膜のみに取り囲まれているか
も知れず、または単離された核は任意の割合で核膜および原形質膜に取り囲まれ
ているかも知れない。卵母細胞は、その原形質膜の強度を増強するため、例えば
核ドナーの注入に先立ちスクロース中で卵母細胞をインキュベートすることによ
り前処理することができる。

【０１２３】 核ドナーを除核した卵母細胞の卵黄周囲腔に入れる技術は当業者によく知られ
ており、本明細書中、核転移に関して先に引用した特許および参考文献に詳細に
記載されている。

【０１２４】 本明細書中使用する「融合」という語は、核ドナーおよびレシピエント卵母細
胞に対応する脂質膜の部分を合することを意味し得る。脂質膜は例えば細胞の原
形質膜または核膜に対応する。融合は、例えば核ドナーおよびレシピエント卵母
細胞を互いに隣接して位置させた時、または核ドナーをレシピエント卵母細胞の
卵黄周囲腔に位置させた時、融合刺激の添加と共に、それらの間に起こり得る。
哺乳動物であるブタの細胞を卵母細胞内部に転置させるための個別例を、他の好
ましい態様において後述する。転置のためのこれらの技術は、本明細書中、核転
移に関して先に引用した参考文献に詳細に記載されている。

【０１２５】 本明細書中使用する「電気的パルス」という語は、核ドナーおよびレシピエン
ト卵母細胞に電流を流すことを意味し得る。核転移のために、核ドナーおよびレ
シピエント卵母細胞を電極の間に並べ、電流を流す。電流は交流または直流とす
ることができる。電流は、１回のパルスとして、または多数のパルスとして、様
々な異なった時間、細胞に送り込まれる。細胞は、電気的パルスの送り込みのた
め、典型的には適当な培地で培養されている。核転移に利用される電気的パルス
条件の例は、本明細書中、核転移に関して先に引用した参考文献および特許に記
載されている。

【０１２６】 本明細書中使用する「融合剤」という語は、異なった細胞由来の原形質膜の一
部が、核ドナーをレシピエント卵母細胞に隣接して位置させた時に融合する可能
性を増大させることのできる任意の化合物または生物体を指すことができる。好
ましい態様において、融合剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリプシ
ン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レクチン、アグルチニン、ウイルス、
およびセンダイウイルスより成る群から選ばれる。これらの例は限定を意図する
ものではなく、当分野で既知の他の融合剤が適用可能であり、且つ本発明に包含
される。

【０１２７】 本明細書中、融合剤に関して使用する「適当な濃度」という語は、測定可能な
量の融合を与える融合剤の濃度を指すことができる。融合は、例えば光学顕微鏡
、染料、および蛍光脂質を利用するといった当業者によく知られる多数の技術に
よって測定することができる。

【０１２８】 「活性化」という語は、核転移工程の前、最中、および後に細胞を刺激して分
裂させるのに有用な材料および方法を指すことができる。前の文で使用した「細
胞」という語は、卵母細胞、サイブリッド、核ドナー、および初期の胚を指すこ
とができる。これらの型の細胞は、核転移が起こった後に分裂させるために刺激
が必要であるかも知れない。本発明は、当業者にとって既知の任意の活性化材料
および方法に関連している。

【０１２９】 電気的パルスは、時には細胞の活性化を刺激するのに十分であるが、細胞の適
切な活性化のために、活性化のための他の非電気的手段が有用であり、且つしば
しば必要となる。非電気的活性化のために有用な化学的材料および方法を、本発
明の他の好ましい態様において後述する。２またはそれ以上の化学的成分を細胞
の活性化のために細胞に導入する場合、その成分は同時に、または段階的に添加
することができる。

【０１３０】 活性化のための電気的プロセスの例は当分野でよく知られている。研究者は活
性化のための非電気的プロセスもまた報告している。例えば、Grocholova等、19
97、J.Exp.Zoology 277:49-56；Schoenbeck等、1993、Theriogenology 40:257-2
66；Prather等、1989、Biology of Reproduction 41:414-418；Prather等、1991
、Molecular Reproduction and Development 28:405-409；Mattioli等、1991、M
olecular Reproduction and Development 30:109-125；Terlouw等、1992、Theri
ogenology 37:309；Prochazka等、1992、J.Reprod.Fert. 96:725-734；Funahash
i等、1993、Molecular Reproduction and Development 36:361-367；Prather等
、Bio.Rep. 50巻追補１:282；Nussbaum等、1995、Molecular Reproduction and
Development 41:70-75；Funahashi等、1995、Zygote 3:273-281；Wang等、1997
、Biology of Reproduction 56:1376-1382；Piedrahita等、1989、Biology of R
eproduction 58:1321-1329；Machaty等、1997、Biology of Reproduction 57:85
-91；およびMachaty等、1995、Biology of Reproduction 52:753-758を参照され
たい。

【０１３１】 非電気的活性化に有用な成分の例は、エタノール；三燐酸イノシトール（ＩＰ _３ ）；二価イオン（例えば、Ｃａ^２＋および／またはＳｒ^２＋の添加）；微小管
インヒビター（例えば、サイトカラシンＢ）；二価イオンのためのイオノフォア
（例えばＣａ^２＋イオノフォアイオノマイシン）；蛋白キナーゼインヒビター（
例えば、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ））；蛋白合成インヒビター（例
えばシクロへキサミド）；ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセタート（Ｐ
ＭＡ）のようなホルボールエステル：およびサプシガルギンを包含する。温度変
化および機械的技術もまた非電気的活性化にとって有用であることが知られてい
る。本発明は当分野で知られる任意の活性化技術を包含する。例えば、「単為生
殖卵母細胞活性化」と題するSusko-Parrish等の米国特許第５４９６７２０号（
１９９６年３月５日登録）、およびWakayama等、1998、Nature 394:369-374を参
照されたく、これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含
する全内容を本明細書の一部とする。

【０１３２】 非電気的活性化にイオノマイシンおよびＤＭＡＰを利用する場合、イオノマイ
シンおよびＤＭＡＰは同時に、または段階的添加によって細胞に導入することが
でき、後者が、本明細書に記載の通り、好ましい様式である。イオノマイシンお
よびＤＭＡＰの好ましい濃度は、イオノマイシン０.５μＭないしイオノマイシ
ン５０μＭ、およびＤＭＡＰ ０.５ｍＭないしＤＭＡＰ５０ｍＭ、より好ましく
はイオノマイシン１μＭないしイオノマイシン２０μＭ、およびＤＭＡＰ１ｍＭ
ないしＤＭＡＰ ５ｍＭ、そして最も好ましくはイオノマイシン約１０μＭおよ
びＤＭＡＰ約２ｍＭ［ここで「約」という語はプラスまたはマイナス２μＭのイ
オノマイシンおよび１ｍＭのＤＭＡＰを指すことができる］。

【０１３３】 別の好ましい態様において、（１）クローニングされたブタ胚の１またはそれ
以上の細胞は、改変された核ＤＮＡを含み；（２）クローニングされたブタ胚を
操作に付し；（３）この操作は少なくとも１個の個別的細胞をクローニングされ
た胚から分離させる工程を含み；（４）この操作は、核転移方法において個別的
細胞を核ドナーとして利用する工程を含み；（５）その個別的細胞を、胚盤胞期
の胚の内細胞塊から分離させ；（６）その個別的細胞を前胚盤胞期の胚から分離
させ；（７）この操作は再クローニングのプロセスを含み；（８）この再クロー
ニングプロセスは、（ａ）胚を１またはそれ以上の個別的細胞に分離し、そして
（ｂ）（ｉ）（ａ）の個別的細胞、および（ii）卵母細胞の間の核転移をその後
少なくとも１回実施する、という工程を含み；（９）その後の核転移のため、個
別的細胞を、除核した卵母細胞の卵黄周囲腔に入れ；（１０）その後の核転移は
、その個別的細胞および／または除核した卵母細胞の転置、注入、融合、および
活性化の工程のうち少なくとも一つを含み；（１１）この、その後の核転移から
生ずるクローニングされた哺乳動物の胚の細胞のうち１またはそれ以上は、改変
された核ＤＮＡを含み；そして、（１２）この、その後の核転移から生ずるクロ
ーニングされた哺乳動物の胚は、その後の操作に付すことができる［ここで、そ
の後の操作とは、本明細書中、全能性細胞および／またはクローン胚に関して前
に定義した操作工程のいずれかである］。

【０１３４】 本明細書中使用する「個別的細胞」という語は、本発明に係るクローニングさ
れた哺乳動物の胚から単離された細胞を指すことができる。個別的な単一の細胞
は、本明細書中、先に引用した文献中に記載の、当業者に周知の技術によって胚
から単離することができる。

【０１３５】 本明細書に記載の「その後の核転移」という語は、「再クローニング」工程と
も呼ばれる。好ましくは、再クローニング工程は、核転移の生成物が生児出生動
物であるよう、核転移の間の核再プログラミングを増強するために利用すること
ができる。その後の核転移工程の数は、後に、より詳細に述べる。

【０１３６】 本明細書に前述した転置、注入、融合、および活性化工程に関する好ましい態
様は、いずれもその後の核転移工程のいずれかに関連し得る。

【０１３７】 本明細書中使用する「内細胞塊」という語は、胚そのものを生ずる細胞を指す
ことができる。胚盤胞の外側を覆う細胞は、胚の栄養芽層と呼ぶことができる。
内細胞塊を胚から単離する方法は、前述のように当業者によく知られている。「
前胚盤胞」という語は当業者によく知られており、先に言及した。

【０１３８】 本明細書中使用する「インビボで排卵された」という語は、発情に伴う性質を
動物が示した数時間後に、または排卵を誘発することが知られている外因性ゴナ
ドトロピンの注射後に、その動物から単離される卵母細胞を指すことができる。
発情期の動物の性質は、本明細書に開示する参考文献に記載のように、当業者に
はよく知られている。例えば、Gordon、1977、「ブタにおける胚転移および付随
技術（Gordon編）」、CAB International, ワリングフォード、英国、60-76頁、
およびKojima、1988、「胚転移」、Manual of pig embryo transfer procedures
、National Livestock Breeding Center、Japanese Society for Development o
f Swine Technology、7-21頁を参照されたく、これらの各々は、引用により、全
ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。

【０１３９】 別の態様において、本発明は、（ａ）核転移卵母細胞を確立するための、卵母
細胞内への核ドナーの転置；および（ｂ）ブタ胚を確立するための、核転移卵母
細胞の非電気的活性化、という工程を含むプロセスによって生成されるクローニ
ングされたブタ胚に関するものである。

【０１４０】 好ましい態様において、（１）核ドナーは培養細胞であり、且つ本明細書に記
載の任意の細胞型から選択され；（２）核ドナーは全能性細胞であるか、または
全能性細胞から単離され；（３）核ドナーは本明細書に記載の任意の細胞型であ
り（例えば、胚性生殖細胞、丘細胞、羊膜細胞、線維芽細胞）；（４）転置は融
合の工程を含み；そして（５）このプロセスは胚をインビトロで培養する工程を
含む。ブタ胚に関して、そしてとりわけ活性化に関して本明細書に記載したその
他の好ましい態様は、いずれも本発明の態様に関係する。

【０１４１】 別の態様では、本発明は、クローニングされたブタ胚を製造する方法に関連す
る。この方法は、（ａ）核ドナー［ここで核ドナーは全能性ブタ細胞である］；
および（ｂ）卵母細胞［ここで、卵母細胞は胚の形成が可能な段階にある］の間
の核転移の工程を含む。さらに別の態様では、本発明は、（ａ）核転移卵母細胞
を確立するための、卵母細胞内への核ドナーの転置；および（ｂ）ブタ胚を確立
するための、核転移卵母細胞の非電気的活性化、という工程を含む、ブタ胚をク
ローニングするための方法に関するものである。好ましい態様において、クロー
ニングされたブタ胚に関する本発明のいかなる態様も、クローニングされたブタ
胚を製造するための方法に適用される。

【０１４２】 本発明に係るクローン胎児 別の態様では、本発明は、本発明に係る全能性胚から生ずるクローニングされ
たブタ胎児を特徴とする。胎児は、妊娠した雌性動物の子宮から、そして異所性
妊娠の場合には、妊娠した雌性動物の他の部分から単離することができる。

【０１４３】 好ましい態様において、（１）胎児の１またはそれ以上の細胞は改変された核
ＤＮＡ（本明細書中、先に定義した）を有し；そして（２）胎児は本明細書に定
義される任意の操作に付すことができる。例えば、或る操作は、妊娠した雌性動
物の子宮から胎児を単離し、その胎児から細胞を単離し（例えば、始原生殖細胞
）、そして単離した細胞を核転移のための核ドナーとして利用する、工程を含む
ことができる。

【０１４４】 本発明の別の態様は、（１）（ａ）前記定義によるクローニングされたブタ胚
の製造、および（ｂ）クローニングされたブタ胚が胎児に発育するような、クロ
ーニングされたブタ胚の操作、という工程を含むプロセスによって製造された、
クローニングされたブタ胎児；（２）（ａ）前記定義によるクローニングされた
ブタ胚の製造、および（ｂ）クローニングされたブタ胚が胎児に発育するような
、クローニングされたブタ胚の操作、という工程を含む、クローニングされたブ
タ胎児を製造するための方法；（３）胎児から少なくとも一つの細胞型を単離す
る工程を含む、本発明に係るクローン胎児を（例えば、支持細胞層を確立するた
めに）使用する方法；および（４）少なくとも胎児の一部分を個別的細胞に分離
する工程を含む、本発明に係るクローン胎児を（例えば、支持細胞層を確立する
ために）使用する方法、を特徴とする。

【０１４５】 本発明に係るクローニングされたブタ族動物 別の態様では、本発明は、本発明に係る全能性ブタ細胞から生ずるクローニン
グされたブタ族動物を特徴とする。クローニングされたブタ族動物は、全能性ブ
タ細胞および卵母細胞間の核転移プロセスによって確立されたクローン胚から発
育させることができる。全能性ブタ細胞は、好ましくは本明細書中の前述した材
料および方法のいずれかを利用することにより確立する。

