JP2002526552A - ジンクフィンガー反応性抗菌化合物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は細菌ＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガー中の亜鉛と相互作用する抗菌化合物、そのような化合物のスクリーニング法、およびポリメラーゼ活性または細菌増殖を阻害するためにそのような化合物を使用する方法に関している。
Description
【０００１】技術分野 本発明はＤＮＡポリメラーゼおよび抗菌化合物に関している。
【０００２】背景技術 グラム陽性真正細菌（Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）
には多くのヒト院内軟組織感染（ｈｕｍａｎ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｓｏｆｔ
−ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）の原因となる多数のヒト病原体（黄色
ブドウ球菌を含んで）が含まれる。他の普通の真正細菌と同様に、グラム陽性真
正細菌はその増殖および複製にＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを絶対的に必要とする
。
には多くのヒト院内軟組織感染（ｈｕｍａｎ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｓｏｆｔ
−ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）の原因となる多数のヒト病原体（黄色
ブドウ球菌を含んで）が含まれる。他の普通の真正細菌と同様に、グラム陽性真
正細菌はその増殖および複製にＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを絶対的に必要とする
。
【０００３】 １９７２年に発見されているが、真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩＩ）はＤＮＡ複製に関与する主たるポリメラーゼ酵素であり、従って、細胞
分裂に必須である。二つのクラスのｐｏｌＩＩＩが知られている。
ＩＩＩ）はＤＮＡ複製に関与する主たるポリメラーゼ酵素であり、従って、細胞
分裂に必須である。二つのクラスのｐｏｌＩＩＩが知られている。
【０００４】 グラム陽性ｐｏｌＩＩＩは最初にグラム陽性真正細菌枯草菌で発見されたので
そのように命名された。その後、グラム陽性ｐｏｌＩＩＩはｐｏｌＣ遺伝子によ
りコード化されていることが認められた。ｐｏｌＣ遺伝子産物は一般的に約１４
３０−１４６０アミノ酸長のポリペプチドであり、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ部位およびポリメラーゼ部位の両方を統合する。グラム陽性ｐｏｌＩＩＩは”
ＨＰＵｒａ”型と称される阻害性ｄＧＴＰ類似体に独特の感受性を持っている（
Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６７：１４５４
，１９７０）。
そのように命名された。その後、グラム陽性ｐｏｌＩＩＩはｐｏｌＣ遺伝子によ
りコード化されていることが認められた。ｐｏｌＣ遺伝子産物は一般的に約１４
３０−１４６０アミノ酸長のポリペプチドであり、３’−５’エキソヌクレアー
ゼ部位およびポリメラーゼ部位の両方を統合する。グラム陽性ｐｏｌＩＩＩは”
ＨＰＵｒａ”型と称される阻害性ｄＧＴＰ類似体に独特の感受性を持っている（
Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６７：１４５４
，１９７０）。
【０００５】 グラム陰性ｐｏｌＩＩＩは最初にグラム陰性真正細菌大腸菌で発見されたので
そのように命名された。グラム陰性ｐｏｌＩＩＩはｄｎａＥ遺伝子によりコード
化されており、典型的には１１５５−１１６５アミノ酸長であり、ポリメラーゼ
部位のみを含んでおり、ＨＰＵｒａ様化合物には完全に不感性である。
そのように命名された。グラム陰性ｐｏｌＩＩＩはｄｎａＥ遺伝子によりコード
化されており、典型的には１１５５−１１６５アミノ酸長であり、ポリメラーゼ
部位のみを含んでおり、ＨＰＵｒａ様化合物には完全に不感性である。
【０００６】 グラム陰性真正細菌のゲノムは明らかにｄｎａＥを含んでいるがｐｏｌＣを含
んでいない。グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマはｐｏｌＣおよびｄｎａ Ｅ の両方を含んでいる。ｄｎａＥ遺伝子産物はグラム陰性真正細菌ゲノムの複製
に必要とされ、一方、ｐｏｌＣ遺伝子産物はグラム陽性真正細菌およびマイコプ
ラズマゲノムの複製に必要とされる。グラム陽性細菌におけるｄｎａＥ遺伝子産
物の機能は明らかになっていない。発明の要約 本発明は、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマのＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩがポリメラーゼ活性部位に隣接するジンクフィンガードメインを含んでおり
、ジンクフィンガーの完全性がポリメラーゼ活性に必要とされるという発見に基
づいている。
んでいない。グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマはｐｏｌＣおよびｄｎａ Ｅ の両方を含んでいる。ｄｎａＥ遺伝子産物はグラム陰性真正細菌ゲノムの複製
に必要とされ、一方、ｐｏｌＣ遺伝子産物はグラム陽性真正細菌およびマイコプ
ラズマゲノムの複製に必要とされる。グラム陽性細菌におけるｄｎａＥ遺伝子産
物の機能は明らかになっていない。発明の要約 本発明は、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマのＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩがポリメラーゼ活性部位に隣接するジンクフィンガードメインを含んでおり
、ジンクフィンガーの完全性がポリメラーゼ活性に必要とされるという発見に基
づいている。
【０００７】 従って、本発明はグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマによる感染を阻害
する化合物を同定する方法および抗菌性化合物それ自体を特色としている。 一般的には、本発明はグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ感染を阻害す
るための化合物を特色としている。本化合物はジンクフィンガー反応性部分（ｚ
ｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）、リンカー、および
リンカーを介してジンクフィンガー反応性部分に連結されたグラム陽性真正細菌
またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含んでいる
。本化合物は式： Ａ−（Ｌ−Ｂ）m で表すことができ、式中、Ｂはジンクフィンガー反応性部分であり、Ｌはリンカ
ーであり、およびＡはＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分である。 Ａ
の例には次の化合物が含まれ：
する化合物を同定する方法および抗菌性化合物それ自体を特色としている。 一般的には、本発明はグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ感染を阻害す
るための化合物を特色としている。本化合物はジンクフィンガー反応性部分（ｚ
ｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）、リンカー、および
リンカーを介してジンクフィンガー反応性部分に連結されたグラム陽性真正細菌
またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含んでいる
。本化合物は式： Ａ−（Ｌ−Ｂ）m で表すことができ、式中、Ｂはジンクフィンガー反応性部分であり、Ｌはリンカ
ーであり、およびＡはＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分である。 Ａ
の例には次の化合物が含まれ：
【０００８】
【化７】
【０００９】 式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件で
；Ｒ1およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、
または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル
、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；ｍは１または２であり；
およびｎは０、１または２である。本発明は本発明の化合物の塩もまた含んでい
る。Ｌは直接結合またはＣ1-18アルキレン鎖でもよい。アルキレン鎖は任意に、
１から５のエーテル基、チオエーテル基、アミン基、エステル基、チオエステル
基またはアミド基を含んでいる。Ｂはアゾジ（ビス）尿素基、芳香族または脂肪
族ジスルフィド基、芳香族または脂肪族ニトロソ基、チオスルホナート基または
チアゾリドン基を含むことができる。
；Ｒ1およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、
または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル
、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；ｍは１または２であり；
およびｎは０、１または２である。本発明は本発明の化合物の塩もまた含んでい
る。Ｌは直接結合またはＣ1-18アルキレン鎖でもよい。アルキレン鎖は任意に、
１から５のエーテル基、チオエーテル基、アミン基、エステル基、チオエステル
基またはアミド基を含んでいる。Ｂはアゾジ（ビス）尿素基、芳香族または脂肪
族ジスルフィド基、芳香族または脂肪族ニトロソ基、チオスルホナート基または
チアゾリドン基を含むことができる。
【００１０】 Ｂの例には次の化合物が含まれ：
【００１１】
【化８】
【００１２】 式中、ＲaおよびＲbの一つが−Ｌ−Ａであり、ＲaおよびＲbは同時には−Ｌ−Ａ
ではないという条件で、ＲaおよびＲbの各々は独立して、水素、Ｃ1-6アルキル
、フェニル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、アミンまたは−Ｌ
−Ａであり；およびｐは１、２、３または４である。本発明はまた任意の前記化
合物の塩も含んでいる。
ではないという条件で、ＲaおよびＲbの各々は独立して、水素、Ｃ1-6アルキル
、フェニル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、アミンまたは−Ｌ
−Ａであり；およびｐは１、２、３または４である。本発明はまた任意の前記化
合物の塩も含んでいる。
【００１３】 Ａ、ＬおよびＢの追加の例としては、Ａとして次の化合物：
【００１４】
【化９】
【００１５】 Ｂとして：ＣＨ3ＣＯ−Ｎ＝Ｎ−ＣＯ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3ＣＨ2ＣＯ−Ｎ＝Ｎ−ＣＯ
−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5ＣＯ−Ｎ＝Ｎ−ＣＯ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3 ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ
、ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ、
−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5ＣＯ−Ｎ＝Ｎ−ＣＯ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3 ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ、ＣＨ3−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ
、ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ、Ｃ6Ｈ5−ＳＯ2−Ｓ−Ｌ−Ａ、
【００１６】
【化１０】
【００１７】 およびＬとして：Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2 −Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃ
Ｈ2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2）2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2
ＣＨ2）2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ
ＯＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2）2−ＢまたはＡ−（
ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2）2−Ｂが含まれる。
Ｈ2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2）2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2
ＣＨ2）2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ
ＯＣＨ2ＣＨ2−Ｂ、Ａ−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2）2−ＢまたはＡ−（
ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2）2−Ｂが含まれる。
【００１８】 別の態様において、化合物（例えば、本発明の化合物）がＤＮＡポリメラーゼ
（例えば、枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのようなグラム陽性真正細菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩまたはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ）中のジン
クフィンガーへ結合されている亜鉛イオンを除去または亜鉛イオンと相互作用す
るのに十分な条件下、ＤＮＡポリメラーゼを化合物に接触させることによりジン
クフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する方法を本発
明は含んでいる。
（例えば、枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのようなグラム陽性真正細菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩまたはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ）中のジン