【０１４６】 また別の態様において、本発明はクローニングされたブタ族動物に関するもの
であり、ここでこの動物は多数のブタ族動物の一員であり、そしてこの多数の動
物は実質上類似の核ＤＮＡ配列を持っている。核ＤＮＡ配列に関連する「実質上
類似の」という語は、本明細書中、先に定義した。

【０１４７】 好ましい態様において、（１）多数とは、５またはそれ以上の動物、１０また
はそれ以上の動物、１００またはそれ以上の動物、そして１０００またはそれ以
上の動物で構成され；そして（２）この多数の動物は同一の核ＤＮＡ配列を有し
得る。核ＤＮＡ配列に関する「同一の」という語は、本明細書中、前述した。

【０１４８】 別の態様において、本発明は、改変した核ＤＮＡを含む１またはそれ以上の細
胞を有するクローニングされたブタ族動物に関するものである。前述の改変した
核ＤＮＡに関する好ましい態様の全ては、本発明に係るクローニングされたブタ
族動物に適用される。

【０１４９】 さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１個の構成成分をブタ族動物
から単離する工程を含む、クローニングされたブタ族動物を使用する方法を特徴
とする。

【０１５０】 本明細書中使用する「構成成分」という語は、ブタ族動物の任意の部分に関連
し得る。構成成分は、流体、生物学的流体、細胞、組織、臓器、配偶子、胚、お
よび胎児より成る群から選択できる。例えば、先に定義した前駆細胞は、本発明
に係るクローニングされた生体から単離される流体、生物学的流体、細胞、組織
、臓器、配偶子、胚、および胎児から生じ得る。

【０１５１】 本明細書中使用する「配偶子」という語は、動物の生殖系に直接的または間接
的に参加する任意の細胞を指すことができる。配偶子は生体の性腺由来の特化し
た生成物であり得、ここで配偶子は授精に参加している間に遺伝物質を転移させ
ることができる。配偶子の例は、精母細胞、精原細胞、卵母細胞、および卵原細
胞である。配偶子は、動物から採取した流体、組織、および臓器中に存在し得る
（例えば、精子は精液中に存在する）。本発明は、動物由来の任意の型の配偶子
の採取に関連する。例えば、精液および卵母細胞の採取の方法は当業者に知られ
ている。例えば、Gordon、1997、「ブタの育種管理入門、ブタの胚転移および付
随技術」、Controlled reproduction in pigs(Gordon編)、CAB International、
ワリングフォード、英国、1-59頁；Mattioli等、1989、Theriogenology 31:1207
-1207；FunahashiおよびDay、1993、J.Reprod.Fert. 98 179-185；Funahashi等
、1997、Biol.Reprod. 57:49-53；Abeydeera等、1998、Biol.Reprod. 58:213-21
8；およびSawai等、1997、Biol.Reprod. 57:1-6を参照されたく、これらの各々
は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一
部とする。

【０１５２】 「組織」という語は先に定義した。「臓器」という語は、動物から単離された
任意の臓器または臓器の任意の一部分を指す。臓器および組織の例は、神経組織
、脳組織、脾臓、心臓、肺、胆嚢、膵臓、精巣、卵巣および腎臓である。これら
の例は限定的なものではなく、本発明は、本発明に係るクローン動物から単離さ
れた任意の臓器および任意の組織に関連している。

【０１５３】 好ましい態様において、本発明は、（１）流体、生物学的流体、細胞、組織、
臓器、配偶子、胚、および胎児を操作に付し；（２）この操作は、配偶子、胚、
および／または胎児組織を低温保存する工程を含むことができ；（３）この操作
は、低温保存されたものを融解させる工程を含むことができ；（４）この操作は
、精液を、Ｘ染色体保有精液とＹ染色体保有精液とに分離する工程を含むことが
でき、；（５）この操作は、人工授精のための精液を調製する方法を含み；（６
）この操作は、所望のポリペプチドを生物学的流体または組織から精製する工程
を含み；（７）この操作は、生物学的流体または組織の濃縮を含み；（８）この
操作は、１またはそれ以上の流体、クローニングされた細胞、クローニングされ
た組織、クローニングされた臓器、および／またはクローニングされた臓器の一
部をレシピエント生体に転移させる工程を含むことができ（例えば、レシピエン
ト生体はドナー供給源とは異なる種であってよい）；（９）レシピエント生体は
人間以外であり；そして（１０）レシピエント生体は人間である、という事に関
連している。

【０１５４】 本明細書中、精液の分離に関して使用する「分離する」という語は、精液試料
を性特異的画分に分画するための当業者によく知られる方法を指すことができる
。この型の分離は市販のフローサイトメーターを用いて達成することができる。
遺伝子内容によって精子を分離するためのフローサイトメーターの利用方法は当
分野でよく知られている。さらに、精液は、当業者によく知られるその他の方法
により、性不随性質によって分離することができる。「性不随膜蛋白および子孫
が所望の性である可能性を高める方法」と題される、Spauldingの米国特許５４
３９３６２，５３４６９９０，および５０２１２４４（それぞれ１９９５年８月
８日、１９９４年９月１３日、および１９９１年６月４日登録）を参照されたく
、これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容
を本明細書の一部とする。

【０１５５】 本明細書中使用する「精製」という語は、試料中の特定のポリペプチドまたは
ポリペプチド群の比活性を増大させることを意味し得る。比活性は、標的ポリペ
プチドの活性または量と、試料中の総ポリペプチドの濃度との間の比として表現
することができる。活性は、例えば触媒活性および／または結合活性であってよ
い。また、比活性は、標的ポリペプチドの濃度および総ポリペプチドの濃度の間
の比として表現することもできる。精製方法は、透析、遠沈、およびカラムクロ
マトグラフィー技術を包含し、これらは当業者によく知られた方法である。例え
ば、Young等、1997、「トランスジェニック乳用動物の乳汁における生物薬剤学
的蛋白の産生」、BioPharm 10(6):34-38を参照されたい。

【０１５６】 本明細書中使用する「転移する」という語は、一群の細胞、組織、臓器、およ
び／または臓器の一部を動物に移動させることに関するものであってよい。細胞
、組織、臓器、および／または臓器の一部は、例えば、（ａ）インビトロで発育
させ、次いで動物に転移させ、（ｂ）クローニングされたブタ族動物から摘出し
、異なる種である別の動物に転移させ、（ｃ）クローニングされたブタ族動物か
ら摘出し、同じ種である別の動物に転移させ、（ｄ）動物の或る部分から摘出し
（例えば、動物の脚由来の細胞）、次いで同じ動物の別の部分に転移させ（例え
ば、同じ動物の脳）、そして／または（ｅ）以上の任意の組み合わせとすること
ができる。

【０１５７】 本明細書中使用する「転移する」という語は、流体、細胞、組織、および／ま
たは臓器を或る動物に添加すること、および、細胞、組織、および／または臓器
を動物から摘出し、別の供給源由来の細胞、組織、および／または臓器に交換す
ることを意味し得る。例えば、神経疾患（例えばアルツハイマー病）を治療する
ために、クローニングされたブタ族生体由来の神経組織を、人間の神経系の適当
な領域に移植することができる。別の例では、心臓または心臓の一部をクローン
ニングされたブタ族動物から摘出し、前もって心臓または心臓の一部を摘出して
おいた人間に、外科的に挿入することができる。本発明に係るこの好ましい態様
を達成するための外科的方法は、外科学において通常の知識を有する者にとって
既知である。転移方法は、細胞、組織、流体および／または臓器を、転移工程の
前にレシピエント生体から摘出する工程を包含し得る。

【０１５８】 別の態様において、本発明は、（１）（ａ）クローニングされたブタ胚を生成
するための本明細書に記載の方法のいずれか一つによる、クローニングされたブ
タ胚の製造、および（ｂ）クローニングされたブタ胚が生児出生動物へと発育す
るような、クローニングされたブタ胚の操作、という工程を含むプロセスによっ
て製造された、クローニングされたブタ族動物；および（２）（ａ）クローニン
グされたブタ胚を生成するための本明細書に記載の方法のいずれか一つによる、
クローニングされたブタ胚の製造、および（ｂ）クローニングされた哺乳動物の
胚が生児出生ブタ族動物へと発育するような、クローニングされた哺乳動物の胚
の操作、という工程を含む、ブタ族動物をクローニングするためのプロセス、を
特徴とする。

【０１５９】 好ましい態様において、（１）この操作は、胚を動物の子宮内に着床させる工
程を含むことができ；（２）その動物の発情周期は胚の発育段階と同調させるこ
とができ；そして（３）この操作は胚を人工環境内に着床させる工程を含むこと
ができる。

【０１６０】 別の態様において、本発明は、（ａ）核ドナーを卵母細胞中に転置させて核転
移卵母細胞を確立し；（ｂ）この核転移卵母細胞を非電気的に活性化してクロー
ニングされたブタ胚を確立し；そして（ｃ）このブタ胚をレシピエントの雌内部
に転移させ、そこでこのブタ胚がクローニングされたブタ族動物へと発育する、
という工程を含む、ブタ族動物をクローニングするためのプロセスを特徴とする
。

【０１６１】 好ましい態様において、（１）核ドナーは培養細胞であり、且つ本明細書に記
載の細胞型のいずれかから選択され；（２）核ドナーは全能性細胞であり；（３
）転置は融合を含み；そして（４）本方法はブタ胚をインビトロで培養する工程
を含む。ブタ胚に関して、そして特に活性化に関して本明細書に記載するその他
の好ましい態様は、いずれも本発明のこの態様に関連するものである。

【０１６２】 上に述べた本発明の要約は限定的なものではなく、本発明に係るその他の特徴
および利点は、好ましい態様についての以下の詳細な説明、および請求の範囲か
ら、明らかであろう。

【０１６３】 図面の簡単な説明 図１は、前駆細胞から全能性細胞を生成することに関する、本発明の複数の態
様を示している。この図は、全能性細胞を、胚性幹細胞、始原生殖細胞、および
動物から単離された細胞から生じさせることができるということを示している。
図１に示す前駆細胞供給源は限定的なものではなく、その他の前駆細胞供給源は
本明細書に記載した。 図２は、全能性細胞セルラインおよびクローン動物を確立するための経路に関
する本発明の複数の態様を示している。線維芽細胞は、本明細書に記載の任意の
供給源から単離することができる。 図３は、クローニングされたトランスジェニックセルラインおよびクローニン
グされたトランスジェニック動物を確立するための、本発明の複数の態様を示し
ている。

【０１６４】 （好ましい態様の詳細な記載） 本発明は、ブタなる動物に対するクローニング技術に関するものである。本発
明は、ブタなる動物のクローニング分野で現在使用されている手段および方法を
凌ぐ多様な利点を提供する。例えば、本発明は、部分的にはブタなる動物のクロ
ーニングに有用な全能性細胞に関するものである。これらの全能性細胞は、事実
上あらゆるタイプの細胞を利用することによるブタクローン動物の製造方法のも
とであり得る。例えば、生きて生まれた動物から単離された細胞は、全能性細胞
へ再プログラム化され得る。本発明のこの特徴により、既存のブタなる動物の表
現型を評価し、次いでその動物をクローニングするための全能性セルラインを容
易に樹立することが可能となる。

【０１６５】 さらに、本発明の全能性細胞により、事実上いかなるタイプの細胞からでもセ
ルラインが樹立され得る。この再プログラム化方法については本明細書で先に記
載している。これらの全能性セルラインは、核移植クローニング技術用のドナー
細胞の供給源をほぼ無制限に提供する。さらに、クローニングに使用される既存
セルラインよりもこれらのセルラインの分化速度は低いため、この特徴により、
クローニング効率が高められるという利点が提供される。例えば、胚性幹セルラ
インは、全能性ではない細胞の多数のコロニーを含み得る。本発明セルラインは
、高パーセンテージの全能性細胞を含み得る。

【０１６６】 さらに、本発明の全能性細胞、全能性クローン胚およびクローン動物を確立す
るための方法および過程によりクローニング効率が高められる。この高められた
効率は当業界における待望のニーズを満足させるものである。

【０１６７】 Ｉ．全能性ブタ細胞 Ａ．全能性細胞の確立 本発明の全能性細胞は、いかなるタイプの前駆細胞からでも製造され得る。本
発明の好ましい態様は、下記タイプの前駆細胞に関するものである。すなわち、
（１）インビトロまたはインビボで合体した２つの配偶子から生じる胚、（２）
培養胚性細胞（例、前未分化胚芽細胞および内部細胞塊細胞）から生じる胚性幹
細胞（ＥＳ細胞）、（３）胚から分離された培養および非培養内部細胞塊細胞、
（４）培養および非培養前未分化胚芽細胞、（５）培養および非培養胎児細胞、
（６）培養および非培養始原生殖細胞、（７）本明細書で定義されている培養胚
性生殖細胞（ＥＧ細胞）、（８）動物から単離された培養および非培養細胞、（
９）培養および非培養丘細胞、（１０）培養および非培養羊膜細胞、（１１）培
養および非培養胎児線維芽細胞、（１２）培養および非培養生殖隆起細胞、（１
３）培養および非培養分化細胞、および（１４）培養および非培養非分化細胞ま
たは未分化細胞。

【０１６８】 本発明全能性細胞は、好ましくはここで具体的に記載された前駆細胞から生成
される。ブタなる動物に由来する細胞は、ほぼいかなるタイプの組織からでも単
離され得る。例えば、ブタなる動物から耳穿孔標本を採取し、標本からの細胞を
解離し、それに続いて当業界における平均的技術者に熟知されている細胞培養技
術を用いることにより細胞をインビトロ培養し得る。一次培養細胞を全能性細胞
に培養するための材料および方法の例は、後記実施態様に記載されている。