クフィンガーへ結合されている亜鉛イオンを除去または亜鉛イオンと相互作用す
るのに十分な条件下、ＤＮＡポリメラーゼを化合物に接触させることによりジン
クフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する方法を本発
明は含んでいる。
【００１９】 本発明はまた、化合物（例えば、本発明の化合物）が細菌に入り込み、ＤＮＡ
ポリメラーゼ（例えば、枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのようなグラム陽性真
正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩ
Ｉ）中のジンクフィンガーへ結合されている亜鉛イオンを除去または亜鉛イオン
と相互作用するのに十分な条件下、細菌を化合物に暴露することにより、ジンク
フィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細菌の細胞分裂速度を減少させ
る方法も含んでいる。
ポリメラーゼ（例えば、枯草菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのようなグラム陽性真
正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩ
Ｉ）中のジンクフィンガーへ結合されている亜鉛イオンを除去または亜鉛イオン
と相互作用するのに十分な条件下、細菌を化合物に暴露することにより、ジンク
フィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細菌の細胞分裂速度を減少させ
る方法も含んでいる。
【００２０】 さらに別の態様において、化合物が細菌（例えば、グラム陽性真正細菌および
マイコプラズマ）に入り込むのに十分な条件下、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポ
リメラーゼを含んでいる細菌を化合物に暴露し、亜鉛イオン（例えば、65Ｚｎイ
オン）がＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガーへ結合されているかどうかを決
定することにより、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細菌
の細胞分裂速度を化合物が減少させるかどうかを試験するための方法を本発明は
含んでいる（ここで、化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合する
が、化合物存在下では結合しないことは、化合物が細菌の細胞分裂速度を減少さ
せることを示している）。
マイコプラズマ）に入り込むのに十分な条件下、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポ
リメラーゼを含んでいる細菌を化合物に暴露し、亜鉛イオン（例えば、65Ｚｎイ
オン）がＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガーへ結合されているかどうかを決
定することにより、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細菌
の細胞分裂速度を化合物が減少させるかどうかを試験するための方法を本発明は
含んでいる（ここで、化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合する
が、化合物存在下では結合しないことは、化合物が細菌の細胞分裂速度を減少さ
せることを示している）。
【００２１】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼは配列ＩＤ番号：１と少なくとも７
０％相同または同一であろうし、下記の配列を含んでいる： Ｚ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ15-27−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１４） 式中、ＺはＨｉｓまたはＣｙｓであり、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸で
あり、およびＸ15-27は任意の１５から２７の連続したアミノ酸である。例えば
、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼは配列ＩＤ番号：２を含むことがで
きる。別の態様において、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼは下記の配
列を含んでいる： Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ19-21−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１５）
式中、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸であり、およびＸ19-21は任意の１９
から２１の連続したアミノ酸である。
０％相同または同一であろうし、下記の配列を含んでいる： Ｚ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ15-27−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１４） 式中、ＺはＨｉｓまたはＣｙｓであり、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸で
あり、およびＸ15-27は任意の１５から２７の連続したアミノ酸である。例えば
、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼは配列ＩＤ番号：２を含むことがで
きる。別の態様において、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼは下記の配
列を含んでいる： Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ19-21−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１５）
式中、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸であり、およびＸ19-21は任意の１９
から２１の連続したアミノ酸である。
【００２２】 本発明は、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガーを含
んでいるポリペプチドを含む混合物を提供すること；化合物がジンクフィンガー
に接触するのを可能にする十分な条件下、化合物と混合物を混合すること；およ
び亜鉛イオンがジンクフィンガーに結合されているかどうかを決定することによ
り化合物がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害するかどうかを試験
する方法も提供し、ここで化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合
するが、化合物存在下では結合しないことは、化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻
害することを示している。いくつかの態様において、混合物はポリペプチド含有
細胞を含んでいる。
んでいるポリペプチドを含む混合物を提供すること；化合物がジンクフィンガー
に接触するのを可能にする十分な条件下、化合物と混合物を混合すること；およ
び亜鉛イオンがジンクフィンガーに結合されているかどうかを決定することによ
り化合物がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害するかどうかを試験
する方法も提供し、ここで化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合
するが、化合物存在下では結合しないことは、化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻
害することを示している。いくつかの態様において、混合物はポリペプチド含有
細胞を含んでいる。
【００２３】 異なった態様において、本発明は、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼ
を含んでいる細菌を含む混合物を提供し；化合物が細菌内のＤＮＡポリメラーゼ
と接触するのを可能にする十分な条件下、化合物と混合物を混合し（化合物はジ
ンクフィンガー中の亜鉛イオンと相互作用する基を含んでいる）；および化合物
存在下でのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を測定することにより化合物
がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害するかどうかを決定する方法
を含んでおり、ここで化合物存在下でのポリメラーゼ活性が化合物不在下でのポ
リメラーゼ活性よりも低いことは化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻害しているこ
とを示している。
を含んでいる細菌を含む混合物を提供し；化合物が細菌内のＤＮＡポリメラーゼ
と接触するのを可能にする十分な条件下、化合物と混合物を混合し（化合物はジ
ンクフィンガー中の亜鉛イオンと相互作用する基を含んでいる）；および化合物
存在下でのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を測定することにより化合物
がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害するかどうかを決定する方法
を含んでおり、ここで化合物存在下でのポリメラーゼ活性が化合物不在下でのポ
リメラーゼ活性よりも低いことは化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻害しているこ
とを示している。
【００２４】 さらに別の態様において、本発明はＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性が
阻害されるように、細菌内ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼ中の亜鉛と
相互作用するのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）量を哺乳動物に投与
することにより、望ましくないグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感染に
感染しやすいまたは感染している哺乳動物を処置する方法を含んでいる。本発明
のこの方法は望ましくないグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感染に感染
しやすいまたは感染している哺乳動物を処置するために特に有用である。
阻害されるように、細菌内ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼ中の亜鉛と
相互作用するのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）量を哺乳動物に投与
することにより、望ましくないグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感染に
感染しやすいまたは感染している哺乳動物を処置する方法を含んでいる。本発明
のこの方法は望ましくないグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感染に感染
しやすいまたは感染している哺乳動物を処置するために特に有用である。
【００２５】 本発明はまた、本発明の方法に有用なポリペプチドを含んでおり、それは配列
ＣＸ2ＣＸ19-21ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）またはＨＸ2ＣＸ21ー24ＣＸ2Ｃ（
配列ＩＤ番号：１６）（式中、Ｃはシステインであり、Ｈはヒスチジンであり、
Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸であり、Ｘ19-21は任意の１９から２１の連
続したアミノ酸であり、およびＸ21ー24は任意の２１から２４の連続したアミノ
酸である）のジンクフィンガーを含み、および任意に図１に示したポリメラーゼ
ドメインを含むことができる。本発明のポリペプチドは天然に存在するグラム陽
性真正細菌またはマイコプラズマｐｏｌＩＩＩよりも短い。
ＣＸ2ＣＸ19-21ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）またはＨＸ2ＣＸ21ー24ＣＸ2Ｃ（
配列ＩＤ番号：１６）（式中、Ｃはシステインであり、Ｈはヒスチジンであり、
Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸であり、Ｘ19-21は任意の１９から２１の連
続したアミノ酸であり、およびＸ21ー24は任意の２１から２４の連続したアミノ
酸である）のジンクフィンガーを含み、および任意に図１に示したポリメラーゼ
ドメインを含むことができる。本発明のポリペプチドは天然に存在するグラム陽
性真正細菌またはマイコプラズマｐｏｌＩＩＩよりも短い。
【００２６】 新規抗菌化合物または抗菌剤は中性化合物または塩として存在することができ
る。例えば、アミン基は陽性に荷電でき、アニオンと塩を形成できる（例えば、
臭化物（ｂｒｏｍｉｄｅ））。同様に、抗菌剤のアニオン性基はカチオン（例え
ば、ナトリウムイオン、カリウムイオンまたはアンモニウムイオン）と塩を形成
できる。
る。例えば、アミン基は陽性に荷電でき、アニオンと塩を形成できる（例えば、
臭化物（ｂｒｏｍｉｄｅ））。同様に、抗菌剤のアニオン性基はカチオン（例え
ば、ナトリウムイオン、カリウムイオンまたはアンモニウムイオン）と塩を形成
できる。
【００２７】 典型的なアルキル基は例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルおよびドデシル基である。ア
ルキレン鎖は２価のアルキル基である。
チル、イソブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルおよびドデシル基である。ア
ルキレン鎖は２価のアルキル基である。
【００２８】 ハロ基とはハロゲン基である、例えば、クロロ、ブロモまたはヨード。ハロア
ルキル中のハロ基はアルキル基の任意の炭素原子と結合できる。同様に、ヒドロ
キシアルキル中のヒドロキシ基はそのアルキル基の任意の炭素原子と結合できる
。
ルキル中のハロ基はアルキル基の任意の炭素原子と結合できる。同様に、ヒドロ
キシアルキル中のヒドロキシ基はそのアルキル基の任意の炭素原子と結合できる
。
【００２９】 エステル基、チオエステル基またはアミド基が新規抗菌化合物に存在している
場合、これらの基は両方向で連結できる。例えば、エステル基は−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−として存在できる。
場合、これらの基は両方向で連結できる。例えば、エステル基は−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−として存在できる。
【００３０】 アミンまたはアミドの窒素原子は水素またはＣ1-3アルキル基と結合できる。 ”ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）”とはポリペプチド配列内で
（１）４つのＣｙｓ残基、（２）３つのＣｙｓ残基および１つのＨｉｓ残基、ま
たは（３）２つのＣｙｓ残基および２つのＨｉｓ残基との配位により亜鉛を特異
的に結合したポリペプチド配列である。
（１）４つのＣｙｓ残基、（２）３つのＣｙｓ残基および１つのＨｉｓ残基、ま
たは（３）２つのＣｙｓ残基および２つのＨｉｓ残基との配位により亜鉛を特異
的に結合したポリペプチド配列である。
【００３１】 ”ジンクフィンガー反応性部分（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ
ｍｏｉｅｔｙ）”とは、ジンクフィンガーと接触することにより、ジンクフィ
ンガーを含んでいるポリペプチドの酵素活性（例えば、ｐｏｌＩＩＩのポリメラ
ーゼ活性）が阻害されるように、ジンクフィンガーから亜鉛イオンを除去するか
、さもなくば亜鉛イオンと相互作用してジンクフィンガーの３次元構造を変化さ
せる化合物または化合物の一部分である。
ｍｏｉｅｔｙ）”とは、ジンクフィンガーと接触することにより、ジンクフィ
ンガーを含んでいるポリペプチドの酵素活性（例えば、ｐｏｌＩＩＩのポリメラ
ーゼ活性）が阻害されるように、ジンクフィンガーから亜鉛イオンを除去するか
、さもなくば亜鉛イオンと相互作用してジンクフィンガーの３次元構造を変化さ
せる化合物または化合物の一部分である。
【００３２】 ”ＤＮＡポリメラーゼ”とは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン
酸の多量化を触媒するタンパク質またはポリペプチドである。 ”阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）”または”阻害された（ｉｎｈｉｂｉｔ
ｅｄ）”とは部分的阻害または完全阻害を意味している。
酸の多量化を触媒するタンパク質またはポリペプチドである。 ”阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）”または”阻害された（ｉｎｈｉｂｉｔ
ｅｄ）”とは部分的阻害または完全阻害を意味している。
【００３３】 ”細菌”とは真正細菌またはマイコプラズマ目）ｏｒｄｅｒ Ｍｙｃｏｐｌａ
ｓｍａｔａｌｅｓ）のメンバー（例えば、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａ
ｐｌａｓｍａ）またはアコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）属の種）で
ある。
ｓｍａｔａｌｅｓ）のメンバー（例えば、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａ
ｐｌａｓｍａ）またはアコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）属の種）で
ある。
【００３４】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の”パーセント同一性（ｐｅｒｃｅ
ｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）”を決定するため、配列は最適比較目的のために整列
される（例えば、第二のアミノまたは核酸配列との最適アラインメント（ｏｐｔ
ｉｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）のために、第一のアミノまたは核酸配列の配列
中にギャップが導入できる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド
位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列の位置が対応
する第二の配列の位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められて
いる場合、その位置では分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は
配列により共有されている同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位
置の数／位置の総数ｘ１００）。
ｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）”を決定するため、配列は最適比較目的のために整列
される（例えば、第二のアミノまたは核酸配列との最適アラインメント（ｏｐｔ
ｉｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）のために、第一のアミノまたは核酸配列の配列
中にギャップが導入できる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド
位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列の位置が対応
する第二の配列の位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められて
いる場合、その位置では分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は
配列により共有されている同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位
置の数／位置の総数ｘ１００）。
【００３５】 ２つの配列間の”パーセント相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）”
は数学的アルゴリズムを使用して決定できる。２つの配列の比較に利用される好
適かつ非限定的な数学的アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９０：５８７３−５８７７（１
９９３）で改良されているＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリ
ズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよ
びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。本発明のＴ１３９核酸分子のヌ
クレオチド配列相同体を得るため、ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチがＮＢＬＡＳ
Ｔプログラムで実施できる、スコア＝１００、ワード長＝１２。本発明のＴ１３
９タンパク質分子のアミノ酸配列相同体を得るため、ＢＬＡＳＴタンパク質サー
チがＸＢＬＡＳＴプログラムで実施できる、スコア＝５０、ワード長＝３。比較
目的のためのギャップトアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ
）を得るため、ギャップトＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）に
記載されているように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップトＢＬＡＳＴプロ
グラムを利用する場合、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬ
ＡＳＴ）のデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）
が使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を
参照されたい。配列の比較のために利用できる数学的アルゴリズムの別の好適な
非限定的例はＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリ
ズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェ
アーパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り
込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する
場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２，およびギャップ
ペナルティー４が使用できる。
は数学的アルゴリズムを使用して決定できる。２つの配列の比較に利用される好
適かつ非限定的な数学的アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９０：５８７３−５８７７（１
９９３）で改良されているＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリ
ズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよ
びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。本発明のＴ１３９核酸分子のヌ
クレオチド配列相同体を得るため、ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチがＮＢＬＡＳ
Ｔプログラムで実施できる、スコア＝１００、ワード長＝１２。本発明のＴ１３
９タンパク質分子のアミノ酸配列相同体を得るため、ＢＬＡＳＴタンパク質サー
チがＸＢＬＡＳＴプログラムで実施できる、スコア＝５０、ワード長＝３。比較
目的のためのギャップトアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ
）を得るため、ギャップトＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）に
記載されているように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップトＢＬＡＳＴプロ
グラムを利用する場合、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬ
ＡＳＴ）のデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）
が使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を
参照されたい。配列の比較のために利用できる数学的アルゴリズムの別の好適な
非限定的例はＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリ
ズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェ
アーパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り
込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する
場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２，およびギャップ
ペナルティー４が使用できる。
【００３６】 ２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを与えてまたは与えないで、上
に記載したものと類似の技術を使用して決定できる。パーセント同一性の計算に
は、正確な一致のみが計数された。
に記載したものと類似の技術を使用して決定できる。パーセント同一性の計算に
は、正確な一致のみが計数された。
【００３７】 特に記述しない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語
は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味
を持っている。本発明の実施または試験に適した方法および材料が以下に説明さ
れるが、ここに説明した方法と類似または同等の他の方法および材料（当業者に
はよく知られている）もまた使用できる。ここに述べられているすべての出版物
、特許出願、特許および他の参考文献は全体として本明細書において援用される
。対立がある場合、本明細書（定義を含んで）が規制するであろう。加えて、材
料、方法および実施例は例示のためのみであり、制限を意図するものではない。
は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味
を持っている。本発明の実施または試験に適した方法および材料が以下に説明さ
れるが、ここに説明した方法と類似または同等の他の方法および材料（当業者に
はよく知られている）もまた使用できる。ここに述べられているすべての出版物
、特許出願、特許および他の参考文献は全体として本明細書において援用される
。対立がある場合、本明細書（定義を含んで）が規制するであろう。加えて、材
料、方法および実施例は例示のためのみであり、制限を意図するものではない。
【００３８】 利点の中でも、ポリペプチド内のジンクフィンガーから亜鉛イオンを除去する
、さもなくば相互作用する能力に基づいた抗菌剤という、以前には認識されてい
ない抗菌剤の介在様式（ｍｏｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を本発明
の方法は提供する。加えて、本発明の化合物は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性
部位特異的化学基およびジンクフィンガー反応性化学基を結びつけることにより
、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマに対する強固な特異性（ｔｉｇｈｔ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を提供する。さらに、本発明はｐｏｌＩＩＩに対す
るその独特のおよび非可逆的な阻害のため、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌に対して有
効であろう抗菌剤を提供する。
、さもなくば相互作用する能力に基づいた抗菌剤という、以前には認識されてい
ない抗菌剤の介在様式（ｍｏｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を本発明
の方法は提供する。加えて、本発明の化合物は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性
部位特異的化学基およびジンクフィンガー反応性化学基を結びつけることにより
、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマに対する強固な特異性（ｔｉｇｈｔ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を提供する。さらに、本発明はｐｏｌＩＩＩに対す
るその独特のおよび非可逆的な阻害のため、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌に対して有
効であろう抗菌剤を提供する。
【００３９】 本発明の他の特色および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明
らかになるであろう。詳細な説明 本発明はグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