【０１６９】 様々な細胞培養方法が当業界には存在する。例えば、Culture of animal cell
s：a manual of basic technique（第２版）、Freshney、著作権１９８７（Alan
R.Liss、インコーポレイテッド、ニューヨーク）参照。特に、全能性細胞の前
駆細胞である細胞、および全能性細胞それ自体は支持細胞層で培養され得る。支
持細胞層の例は、当業界の平均的技術者には熟知されており、インビトロ培養さ
れる若干の異なる細胞から生成され得る。例えば、後記実施態様および Strelch
enko、１９９６、Theriogenology ４５：１３０−１４１；Piedrahitaら、１９
９０、Theriogenology ３４：８７９−９０１；Piedrahitaら、１９９８、Biol.
Reprod. ５８：１３２１−１３２９；および Shimら、１９９７、Theriogenolog
y ４７：２４５参照（各々図式、表および図面を含め出典明示により本明細書の
一部とする）。しかしながら、全能性細胞の前駆細胞および全能性細胞それ自体
は、支持細胞層で培養される必要は無い。

【０１７０】 これらの前駆細胞に好ましい培養条件は、ここに具体的に示された量において
、かなりの量のグルコースを含む細胞培養培地である。細胞培養条件は、グルコ
ースとは異なる炭水化物を含み得、また多数のタイプの炭水化物および複合炭水
化物を含み得る。広く多様な炭水化物が当業界の通常技術者には熟知されている
。例えばシグマおよびＤＩＦＣＯカタログ参照。

【０１７１】 好ましい細胞培養条件はまた、１種またはそれ以上の抗生物質を含む細胞培養
培地に関するものである。細胞培養培地での使用に適した抗生物質は当業界では
公知である。例えば、Culture of Animal Cells: a manual of basic technique
s（第３版）、１９９４、Freshney（編）、ウィリー‐リス、インコーポレイテ
ッド；Cells： a laboratory manual（第１巻）、１９９８、Spector、Goldman
、Leinwand（編）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、およ
び Animal Cells:culture and media、１９９４、Darling & Morgan、ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ、リミテッド参照（これらは各々、図式、表および図
面を含め出典明示により本明細書の一部とする）。

【０１７２】 細胞培養条件の別の例は、一つまたはそれ以上のレシピエントリガンドを含む
細胞培養培地である。レシピエントリガンドの例は当業界の平均的技術者には熟
知されている。サイトカイン類および／または成長因子は、本発明の好ましいレ
シピエントリガンドである。例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ・カタログ（６１４マッ
キンリー・プレースＮ.Ｅ.、ミネアポリス、ミネソタ５５４１３）参照。実施態
様において、様々な量のヒト組換え白血病阻止因子（ｈｒＬＩＦ）および塩基性
ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を培養培地に加えることにより、前駆細胞
は全能性細胞に再プログラム化され得る。様々な濃度のこれら２種のサイトカイ
ンは、好ましくは１−１０００ng／mLの濃度、さらに好ましくは１０−５００ng
／mL間の濃度、および最も好ましくは約１００ng／mLの濃度で培養培地に加えら
れ得る。スチール因子の外生可溶性および膜結合形態は、前駆細胞を全能性細胞
に変換するのに必要とはされない。

【０１７３】 これらの実例は制限されていることを意味しているのではなく、サイトカイン
またはサイトカインの組み合わせは後記実施態様に記載されたものから追加また
は削除され得る。全能性細胞の生成に好ましいサイトカインは、線維芽細胞成長
因子（ＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン(cardiotrophin
)１（ＣＴ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、
オンコスタチン(oncostatin)Ｍ（ＯＳＭ）、およびＩＬ−６、ＩＬ−１１および
ＩＬ−１２を含むインターロイキン（ＩＬ）群の構成員から成る群から選択され
得る。

【０１７４】 他のサイトカイン類およびサイトカイン類以外の他の分子が後記実施態様に記
載されたレシピエントリガンドカクテルから追加または削除されることにより、
前項で記載された細胞のいずれかから全能性細胞が樹立され得る。全能性細胞生
成条件のいずれかにここで記載されたものから修正が加えられ得る。これらの修
正された全能性細胞生成条件の能力は、後記「全能性細胞の同定」項で特定され
た方法によりモニターされ得る。

【０１７５】 Ｂ．全能性細胞の同定 全能性細胞は若干の方法で同定され得る。細胞全能性に関する試験の例には、
（１）全能性細胞に特異的なマーカーの同定、 （２）細胞による１回またはそれ以上の核移植周期の遂行（後記）および生成し
た胚から動物への発達 がある。

【０１７６】 マーカーを利用することにより、非全能性細胞と全能性細胞が区別され得る。
マーカーは、低分子量マーカー、巨大分子マーカー、細胞表面マーカーおよび細
胞内マーカーから成る群から選択され得る。全能性細胞の同定に適し得るマーカ
ーの例は、アルカリ性ホスファターゼ、サイトケラチン、ビメンチン、ラミニン
およびｃ−キットから成る群から選択され得る。これらのマーカーは、当業界の
平均的技術者には熟知されており、これらの例は限定を意図したものではない。

【０１７７】 これらのマーカーの中には、全能性について同定されている培養ウシ細胞につ
いて試験されたものもある。先に記載したように、本発明の全能ブタ細胞はアル
カリ性ホスファターゼについて認め得るほどには染色し得ない。従って、本発明
細胞は、先に引用された出版物において検討された多能性細胞とは対照をなして
いる。先に例として列挙したマーカーの中には多能性細胞にも全能性細胞にも存
在し得るものがあるため、これらのマーカーの中には全能性細胞に特異的ではな
いものもあり得ることに注目すべきである。

【０１７８】 本発明は、当業界の平均的技術者には公知である全能性細胞に特異的なあらゆ
るマーカーに関するものである。当業界において明確には定義されていない全能
性に関するマーカーは、全能性細胞マーカーを解明するための例えば差展開およ
びゲノムによる方法といったプロセスにより解明され得る。全能性細胞はまた、
細胞を核酸配列含量分析（例、核酸プローブによるハイブリダイゼーション技術
）にかけることにより同定され得る。全能性細胞からの核酸試料および非全能性
細胞からの核酸試料は、特定核酸配列についてスクリーニングされ得る。非全能
性細胞からの試料が全能性細胞に存在する核酸配列を欠く場合、この核酸配列は
、非全能性細胞から全能性細胞を区別するためのマーカーであり得る。同様に、
非全能性細胞からの標本が全能性細胞には無い核酸配列を含む場合、この核酸配
列は非全能性細胞から全能性細胞を区別するためのマーカーであり得る。ポリペ
プチド分析技術（例、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体を含む方法、および当
業界公知のＨＰＬＣ技術）を利用することにより、類似方法でポリペプチドマー
カーが解明され得る。

【０１７９】 細胞全能性に関する好ましい試験では、細胞が全能性胚および事実上クローン
動物を生じるか否かを測定する。この試験は、細胞全能性に関する典型的な試験
を代表する。かかる試験の一例には、次の段階が含まれる。すなわち、（１）除
核卵母細胞による核移植のために潜在的全能性細胞を利用する、（２）生成した
サイブリッドを発達させる、（３）サイブリッドから個々の細胞へ発達した胚を
分離し、個々の細胞の１個またはそれ以上を第二ラウンドの核移植にかける、（
４）段階（３）から生成したサイブリッドを胚へ発達させる、（５）段階（２）
または（４）からの胚を子宮環境へ移植する、および（６）胚を発達させる。そ
の結果としての胎児が妊娠期間の最初のトリメスターを過ぎて成長する場合、最
初に核移植に使用される細胞は恐らく全能性細胞であると思われる。核移植に利
用される細胞が生きて生まれたクローン動物へと成長する場合、細胞は明らかに
全能性である。この典型的な試験に利用される技術（例、卵母細胞の除核および
核移植）の例は、文献および後記実施態様で十分に記載されている。

【０１８０】 全能性細胞を同定するための試験を用いて、ここに記載された材料および（方
法）に当業界の平均的技術者が修正を加えることにより、いかなるタイプの前駆
細胞からでも全能性細胞が生成され得る。このため、当業界における平均的技術
者であれば、全能性細胞同定方法と連係的にここに記載された材料および方法を
利用することにより容易に全能性細胞を製造し得るため、本発明は、ここに記載
された材料および方法並びにこれらの全能性細胞生成方法に対する修正を全て包
含する。

【０１８１】 Ｃ．永久細胞である全能性細胞の同定 上記材料および方法（例、サイトカインと共に細胞を培養する）は、非永久細
胞を永久細胞に変換させ得る。当業界には、一次細胞から永久セルラインを生成
させるため、および永久細胞を同定するための他の方法も存在する。例えば、細
胞内でテロメラーゼ活性を操作することにより細胞は不死化され得る。例えば、
Westら、１９９７年７月８日付、“Therapy and Diagnosis of Conditions Rela
ted to Telomere Length and／or Telomerase Activity”と題する米国特許第５
６４５９８６号参照、図式、図面および表を全て含め、出典明示により本明細書
の一部とする。

【０１８２】 永久細胞は、培養細胞において細胞分裂が行なわれ、細胞終結前に細胞数が倍
増する回数を測定することにより同定され得る。上記で検討されているところに
よると、永久細胞は、細胞終期前に１０回、２０回、３０回、４０回、５０回お
よび６０回にわたって倍増し得る。細胞終結を測定する材料および方法は上記で
示されている。

【０１８３】 さらに、永久細胞は、永久細胞に特異的である低分子量および巨大分子マーカ
ーの存在および／または非存在を検出することにより同定され得る。マーカーの
存在または存在欠如は、細胞不死化の決定因子であり得る。さらに、マーカーに
伴う現象は、不死性の指標であり得る。例えば、マーカーが酵素である場合、酵
素の存在を示すものおよび／またはその酵素のある種のレベルの触媒活性は、あ
る種の細胞が永久的なものであることの適当な指標であり得る。

【０１８４】 低分子量マーカーには、特異的ヌクレオシド、脂質結合シアル酸、ポリアミン
およびプソイドウリジンがある。これらの例は限定的なものではなく、本発明は
当業界において知られている他の低分子量マーカーがあればそれらも包含する。

【０１８５】 巨大分子マーカーは、核酸ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、
酵素、成長因子、成長因子レシピエント、ホルモン、ホルモンレシピエント、癌
遺伝子、癌遺伝子産物および特異的糖蛋白質を含む幾つかの種類に分けられ得る
。巨大分子マーカーは、細胞外タンパク質、膜結合タンパク質および／または細
胞内タンパク質から成る群から選択され得、これらは膜結合状態または可溶性で
あり得る。永久細胞に関する上記一マーカーは、例えばテロメラーゼまたはその
付随活性である。米国特許５６４５９８６（前出）参照。永久細胞に特異的なマ
ーカーの他の例は、下記リストから選択され得る。これらの例は限定的なもので
はなく、本発明は、当業界において知られている永久細胞に特異的なマーカーを
すべて包含するものとする。

【０１８６】 １）表皮成長因子（ＥＧＦ）およびそのレシピエント（ＥＧＦ−Ｒ） ２）トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）およびそ
のレシピエント ３）ｃ−ｅｒｂＢ２レシピエントチロシンキナーゼ（ＨＥＲ２生成物） ４）ヒアルロナンレシピエント（恐らくＣＤ４４、内在性膜糖蛋白質） ５）腫瘍マーカーの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）群（例えば、Ｔ１、グリコシル化
タンパク質） ６）テロメラーゼ、永久細胞においてテロメア長を維持するリボ核タンパク質 ７）ホスファターゼ類：胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、生殖細
胞アルカリ性ホスファターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＳ） ８）カテプシンＤ（ラミニンの分解を触媒する） ９）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（ポリアミン合成における律速
段階を触媒する） １０）ベータ−グルクロニダーゼ １１）アルファ−６インテグリン １２）ケラチンＫ８ １３）癌遺伝子産物：ｒａｓ癌遺伝子（ｋ−ｒａｓ、Ｈａ−ｒａｓ、ｐ２１）
、−ｓｒｃ、ｃ−ｍｙｃ １４）サイクリンＤ１、サイクリンＡ、および網膜芽腫遺伝子タンパク質（Ｒ
ｂ） １５）ｐ５３発現における変化またはｐ５３突然変異 １６）異種リボ核タンパク質−Ａ２（ｈｎＲＮＰ−Ａ２）過剰発現 １７）Ｌ−プラスチン １８）ガングリオシドフコシル−ＧＭ１ １９）Ｍｏｂ−１発現（ｍｏｂ−１）（前炎症性サイトカインと相同性）。

【０１８７】 当業界で公知の細胞永久性に関するマーカーに加えて、細胞永久性に関するマ
ーカーは、当業界で公知の他の方法を用いても同定され得る。例えば、細胞永久
性マーカーは、特異的永久細胞タイプに特有な特定分子（例、核酸分子およびポ
リペプチド分子）を分析することにより同定され得る。

【０１８８】 II．トランスジェニック全能性ブタ細胞 当業界の平均的技術者にとっては容易に利用可能な材料および方法を用いるこ
とにより、本発明の全能性ブタ細胞を付随的に全能性であるトランスジェニック
細胞に変換することができる。一旦核ＤＮＡが本発明全能性細胞で修飾されると
、これらの細胞から生じる胚および動物もまた修飾された核ＤＮＡを含み得る。
このため、当業界における平均的技術者にとっては容易に利用できる材料および
方法を本発明全能性細胞に適用することにより、トランスジェニック動物および
キメラ動物が製造され得る。例えば、“Transgenic Animals Secreting Desired
Proteins Into Milk”と題するＥＰＯ２６４１６６、“Isolation of Componen
ts of Interest From Milk”と題するＷＯ９４／１９９３５、“Method for Ide
ntifying Transgenic Preimplantation Embryos”と題するＷＯ９３／２２４３
２、“Transgenic Production of Antibodies in Milk”と題するＷＯ９５／１
７０８５、Hammerら、１９８５、Nature ３１５：６８０−６８５；Millerら、
１９８６、J. Endocrinology １２０：４８１−４８８；Williamsら、１９９２
、J. Ani. Sci. ７０：２２０７−２１１１；Piedrahitaら、１９９８、Biol. R
eprod. ５８：１３２１−１３２９；Piedrahitaら、１９９７、J. Reprod. Fert
.(補遺)５２：２４５−２５４；および Nottleら、１９９７、J. Reprod. Fert.
(補遺)５２：２４５−２５４参照、これらは各々、図式、図面および表を全て含
め出典明示により本明細書の一部とする。