中の独特のジンクフィンガーが新規抗菌化合物の薬剤標的として使用できるとい
う発見に関連している。ジンクフィンガーの破壊はポリメラーゼ活性を非可逆的
に阻害し、およびその活性は細菌増殖に必須であるので、ジンクフィンガーを特
異的に破壊する化合物は、抗菌剤の新しい異なったクラスを形成する。これらの
抗菌剤は、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ感染の危険性がある、また
はすでに感染した哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびブタ
）を処置するのに適した医薬組成物を処方するために使用できる。ポリメラーゼ
活性および従ってグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ増殖におけるジンク
フィンガーの重要性の認識はまた、潜在的抗菌化合物のための新規スクリーニン
グをもたらす。 Ｉ．真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびマイコプラズマＤＮＡポリメラー
ゼのジンクフィンガーの発見 Ａ）ＤＮＡポリメラーゼの産生および単離 本発明の方法で有用なｐｏｌＣ特異的ＤＮＡポリメラーゼには任意の天然に存
在するグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩが含
まれる。加えて、本発明は天然に存在するグラム陽性真正細菌またはマイコプラ
ズマｐｏｌＩＩＩ内のアミノ酸残基の付加または置換を持っているポリペプチド
の使用を含んでいる。グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩポリペプチドの産生を容
易にするため、そのようなｐｏｌＩＩＩをコード化しているｐｏｌＣの全体また
は一部を含んでいる核酸が発現のために使用できる。例えば、枯草菌ｐｏｌＩＩ
Ｉをコード化している核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号第Ｘ５２１１６号
として入手可能である。配列は以下のｐｏｌＩＩＩアミノ酸配列をコード化して
いる：
らかになるであろう。詳細な説明 本発明はグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
中の独特のジンクフィンガーが新規抗菌化合物の薬剤標的として使用できるとい
う発見に関連している。ジンクフィンガーの破壊はポリメラーゼ活性を非可逆的
に阻害し、およびその活性は細菌増殖に必須であるので、ジンクフィンガーを特
異的に破壊する化合物は、抗菌剤の新しい異なったクラスを形成する。これらの
抗菌剤は、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ感染の危険性がある、また
はすでに感染した哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびブタ
）を処置するのに適した医薬組成物を処方するために使用できる。ポリメラーゼ
活性および従ってグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマ増殖におけるジンク
フィンガーの重要性の認識はまた、潜在的抗菌化合物のための新規スクリーニン
グをもたらす。 Ｉ．真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびマイコプラズマＤＮＡポリメラー
ゼのジンクフィンガーの発見 Ａ）ＤＮＡポリメラーゼの産生および単離 本発明の方法で有用なｐｏｌＣ特異的ＤＮＡポリメラーゼには任意の天然に存
在するグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩが含
まれる。加えて、本発明は天然に存在するグラム陽性真正細菌またはマイコプラ
ズマｐｏｌＩＩＩ内のアミノ酸残基の付加または置換を持っているポリペプチド
の使用を含んでいる。グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩポリペプチドの産生を容
易にするため、そのようなｐｏｌＩＩＩをコード化しているｐｏｌＣの全体また
は一部を含んでいる核酸が発現のために使用できる。例えば、枯草菌ｐｏｌＩＩ
Ｉをコード化している核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号第Ｘ５２１１６号
として入手可能である。配列は以下のｐｏｌＩＩＩアミノ酸配列をコード化して
いる：
【００４０】
【化１１】
【００４１】 上記配列において、提案されたジンクフィンガーアミノ酸配列（下線部）はＨＹ
ＶＣＰＥＣＱＨＳＥＦＦＮＤＧＳＶＧＳＧＦＤＬＰＤＫＴＣＰＨＣ（配列ＩＤ番
号：２；図２参照）である。この配列の２４アミノ酸Ｃ末端は保存アミノ酸配列
ＰＤＩＤ（ボールド（太字）体）（配列ＩＤ番号：３）である。従って、ジンク
フィンガーはポリメラーゼ活性部位の一部であるようである。
ＶＣＰＥＣＱＨＳＥＦＦＮＤＧＳＶＧＳＧＦＤＬＰＤＫＴＣＰＨＣ（配列ＩＤ番
号：２；図２参照）である。この配列の２４アミノ酸Ｃ末端は保存アミノ酸配列
ＰＤＩＤ（ボールド（太字）体）（配列ＩＤ番号：３）である。従って、ジンク
フィンガーはポリメラーゼ活性部位の一部であるようである。
【００４２】 マイコプラズマｐｏｌＩＩＩをコード化している核酸配列もまた入手可能であ
る。例えば、Ｍ．プルモニスＤＮＡポリメラーゼ配列が受け入れ番号第Ｕ０６８
３３号のＧｅｎＢａｎｋプロフィールに記載されている。
る。例えば、Ｍ．プルモニスＤＮＡポリメラーゼ配列が受け入れ番号第Ｕ０６８
３３号のＧｅｎＢａｎｋプロフィールに記載されている。
【００４３】 一般に、ＤＮＡポリメラーゼは標準法を用いてそれらの天然の細菌源から単離
できる。もしくは、ＤＮＡポリメラーゼは、適した発現担体中のＤＮＡポリメラ
ーゼコード化ＤＮＡ断片による宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、ト
ランスダクションまたは感染）により産生できる。適した発現担体にはプラスミ
ド、ウイルス粒子およびファージが含まれる。昆虫細胞に対しては、バキュウロ
ウイルス発現ベクターが適している。全発現担体またはその一部を宿主細胞ゲノ
ム内へ組み込むことができる。いくつかの環境においては、誘導可能発現ベクタ
ーを用いることが望ましい、例えば、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨTM誘導可能発現ベクタ
ー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）。
できる。もしくは、ＤＮＡポリメラーゼは、適した発現担体中のＤＮＡポリメラ
ーゼコード化ＤＮＡ断片による宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、ト
ランスダクションまたは感染）により産生できる。適した発現担体にはプラスミ
ド、ウイルス粒子およびファージが含まれる。昆虫細胞に対しては、バキュウロ
ウイルス発現ベクターが適している。全発現担体またはその一部を宿主細胞ゲノ
ム内へ組み込むことができる。いくつかの環境においては、誘導可能発現ベクタ
ーを用いることが望ましい、例えば、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨTM誘導可能発現ベクタ
ー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）。
【００４４】 分子生物学分野の当業者は、組換え体タンパク質を提供するために任意の広範
囲の発現系が使用できることを理解するであろう。使用される的確な宿主細胞は
本発明では決定的ではない。
囲の発現系が使用できることを理解するであろう。使用される的確な宿主細胞は
本発明では決定的ではない。
【００４５】 好適なＤＮＡポリメラーゼは、通常の生理学的条件下で可溶性であるものであ
る。ＤＮＡポリメラーゼの一部（例えば、ジンクフィンガー）が関係のないタン
パク質またはポリペプチド（即ち、融合相手）に融合されて融合タンパク質を作
り出しているような融合タンパク質も本発明の範囲内である。融合相手は、精製
、検出または可溶化を容易にするために、またはいくつかの他の機能を提供する
ために選択された成分であろう。融合タンパク質は一般的に、ＤＮＡポリメラー
ゼのすべてまたは一部をコード化しているヌクレオチド配列が読み枠内で融合相
手をコード化しているヌクレオチド配列に連結されているハイブリッド遺伝子を
発現することにより産生される。例えば、発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１，１９８３）はｌａｃＺ融
合タンパク質を産生するために使用できる。ｐＧＥＸベクターはグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んでいる融合タンパク質として外来ポリ
ペプチドを発現するために使用できる。一般に、そのような融合タンパク質は可
溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチ
オン存在下で溶出することにより、細胞溶解物から容易に精製できる。ｐＧＥＸ
ベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から遊離できるように、ト
ロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
る。ＤＮＡポリメラーゼの一部（例えば、ジンクフィンガー）が関係のないタン
パク質またはポリペプチド（即ち、融合相手）に融合されて融合タンパク質を作
り出しているような融合タンパク質も本発明の範囲内である。融合相手は、精製
、検出または可溶化を容易にするために、またはいくつかの他の機能を提供する
ために選択された成分であろう。融合タンパク質は一般的に、ＤＮＡポリメラー
ゼのすべてまたは一部をコード化しているヌクレオチド配列が読み枠内で融合相
手をコード化しているヌクレオチド配列に連結されているハイブリッド遺伝子を
発現することにより産生される。例えば、発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１，１９８３）はｌａｃＺ融
合タンパク質を産生するために使用できる。ｐＧＥＸベクターはグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んでいる融合タンパク質として外来ポリ
ペプチドを発現するために使用できる。一般に、そのような融合タンパク質は可
溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチ
オン存在下で溶出することにより、細胞溶解物から容易に精製できる。ｐＧＥＸ
ベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から遊離できるように、ト
ロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００４６】 融合タンパク質は、発現されている融合タンパク質に特異的な抗体により容易
に精製できる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８８：８９７２（１９８１）に記載されている
系は、ヒト細胞株で発現された未変性融合タンパク質の容易な精製を可能にして
いる。この系において、問題とする遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が翻訳的に６
つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグへ融合されるように、ワクシニア組
換えプラスミド内へサブクローン化される。細胞からの抽出物を組換え体ワクシ
ニアウイルスで感染させ、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムに加え、ヒス
チジンタグ付けしたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させる
。同じ方法が細菌培養物にも使用できる。
に精製できる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８８：８９７２（１９８１）に記載されている
系は、ヒト細胞株で発現された未変性融合タンパク質の容易な精製を可能にして
いる。この系において、問題とする遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が翻訳的に６
つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグへ融合されるように、ワクシニア組
換えプラスミド内へサブクローン化される。細胞からの抽出物を組換え体ワクシ
ニアウイルスで感染させ、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムに加え、ヒス
チジンタグ付けしたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させる
。同じ方法が細菌培養物にも使用できる。
【００４７】 もしくは、ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部はイムノグロブリンＦｃドメイ
ンに融合できる。そのような融合タンパク質はアフィニティーカラムを使用して
容易に精製できる。
ンに融合できる。そのような融合タンパク質はアフィニティーカラムを使用して
容易に精製できる。
【００４８】 ＤＮＡポリメラーゼの天然に存在するおよび組み換え体型の両方が、本発明の
方法に使用するために単離できる。分泌形は培養培地から単離でき、一方、非分
泌形は宿主細胞から単離できる。さらなる精製はアフィニティークロマトグラフ
ィーにより達成できる。一つの実施例において、枯草菌ｐｏｌＩＩＩのヘキサヒ
スチジンタグ付け誘導体（本明細書に記載された通りに産生される）が大腸菌で
発現された。細菌を溶解し、溶解物は使用説明書に従って調製されたＮｉ荷電Ｉ
ＭＡＣ−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）を通過させる。次に組換え体ポリメラ
ーゼをイミダゾール濃度勾配（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用
して溶出する。分画を集め、ポリメラーゼ活性でアッセイする。活性分画をプー
ルすると、ポリメラーゼを含んでいる混合物が得られる。
方法に使用するために単離できる。分泌形は培養培地から単離でき、一方、非分
泌形は宿主細胞から単離できる。さらなる精製はアフィニティークロマトグラフ
ィーにより達成できる。一つの実施例において、枯草菌ｐｏｌＩＩＩのヘキサヒ
スチジンタグ付け誘導体（本明細書に記載された通りに産生される）が大腸菌で
発現された。細菌を溶解し、溶解物は使用説明書に従って調製されたＮｉ荷電Ｉ
ＭＡＣ−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）を通過させる。次に組換え体ポリメラ
ーゼをイミダゾール濃度勾配（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用
して溶出する。分画を集め、ポリメラーゼ活性でアッセイする。活性分画をプー
ルすると、ポリメラーゼを含んでいる混合物が得られる。
【００４９】 一度単離されたら、必要に応じ、さらなる処理がポリメラーゼ活性を減じない
限り（本明細書に記載した方法を使用して測定できる）、ＤＮＡポリメラーゼは
さらに精製および／または濃縮できる。超遠心および／または沈殿（例えば、硫
酸アンモニウム）、マイクロ濾過（例えば、０．４５μｍ酢酸セルロースフィル
ター）、限外濾過（例えば、サイズ分け膜および再循環濾過）、ゲル濾過（例え
ば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−２Ｂ、６Ｂまたは２
Ｂ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００またはＳ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ま
たはＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ２、Ａ４またはＡ６；すべてＰｈａｒｍａｃｉａから
入手可能）、ファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、およ
び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む精製および濃縮のための種々
の方法が当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏ
ｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８０を参照されたい）。
限り（本明細書に記載した方法を使用して測定できる）、ＤＮＡポリメラーゼは
さらに精製および／または濃縮できる。超遠心および／または沈殿（例えば、硫
酸アンモニウム）、マイクロ濾過（例えば、０．４５μｍ酢酸セルロースフィル
ター）、限外濾過（例えば、サイズ分け膜および再循環濾過）、ゲル濾過（例え
ば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−２Ｂ、６Ｂまたは２
Ｂ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００またはＳ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ま
たはＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ２、Ａ４またはＡ６；すべてＰｈａｒｍａｃｉａから
入手可能）、ファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、およ
び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む精製および濃縮のための種々
の方法が当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏ
ｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８０を参照されたい）。
【００５０】 Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼの亜鉛含量の定量 ＤＮＡポリメラーゼの亜鉛含量は生化学分野の当業者にはよく知られている方
法により定量できる。例えば、上記の任意の方法で産生および単離されたＤＮＡ
ポリメラーゼは、非特異的結合亜鉛を捕捉するのに十分長い時間、ＥＤＴＡ含有
水溶液中で透析できる。ジンクフィンガーに結合されている亜鉛イオンはＥＤＴ
Ａでは容易には除去できないことが知られている（Ｋｌｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆ ＡＳＥＢ Ｊ ．，９：５９７−６０４，１９９５）。分析のためにメタロプロテ
イン（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）を調製する標準法（ジンクフィンガーを
含んでいるものを含んで）がＶａｌｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒ ｅｖ ．，７３：７９−１１８（１９９３）に記載されている。そのような方法は
メタロプロテイン分析で使用するガラス器具を他の実験室のガラス器具から分離
することを含んでいる。そのようなガラス器具は蒸留、脱イオン水でのみ洗浄し
なければならない。単離されたＤＮＡポリメラーゼは亜鉛含量を決定するために
原子吸光スペクトル法にかけられる。
法により定量できる。例えば、上記の任意の方法で産生および単離されたＤＮＡ
ポリメラーゼは、非特異的結合亜鉛を捕捉するのに十分長い時間、ＥＤＴＡ含有
水溶液中で透析できる。ジンクフィンガーに結合されている亜鉛イオンはＥＤＴ
Ａでは容易には除去できないことが知られている（Ｋｌｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆ ＡＳＥＢ Ｊ ．，９：５９７−６０４，１９９５）。分析のためにメタロプロテ
イン（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）を調製する標準法（ジンクフィンガーを
含んでいるものを含んで）がＶａｌｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒ ｅｖ ．，７３：７９−１１８（１９９３）に記載されている。そのような方法は
メタロプロテイン分析で使用するガラス器具を他の実験室のガラス器具から分離
することを含んでいる。そのようなガラス器具は蒸留、脱イオン水でのみ洗浄し
なければならない。単離されたＤＮＡポリメラーゼは亜鉛含量を決定するために
原子吸光スペクトル法にかけられる。
【００５１】 Ｃ）ジンクフィンガーの探索 亜鉛イオンを含んでいることが見いだされたＤＮＡポリメラーゼはジンクフィ
ンガーを含んでいるかもしれない。ジンクフィンガーはその配列が非常に多様で
あり、少なくとも１０の連続するアミノ酸の広がりに、亜鉛イオンの配位のため
のただ４つのアミノ酸残基の存在を必要としている。４つのアミノ酸は４つのシ
ステイン、３つのシステインと１つのヒスチジン、または２つのシステインと２
つのヒスチジンである。ジンクフィンガーはＫｌｕｇ ｅｔ ａｌ．（上記文献
）により詳しく説明されている。広範囲のタンパク質がジンクフィンガーを含ん
でいるが、グラム陽性真正細菌ＤＮＡｐｏｌＩＩＩ以外のＤＮＡポリメラーゼが
この構造を含んでいることは最終的に見いだされていない。
ンガーを含んでいるかもしれない。ジンクフィンガーはその配列が非常に多様で
あり、少なくとも１０の連続するアミノ酸の広がりに、亜鉛イオンの配位のため
のただ４つのアミノ酸残基の存在を必要としている。４つのアミノ酸は４つのシ
ステイン、３つのシステインと１つのヒスチジン、または２つのシステインと２
つのヒスチジンである。ジンクフィンガーはＫｌｕｇ ｅｔ ａｌ．（上記文献
）により詳しく説明されている。広範囲のタンパク質がジンクフィンガーを含ん
でいるが、グラム陽性真正細菌ＤＮＡｐｏｌＩＩＩ以外のＤＮＡポリメラーゼが
この構造を含んでいることは最終的に見いだされていない。
【００５２】 グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマｐｏｌＩＩＩがジンクフィンガーを
含んでいることが発見された。これらの細菌間のジンクフィンガー配列は高度に
相同的であり（図１）、ＣＸ2ＣＸl9-2lＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）または
ＨＸ2ＣＸ2l-24ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１６）ジンクフィンガー構造のどちら
かに対応している（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、下つき数字は連続してい
るアミノ酸数を表している）。枯草菌ｐｏｌＩＩＩでのこれら２つの例は図２に
示されている。本発明の方法で有用なＤＮＡポリメラーゼには、一般配列式：Ｚ
Ｘ2ＣＸ15-27ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１４）またはＺＸ2ＣＸ18-24ＣＸ2Ｃ（配
列ＩＤ番号：１７）（式中、ＺはＣｙｓまたはＨｉｓである）が含まれる。この
一般式に含まれる例はＣＸ2ＣＸ19-21ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）およびＨ
Ｘ2ＣＸ2l-24ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１６）である。
含んでいることが発見された。これらの細菌間のジンクフィンガー配列は高度に
相同的であり（図１）、ＣＸ2ＣＸl9-2lＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）または
ＨＸ2ＣＸ2l-24ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１６）ジンクフィンガー構造のどちら
かに対応している（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、下つき数字は連続してい
るアミノ酸数を表している）。枯草菌ｐｏｌＩＩＩでのこれら２つの例は図２に
示されている。本発明の方法で有用なＤＮＡポリメラーゼには、一般配列式：Ｚ
Ｘ2ＣＸ15-27ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１４）またはＺＸ2ＣＸ18-24ＣＸ2Ｃ（配
列ＩＤ番号：１７）（式中、ＺはＣｙｓまたはＨｉｓである）が含まれる。この
一般式に含まれる例はＣＸ2ＣＸ19-21ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１５）およびＨ
Ｘ2ＣＸ2l-24ＣＸ2Ｃ（配列ＩＤ番号：１６）である。
【００５３】 最初の評価のように、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は以前に記載されて
いるジンクフィンガー配列（例えば、Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，
前記文献、を参照されたい）または本明細書に記載されているジンクフィンガー
配列とアライン（ａｌｉｇｎ）できる。ポリメラーゼ配列および既知のジンクフ
ィンガー配列間に著しい相同性が観察され、本明細書に記載した一般配列の環境
内に決定的な４つのアミノ酸が同定されたとしたら、任意の決定的アミノ酸（例
えば、アラニン）を突然変異させるために部位特異的突然変異発生が使用できる
。ポリメラーゼジンクフィンガーが確実であり、および酵素の機能に決定的であ
れば、任意の決定的アミノ酸の置換は酵素のポリメラーゼ活性に影響しなければ
ならない。
いるジンクフィンガー配列（例えば、Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，
前記文献、を参照されたい）または本明細書に記載されているジンクフィンガー
配列とアライン（ａｌｉｇｎ）できる。ポリメラーゼ配列および既知のジンクフ
ィンガー配列間に著しい相同性が観察され、本明細書に記載した一般配列の環境
内に決定的な４つのアミノ酸が同定されたとしたら、任意の決定的アミノ酸（例
えば、アラニン）を突然変異させるために部位特異的突然変異発生が使用できる
。ポリメラーゼジンクフィンガーが確実であり、および酵素の機能に決定的であ
れば、任意の決定的アミノ酸の置換は酵素のポリメラーゼ活性に影響しなければ
ならない。
【００５４】 機能性（即ち、ポリメラーゼ活性に必要とされる）ジンクフィンガーが病原性
生物体の必須ＤＮＡポリメラーゼに存在することを確認することで、その病原体
の増殖を阻害するための新規薬剤標的（ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ）が提
供される。ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼ中のジンクフィンガーを破壊するための一般的方法論 Ａ）ジンクフィンガー反応性部分 ＤＮＡポリメラーゼ中の機能性ジンクフィンガーを同定することにより、当業
者はジンクフィンガーの構造を変化させることで（例えば、亜鉛を追い出すこと
により）ポリメラーゼを阻害でき、それにより、複製をＤＮＡポリメラーゼに依
存している生物体の増殖を阻害する。ジンクフィンガー構造の変化は、ジンクフ
ィンガーとジンクフィンガーと反応または相互作用することが知られている化合
物を接触させることにより誘導できる。もしくは、化合物は、最初はジンクフィ
ンガー構造を変化させることは知られていないが、この活性ついて本発明のジン
クフィンガーに対してスクリーニングされた化合物のライブラリーから選択され
る。そのような化合物は、以下に記載されているものを含んで当該技術分野では
よく知られている；Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：
３６０６−３６１６（１９９６）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ ．，３７：４２６７−４２６９（１９９４）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：３２６４−３２７０（１９９５）；Ｆｕ
ｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１
９９６）；Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：４３１３−
４３２０（１９９６）；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２５９：５０３２−５０３６（１９８４）；およびＬｏｕｉｅ ｅｔ ａｌ．
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６６６３−６６６８
（１９９８）。亜鉛追い出しのより詳細な議論は以下に示される。
生物体の必須ＤＮＡポリメラーゼに存在することを確認することで、その病原体
の増殖を阻害するための新規薬剤標的（ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ）が提
供される。ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼ中のジンクフィンガーを破壊するための一般的方法論 Ａ）ジンクフィンガー反応性部分 ＤＮＡポリメラーゼ中の機能性ジンクフィンガーを同定することにより、当業
者はジンクフィンガーの構造を変化させることで（例えば、亜鉛を追い出すこと
により）ポリメラーゼを阻害でき、それにより、複製をＤＮＡポリメラーゼに依
存している生物体の増殖を阻害する。ジンクフィンガー構造の変化は、ジンクフ
ィンガーとジンクフィンガーと反応または相互作用することが知られている化合
物を接触させることにより誘導できる。もしくは、化合物は、最初はジンクフィ
ンガー構造を変化させることは知られていないが、この活性ついて本発明のジン
クフィンガーに対してスクリーニングされた化合物のライブラリーから選択され
る。そのような化合物は、以下に記載されているものを含んで当該技術分野では
よく知られている；Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：
３６０６−３６１６（１９９６）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ ．，３７：４２６７−４２６９（１９９４）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：３２６４−３２７０（１９９５）；Ｆｕ
ｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１
９９６）；Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：４３１３−
４３２０（１９９６）；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２５９：５０３２−５０３６（１９８４）；およびＬｏｕｉｅ ｅｔ ａｌ．
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６６６３−６６６８
（１９９８）。亜鉛追い出しのより詳細な議論は以下に示される。
【００５５】 Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性部位へのジンクフィンガー反応性部分の標的化 グラム陽性真正細菌またはマイコプラズマｐｏｌＩＩＩに対するジンクフィン
ガー反応性部分の特異性を高めるため、ここに記載した任意のジンクフィンガー
反応性部分が、これらのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性部位へ結合する
ことが知られている化合物（例えば、米国特許第５，５１６，９０５号に開示さ
れているようなＨＰＵｒａ様化合物）と連結できる（例えば、共有結合での連結
）。活性部位結合成分を介してジンクフィンガーのそのようなごく近くに接近し
たジンクフィンガー反応性部分は本発明の抗菌化合物の特異性または有効性を増
加させることが期待される。
ガー反応性部分の特異性を高めるため、ここに記載した任意のジンクフィンガー
反応性部分が、これらのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性部位へ結合する
ことが知られている化合物（例えば、米国特許第５，５１６，９０５号に開示さ
れているようなＨＰＵｒａ様化合物）と連結できる（例えば、共有結合での連結
）。活性部位結合成分を介してジンクフィンガーのそのようなごく近くに接近し
たジンクフィンガー反応性部分は本発明の抗菌化合物の特異性または有効性を増
加させることが期待される。
【００５６】 例えば、ＨＰＵｒａ様化合物はポリメラーゼ活性部位の一部に結合することに
よりグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマＤＮＡｐｏｌＩＩＩを特異的に標
的とするウラシルに基づいた抗菌剤の種類である（図１）。この部分は、ここで
同定されたジンクフィンガードメインのＣ末端とは２４アミノ酸未満しか離れて
おらず、ジンクフィンガーと空間的にごく近くに存在する。
よりグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマＤＮＡｐｏｌＩＩＩを特異的に標
的とするウラシルに基づいた抗菌剤の種類である（図１）。この部分は、ここで
同定されたジンクフィンガードメインのＣ末端とは２４アミノ酸未満しか離れて
おらず、ジンクフィンガーと空間的にごく近くに存在する。
【００５７】 従って、ＨＰＵｒａ様化合物をジンクフィンガーと反応することが知られてい
る化合物と連結させることにより、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマに
特異的な、新しい種類の抗菌剤が製造される。これらの新規抗菌剤合成について
のさらなる詳細は以下に与えられている。ＩＩＩ．抗菌化合物候補のスクリーニング 確実なジンクフィンガーがグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマｐｏｌＩ
ＩＩに存在するという認識により、これらの微生物に対する抗菌剤の新しい種類
に対する根拠が形成された。従って、候補化合物（例えば、化学ライブラリーか
らの化合物）は、代わりの活性として比較的安価でマイクロアレイ可能な亜鉛結
合または放出を使用することにより、抗菌活性を最初にスクリーニングできる。
いくつかのスクリーニング法は以下に説明されている。
る化合物と連結させることにより、グラム陽性真正細菌およびマイコプラズマに
特異的な、新しい種類の抗菌剤が製造される。これらの新規抗菌剤合成について
のさらなる詳細は以下に与えられている。ＩＩＩ．抗菌化合物候補のスクリーニング 確実なジンクフィンガーがグラム陽性真正細菌およびマイコプラズマｐｏｌＩ
ＩＩに存在するという認識により、これらの微生物に対する抗菌剤の新しい種類
に対する根拠が形成された。従って、候補化合物（例えば、化学ライブラリーか
らの化合物）は、代わりの活性として比較的安価でマイクロアレイ可能な亜鉛結
合または放出を使用することにより、抗菌活性を最初にスクリーニングできる。
いくつかのスクリーニング法は以下に説明されている。
【００５８】 Ａ）ＤＮＡポリメラーゼから放出された亜鉛の測定 候補抗菌剤は、ＤＮＡポリメラーゼから亜鉛を追い出す能力を種々の方法によ
り試験できる。例えば、本発明の方法で有用なＤＮＡポリメラーゼを産生する細
菌を、放射性65Ｚｎを補給した環境亜鉛を含まない培地で増殖させることができ
る。
り試験できる。例えば、本発明の方法で有用なＤＮＡポリメラーゼを産生する細
菌を、放射性65Ｚｎを補給した環境亜鉛を含まない培地で増殖させることができ
る。
【００５９】 亜鉛を含まない培地は、最初に培地内へ十分量のＣｈｅｌｅｘ−Ｎａ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）を環境亜鉛を除去するのに十分な時間混合する。Ｃｈｅｌｅｘを培地
から除去し、約０．５から２μＣｉ／ｍｌ培地まで培地へ［65Ｚｎ］Ｃｌ2を加
える。細菌をこの標識化培地中で増殖させ、放射活性亜鉛標識ＤＮＡポリメラー
ゼを前記の方法を使用して単離および精製する。好適には、ＤＮＡポリメラーゼ
へ非特異的に結合されている亜鉛を前記の透析法により除去する。
−Ｒａｄ）を環境亜鉛を除去するのに十分な時間混合する。Ｃｈｅｌｅｘを培地
から除去し、約０．５から２μＣｉ／ｍｌ培地まで培地へ［65Ｚｎ］Ｃｌ2を加
える。細菌をこの標識化培地中で増殖させ、放射活性亜鉛標識ＤＮＡポリメラー
ゼを前記の方法を使用して単離および精製する。好適には、ＤＮＡポリメラーゼ
へ非特異的に結合されている亜鉛を前記の透析法により除去する。
【００６０】 候補抗菌化合物は、ポリメラーゼのジンクフィンガーおよび化合物間の接触を
可能にする条件下、単離された亜鉛標識ＤＮＡポリメラーゼの水性混合物または
溶液へ添加できる。測定を容易にするため、ポリメラーゼは随意に固形支持体（
例えば、セファロースビーズ）へ結合されている。もし、化合物がジンクフィン
ガーからの亜鉛の追い出しに有効であれば、放射活性は溶液内へ放出され、タン
パク質から失われる。タンパク質の放射活性レベルまたはタンパク質を含まない
溶液の放射活性が計数でき、化合物が有効かどうかが決定される。もし、化合物
により特異的に結合されている亜鉛の少なくとも２５％が除去されたとしたら、
化合物は亜鉛の追い出しに有効であると考えられる。好適には亜鉛の少なくとも
５０％（例えば、少なくとも７５％、９０％または９５％）が除去される。
可能にする条件下、単離された亜鉛標識ＤＮＡポリメラーゼの水性混合物または
溶液へ添加できる。測定を容易にするため、ポリメラーゼは随意に固形支持体（
例えば、セファロースビーズ）へ結合されている。もし、化合物がジンクフィン
ガーからの亜鉛の追い出しに有効であれば、放射活性は溶液内へ放出され、タン
パク質から失われる。タンパク質の放射活性レベルまたはタンパク質を含まない
溶液の放射活性が計数でき、化合物が有効かどうかが決定される。もし、化合物
により特異的に結合されている亜鉛の少なくとも２５％が除去されたとしたら、
化合物は亜鉛の追い出しに有効であると考えられる。好適には亜鉛の少なくとも
５０％（例えば、少なくとも７５％、９０％または９５％）が除去される。
【００６１】 Ｂ）ポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性の測定 最初のスクリーニングを通過した後、候補抗菌化合物はＤＮＡポリメラーゼ活
性を阻害する能力でもスクリーニングできる。エキソヌクレアーゼ活性、ならび
にポリメラーゼ活性に対する化合物の影響が測定できる。
性を阻害する能力でもスクリーニングできる。エキソヌクレアーゼ活性、ならび
にポリメラーゼ活性に対する化合物の影響が測定できる。
【００６２】 ポリメラーゼ活性は当該技術分野でよく知られている多くの方法により測定で
きる、例えば、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２ ６２ ：３５−４２（１９９５）に記載されている方法。簡単には、酵素の適当な
希釈液の５マイクロリットルを２０μｌのポリメラーゼアッセイ混合物（１８．
７５ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３１．２５μ
Ｍ ｄＡＴＰ、３１．２５μＭ ｄＣＴＰ、３１．２５μＭ ｄＧＴＰ、１２．
５μＭ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ［１．５μＣｉ／μｍｏｌ］、１．２５ｍＭ
ＤＴＴ、２０％グリセロール、および０．５ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ）と迅速に
混合し、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍｌの冷１０％
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することに
より停止させる。０℃で約１０分後、試料はＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルタ
ーで濾過し、最初に冷１Ｍ ＨＣｌ含有１００ｍＭピロリン酸ナトリウム、続い
て冷エタノールで洗浄する。フィルターを乾燥させ、その放射活性を液体シンチ
レーション計数により定量する。
きる、例えば、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２ ６２ ：３５−４２（１９９５）に記載されている方法。簡単には、酵素の適当な
希釈液の５マイクロリットルを２０μｌのポリメラーゼアッセイ混合物（１８．
７５ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３１．２５μ
Ｍ ｄＡＴＰ、３１．２５μＭ ｄＣＴＰ、３１．２５μＭ ｄＧＴＰ、１２．
５μＭ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ［１．５μＣｉ／μｍｏｌ］、１．２５ｍＭ
ＤＴＴ、２０％グリセロール、および０．５ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ）と迅速に
混合し、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍｌの冷１０％
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することに
より停止させる。０℃で約１０分後、試料はＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルタ
ーで濾過し、最初に冷１Ｍ ＨＣｌ含有１００ｍＭピロリン酸ナトリウム、続い
て冷エタノールで洗浄する。フィルターを乾燥させ、その放射活性を液体シンチ
レーション計数により定量する。
【００６３】 ＤＮＡに対するポリメラーゼのミカエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定数（ＫM
）を決定するため、アッセイ間の活性化ウシ胸腺ＤＮＡの濃度を０．０から０．
８ｍｇ／ｍｌまで変化させる。ｄＧＴＰに対するＫMを決定するためには、［3Ｈ
］ｄＴＭＰの取り込みがｄＧＴＰ濃度（例えば、０．０から０．５ｍＭ）の関数
として追跡でき、取り込みの値はｄＧＴＰに依存しないバックグラウンド取り込
みで補正される。
）を決定するため、アッセイ間の活性化ウシ胸腺ＤＮＡの濃度を０．０から０．
８ｍｇ／ｍｌまで変化させる。ｄＧＴＰに対するＫMを決定するためには、［3Ｈ
］ｄＴＭＰの取り込みがｄＧＴＰ濃度（例えば、０．０から０．５ｍＭ）の関数
として追跡でき、取り込みの値はｄＧＴＰに依存しないバックグラウンド取り込
みで補正される。
【００６４】 エキソヌクレアーゼ活性もまたＢａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．前記文献、に記載
されている方法を含んで、当該技術分野でよく知られている方法により測定でき
る。例えば、酵素の適当な希釈液の５マイクロリットルを４５μｌのエキソヌク
レアーゼアッセイ混合物（３３．３ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、７．４ｍＭ塩化
マグネシウム、３．３ｍＭ ＤＴＴ、１１．１％グリセロール、および3Ｈ−標
識変性ＤＮＡ［０．０５−０．２μｇ／μｌ；約７０，０００ｃｐｍ／アッセイ
］）と迅速に混合し、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍ
ｌの１０％ＴＣＡ含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することにより停止
させる。共沈殿物として５０μｌのウシ血清アルブミンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を
加えた。０℃で約１０分後、試料を１５，０００ｇで２０分遠心分離する。４０
０μｌの上清を採り、２ｍｌの水性シンチレーション剤中で放射活性をアッセイ
した。もし、反応における化合物の存在がエキソヌクレアーゼ活性の実質的な減
少を導いたとしたら、候補化合物はエキソヌクレアーゼ活性の阻害に有効である
。
されている方法を含んで、当該技術分野でよく知られている方法により測定でき
る。例えば、酵素の適当な希釈液の５マイクロリットルを４５μｌのエキソヌク
レアーゼアッセイ混合物（３３．３ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、７．４ｍＭ塩化
マグネシウム、３．３ｍＭ ＤＴＴ、１１．１％グリセロール、および3Ｈ−標
識変性ＤＮＡ［０．０５−０．２μｇ／μｌ；約７０，０００ｃｐｍ／アッセイ
］）と迅速に混合し、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍ
ｌの１０％ＴＣＡ含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することにより停止
させる。共沈殿物として５０μｌのウシ血清アルブミンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を
加えた。０℃で約１０分後、試料を１５，０００ｇで２０分遠心分離する。４０
０μｌの上清を採り、２ｍｌの水性シンチレーション剤中で放射活性をアッセイ
した。もし、反応における化合物の存在がエキソヌクレアーゼ活性の実質的な減
少を導いたとしたら、候補化合物はエキソヌクレアーゼ活性の阻害に有効である
。
【００６５】 エキソヌクレアーゼ基質に対するＫMを決定するため、一本鎖ＤＮＡの濃度を
０．０から０．２ｍｇ／ｍｌまで変化させた。 Ｃ）殺菌活性の測定 候補抗菌化合物は細菌の細胞分裂速度を減少させる能力でスクリーニングでき
る（静菌および／または殺菌活性）。細胞分裂速度を測定する方法は当該技術分