【０１８９】 トランスジェニック細胞の製造方法は、典型的には（１）特異的ＤＮＡ配列を
細胞の核ゲノムに挿入するのに有用な適当なＤＮＡ構築物を組立て、（２）ＤＮ
Ａ構築物を細胞へトランスフェクションし、（３）ランダム挿入および／または
相同的組換えを行わせるといった段階を含む。この過程から生じる修飾は、標的
ゲノムへの適当なＤＮＡ構築物（複数も可）の挿入、標的ゲノムからのＤＮＡの
削除、および／または標的ゲノムの突然変異であり得る。

【０１９０】 ＤＮＡ構築物は、興味の対象である遺伝子並びに多様なエレメント、例えば調
節プロモーター、インスレーター、エンハンサーおよびリプレッサーおよびＤＮ
Ａ構築物から転写されたＲＮＡにリボソーム結合するためのエレメントを含み得
る。ＤＮＡ構築物はまた、本明細書で先に同定された、リボザイムおよびアンチ
センスＤＮＡおよび／またはＲＮＡをコード化し得る。これらの例は当業界にお
ける平均的技術者には熟知されており、限定を意味するものではない。

【０１９１】 調節エレメントに関するＤＮＡ配列と連係的に利用できる有効な組換えＤＮＡ
技術およびデータベースおよび商業セクターで容易に利用できる遺伝子故に、当
業界における平均的技術者であれば、ここに記載された材料および方法を用いて
トランスジェニック細胞の樹立に適したＤＮＡ構築物を容易に生成し得る。

【０１９２】 トランスフェクション技術は、当業界における平均的技術者には熟知されてお
り、細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクションを実施するための材料および
方法は市販されている。例えば、細胞をＤＮＡ構築物によりトランスフェクショ
ンするのに使用され得る材料は、親油性化合物、例えばリポフェクチン（商標）
、スーパーフェクト（商標）、リポＴＡＸＩ（商標）およびＣＬＯＮフェクチン
（商標）である。特定親油性化合物を誘導することにより、細胞へのＤＮＡ構築
物のトランスフェクションを仲介するためのリポソームが形成され得る。さらに
、当業界において公知であるカチオンベースのトランスフェクション剤を用いる
ことにより、核酸分子で細胞をトランスフェクションし得る（例、燐酸カルシウ
ム沈降）。また、当業界で公知の電気穿孔技術を利用することにより、核酸分子
を細胞へ移すことができる。さらに、当業界で公知の粒子ボンバード技術を用い
ることにより、外生ＤＮＡを細胞へ導入することができる。ＤＮＡ構築物からの
標的配列は、ＤＮＡ構築物の合理的設計により核ゲノムの特異領域へ挿入され得
る。これらの設計技術および方法は、当業界における平均的技術者には熟知され
ている。米国特許５６３３０６７、“Method of Producing a Transgenic Bovin
e or Transgenic Bovine Embryo”、DeBoerら、１９９７年５月２７日付、米国
特許５６１２２０５、“Homologous Recombination in Mammalian Cells”、Kay
ら、１９９７年３月１８日付、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２２４３２、“Meth
od for Identifying Transgenic Pre-Implantation Embryos”参照、各々、図式
、図面および表を全て含め出典明示により本明細書の一部とする。一旦所望のＤ
ＮＡ配列が細胞の核ゲノムへ挿入されると、挿入領域の位置および目的ＤＮＡ配
列が核ゲノムへ挿入されている頻度は、当業界専門技術者に熟知された方法によ
り確認され得る。

【０１９３】 一旦一導入遺伝子または複数の導入遺伝子が全能性細胞の核ゲノムへ挿入され
ると、その細胞はトランスジェニック動物をクローニングするための核ドナーと
して使用され得る。トランスジェニック動物に関する具体例の説明は、後記でよ
り詳細に記載されている。

【０１９４】 Ａ．病気および寄生体 所望のＤＮＡ配列を細胞の核ＤＮＡへ挿入することにより、特定寄生体、病気
および感染源に対するクローン化トランスジェニック動物の抵抗力を高めること
ができる。寄生体の例には、寄生虫、ハエ、ダニおよびノミがある。感染源の例
には細菌、真菌およびウイルスがある。病気の例には、萎縮性鼻炎、コレラ、レ
プトスピラ症、仮性狂犬病およびブルセラ症がある。これらの例は限定的なもの
ではなく、本発明は当業界で公知の病気または寄生体または感染源をすべて包含
する。例えば、Hagan & Bruners Infectious Diseases of Domestic Animals（
第７版）、Gillespie & Timoney、著作権１９８１（コーネル・ユニバーシティ
ー・プレス、イサカ、ニューヨーク）参照。

【０１９５】 導入遺伝子は、病気または寄生体状態の徴候を完全に排除または部分的に軽減
することにより、または寄生体または病気を制御するタンパク質を製造すること
により特定寄生体または疾患に対する抵抗性を付与し得る。

【０１９６】 Ｂ．ＤＮＡ構築物のエレメントおよびＤＮＡ構築物の製造 宿主の性質により、広く多様な転写および翻訳調節配列が使用され得る。転写
および翻訳調節シグナルは、ウイルス性供給源、例えばアデノウイルス、ウシ乳
頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルスなどから誘導され得、
調節シグナルは高レベルの発現潜在性を有する特定遺伝子配列を伴う。別法とし
て、哺乳類発現産物、例えばアクチン、カゼイン、アルファ−ラクトアルブミン
、ウロプラキン、コラーゲン、ミオシンなどからのプロモーターが使用され得る
。転写調節シグナルは、遺伝子産物の発現が変調され得るように抑制または活性
化させるものが選択され得る。興味の対象は、外部因子、例えば化学物質または
薬剤により抑制または開始され得る調節シグナルである。これらの例は限定的な
ものではなく、本発明は調節エレメントを全て包含する。調節エレメントの他の
例はここに記載されている。

【０１９７】 Ｃ．好ましい組換え産物の例 様々なタンパク質およびポリペプチドは、トランスジェニック細胞の作製に適
したＤＮＡ構築物内に含まれる遺伝子によりコード化され得る。それらのタンパ
ク質またはポリペプチドには、ホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポ
タンパク質、レシピエント、薬剤、医薬、バイオシューティカル（bioceutical
）、機能性食品、癌遺伝子、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、ウイ
ルス性抗原、寄生体抗原、細菌性抗原および化学合成ポリマーおよび化学的、細
胞および／または酵素的プロセスにより生合成および／または修飾されたポリマ
ーがある。これらの化合物の具体例には、プロインシュリン、インシュリン、成
長ホルモン、アンドロゲンレシピエント、インシュリン様成長因子Ｉ，インシュ
リン様成長因子II、インシュリン成長因子結合タンパク質、上皮成長因子、ＴＧ
Ｆ−α、ＴＧＦ−β、皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）、血管新生因子（例、酸性線維
芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子およびアンギオゲニン）、血管新生
阻害因子（例、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）、マトリックスタンパ
ク質（IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、ラミニン）、癌遺伝子（ｒａｓ、ｆ
ｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ、ｊｕｎ）、Ｅ６またはＥ７トランスフ
ォーミング配列、ｐ５３タンパク質、サイトカインレシピエント、ＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、α、βまたはγＩＦＮ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、
ウイルスのキャプシドタンパク質、およびウイルス、細菌および寄生体由来のタ
ンパク質がある。発現され得る他の特異的タンパク質またはポリペプチドには、
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１−アンチトリプシン、コレステロー
ル−７α−ヒドロキシラーゼ、先端切除アポリポタンパク質Ｂ、リポタンパク質
リパーゼ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ１、ＬＤＬレシピエン
ト、酸化リポタンパク質に関するスカベンジャーレシピエント、各々の分子変異
体、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせがある。他の例は、モノクローナル抗体
、抗体フラグメント、凝固因子、アポリポタンパク質、薬剤、腫瘍抗原、ウイル
ス性抗原、寄生体抗原、モノクローナル抗体および細菌性抗原である。当業界の
一専門技術者であれば、これらのタンパク質が広く多様な種類のタンパク質に属
すること、およびこれらの種類の範囲内またはこれらの種類の範囲外における他
のタンパク質も使用され得ることは容易に認めるはずである。これらは単なる例
に過ぎず、いずれにしても限定を意味するものではない。

【０１９８】 また、ＤＮＡ構築物から細胞へ組込まれる遺伝物質には、（１）標的細胞には
通常存在しない核酸配列、（２）標的細胞に通常存在するが、顕著な生理学的レ
ベルでは発現されない核酸分子、（３）標的細胞に通常存在し、生理学的目的レ
ベルで正常に発現される核酸配列、（４）標的細胞で発現させるために修飾され
得る他の核酸配列、および（５）上記のいずれかの組み合わせが含まれることに
注目すべきである。

【０１９９】 さらに、ＤＮＡ構築物は細胞の核ＤＮＡへ組込まれ得、そこで組込まれたＤＮ
Ａはリボ核酸分子に転写され得、特異領域で他のＲＮＡ分子を開裂し得る。ＲＮ
Ａ分子を開裂し得るリボ核酸分子は、当業界ではリボザイムと称される。リボザ
イムはそれ自体ＲＮＡ分子である。リボザイムは、ＲＮＡ分子における別々の領
域に結合し得、次いでその結合領域内または結合領域に隣接した領域を特異的に
開裂し得る。それによって、リボザイム技術は、先の無傷のメッセージＲＮＡ分
子から翻訳されるポリペプチドの量を減少させ得る。

【０２００】 さらに、ＤＮＡ構築物は、細胞の核ＤＮＡへ組込まれ、転写時特異的ＲＮＡま
たはＤＮＡ配列の両方に結合し得るＲＮＡを製造し得る。核酸配列はアンチセン
ス技術で利用され得、メッセージ（ｍＲＮＡ）に結合し、これらのメッセージの
翻訳を遮断する。それによって、アンチセンス技術は、細胞における特定ポリペ
プチドの合成を遮断または部分的に遮断し得る。

【０２０１】 III．核移植 非全能性細胞を用いる核移植（ＮＴ）技術は、当業界における平均的技術者に
は熟知されている。例えば、１９８７年５月１２日付、McGrath & Solter、“Nu
clear Transplantation in the Mammalian Embryo by Microsurgery and Cell F
usion”米国特許第４６６４０９７号、米国特許４９９４３８４（Pratherら）、
および５０５７４２０（Masseyら）参照、これらは各々図式、表および図面を全
て含め、出典明示により本明細書の一部とする。実施態様により、全能性ブタ胚
を有効に製造し得るＮＴ技術が明らかにされている。

【０２０２】 Ａ．核ドナー 本発明全能性細胞は、クローン胚を生成するためのＮＴ方法における核ドナー
として使用され得る。上記で記載されたところによると、全能性細胞は、ほぼい
かなるタイプの細胞からでも生成され得る。ＮＴ技術の場合、ドナー細胞は、増
殖中の細胞塊から分離されるか、一次細胞培養から単離されるか、またはセルラ
インから単離され得る。全細胞は、レシピエント卵母細胞の卵黄周囲空間に入れ
られ得るかまたは、核ドナーを針へ吸引し、針をレシピエント卵母細胞へ入れ、
核ドナーを放出し、卵母細胞の原形質膜をあまり破壊すること無く針を除去する
ことにより直接レシピエント卵母細胞へ注入され得る。また、核（例、核質）は
、核ドナーから単離され、レシピエント卵母細胞の卵黄周囲空間へ入れられ得る
かまたは例えばレシピエント卵母細胞へ直接注入され得る。

【０２０３】 Ｂ．レシピエント卵母細胞 レシピエント卵母細胞は、典型的にはその卵質の一部が除去された卵母細胞で
あり、その場合除去された卵質は卵母細胞核を含んでいる。除核技術は当業界に
おける平均的技術者には熟知されている。例えばNagashimaら、１９９７、Mol.R
eprod.Dev. ４８：３３９−３４３、Nagashimaら、１９９２、J.Reprod.Dev.３
８：３７−７８、Pratherら、１９８９、Biol.Reprod.４１：４１４−４１８、P
ratherら、１９９０、J.Exp.Zool．２５５：３５５−３５８、Saitoら、１９９
２、Assis.Reprod.Tech.Andro. ２５９：２５７−２６６、およびTerlouwら、１
９９２、Theriogenology ３７：３０９参照、これらは各々、図式、表および図
面を全て含め出典明示により本明細書の一部とする。

【０２０４】 卵母細胞は、当業界において公知であり本明細書に記載されている卵管採取方
法または経膣卵母細胞採取方法により生きている動物の卵管および／または卵巣
から単離され得る。さらに、卵母細胞は死んだ動物から摘出され得る。例えば、
卵巣は屠殺場から入手され得、卵母細胞はこれらの卵巣から吸引され得る。卵母
細胞はまた、殺されたばかりの動物の卵巣から、または卵巣が冷凍および／また
は解凍されたときに分離され得る。

【０２０５】 卵母細胞は、当業界における平均的技術者には熟知されている様々な培地で成
熟し得る。卵母細胞の成熟に適したかかる培地の一例は、後記実施態様に記載さ
れている。卵母細胞は、３９℃で５％ＣＯ_２を含む環境内のこのタイプの培地に
おいてよい状態で成熟し得る。卵母細胞は低温保存され、次いで成熟培地に卵母
細胞を置く前に解凍され得る。細胞および胚に関する低温保存方法は、ここで検
討されているように当業界では公知である。

【０２０６】 卵母細胞成熟培地の成分は、卵母細胞成熟を阻止する分子を含み得る。かかる
成分の例は、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）およびイソブチルメチルキ
サンチン（ＩＢＭＸ）である。ＩＢＭＸは、卵母細胞を可逆的に阻止することが
報告されているが、阻止維持効率は全く低い。例えば、Rose‐HellkantおよびBa
vister、１９９６、Mol.Reprod.Develop. ４４：２４１−２４９参照。しかしな
がら、卵母細胞は、有効濃度のＩＢＭＸ中３１℃で卵母細胞をインキュベーショ
ンすることにより比較的高い効率で胚小胞段階で抑止され得る。好ましくは、卵
母細胞を集めている全期間、卵母細胞をインキュベーションする。卵母細胞成熟
に適したＩＢＭＸの濃度は、０.０１ミリモル〜２０ミリモルのＩＢＭＸ、好ま
しくは０.０５ミリモル〜１０ミリモルのＩＢＭＸ、およびさらに好ましくは約
０.１ミリモルＩＢＭＸ〜約０.５ミリモルＩＢＭＸ、および最も好ましくは０.
１ミリモルＩＢＭＸ〜０.５ミリモルＩＢＭＸである。

【０２０７】 核ドナー細胞およびレシピエント卵母細胞は、同じ種または異なる種から生じ
得る。例えば、全能ブタ細胞は、ブタ除核卵母細胞へ挿入され得る。別法として
、全能イノシシ細胞は、家畜化ブタ卵母細胞へ挿入され得る。いかなる核ドナー
／レシピエント卵母細胞の組み合わせでも本発明に包含される。好ましいのは、
同種からの核ドナーおよびレシピエント卵母細胞である。交差種間（cross-spec
ies）ＮＴ技術を利用することにより、絶滅の危機に瀕しているかまたは絶滅し
たクローン動物が製造され得る。

【０２０８】 卵母細胞は、核ドナーがレシピエント卵母細胞へ導入される前、間および／ま
たは後に電気的および／または非電気的手段により活性化され得る。例えば、卵
母細胞は、核ドナーとの融合前に非電気的活性化に適した１種またはそれ以上の
成分を含む培地に置かれ得る。また、サイブリッドは、非電気的活性化に適した
１種またはそれ以上の成分を含む培地に置かれ得る。活性化過程は後記でかなり
詳細に検討されている。

【０２０９】 Ｃ．注射／融合 当業界における平均的技術者に熟知されている様々な材料および方法を用いて
、核ドナーは卵母細胞へ移され得る。一例では、核ドナーは、レシピエント卵母
細胞へ直接注射され得る。この直接注射は、核ドナーを針へ徐々に引入れ、その
針でレシピエント卵母細胞を穿刺し、核ドナーを卵母細胞へ放出させ、その膜を
あまり破壊することなく針を卵母細胞から除去することにより達成され得る。当
業界において、そして本明細書に引用されている出版物により具体的に特定され
ているところによると、適当な針はガラス毛細管から形成され得る。

【０２１０】 別の例では、当業界における平均的技術者に熟知されている技術を利用するこ
とにより、核ドナーおよびレシピエント卵母細胞からの原形質膜の少なくとも一
部分を一緒に融合させ得る。Willadsen、１９８６、Nature ３２０：６３−６５
参照、これは図式、表および図面を全て含め、出典明示により本明細書の一部と
する。典型的には、先にそして出典明示により本明細書の一部とされる他の出版
物で特定されたところによると、脂質膜は電気的および化学的手段により一緒に
融合され得る。

【０２１１】 細胞融合の非電気的手段の例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および
／またはセンダイウイルスを含む溶液中でサイブリッドをインキュベーションす
る。広範な分子量のＰＥＧ分子が細胞融合に利用され得る。

【０２１２】 ここで明確に検討されているわけではない融合過程は、過度の実験を行わなく
ても測定され得る。例えば、細胞融合技術に対する修正は、顕微鏡下で細胞融合
の程度を観察することによりそれらの効率についてモニターされ得る。次いで、
生成した胚はクローン化され、選択マーカー試験および／または動物発達試験を
含み得る、全能性細胞の同定について本明細書で先に記載した方法と同じ方法に
より全能性胚として同定され得る。

【０２１３】 Ｄ．活性化 卵母細胞およびサイブリッド活性化方法は、当業界における平均的技術者には
公知である。米国特許５４９６７２０、“Parthenogenic Oocyte Activation”
、Susko-Parrishら（１９９６年３月５日付）参照、これは図式、表および図面
を全て含め、出典明示により本明細書の一部とする。

【０２１４】 電気的および非電気的方法は、細胞（例、卵母細胞およびサイブリッド）の活
性化に使用され得る。非電気的活性化手段の使用は必ずしも必要というわけでは
ないが、特に若い卵母細胞がレシピエントとして使用されるとき、非電気的活性
化によりサイブリッドの発達潜在性が高められ得る。

【０２１５】 細胞活性化の電気的技術の例は当業界ではよく知られている。１９９８年４月
２３日公開、Piedraheidraおよび Blazer、ＷＯ９８／１６６３０（図式、表お
よび図面を全て含め出典明示により本明細書の一部とする）、および米国特許４
９９４３８４および５０５７４２０参照。非電気的細胞活性化手段には、細胞分
裂の確率を増加させる当業界公知の方法が全て含まれ得る。核ドナーおよび／ま
たはレシピエントを活性化する非電気的手段の例は、細胞をエタノール、イノシ
トール三リン酸（ＩＰ_３）、Ｃａ^２＋イオノホアおよびプロテインキナーゼ阻害
剤、例えば６−ジメチルアミノプリン、温度変化、タンパク質合成阻害剤（例、
シクロヘキサミド）、ホルボールエステル、例えばホルボール・１２−ミリステ
ート・１３−アセテート（ＰＭＡ）、機械的技術、タプシガルギン（thapsigarg
in）および精液因子に導入することにより達成され得る。精液因子は、細胞分裂
の確率を高める精液の成分を全て包含し得る。他の非電気的活性化方法には、一
細胞または複数の細胞を低温刺激および／または機械的ストレスにかける方法が
ある。

【０２１６】 好ましいプロテインキナーゼ阻害剤の例は、プロテインキナーゼＡ、Ｇおよび
Ｃ阻害剤、例えば６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、スタウロスポリン、
２−アミノプリン、スフィンゴシンである。チロシンキナーゼ阻害剤もまた、細
胞の活性化に利用され得る。

【０２１７】 本明細書で明確に検討されているわけではない活性化材料および方法は、後記
および米国特許第５４９６７２０号記載の典型的プロトコルで特定された具体的
条件を修正することにより確認され得る。

【０２１８】 活性化方法の修正により得られる活性化効率および全能性は、「全能性細胞の
同定」と題する項で前述した方法により同定され得る。全能性胚の同定方法は、
１種またはそれ以上の試験、例えば（ａ）胚における全能性細胞に関する特異マ
ーカーの同定、および（ｂ）胚を発達させて動物に至らせることにより胚が全能
であるか否かを測定する試験を含み得る。従って、本明細書記載の活性化方法に
対する修正についてここでは明確に説明され得ないが、本発明はこれらの修正を
全て包含している。

【０２１９】 Ｆ．核移植から得られる胚の操作 ＮＴ過程から得られる胚は、様々な方法で操作され得る。本発明は少なくとも
１回のＮＴから得られるクローン胚に関するものである。本発明の実施態様は、
２回またはそれ以上のＮＴ方法により全能性胚の製造効率が高められ得ることを
立証している。実施態様は、クローン全能性胚の製造方法に２回またはそれ以上
のＮＴ処置を組み入れることにより、胎盤の発達が促進され得ることを示してい
る。さらに、全能性胚の製造方法に含まれるＮＴ周期の数を増やすことにより、
非全能性細胞から全能性細胞へ変換するのに必要な因子が示され得る。生成した
胚の全能性に対する２回またはそれ以上のＮＴ周期組み入れ効果は驚くべき結果
であり、当業界において以前に確認または調査されたことはなかった。

【０２２０】 クローン化全能性胚方法に２回またはそれ以上のＮＴ周期を組入れることによ
り、さらに別の利点が提供され得る。クローン全能性胚の確立方法へ多数のＮＴ
処置を組み入れることにより、クローン全能性胚数を増加させる方法が提供され
る。

【０２２１】 多数のＮＴ処置をクローン全能性胚の形成に利用するとき、ある一定期間成熟
させた卵母細胞が１回目、２回目または後続ＮＴ処置におけるレシピエントとし
て利用され得る。例えば、初回ＮＴおよび２回目のＮＴが遂行される場合、最初
のＮＴは、約５３時間成熟させた卵母細胞をレシピエントとして利用し得、２回
目のＮＴは、約５３時間より短時間熟成させた卵母細胞をレシピエントとして利
用し得る。別法として、初回ＮＴは、約５３時間熟成させた卵母細胞をレシピエ
ントとして利用し得、２回目のＮＴは、約５３時間より長時間熟成させた卵母細
胞を２周期ＮＴ法のレシピエントとして利用し得る。さらに、両ＮＴ周期とも、
約５３時間熟成させた卵母細胞をレシピエントとして利用し得、両ＮＴ周期とも
約５３時間より短時間熟成させた卵母細胞をレシピエントとして利用し得、そし
て両ＮＴ周期とも約５３時間よりも長時間成熟させた卵母細胞を２周期ＮＴ法に
おけるレシピエントとして利用し得る。

【０２２２】 ２回またはそれ以上のＮＴ周期を組み入れたＮＴ技術の場合、１回またはそれ
以上のＮＴ周期に活性化段階が先行、後続および／または同時に実施され得る。
本明細書で先に記載されたところによると、活性化段階は、本明細書記載の電気
的および／または非電気的手段により遂行され得る。後記実施態様は、一ＮＴ周
期後に活性化段階を組み入れたＮＴ技術について記載している。しかしながら、
活性化段階はまた、ＮＴ周期と同時期（例、ＮＴ周期と同時）に実施され得、お
よび／または活性化段階はＮＴ周期前に実施され得る。ＮＴ周期から得られるク
ローン全能性胚は、（１）分離されるかまたは（２）そのままさらに発達し得る
。

【０２２３】 胚が分離される場合、分離胚誘導細胞は培養細胞の樹立に利用され得る。いず
れのタイプの胚性細胞でも培養細胞の樹立に利用され得る。これらの培養細胞は
、科学文献において胚性幹細胞または胚性幹様細胞と称されることもある。胚性
幹細胞は、初期胚、桑実胚および胚盤胞段階胚から誘導され得る。培養胚性細胞
製造に関する多数の方法が当業界における平均的技術者に知られている。これら
の方法は、本明細書で先に引用された具体的な参考文献で列挙されている。

【０２２４】 胚を胎児に子宮内で発達させる場合、発達中の胎児から分離された細胞は、培
養細胞の樹立に利用され得る。好ましい態様において、始原生殖細胞、生殖隆起
細胞および胎児線維芽細胞は、かかる胎児から分離され得る。ここに記載された
特定形態を有する培養細胞は、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）と称され得る。これら
の培養細胞は、当業界における平均的技術者に熟知された培養方法を使用するこ
とにより樹立され得る。かかる方法は、先に本明細書で引用された出版物で列挙
され、ここで検討されている。

【０２２５】 ＮＴから得られるクローン全能性胚はまた、胚を低温保存および／または解凍
することにより操作され得る。例えば、Nagashimaら、１９８９、Japanese J.An
im.Reprod.３５：１３０−１３４および Fengら、１９９１、Theriogenology３
５：１９９参照、これらは各々表、図式および図面を全て含め出典明示により本
明細書の一部とする。他の胚操作方法には、インビトロ培養方法、母性レシピエ
ントへの胚移入の遂行、ＮＴプロセスのための割球分離、ＮＴ方法で使用される
セルラインを樹立するための割球または内部細胞塊細胞の分離、胚分裂方法、胚
凝集方法、胚雌雄決定方法および胚生検方法がある。具体例としての操作方法は
限定を意味するわけではなく、本発明は当業界における平均的技術者に公知の胚
操作方法を全て包含するものとする。

【０２２６】 IV．クローン胚の発達 Ａ．全能性胚の同定 全能性胚は、「全能性細胞の同定」と題する項で記載された方法により同定さ
れ得る。個々の細胞は分離され、同様の試験に付され得る。試験は、例えばマー
カーの存在または非存在の確認に関するものである。また、全能性胚は、妊娠の
初めのトリメスターを過ぎるまで、または好ましくは生きて生まれた動物へと成
長するまで、胚を発達させることにより同定され得る。また、全能性に関するマ
ーカーの同定方法も本明細書に記載されている。

【０２２７】 Ｂ．胚のインビトロ培養 ここで検討されているクローニング方法は、雌性レシピエントへの移植前に細
胞および胚をインビトロ培養するという利点を提供する。胚のインビトロ培養方
法は、当業界の技術者には熟知されている。例えば、Nagashimaら、１９９７、M
ol.Reprod.Dev.４８：３３９−３４３、Petters & Wells、１９９３、J．Reprod
.Fert.(補遺)４８：６１−７３、Reedら、１９９２、Theriogenology ３７：９
５−１０９、およびDobrinskyら、１９９６、Biol.Reprod.５５：１０６９−１
０７４参照、各々、図式、表および図面を全て含め出典明示により本明細書の一
部とする。さらに、クローン胚のインビトロ培養に適した培地に関する実施態様
については後述されている。支持細胞層は、クローン胚のインビトロ培養に利用
される場合もあれば利用されない場合もあり得る。支持細胞については、前記お
よび後記実施態様で記載されている。

【０２２８】 Ｃ．胚の子宮内成長 クローン胚は、ＮＴ処置および胚インビトロ培養過程後に人工または自然子宮
環境で培養され得る。人工的発達環境の実例は開発されており、中には当業界の
技術者に知られているものある。人工的環境の成分は、例えば一成分または複数
成分の量を改変することにより、および胚の成長速度をモニターすることにより
修正され得る。

【０２２９】 また、動物の子宮へ胚を移植する方法は、先に検討したように、当業界ではよ
く知られている。好ましくは、胚（複数も可）の発達段階は、動物の発情周期と
相関関係を示す。

【０２３０】 ある種からの胚を、別種からの動物の子宮環境中に入れることができる。例え
ば、ウシの胚がヒツジの卵管で成長し得ることが当業界において示された。Stic
e & Keefer、１９９３、“Multiple generational bovine embryo cloning”、B
iology of Reproduction ４８：７１５−７１９。本発明は、他のあらゆる有蹄
動物子宮環境におけるブタ胚の組み合わせを全て包含する。交差種間（cross-sp
ecies）子宮内成長法により、絶滅の危機に瀕する種のクローン動物が有効に製
造され得る。例えば、イノシシ胚は家畜雌ブタの子宮で成長し得る。