野でよく知られている。例えば、細胞分裂速度は二つの時間点での細胞数の相違
を計数し、その相違のｌｏｇ2をとり、その値を二つの時間点間に経過した時間
で割ることにより測定できる。化合物存在下で増殖した細菌の測定された細胞分
裂速度が化合物不在下よりも実質的に遅かったならば、候補化合物は細胞分裂速
度を減少させるのに有効である。
０．０から０．２ｍｇ／ｍｌまで変化させた。 Ｃ）殺菌活性の測定 候補抗菌化合物は細菌の細胞分裂速度を減少させる能力でスクリーニングでき
る（静菌および／または殺菌活性）。細胞分裂速度を測定する方法は当該技術分
野でよく知られている。例えば、細胞分裂速度は二つの時間点での細胞数の相違
を計数し、その相違のｌｏｇ2をとり、その値を二つの時間点間に経過した時間
で割ることにより測定できる。化合物存在下で増殖した細菌の測定された細胞分
裂速度が化合物不在下よりも実質的に遅かったならば、候補化合物は細胞分裂速
度を減少させるのに有効である。
【００６６】 一次スクリーニングの例として、候補抗菌化合物は滅菌ＤＭＳＯに溶解され、
ミリリットル当たり約１０6コロニー形成単位（ｃｆｕ）で対数増殖期のメチシ
リン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ番号２９２１３号）を含んでいるミュラー
−ヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ）（ＭＨＢ；Ｄ
ｉｆｃｏ）内へ１００倍に希釈する（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）。対照培養物は
１％ＤＭＳＯのみを含んでいる。化合物および対照培養物は３７℃でインキュベ
ートし、続いての２４時間の間の特定の時点で培養物から試料を採取する。各々
の試料はＭＨＢに希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種することにより、ｃｆｕ／ｍ
ｌで細菌をアッセイする。もし、化合物存在下において、関連した試料のｃｆｕ
／ｍｌが化合物不在下と比較して少なくとも５０％減少していたら、候補化合物
は殺菌活性を持っているといわれる。
ミリリットル当たり約１０6コロニー形成単位（ｃｆｕ）で対数増殖期のメチシ
リン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ番号２９２１３号）を含んでいるミュラー
−ヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ）（ＭＨＢ；Ｄ
ｉｆｃｏ）内へ１００倍に希釈する（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）。対照培養物は
１％ＤＭＳＯのみを含んでいる。化合物および対照培養物は３７℃でインキュベ
ートし、続いての２４時間の間の特定の時点で培養物から試料を採取する。各々
の試料はＭＨＢに希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種することにより、ｃｆｕ／ｍ
ｌで細菌をアッセイする。もし、化合物存在下において、関連した試料のｃｆｕ
／ｍｌが化合物不在下と比較して少なくとも５０％減少していたら、候補化合物
は殺菌活性を持っているといわれる。
【００６７】 化合物暴露細菌が抗菌化合物に対する耐性を発生させたかどうかを決定するた
め、少なくともいくらかの増殖を可能にする化合物濃度を含んでいる培地中で細
菌を３日間増殖させた。この細菌は二次殺菌活性アッセイ（前記と同一の方法）
で使用された。もし、二次アッセイにおいて観察されたｃｆｕ／ｍｌの減少が一
次アッセイにおいて観察されたｃｆｕ／ｍｌの減少より実質的に少なかったら耐
性が示される。もしくは、１０8ｃｆｕの細菌を抗菌化合物の３Ｘ、１０Ｘまた
は３０Ｘ ＭＩＣを含んでいる１５０ｍｍのペトリ皿上に播種する。３７℃で３
日間インキュベーション後、コロニーを計数し、播種した細胞数と関係付けると
、突然変異頻度の概算が得られる。
め、少なくともいくらかの増殖を可能にする化合物濃度を含んでいる培地中で細
菌を３日間増殖させた。この細菌は二次殺菌活性アッセイ（前記と同一の方法）
で使用された。もし、二次アッセイにおいて観察されたｃｆｕ／ｍｌの減少が一
次アッセイにおいて観察されたｃｆｕ／ｍｌの減少より実質的に少なかったら耐
性が示される。もしくは、１０8ｃｆｕの細菌を抗菌化合物の３Ｘ、１０Ｘまた
は３０Ｘ ＭＩＣを含んでいる１５０ｍｍのペトリ皿上に播種する。３７℃で３
日間インキュベーション後、コロニーを計数し、播種した細胞数と関係付けると
、突然変異頻度の概算が得られる。
【００６８】 Ｄ）最小阻止濃度（ＭＩＣ） 候補抗菌化合物の最小阻止濃度を決定するため、対数期細菌培養物を、１％Ｄ
ＭＳＯ含有ＬＢ培地で約１０4／ｍｌに希釈する。０．５ｍｌの懸濁液を４８ウ
ェルマイクロタイタープレートの各々のウェルに加える。化合物の２００、１０
０、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５７５または０ミリモ
ル濃度が達成されるようにウェルに化合物を加える。プレートは３７℃で２４時
間インキュベートし、ウェルを目で検査して読みとる。最小阻止濃度（ＭＩＣ）
は、視覚的に細菌増殖が明らかでない最も低い阻害剤の濃度として定義されてい
る。
ＭＳＯ含有ＬＢ培地で約１０4／ｍｌに希釈する。０．５ｍｌの懸濁液を４８ウ
ェルマイクロタイタープレートの各々のウェルに加える。化合物の２００、１０
０、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５７５または０ミリモ
ル濃度が達成されるようにウェルに化合物を加える。プレートは３７℃で２４時
間インキュベートし、ウェルを目で検査して読みとる。最小阻止濃度（ＭＩＣ）
は、視覚的に細菌増殖が明らかでない最も低い阻害剤の濃度として定義されてい
る。
【００６９】 もしくは、ＭＩＣは以下のように決定できる。４８、２４、１２、６、３、１
．５、０．７５、０．３７５および０．１９μｇ／ｍｌの化合物濃度が達成され
るように、１．４％寒天を含んでいる液体ＬＢ培地の個々の容器へ６０℃で化合
物の貯蔵溶液を加える。ＬＢ寒天をペトリプレート上に注いで固化させる。約５
００から１０００ｃｆｕの１００μｌを各々のペトリプレート上へ播種する（化
合物なしの対照プレートを含んで）。プレートは３７℃で２４時間インキュベー
トする。ＭＩＣはコロニー形成が観察されない最も低い濃度として決定される。
．５、０．７５、０．３７５および０．１９μｇ／ｍｌの化合物濃度が達成され
るように、１．４％寒天を含んでいる液体ＬＢ培地の個々の容器へ６０℃で化合
物の貯蔵溶液を加える。ＬＢ寒天をペトリプレート上に注いで固化させる。約５
００から１０００ｃｆｕの１００μｌを各々のペトリプレート上へ播種する（化
合物なしの対照プレートを含んで）。プレートは３７℃で２４時間インキュベー
トする。ＭＩＣはコロニー形成が観察されない最も低い濃度として決定される。
【００７０】 Ｅ）インビトロ細胞毒性スクリーニング 候補抗菌化合物はまたインビトロ細胞毒性でスクリーニングできる。種々の濃
度で、化合物を対数的に増殖している哺乳動物細胞（例えば、ヒーラＳ３）の小
撹拌培養液に加える。続いての４８時間の間に８時間間隔で培養液から試料を採
取して細胞数を標準技術（例えば、コールターカウンターで）により計数する。
好適には、化合物はＭＩＣ濃度（前記）の３Ｘおよび１０Ｘで評価される。
度で、化合物を対数的に増殖している哺乳動物細胞（例えば、ヒーラＳ３）の小
撹拌培養液に加える。続いての４８時間の間に８時間間隔で培養液から試料を採
取して細胞数を標準技術（例えば、コールターカウンターで）により計数する。
好適には、化合物はＭＩＣ濃度（前記）の３Ｘおよび１０Ｘで評価される。
【００７１】 Ｆ）インビボ致死保護スクリーニング 候補抗菌化合物が致死的細菌感染から動物を保護できるかどうかを決定するた
め、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌”スミス（Ｓｍｉｔｈ）”株の単一腹腔内
（ｉｐ）注射により（０．５ｍｌ生理学的食塩水；４ｘ１０7ｃｆｕ／マウス）
、２０グラムのメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを感染させた。１時間後
、マウスに種々の溶液／懸濁液を個々に注射した。陰性対照マウスには０．１ｍ
ｌの生理学的食塩水を注射した。陽性対照マウスには４ｍｇ／ｍｌのバンコマイ
シン食塩溶液を０．１ｍｌ注射した（これは２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量に相当す
る）。試験マウスには約１から１０ｍｇ／ｋｇの化合物を適切な希釈剤を用いて
注射した。もし化合物希釈液が食塩水でない場合、第二陰性対照として別のマウ
スに化合物希釈液が注射された。各々のマウスは３日間にわたって生存がモニタ
ーされた。もし、化合物またはバンコマイシンを注射されたマウスは生きている
が、希釈液を受けたマウスが観察期間の最後に死んでいたら、化合物はこの致死
的感染を防いだといわれる。
め、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌”スミス（Ｓｍｉｔｈ）”株の単一腹腔内
（ｉｐ）注射により（０．５ｍｌ生理学的食塩水；４ｘ１０7ｃｆｕ／マウス）
、２０グラムのメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを感染させた。１時間後
、マウスに種々の溶液／懸濁液を個々に注射した。陰性対照マウスには０．１ｍ
ｌの生理学的食塩水を注射した。陽性対照マウスには４ｍｇ／ｍｌのバンコマイ
シン食塩溶液を０．１ｍｌ注射した（これは２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量に相当す
る）。試験マウスには約１から１０ｍｇ／ｋｇの化合物を適切な希釈剤を用いて
注射した。もし化合物希釈液が食塩水でない場合、第二陰性対照として別のマウ
スに化合物希釈液が注射された。各々のマウスは３日間にわたって生存がモニタ
ーされた。もし、化合物またはバンコマイシンを注射されたマウスは生きている
が、希釈液を受けたマウスが観察期間の最後に死んでいたら、化合物はこの致死
的感染を防いだといわれる。
【００７２】 保護スクリーニングは市販のサブコントラクター（例えば、ＭＤＳ Ｐａｎｌ
ａｂｓ，Ｉｎｃ）によっても実施できる。 Ｇ）インビボ急性毒性スクリーニング 候補抗菌化合物のインビボ急性毒性が決定できる。種々の濃度の化合物がマウ
スの尾静脈へ投与された。各々のマウスは２５、５０、１００または１５０ｍｇ
化合物／ｋｇ体重を含む０．０５から０．２ｍｌの接種物を受け取った。マウス
は嗜眠、震え、不動性状態になる傾向または猫背のような急性毒性の徴候を１２
時間密に観察する。一時的不快以上のことを起こす用量に注目する。研究に使用
されたすべての動物は、観察期間の終了時に断頭により安楽死させる。
ａｂｓ，Ｉｎｃ）によっても実施できる。 Ｇ）インビボ急性毒性スクリーニング 候補抗菌化合物のインビボ急性毒性が決定できる。種々の濃度の化合物がマウ
スの尾静脈へ投与された。各々のマウスは２５、５０、１００または１５０ｍｇ
化合物／ｋｇ体重を含む０．０５から０．２ｍｌの接種物を受け取った。マウス
は嗜眠、震え、不動性状態になる傾向または猫背のような急性毒性の徴候を１２
時間密に観察する。一時的不快以上のことを起こす用量に注目する。研究に使用
されたすべての動物は、観察期間の終了時に断頭により安楽死させる。
【００７３】 Ｈ）インビボ半減期 候補抗菌化合物の静脈内インビボ半減期を見積もることができる。マウスに尾
静脈を通して、急性毒性を起こさない最も高い投与量（前記参照）を注射する。
注射１０、３０、４５、９０および１５０分後、２匹のマウスを断頭し、瀉血に
より滅菌試験管内へ血液を集める。血液試料は遠心分離して血漿を集める。０．
２ｍｌの血漿をＨＰＬＣ分析に使用して、注射後の示された時間における血液中
の化合物量を決定する。
静脈を通して、急性毒性を起こさない最も高い投与量（前記参照）を注射する。
注射１０、３０、４５、９０および１５０分後、２匹のマウスを断頭し、瀉血に
より滅菌試験管内へ血液を集める。血液試料は遠心分離して血漿を集める。０．
２ｍｌの血漿をＨＰＬＣ分析に使用して、注射後の示された時間における血液中
の化合物量を決定する。
【００７４】 半減期は、血液化合物レベルが特定の時間に認められた前量の５０％に到達す
るのに必要な時間を注目することにより決定され、ただし、時間点は血液化合物
レベルの衰退期にとられる。別の言葉で言えば、最大血液化合物レベルは、半減
期を決定する目的で時間を指定された試料が採取される前に達成される。
るのに必要な時間を注目することにより決定され、ただし、時間点は血液化合物
レベルの衰退期にとられる。別の言葉で言えば、最大血液化合物レベルは、半減
期を決定する目的で時間を指定された試料が採取される前に達成される。
【００７５】 もしくは、血液以外の他の組織で投与後の化合物レベルが評価できる。例えば
、殺したマウスから血液を集める代わりに肝臓を採取し、ホモジナイズし、透明
化し、化合物レベルをアッセイする。種々の組織における化合物レベルおよび半
減期は、化合物の組織分布、および一つの投与方法における血液化合物レベルと
他の組織でのレベル間の変異を決定するために有用である。
、殺したマウスから血液を集める代わりに肝臓を採取し、ホモジナイズし、透明
化し、化合物レベルをアッセイする。種々の組織における化合物レベルおよび半
減期は、化合物の組織分布、および一つの投与方法における血液化合物レベルと
他の組織でのレベル間の変異を決定するために有用である。
【００７６】 そのような結果はまた、特定の投与経路に関連する薬理学的相違の決定に重要
である。例えば、化合物は皮下で投与された場合より吸入で投与された場合に肺
において劇的に高い生物利用能を持つことができた。
である。例えば、化合物は皮下で投与された場合より吸入で投与された場合に肺
において劇的に高い生物利用能を持つことができた。
【００７７】 Ｉ）大腿感染マウスモデルを使用したインビボ効能スクリーニング インビボ効能スクリーニングはまた、以下に記載される大腿感染モデルを使用
しても実施できる。このモデルは合理的で、融通性があり、比較的安価であり再
現性がよい。それは当該技術分野で記載されている（例えば、Ｇｕｄｍｕｎｄｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３ １ ：１７７−１９１，１９９３、を参照されたい）。
しても実施できる。このモデルは合理的で、融通性があり、比較的安価であり再
現性がよい。それは当該技術分野で記載されている（例えば、Ｇｕｄｍｕｎｄｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３ １ ：１７７−１９１，１９９３、を参照されたい）。
【００７８】 大腿感染マウスモデルにおいて、マウスは広範囲の細菌による感染に対して感
受性を高くするために好中球を減少させる（例えば、マウスにシクロホスファミ
ドを投与することにより）。マウスは次に、大腿への試験細菌（一つまたはそれ
以上の種）の筋肉内（ｉｍ）注射により感染させる。感染マウスは典型的には少
なくとも３群に分割される。第一の群は候補抗菌化合物による処置を受ける。第
二の群は既知の有効な抗生物質（例えば、バンコマイシン）を注射される。第三
の群は、もし希釈剤が両方の場合で同一であれば、化合物を送達するために使用
された希釈剤のみが注射される。もし、化合物のために使用された希釈剤がバン
コマイシンに使用されたものと異なっていれば、第二の希釈剤の影響を試験する
ために別の対照群が必要とされるであろう。