【０２３１】 一旦胚が雌性レシピエントの子宮中に入れられると、胚は分娩日まで成長し得
る。別法として、胚はそのまま子宮で成長し、次に選択された時点で除去され得
る。生まれる前に子宮から胎児を取り出す外科的方法は当業界ではよく知られて
いる。

【０２３２】 Ｖ．ブタクローン動物 本明細書で前述したところによると、本発明は、動物のクローニング前にその
動物の表現型を評価できるという利点を提供する。多様な産物がクローン動物か
ら分離され得る。例えば、精液は、ブタなる動物、例えば家畜雄ブタから採集さ
れ得る。精液は低温保存され得る。精液はまた、精液の性特異フラクションへ分
離され得る。Spaulding、各々１９９５年８月８日、１９９４年９月１３日およ
び１９９１年６月４日付け、“Sex‐associated Membrane Proteins and Method
s for Increasing the Probability that Offspring Will be of a Desired Sex
”と題する米国特許第５４３９３６２、５３４６９９０および５０２１２４４号
参照、これらは各々、図式、図面および表を含め出典明示により本明細書の一部
とする。先に検討した通り、精液を集める方法は、当業界における平均的技術者
にはよく知られている。

【０２３３】 さらに、本発明は、一つには、ブタクローン動物から集められた産物に関する
ものである。これらの産物は、動物から分離された体液または器官、または体液
または器官から分離された産物であり得る。好ましい態様において、産物、例え
ば肉はブタクローン動物から集められ得る。別の態様において、本発明は、去勢
動物であるブタなる動物の表現型を決定し、次いで、クローン動物が再生機能を
もち、精液の製造に使用され得るように、この動物をクローニングする操作に関
するものである。本発明の他の好ましい態様は、本発明クローン動物から採取さ
れた異種移植物質、精液、胚、卵母細胞、あらゆるタイプの細胞および子孫とい
った産物に関するものである。

【０２３４】 本明細書で前述されている異種移植物質は、一生物体から抽出され、別の生物
体に移された細胞物質を全て包含し得る。一生物体から細胞物質を抽出し、それ
を別の生物体へ移植する医学的方法は、当業界における平均的技術者には熟知さ
れている。好ましい異種移植細胞物質の例は、肝臓、肺、心臓、神経、胆嚢およ
び膵臓細胞物質から成る群から選択され得る。

【０２３５】 前項で検討されているところによると、トランスジェニック動物は、当業界に
おける平均的技術者には熟知されているトランスジェニック技術を用いることに
より本発明方法から生成され得る。好ましくは、ブタクローン化トランスジェニ
ック動物は、これらの方法により製造される。これらのクローントランスジェニ
ック動物がそれらに特有な病気または寄生体に抵抗力または部分的抵抗力をもつ
ように上記動物は遺伝子操作され得る。これらの病気および寄生体の例は前項で
概説されている。

【０２３６】 さらに、クローン化トランスジェニック動物が組換え産物を製造するように、
それらは遺伝子操作され得る。組換え産物の例は前項で概説されている。これら
の産物の発現は、この目的の達成に適したプロモーターエレメントおよび調節エ
レメントを選択的に操作することによりクローン化トランスジェニック動物内の
特定細胞または領域へ指向され得る。

【０２３７】 例えば、ヒト組換え産物は、組換え産物をコード化するＤＮＡ配列にウロプラ
キンプロモーターを機能し得るように結合することにより、畜牛の尿で発現され
得る。別法として、ウシなる動物の乳においてヒト組換え産物を選択的に発現さ
せる実例は、当業界の平均的技術者に熟知されている。

【０２３８】 一旦組換え産物または複数の同産物がクローン化トランスジェニック動物の特
定組織または体液中で発現されると、適当な組織または体液が当業界で公知の方
法を用いて採取され得る。組換え産物は、当業界における平均的技術者に熟知さ
れた標準精製技術を用いることにより体液または組織から精製され得る。

【０２３９】 （実施例） 以下の実施例は、本発明の様々な態様と特徴の非制限的な例でありそして単な
る代表例に過ぎない。

【０２４０】 実施例１．フィーダー細胞層の調製 胎仔線維芽細胞のフィーダー細胞層が、妊娠１０から２０日目のマウス胎仔か
ら調製された。頭部、肝臓、心臓、及び消化管が摘出され、残りの臓器が洗浄さ
れ、そして０．０５％トリプシンと０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇibco BRL カタ
ログ番号 15400-096）中、３７℃でインキュベートされた。ルーズな細胞は、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、１０％ ウシ胎仔血清、及び０．１ｍＭ ２-
メルカプトエタノールが補充されたＭＥＭ-アルファを含有する組織培養皿中で
培養された。フィーダー細胞培養は、３７．４℃、３．５％ ＣＯ_２、及び湿潤
した空気において２から３週間以上かけて樹立された。フィーダー細胞として利
用される前に、マウス線維芽細胞は、３時間、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなる
ようにマイトマイシンＣ（Caobiocem カタログ番号 47589）で前処置され、予め
平衡化された成長培地を添加する前にＰＢＳで５回洗浄された。 フィーダー細胞は、培養ブタ胎仔線維芽細胞を樹立するために、後述されるよ
うにブタ胎仔から樹立される。

【０２４１】 実施例２：胚以外の組織からの培養核ドナー細胞の樹立 本明細書中で明確にされた物質及び方法により提供される利点の１つは、実質
的には如何なる種類の前駆細胞からも全能細胞を樹立することが可能となること
である。

【０２４２】 １．ウシ胎仔組織からの培養細胞の樹立 生殖隆起細胞がウシ胎仔から単離されて、タンパク分解酵素（プロナーゼＥあ
るいはトリプシン）により分解された。該生殖隆起細胞から直接形成されるＥＧ
細胞の形態を有する細胞は消化されるが、マウスのフィーダー細胞層（実施例１
参照）上に樹立されるときにはより早く成長する。細胞培養用培地への成長因子
、ｈｒＬＩＦ及びｂＦＧＦの添加は、ＥＧ細胞の樹立と増殖にはほとんど影響を
与えない。ＥＧ細胞の増殖速度は、１７ｍＭ Ｄ−グルコースが培養用培地に注
入されたときは増加した。細胞培養用培地は、アルファ−ＭＥＭ、１０％ ウシ
胎仔血清、及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有した。

【０２４３】 ３３、３６、４７、及び５４日齢の胎仔が生殖隆起細胞の始原として使用され
た。３３、３６、及び４７日齢の胎仔からのＥＧ細胞を樹立するのはずっと困難
で、一般に成長が遅かった。細胞培養が３３、３６、及び４７日齢の胎仔から単
離された生殖隆起細胞から樹立されるときには、ＥＧ細胞は、他の細胞種、典型
的には線維芽細胞のような伸長細胞により過成長された。対照的に５４日齢の胎
仔からのＥＧ細胞は、比較的早く成長し１−２週間以内に大きなコロニーを形成
した。ＥＧ細胞は他の競合する細胞種から物理的に単離され、本明細書中に記述
されている形態である、典型的なＥＧ細胞の形態をもつ明らかに１種類の細胞種
からなる単層としてコンフルエントになるまで育てられる。

【０２４４】 ２．培養ブタ卵丘細胞の樹立 卵丘細胞は、体外で成熟されたブタ卵丘−卵母細胞複合体から単離された。卵
巣由来の卵丘−卵母細胞複合体は、屠殺場から回収され、ブタの成熟培地（後述
）にて成熟させた。卵丘−卵母細胞複合体を１５ｍｌの遠心チューブ中に５００
μＬ ＴＬ ＨＥＰＥＳと一緒に入れ、その内容物をボルテクスミキサーを用い
て攪拌（ハーフスピードで３分間攪拌）することにより卵丘細胞は、卵丘−卵母
細胞複合体から剥ぎ取られた。

【０２４５】 攪拌された卵丘−卵母細胞複合体からできる細胞懸濁液は、１０ｍＬのＴＬ
ＨＥＰＥＳで２回洗浄した後、ペトリ皿に移された。ペトリ皿は顕微鏡下におか
れ、卵母細胞が、その細胞懸濁液から内径の小さなピペットを用いて手作業で摘
出された。

【０２４６】 卵母細胞が細胞懸濁液から摘出されると、残った卵丘細胞が１５ｍＬ 遠心チ
ューブ中に入れられた。そのチューブは遠心分離機に入れられ、卵丘細胞のペレ
ットにされた。ペレット状にされた卵丘細胞は、６０ｍｍ 組織培養皿中にＭＥ
Ｍ−アルファ、１０％ ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール
及びアリコートを含有する５ｍＬの培養用培地中に、およそ２５，０００細胞／
ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。 卵丘細胞は基本的な細胞培養技術を用いて培養された。細胞培養用培地は、３
−４日毎に交換され、卵丘細胞はコンフルエントになると継代された。

【０２４７】 ３．培養ブタ羊水細胞の樹立 羊水は、指導されている針技術を用いて妊娠中の雌性ブタから回収される。羊
水は１５ｍＬ コニカルチューブ中に移され、１０００ｘｇで１０分間遠心分離
される。細胞ペレット上の１ｍＬの液を残して上清の液が除去される。その細胞
ペレットは、その１ｍＬの羊水中に再懸濁される。０．５ｍＬの羊水細胞サンプ
ルがＴ２５ 培養フラスコ中において４．５ｍＬの完全なＡｍｉｎｏＭａｘ培地
（９０ｍＬのAmnioMax-C100 Basal 培地＋１５ｍＬのAmnioMax−C100添加物［Gi
bco BRL〕）に添加され、３９℃の温度で５％ＣＯ_２を含有する空気を有するイ
ンキュベーター内に置かれる。

【０２４８】 羊水細胞は、約４日以内に培養フラスコに接着する。羊水細胞培養は、典型的
には７−１４日以内に７０％コンフルエントとなった。細胞はフラスコから細胞
培養用培地を除去し、ＥＢＳＳ培地あるいはＰＢＳ培地（カルシウムあるいはマ
グネシウムなし、Gibco BRL）で細胞を２回洗浄することによって継代される。
０．２ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Gibco BRL）が培養フラスコに添加さ
れ、細胞が培養フラスコ表面から遊離されるまで３９℃でインキュベートされる
。培養フラスコ表面から細胞が遊離した後、細胞培養用培地がフラスコに添加さ
れてトリプシンが不活性化し、細胞は３つの新しいＴ２５フラスコに分配された
。

【０２４９】 ４．培養ブタ胎仔線維芽細胞の樹立 培養ブタ胎仔線維芽細胞は、妊娠３３から５４日目のブタ胎仔から調整された
。頭部、肝臓、心臓、及び消化管が摘出され、残りの臓器が洗浄され、そしてＣ
ａ^２＋とＭｇ^２＋フリーのダルベッコのＰＢＳ（Gibco BRL カタログ番号 14190
-151）で希釈された０．０５％ トリプシンと０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（Gibco
BRL カタログ番号 15400-096）中において３７℃でインキュベートされた。ルー
ズな細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ ウシ胎仔血清（Hyclon
e カタログ番号 SH3007.03）、及び０．１ｍＭ ２-メルカプトエタノール（Gib
co BRL カタログ番号 21985-023）が補充されたＭＥＭ-アルファ（Gibco BRL カ
タログ番号 32561-037）を含有する組織培養皿中で培養された。ブタ胎仔の細胞
は、３７．４℃、３．５％ ＣＯ_２、及び湿潤した空気で２から３週間以上かけ
て樹立された。

【０２５０】 ５．成熟動物由来の培養ブタ線維芽細胞の樹立 成長した動物の組織から全能細胞を樹立するための最初のステップは、単離さ
れた細胞の初代培養を樹立することである。これに続く方法は耳パンチサンプル
に関するが、この方法は如何なる種類の組織から単離された細胞にも適用可能で
ある。以下に示すステップは、好ましくは、無菌方法を用いて行われる。 １．各耳サンプルを別々の２つの３５ｍｍ ペトリ皿中において２ｍＬのトリ
プシン／ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄する。各耳サンプルは別々に処理する。２ｍＬ
のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を含有する３５ｍｍ ペトリ皿中において、滅菌の
ハサミとメスを用いて耳サンプルを細かく切る。細かく切られた断片は径が１ｍ
ｍ以下であるのが好ましい。 ２．細かく切られた耳片は、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液中で４０−５０分間、
３７℃インキュベーター内で時々回旋させながらインキュベートする。トリプシ
ン／ＥＤＴＡ溶液は、詳細に後述されている。皿は、パラフィルム（登録済）の
ような伸縮性のある材料でＣＯ_２の蓄積を減らすためにラップされていてもよい
。 ３．消化された耳サンプル片を１５ｍＬ 滅菌チューブに移す。消化された耳
切片を２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて回収するために皿を洗浄し、
この洗浄溶液を該滅菌チューブに移す。 ４．該チューブを２分間ハイスピードで攪拌する。 ５．５ｍＬの細胞培養用培地（下記で定義された）添加し該トリプシンを不活
性化する。 ６．該１５ｍＬチューブを２８０ｘｇで１０分間遠心分離する。 ７．容器を傾けて上清を除去し、チューブの側面を軽く叩くことによって残っ
た溶液中に細胞片を再懸濁する。 ８．２ｍＬの細胞培養用培地を該チューブに添加し、その後ステップ６に示さ
れるように遠心分離する。 ９．容器を傾けて上清を除去し、ステップ（７）で示されるように細胞片を再
懸濁させ、その後、２ｍＬの培養液を添加する。 １０．ＤＮＡ分析用に２−３片の耳サンプルを残して２ｍＬチューブ中に−８
０℃で保存する。 １１．３５ｍｍ 培地皿中に再懸濁された細胞を移し、湿潤した５％ＣＯ_２／
９５％空気中３７℃でインキュベートする。 １２．２−４日毎に培地交換する。

【０２５１】 トリプシン／ＥＤＴＡ溶液は、その溶液が０．０５％ トリプシン（ｗ／ｖ）
及び０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを含有するようトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Gibco
BRL カタログ番号 15400-096）をＣａ^２+フリー及びＭｇ^２+フリーのダルベッコ
のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Gibco BRL カタログ番号 14190-151）と混
合することによって調製された。該溶液は０．２μｍのフィルターで濾過するこ
とにより滅菌された。

【０２５２】 細胞培養用培地は最小必須ＭＥＭ−アルファ（Gibco BRL カタログ番号 32561
-037）、１０％ ウシ胎仔血清（Hyclone #SH30070.03）、０．１ｍＭ ２-メル
カプトエタノール（Gibco BRL カタログ番号 21985-023）、１００Ｕ／ｍＬ ペ
ニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬ アム
ホテルシンＢ（Fungizone）を混合することにより調製された。

【０２５３】 実施例３：培養ブタ細胞のプログラム変更 実施例２で教示される方法により樹立された培養細胞が、明確に全能でなけれ
ば、細胞は以下の方法によりプログラム変更が可能となる。 生殖隆起細胞懸濁液（最終濃度が１００，０００細胞／ｍｌ）がマウス初期胚
線維芽細胞のフィーダー層を含有している３５ｍｍ ペトリ皿中に入れられた。
培養用培地は、３７．５℃で最小必須ＭＥＭ−アルファ（Gibco BRL カタログ番
号 32561-037）、１０％ ウシ胎仔血清（Hyclone カタログ番号 SH30070.03）
、０．１ｍＭ ２-メルカプトエタノール（Gibco BRL カタログ番号 21985-023
）、１００ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え白血病抑制因子（hrLIF；R&D System カタロ
グ番号 250-L）、１００ｎｇ／ｍｌ ウシ塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；R&
D System カタログ番号 133-FB）、及び５％ＣＯ_２でなければならない。外因性
の幹細胞成長因子(steel factor)（例えば、膜結合型幹細胞成長因子及び可溶性
幹細胞成長因子）は該培地に補充される必要がない。

【０２５４】 １００ｎｇ／ｍＬ ｈｒＬＩＦ、及び１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦが補充され
た培養用培地は、典型的には１０から１４日間、前駆細胞と一緒にインキュベー
トされる。補充培地は２-４日毎にフレッシュな補充培地と取り換えられる。こ
の培養方法においてはいつでも、ＥＧ細胞が観察され得る。これらＥＧ細胞が細
胞培養から単離され、別に培養されて同種のＥＧ細胞培養を樹立させることが可
能である。

【０２５５】 ＥＧ細胞株を維持するため、高密度の集団細胞が１：４から１：８の希釈率で
毎週継代される。０．０５％ トリプシン-０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ混合物でそ
れら細胞をインキュベートし、フレッシュな成長培地での新しい培養の準備をす
ることにより、細胞は継代される。インシュリン−トランスフェリン、亜セレン
酸ナトリウム培地添加物（Sigma カタログ番号 11884）を１：１００に希釈され
るようにその細胞培養用培地に加えることにより全能細胞に対するＭＥＭ−アル
ファ培地の成長促進能を増強させることが可能である。マイコプラズマの混入に
対する予防手段として酒石酸チロシン（Sigma カタログ番号 T3151）を用いた短
期間培養が行われる。ＮＴ前に細胞株は、マイコプラズマ配列に特異的なＤＮＡ
プライマー（Stratagene カタログ番号 302007）を用いて行われるＰＣＲによる
マイコプラズマの存在が検討された。

【０２５６】 実施例４：卵母細胞の成熟 １．卵母細胞の吸引と回収 雌ブタの卵巣が２５℃で研究室に運ばれ、すぐに０．９％ 生理食塩水で洗浄
された。減圧吸引が４５ｍＬ／ｍｉｎの流速で調節された減圧吸引システムに連
結された１８ゲージの針と５０ｍＬチューブを用いて３−６ｍｍの卵胞が、減圧
吸引された。吸引後、卵母細胞は、５−１０分間で安定させた。卵胞液（ｐＦＦ
）は吸引され、必要であれば成熟系で利用するように取っておかれた。

【０２５７】 卵母細胞は、２０ｍＬ Ｈｅｐｅｓ−ＰＶＡ培地中で再懸濁することによって
洗浄され、その後卵母細胞を安定させた。培地は除去され、洗浄のステップが２
回以上繰り返された。Ｈｅｐｅｓ−ＰＶＡ培地は、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍ
Ｍ ＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＮａＨＣＯ _３ 、０．３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２ｍＭ ソルビト
ール、０．２ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．０５μＬ／ｍＬ ゲンタマイシ
ン、０．０７ｇ／Ｌ ペニシリンＧ、０．１ｇ／Ｌ ポリビニルアルコール、及
び２ｍＬ／Ｌ 乳酸ナトリウムを含有し、ｐＨ７．４である。洗浄された卵母細
胞はその後、成熟培地中に入れられた。

【０２５８】 ２．体外成熟 卵母細胞は、成熟培地中で３回洗浄され、２０−２２時間の間に５０卵母細胞
／ウェルが、４ウェルのプレート中の０．５ｍＬのホルモンが含有された成熟培
地に移された。更に、６−８卵胞殻片（follicle shell pieces）が該ウェルに
添加されるが、その卵胞殻片の添加は、付加的なものである。これら卵胞殻片は
、ブタ卵母細胞の細胞質成熟を改善することが知られており、これにより卵母細
胞の発育能が増大する結果となる。例えば、Abeydeere他、1998、Biol. Reprod.
58：213−218参照。

【０２５９】 成熟培地は、１０９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、
１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、６ｍＭ
グルコース、１ｍＭ グルタミン、１２ｍＭ ソルビトール、５ｍｇ／Ｌ イ
ンシュリン、１００ＩＵ／Ｌ ペニシリンＧ、及び５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマ
イシンを含有しｐＨ７．４である。ブタ卵胞液（ｐＦＦ）は、約１０％（ｖ／ｖ
）の濃度で該成熟培地中に添加可能である。またβ−メルカプトエタノールが５
０μＭの最終濃度まで成熟培地に添加可能である。更に、システインが最終濃度
が０．６ｍＭまで成熟培地に添加可能である。ホルモン入りの成熟培地は、１０
ｎｇ／ｍＬ 上皮細胞成長因子、１０Ｕ／ｍＬ ウマ絨毛性生殖腺刺激ホルモン
、１０Ｕ／ｍＬ ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン、及び１ｍＭ ｄｂ−ｃＡＭＰ
を含有していた。

【０２６０】 卵母細胞と卵胞殻片はその後、０．５ｍＬのフレッシュな成熟培地に移され、
付加的に２０−２２時間成熟されたが、ここでの成熟培地は、ホルモンあるいは
ｄｂ−ｃＡＭＰを含有していなかった。卵母細胞は５．０％ ＣＯ_２空気中３９
℃で合計で４０−４４時間成熟された。

【０２６１】 実施例５：核移植 成熟の４２−４６時間後、卵母細胞が約２分間成熟卵母細胞を攪拌することに
より卵丘細胞から剥ぎ取られた。攪拌後、卵母細胞が、極体形成速度に対して評
価された。極体形成速度は実体顕微鏡を用いた視覚的検査により評価可能である
。３μｇ／ｍＬ ヘキスト３３４４２と７．５μｇ／ｍＬ サイトカラシンＢを
含有する培地中で約２０分間卵母細胞を染色することにより極体形成速度の視覚
的な評価を高めることが可能である。卵母細胞はその後、除核用のピペットで除
核された。

【０２６２】 卵母細胞が除核された後、ＮＴ方法が実施された。それぞれのＮＴ方法におい
て核ドナー細胞が、相互に接触しているそれぞれの細胞に対する細胞膜の部分と
核ドナーが卵母細胞の透明体に適合するように卵母細胞に適合させて配置された
。ブタＥＧ細胞、培養ブタ生殖隆起細胞、培養ブタ線維芽細胞、培養ブタ卵丘細
胞、及び成熟４８時間した後に卵丘−卵母細胞複合体から分離された卵丘細胞が
、ＮＴ方法に対する核ドナーとして使用された。

【０２６３】 核ドナーが除核された卵母細胞に適合させて配置された後、その２つの細胞は
融合された。細胞を融合するのに３つの培地が使用され得る。：（１）０．２５
Ｍ ソルビトール、０．１ｍＭ ＣａＯＡｃ、０．１ｍＭ ＭｇＯＡｃ、及び０
．１％ ＢＳＡ；（２）０．３Ｍ マンニトール、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０
．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び０．１％ ＢＳＡ；（３）０．３Ｍ マンニトール
、５％ ＴＬ Ｈｅｐｅｓ、及び０．３％ ＢＳＡ；及び（４）チンマーマン培
地。融合後、融合された卵母細胞は、１０９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、
２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１ｍＭ
ＫＨ_２ＰＯ_４、６ｍＭ グルコース、１ｍＭ グルタミン、７ｍＭ タウリン、
５ｍＭ ヒポタウリン、０．４％ ＢＳＡ、１００ＩＵ／Ｌ ペニシリンＧ、及
び５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシンを含有しｐＨ７．４である培養液中に４時
間置かれた。融合された卵母細胞はまた、ＣＲ２培地（アミノ酸が補充されたＣ
Ｒ１培地）中で培養されることも可能であり、後者は米国特許番号第5、096、822
号、「Bovine embryo medium」、Rosenkrans Jr他、November 3、1992に記載さ
れており、これにより全ての図、表、記述を含みそのまま引用により本明細書中
に組み込まれてる。

【０２６４】 実施例６：活性化 融合後４時間培養されてから、融合された卵母細胞は、１０μＭ イオノマイ
シンを含むＺＩ溶液（ＴＬ Ｈｅｐｅｓストック＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で
８分間インキュベートされ、その後、Ｚ３０溶液（ＴＬ Ｈｅｐｅｓストック＋
３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）中で８分間リンスされた。ＴＬ Ｈｅｐｅｓストックは
、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、０．３ｍＭ
ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、２ｍｌ／Ｌ 乳酸ナトリウム、及び１ｍｌ／Ｌ フェノールレッド
を含有し、７．４のｐＨであった。

【０２６５】 卵母細胞がＴＬ Ｈｅｐｅｓ ＰＶＡで３回洗浄され、その後ＢＳＡ入りのＣ
Ｒ２培地の２ｍＭ ＤＭＡＰ溶液の中に５．０％ＣＯ_２空気中、３９℃で４時間
置かれた。続いて活性化がおこり、活性化された卵母細胞が、ＴＬ Ｈｅｐｅｓ
ＰＶＡで３回リンスされ、ブタ胎仔培養用培地中に入れられた。

【０２６６】 実施例７：活性化された卵母細胞及び胚の体外培養 ＤＭＡＰ溶液の除去後、活性化された卵母細胞と細胞質雑種は、ＴＬ Ｈｅｐ
ｅｓ ＰＶＡ中で３回洗浄され、ブタ胚培養用培地中に４日間置かれた。胚培養
用培地は、１０９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、６ｍＭ グ
ルコース、１ｍＭ グルタミン、１２ｍＭ ソルビトール、５ｍｇ／Ｌ インシ
ュリン、１００ＩＵ／Ｌ ペニシリンＧ、及び５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシ
ンを含有しｐＨ７．４であった。活性化された卵母細胞と細胞質雑種はまた、Ｃ
Ｒ２培地で培養されることも可能である。４日目に胚は卵割が認められ、付加的
に３日間１０％ ウシ胎仔血清（ｖ／ｖ）が補充されたフレッシュな胚培養用培
地へ移される。７日目に胎仔は、胚盤胞まで成長が認められる。

【０２６７】 実施例８．再クローニング方法 １つあるいは複数の付加的な再クローニングサイクルが、核ドナー細胞の全能
性を高めるために実施されることも可能である。再クローニングサイクルにおい
て、最初のＮＴサイクルからの胚は、その胚が桑実胚の段階にある時に、サイト
カラシンＢによる処置後、プロナーゼＥ（ＴＬ ＨＥＰＥＳ中１−３ｍｇ／ｍＬ
）により、あるいは機械的に脱凝集される。脱核された卵母細胞（実施例４に教
示されるように成熟後５２−５４時間）の囲卵腔中に１つ割球が置かれる。

【０２６８】 １つの割球は、３０℃で等張ソルビトール溶液（０．２５Ｍ）中、１５μｓに
対して１０５Ｖの電気パルスで５００μｍのチャンバ中での電気融合により脱核
された卵母細胞へ融合される。該融合された卵母細胞が再クローニングサイクル
に対して化学的な活性化を受けることは必要とされない。

【０２６９】 卵母細胞融合後、２回目のＮＴサイクルからの融合された卵母細胞は、３９℃
で５％ ＣＯ_２を含んだ湿潤した空気下、胚培養用培地で培養される。そのよう
な胚は雌性レシピエントに移植されることが可能となる。

【０２７０】 実施例９：母体レシピエントへのブタ胚移植及びクローンブタの発育 １０頭のブタに性腺刺激ホルモン（ＰＧ６００（登録商標））が注射され、そ
の結果、およそ２−５頭のレシピエントにおいて処置後３−５日間発情を示した
。同調されたブタは発情の３日目あるいは５日目のいずれかにおいて胚移植のた
めに利用される。初期胚（＜８細胞期）が発情３日目のレシピエントに移植され
、後期胚（＞８細胞期）は、発情５日目の別途レシピエントに移植された。動物
は、麻酔され、腹側中央部切開術が施され、生殖器官が露出される。胚移植手順
は、寄託される３０−５０の初期胚の卵管中への移植、あるいは後期胚（桑実胚
及び／あるいは胚盤胞期の胚）の子宮角中への移植からなる。レシピエントは、
妊娠が開始したかどうか検討され、弱い超音波検査により継続的に監視される。

【０２７１】 実施例１０：遺伝子組換えブタのクローニング 遺伝子組換えブタクローンを確立するのに適切な遺伝子組換え細胞は、成熟動
物から単離される細胞から調製されることが可能である。図３は、そのような遺
伝子組換え細胞を確立するのに利用されることが可能である方法を図示している
。本発明の教示を用いることにより、ほぼどんな種類の細胞からも遺伝子組換え
細胞が確立可能であるが、図３は、遺伝子組換え胚性未分化細胞、及び遺伝子組
換え全能細胞を確立する方法を図示している。

【０２７２】 線維芽細胞培養は、前述されるようにブタから抽出された耳パンチから樹立さ
れ得る。加えて培養された繊維芽細胞は豚胎仔から樹立可能である。個々の細胞
は、この細胞培養から単離され、核移植方法における核ドナーとして利用可能で
ある。１回の核移植サイクルあるいは複数回の核移植サイクルが適用可能である
。他の付加的なステップは前記の実施例において示されている。

【０２７３】 細胞はその後、ＤＮＡ作成物と形質導入されらことが可能である。細胞は、図
３に示されるように複数のステップで形質導入され得る。遺伝子組換え細胞を調
製する物質と方法は、前記で引用された刊行物に示されている。本発明に係る全
能細胞は、（ａ）抗生物質耐性遺伝子；（ｂ）蛋白質あるいは蛋白質群をコード
しているＤＮＡ配列；及び（ｃ）プロモーター要素あるいは要素群、を含むＤＮ
Ａと形質導入されることが可能である。形質導入細胞は、抗生物質を含有する細
胞培養用培地の選択により遺伝子組換え修飾に選択される。遺伝子組換え細胞は
、その後１つあるいは複数のスクリ−ニング技術を用いて遺伝子組換え修飾がス
クリーニングされる。これら技術の例としては：（１）ポリメラーゼ鎖反応、（
２）サザンブロッティング、（３）ファイバー−ＦＩＳＨ法がある。これら技術
は一般的な当業者には良く知られている。後ろ２つの技術は、胚性生殖細胞の核
ＤＮＡ中に挿入された遺伝子配列の複製数を検討するのに利用可能である。

【０２７４】 これらスクリーニング法は、図３に示されたいずれのステップにおける形質導
入細胞にも適用可能である。遺伝子組換え動物クローンは、実施例５に示される
ようにＮＴ法における核ドナーとして遺伝子組換え細胞を利用することにより確
立される。そのような方法により作成される融合卵母細胞は、遺伝子組換えブタ
クローンの作成のため実施例６、７、及び９、そして付加的に８に教示される方
法に用いられる。

【０２７５】 本発明は、当業者が該発明を実施し利用するよう十分詳細に記載され例示され
ているが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、変更、修飾、改良ができ
ることが明らかである。

【０２７６】 当業者は、目的を実行しそして言及された目的と利点だけでなく、そこにある
本質的な目的と利点を得るよう本発明を十分に適応させることを容易に理解する
。細胞株、胚、動物及びそれらを作る手順や方法は、好ましい実施例により示さ
れ、例示され、そして本発明の範囲を制限するような意図はない。これらの修飾
は本発明の精神の範囲に包含され、そして本発明の請求の範囲により明確にされ
る。 本発明の範囲と精神から逸脱することなく、本明細書中に開示された本発明に
対して、様々な置換及び修飾がなされ得ることが、当業者には容易に明らかであ
る。

【０２７７】 本明細書に記述されるすべての特許、及び刊行物は、本発明が関する一般的な
当業者の水準で示されている。それぞれ１つ１つの刊行物が特異的に、そして個
々に示されて引用によって本明細書中に組み込まれているのと同じ程度に、すべ
ての特許、及び刊行物が引用によって本明細書中に組み込まれている。

【０２７８】 本明細書中に説明的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていな
い要素あるいは複数の要素、制限あるいは複数の制限もなく、実施されてもよい
。したがって例えば、本明細書中のいずれの場合においても「含んでいる」「か
ら本質的に成る」及び「から成る」のいずれの用語も、他の２つの用語のいずれ
にも置き換えられ得る。使用されてきた用語や表現は、限定する用語ではなく記
述の用語として使用され、そのような言葉や表現の使用において、示された、及
び記載された特徴、あるいはその特徴の一部と同等のものを排除する意図はない
が、本発明の請求項の範囲内で様々な修飾が可能であることをが認識される。し
たがって、本発明は好ましい実施の形態と付加的な特徴により明確に開示されて
いるが、本明細書中に開示されている内容の修飾や変形が、当業者によって採用
されてもよく、そのような変更や変形は、添付請求項で明確にされた本発明の範
囲内にあると考えられるものと理解されるべきである。

【０２７９】 更に、本発明の特徴あるいは態様がマーカッシュ形式のグループに関して記述
されている場合、当業者は、マーカッシュ形式のグループの個々の構成要素、あ
るいはサブグループの構成要素のいずれに関しても、本発明がそのマーカッシュ
形式のグループによりまた記述されることを認識する。例えば、Ｘが、臭素、塩
素、及びヨウ素からなるグループから選択されるとして示されているならば、Ｘ
が臭素である請求項とＸが臭素と塩素である請求項とは、完全に記述されている
ことになる。 他の実施の形態は、以下に続く請求項の範囲内で述べられている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、前駆細胞から全能性細胞を生成することに関する、本発
明の複数の態様を示している。この図は、全能性細胞を、胚性幹細胞、始原生殖
細胞、および動物から単離された細胞から生じさせることができるということを
示している。図１に示す前駆細胞供給源は限定的なものではなく、その他の前駆
細胞供給源は本明細書に記載した。

【図２】 図２は、全能性細胞セルラインおよびクローン動物を確立するた
めの経路に関する本発明の複数の態様を示している。線維芽細胞は、本明細書に
記載の任意の供給源から単離することができる。

【図３】 図３は、クローニングされたトランスジェニックセルラインおよ
びクローニングされたトランスジェニック動物を確立するための、本発明の複数
の態様を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エリック・ジェイ・フォーズバーグ アメリカ合衆国53575ウィスコンシン州フ ィッチバーグ、ナイアガラ・コート5707番 (72)発明者 マイケル・ディ・ビショップ アメリカ合衆国53960ウィスコンシン州リ オ、ホール・ロード・ダブリュー4628番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA07 CA01 DA02 GA18 GA30 HA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC20 BA08 BB15 BB34 BC41 BD41 BD44 CA41 CA44 CA60

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全能性細胞が培養されたものである、全能性ブタ細胞。
2. 【請求項２】 細胞が胚生殖細胞の形態を有する、請求項１記載の全能性ブ
   タ細胞。
3. 【請求項３】 （ａ）少なくとも１個の前駆細胞を分離し、 （ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養し、そして （ｃ）刺激因子を前駆細胞へ導入することにより、前駆細胞を全能性ブタ細胞
   に変換させる 段階を含む方法により製造される、全能性ブタ細胞。
4. 【請求項４】 ａ）１個またはそれ以上の前駆細胞を分離し、そして （ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養することにより、全能性ブタ細胞を樹立
   する 段階を含む方法により製造される全能性ブタ細胞であって、胚生殖細胞形態を有
   するブタ全能性細胞。
5. 【請求項５】 刺激因子がレシピエントリガンドカクテルを含む、請求項４
   記載の全能性ブタ細胞。
6. 【請求項６】 前駆細胞が、非胚性細胞、分化細胞、線維芽細胞、胎児細胞
   、胎児線維芽細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、胚性細胞、丘細胞、羊膜細胞
   および肝細胞から成る群から選択される、請求項３または４記載の全能性ブタ細
   胞。
7. 【請求項７】 ブタ細胞が修飾核ＤＮＡを含む、請求項１、２、３または４
   記載の全能性ブタ細胞。
8. 【請求項８】 ブタ細胞がアルカリ性ホスファターゼに関して認め得るほど
   には染色されない、請求項１、２、３または４記載の全能性ブタ細胞。
9. 【請求項９】 ブタ細胞に操作が加えられている、請求項１、２、３または
   ４記載の全能性ブタ細胞。
10. 【請求項１０】 細胞培養培地が支持細胞を含む、請求項３または４記載の
    全能性ブタ細胞。
11. 【請求項１１】 細胞培養培地がかなりの濃度のグルコースを含む、請求項
    ３または４記載の全能性ブタ細胞。
12. 【請求項１２】 かなりの濃度のグルコースが、１０ミリモルを越えるグル
    コースである、請求項１１記載の全能性ブタ細胞。
13. 【請求項１３】 かなりの濃度のグルコースが、約１７ミリモルのグルコー
    スである、請求項１２記載の全能性ブタ細胞。
14. 【請求項１４】 細胞培養培地が１つまたはそれ以上の支持細胞を含む、請
    求項３または４記載の全能性ブタ細胞。
15. 【請求項１５】 （ａ）少なくとも１個の前駆細胞を分離し、 （ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養し、そして （ｃ）刺激因子を前駆細胞へ導入することにより、前駆細胞を全能性ブタ細胞
    に変換させる 段階を含む、全能性ブタ細胞の製造方法。
16. 【請求項１６】 ａ）１個またはそれ以上の前駆細胞を分離し、そして （ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養することにより、全能性ブタ細胞を樹立
    する 段階を含む、全能性ブタ細胞の製造方法であって、全能性ブタ細胞が胚生殖細胞
    形態を有している方法。
17. 【請求項１７】 胚が全能性であり、胚が全能性細胞から生じる、クローン
    化ブタ胚。
18. 【請求項１８】 胚が全能性であって、核ドナーおよび卵母細胞間の核移植
    を含む方法により製造され、この場合核ドナーが全能性ブタ細胞であり、卵母細
    胞が胚を形成させ得る段階にある、クローン化ブタ胚。
19. 【請求項１９】 核移植が全能性ブタ細胞および卵母細胞の活性化を含む、
    請求項１８記載のクローン化ブタ胚。
20. 【請求項２０】 （ａ）核ドナーを卵母細胞へ転移させることにより核移植
    卵母細胞を確立させ、そして （ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりブタ胚を確立させる 段階を含む方法により製造される、クローン化ブタ胚。
21. 【請求項２１】 胚の１つまたはそれ以上の細胞が修飾核ＤＮＡを含む、請
    求項１７、１８または２０記載のクローン化ブタ胚。
22. 【請求項２２】 卵母細胞が核ドナーの種とは異なる種に由来する、請求項
    １８または２０記載のクローン化ブタ胚。
23. 【請求項２３】 転移が核ドナーおよび卵母細胞の融合段階を含む、請求項
    ２０記載のクローン化ブタ胚。
24. 【請求項２４】 非電気的活性化が、 （ａ）卵母細胞における２価カチオンの細胞内レベルを増加させ、そして （ｂ）卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化を低減化する ことを含む、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
25. 【請求項２５】 非電気的活性化が、イオノマイシンおよびＤＭＡＰを核移
    植胚へ導入する段階を含む、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
26. 【請求項２６】 イオノマイシンが約１０マイクロモルであり、ＤＭＡＰが
    約２ミリモルである、請求項２３記載のクローン化ブタ胚。
27. 【請求項２７】核ドナーが、胚生殖細胞、および胚性幹細胞、丘細胞、羊膜
    細胞、非胚性細胞、分化細胞、線維芽細胞、胎児細胞、胎児線維芽細胞、始原生
    殖細胞、生殖隆起細胞、胚性細胞、分化細胞、未分化細胞および肝細胞から成る
    群から選択される、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
28. 【請求項２８】 胚に操作が加えられる、請求項１７、１８または２０記載
    のクローン化ブタ胚。
29. 【請求項２９】 操作にクローン化ブタ胚のインビトロ培養が含まれる、請
    求項２８記載のクローン化ブタ胚。
30. 【請求項３０】 操作に、適当な有蹄動物の子宮へのクローン化ブタ胚の移
    植が含まれる、請求項２８記載のクローン化ブタ胚。
31. 【請求項３１】 操作が、 （ａ）クローン化ブタ胚を１個またはそれ以上の個々の細胞に分離し、そして （ｂ）（ｉ）（ａ）の個々の細胞、および （ii）卵母細胞 間で少なくとも１回の後続核移植を遂行する 段階を含む、請求項２８記載のクローン化ブタ胚。
32. 【請求項３２】 核ドナーおよび卵母細胞間における核移植を含む、クロー
    ン化ブタ胚の製造方法であって、核ドナーが全能性ブタ細胞であり、卵母細胞が
    胚形成させ得る段階にある方法。
33. 【請求項３３】 （ａ）核ドナーを卵母細胞に転移させることにより核移植
    卵母細胞を確立し、および （ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりブタ胚を確立させる 段階を含む、クローン化ブタ胚の製造方法。
34. 【請求項３４】 請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
    、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１のいずれか１項記載の胚から
    生じるブタクローン動物。
35. 【請求項３５】 （ａ）請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
    、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１のいずれか１項記載の
    クローン化ブタ胚を製造し、および （ｂ）発達して動物となるようにクローン化ブタ胚に操作を加える 段階を含む方法により製造されるブタクローン動物。
36. 【請求項３６】 （ａ）核ドナーを卵母細胞へ転移させることにより、核移
    植卵母細胞を確立し、 （ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりクローン化ブタ胚を確立し、そ
    して （ｃ）ブタ胚を雌レシピエントへ移植し、そこでブタ胚が発達してブタクロー
    ン動物となる 段階を含む方法により製造されるブタクローン動物。
37. 【請求項３７】 動物の１個またはそれ以上の細胞が修飾核ＤＮＡを含む、
    請求項３４、３５または３６記載のブタクローン動物。
38. 【請求項３８】 （ａ）ブタ動物から少なくとも一成分を単離し、そして （ｂ）その成分を別の動物へ移入する 段階を含み、上記成分が、体液、細胞、組織および器官から成る群から選択され
    る、ブタクローン動物の使用方法。
39. 【請求項３９】 体液が精液である、請求項３８記載の方法。
40. 【請求項４０】 器官が、神経組織、脳組織、脾臓、心臓、肺、胆嚢、膵臓
    、精巣、卵巣および腎臓から成る群から選択される、請求項３８記載の方法。
41. 【請求項４１】 （ａ）請求項３２または３３記載の方法によりクローン化
    ブタ胚を製造し、そして （ｂ）発達して動物になるようにクローン化ブタ胚に操作を加える 段階を含む、ブタクローン動物の製造方法。
42. 【請求項４２】 （ａ）核ドナーを卵母細胞に転移させることにより核移植
    卵母細胞を確立し、 （ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりクローン化ブタ胚を確立し、そ
    して （ｃ）ブタ胚を雌レシピエントへ移入し、そこでブタ胚が発達してブタクロー
    ン動物となる 段階を含む、ブタクローン動物の製造方法。