受性を高くするために好中球を減少させる（例えば、マウスにシクロホスファミ
ドを投与することにより）。マウスは次に、大腿への試験細菌（一つまたはそれ
以上の種）の筋肉内（ｉｍ）注射により感染させる。感染マウスは典型的には少
なくとも３群に分割される。第一の群は候補抗菌化合物による処置を受ける。第
二の群は既知の有効な抗生物質（例えば、バンコマイシン）を注射される。第三
の群は、もし希釈剤が両方の場合で同一であれば、化合物を送達するために使用
された希釈剤のみが注射される。もし、化合物のために使用された希釈剤がバン
コマイシンに使用されたものと異なっていれば、第二の希釈剤の影響を試験する
ために別の対照群が必要とされるであろう。
【００７９】 処置を始める直前に、および注射後の前もって決められた時間に動物を殺す。
細菌が注射された大腿の一部を取り出し、滅菌食塩水中でホモジナイズし、希釈
し、細菌含量をｃｆｕ／ｍｌで決定するために標準細菌寒天プレート上に播種す
る。
細菌が注射された大腿の一部を取り出し、滅菌食塩水中でホモジナイズし、希釈
し、細菌含量をｃｆｕ／ｍｌで決定するために標準細菌寒天プレート上に播種す
る。
【００８０】 典型的には、実験観察期間に非処置動物の死亡を避けるように感染は計画され
る。非処置感染動物の大腿中の細菌が対数で２から３（ｔｗｏ ｔｏ ｔｈｒｅ
ｅ ｌｏｇｓ）を超えない程度で増殖するように、接種物および観察期間が選択
されるならば、死亡を避けることができる。化合物の有効性は典型的には、この
増殖を防止するために、および細菌負荷を希釈剤処置動物に存在する細菌負荷の
５０％より低くするように与えられた投与量の能力に基づいている。このアッセ
イにおいて、４時間毎に静脈内に投与された４０ｍｇ／ｋｇバンコマイシンは、
対照大腿と比較して黄色ブドウ球菌増殖を対数で２から４の範囲で減少させた。
る。非処置感染動物の大腿中の細菌が対数で２から３（ｔｗｏ ｔｏ ｔｈｒｅ
ｅ ｌｏｇｓ）を超えない程度で増殖するように、接種物および観察期間が選択
されるならば、死亡を避けることができる。化合物の有効性は典型的には、この
増殖を防止するために、および細菌負荷を希釈剤処置動物に存在する細菌負荷の
５０％より低くするように与えられた投与量の能力に基づいている。このアッセ
イにおいて、４時間毎に静脈内に投与された４０ｍｇ／ｋｇバンコマイシンは、
対照大腿と比較して黄色ブドウ球菌増殖を対数で２から４の範囲で減少させた。
【００８１】 希釈剤および投与経路の選択は、各々の候補化合物の物理的特性により主とし
て規定されるであろう。水に著しい溶解性を持っている化合物に対しては、任意
の経路による食塩水での溶解および投与が可能である。より疎水性の化合物は、
腹腔内投与のためのＤＭＳＯおよび水の混合物（例えば、８０％ＤＭＳＯ［ｖ／
ｖ］）または９０％ピーナッツ油を含むＤＭＳＯが必要とされるであろう。皮下
投与のために、ほとんど不溶性の化合物がグリセロール、ポリエチレングリコー
ルおよび水の混合物中にミクロ化／可溶化できる。 ＩＶ．医薬組成物およびその投与 本発明の抗菌化合物は動物、特にヒトに投与するために適した医薬組成物に処
方できる。
て規定されるであろう。水に著しい溶解性を持っている化合物に対しては、任意
の経路による食塩水での溶解および投与が可能である。より疎水性の化合物は、
腹腔内投与のためのＤＭＳＯおよび水の混合物（例えば、８０％ＤＭＳＯ［ｖ／
ｖ］）または９０％ピーナッツ油を含むＤＭＳＯが必要とされるであろう。皮下
投与のために、ほとんど不溶性の化合物がグリセロール、ポリエチレングリコー
ルおよび水の混合物中にミクロ化／可溶化できる。 ＩＶ．医薬組成物およびその投与 本発明の抗菌化合物は動物、特にヒトに投与するために適した医薬組成物に処
方できる。
【００８２】 Ａ）新規抗菌化合物 新規抗菌化合物は典型的には３つの成分を含んでいる：グラム陽性真正細菌ま
たはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分（”Ａ”）、ジ
ンクフィンガー反応性部分（”Ｂ”）、およびｐｏｌＩＩＩ活性部位結合部分お
よびジンクフィンガー反応性部分を一緒に連結するリンカー（”Ｌ”）。新規抗
菌化合物は一般式：Ａ−（Ｌ−Ｂ）mにより表される。新規抗菌化合物は２まで
のジンクフィンガー反応性部分を持つことができるので、ｍは正の整数１または
２であろう。
たはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分（”Ａ”）、ジ
ンクフィンガー反応性部分（”Ｂ”）、およびｐｏｌＩＩＩ活性部位結合部分お
よびジンクフィンガー反応性部分を一緒に連結するリンカー（”Ｌ”）。新規抗
菌化合物は一般式：Ａ−（Ｌ−Ｂ）mにより表される。新規抗菌化合物は２まで
のジンクフィンガー反応性部分を持つことができるので、ｍは正の整数１または
２であろう。
【００８３】 ｐｏｌＩＩＩ活性部位結合部分は、そのような活性部位へ結合することが知ら
れている化合物から改変されるであろう、例えば、以下に示した式を持っている
化合物：
れている化合物から改変されるであろう、例えば、以下に示した式を持っている
化合物：
【００８４】
【化１２】
【００８５】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件で；Ｒ1
およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、また
は−Ｌ−Ｂである。Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、ハ
ロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；およびｎは０、１または２で
ある。
およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、また
は−Ｌ−Ｂである。Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、ハ
ロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；およびｎは０、１または２で
ある。
【００８６】 リンカーは直接結合のように短いか、またはＣ18アルキレン鎖のように長くて
もよい。リンカーがアルキレン鎖である場合、それは任意にエーテル、チオエー
テル、アミン、エステル、チオエステルまたはアミドを含むことができる。例え
ば、アルキレン鎖は多（例えば、１−５）アミン基を含むことができる。適した
例は−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）−基であろう。リンカ
ーは分岐鎖アルキレン鎖でもよい、例えば、−ＣＨ（−（ＣＨ2）3−）−Ｏ−（
ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−基、これは１つ以上のジンクフィンガー反応性部分
を結合できる。エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、チオエステルまた
はアミド基はまたリンカーの末端にも存在でき、従って、別に２つの残基をリン
カーへ連結する。
もよい。リンカーがアルキレン鎖である場合、それは任意にエーテル、チオエー
テル、アミン、エステル、チオエステルまたはアミドを含むことができる。例え
ば、アルキレン鎖は多（例えば、１−５）アミン基を含むことができる。適した
例は−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）−基であろう。リンカ
ーは分岐鎖アルキレン鎖でもよい、例えば、−ＣＨ（−（ＣＨ2）3−）−Ｏ−（
ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−基、これは１つ以上のジンクフィンガー反応性部分
を結合できる。エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、チオエステルまた
はアミド基はまたリンカーの末端にも存在でき、従って、別に２つの残基をリン
カーへ連結する。
【００８７】 ジンクフィンガー反応性部分は当該技術分野でよく知られているジンクフィン
ガー反応性部分から改変される、例えば、アゾジ（ビス）尿素基、芳香族または
脂肪族ジスルフィド基、芳香族または脂肪族ニトロソ基、チオスルホナート基ま
たはチアゾリドン基。そのような残基は、亜鉛イオンと直接的に結合を形成する
ことにより、または亜鉛イオンに配位しているアミノ酸残基（例えば、システイ
ンまたはヒスチジン残基）と結合することによりジンクフィンガーから亜鉛イオ
ンを追い出す、さもなくば相互作用する。ここで用語”結合”とは共有結合、イ
オン結合または水素結合のような結合の任意の形でありうることに注意されたい
。例えば、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：３６０６
−３６１６（１９９６）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．，３７：４２６７−４２６９（１９９４）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．，３８：３２６４−３２７０（１９９５）；Ｆｕｊｉｔａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１９９６）
；Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：４３１３−４３２０
（１９９６）；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９ ：５０３２−５０３６（１９８４）；およびＬｏｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９５：６６６３−６６６８（１９９
８）を参照されたい。
ガー反応性部分から改変される、例えば、アゾジ（ビス）尿素基、芳香族または
脂肪族ジスルフィド基、芳香族または脂肪族ニトロソ基、チオスルホナート基ま
たはチアゾリドン基。そのような残基は、亜鉛イオンと直接的に結合を形成する
ことにより、または亜鉛イオンに配位しているアミノ酸残基（例えば、システイ
ンまたはヒスチジン残基）と結合することによりジンクフィンガーから亜鉛イオ
ンを追い出す、さもなくば相互作用する。ここで用語”結合”とは共有結合、イ
オン結合または水素結合のような結合の任意の形でありうることに注意されたい
。例えば、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：３６０６
−３６１６（１９９６）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．，３７：４２６７−４２６９（１９９４）；Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．，３８：３２６４−３２７０（１９９５）；Ｆｕｊｉｔａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１９９６）
；Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：４３１３−４３２０
（１９９６）；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９ ：５０３２−５０３６（１９８４）；およびＬｏｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９５：６６６３−６６６８（１９９
８）を参照されたい。
【００８８】 新規抗菌化合物は以下に示した一般法に従って製造できる。 Ｂ）新規抗菌化合物を製造する方法 新規抗菌化合物の製造のためには多くの異なった経路が存在する。以下の一般
法に制限されるわけではない。
法に制限されるわけではない。
【００８９】 新規抗菌化合物の製造はｐｏｌＩＩＩ活性部位結合部分（”Ａ”）をリンカー
（”Ｌ”）とカップリングさせることから始めることができる。３−置換ピリミ
ジンおよび７−および９−置換プリンの製造法は各々米国特許第５，５１６，９
０５号および５，６４６，１５５号に詳細に記載されている。置換基はさらに修
飾でき、ジンクフィンガー反応性部分（”Ｂ”）へカップリングするためにその
末端に官能性基を含むリンカー部分を形成する。適したリンカー末端官能性基に
は置換反応のための典型的脱離基、例えば、ハライド；活性化カルボン酸誘導体
（例えば、酸ハライド）とアミド結合を形成するためのアミン基；または他のチ
オ含有化合物とジスルフィド結合を形成するためのチオ基が含まれる。以下のス
キームは種々の新規抗菌化合物の製造を例示している。
（”Ｌ”）とカップリングさせることから始めることができる。３−置換ピリミ
ジンおよび７−および９−置換プリンの製造法は各々米国特許第５，５１６，９
０５号および５，６４６，１５５号に詳細に記載されている。置換基はさらに修
飾でき、ジンクフィンガー反応性部分（”Ｂ”）へカップリングするためにその
末端に官能性基を含むリンカー部分を形成する。適したリンカー末端官能性基に
は置換反応のための典型的脱離基、例えば、ハライド；活性化カルボン酸誘導体
（例えば、酸ハライド）とアミド結合を形成するためのアミン基；または他のチ
オ含有化合物とジスルフィド結合を形成するためのチオ基が含まれる。以下のス
キームは種々の新規抗菌化合物の製造を例示している。
【００９０】 Ｂへのカップリングのために適した末端官能性基を持つＬ−Ａの製造 前記のように、残基Ｌは修飾してＢへのカップリングのための官能性基が形成
される。そのような官能性基の３つの例が以下に例示されている、即ち、−Ｉ（
化合物Ｉ）、−ＳＨ（化合物ＩＩ）および−ＮＨ（化合物ＩＩＩ）。
される。そのような官能性基の３つの例が以下に例示されている、即ち、−Ｉ（
化合物Ｉ）、−ＳＨ（化合物ＩＩ）および−ＮＨ（化合物ＩＩＩ）。
【００９１】
【化１３】
【００９２】ＢへのＬ−Ａのカップリング 残基Ｌ上の官能性基は、例えば、アルキル化のようなカップリング反応により
Ｂとカップリングされ、新規抗菌化合物を得る。例示のカップリング反応が以下
に説明されている。反応Ａ 反応Ａにおいて、化合物Ｉは求核置換を進行させ、Ａ−ＬおよびＢ間のアミン
結合を達成し、ヨウ素を脱離基として置き換える。
Ｂとカップリングされ、新規抗菌化合物を得る。例示のカップリング反応が以下
に説明されている。反応Ａ 反応Ａにおいて、化合物Ｉは求核置換を進行させ、Ａ−ＬおよびＢ間のアミン
結合を達成し、ヨウ素を脱離基として置き換える。
【００９３】
【化１４】
【００９４】反応Ｂ 反応Ｂにおいて、化合物ＩＩのチオール基はメチルスルホニル基を置き換え、
最終抗菌化合物中にジスルフィド結合を形成する。同様に、反応Ｃにおいてはク
ロリドが化合物ＩＩのチオ基により置き換えられてスルホナートチオ結合が生成
物に形成される。
最終抗菌化合物中にジスルフィド結合を形成する。同様に、反応Ｃにおいてはク
ロリドが化合物ＩＩのチオ基により置き換えられてスルホナートチオ結合が生成
物に形成される。
【００９５】 反応Ｂ
【００９６】
【化１５】
【００９７】 反応Ｃ
【００９８】
【化１６】
【００９９】反応Ｄ、ＥおよびＦ 反応Ｄ、ＥおよびＦにおいて、化合物ＩＩＩのアミン基は酸クロリドと反応し
、アミド結合を形成する。反応Ｅのアミドの窒素原子はさらに残基Ｂのジスルフ
ィド結合を攻撃し、環の形成を生じる。
、アミド結合を形成する。反応Ｅのアミドの窒素原子はさらに残基Ｂのジスルフ
ィド結合を攻撃し、環の形成を生じる。
【０１００】 反応Ｄ
【０１０１】
【化１７】
【０１０２】 反応Ｅ
【０１０３】
【化１８】
【０１０４】 反応Ｆ
【０１０５】
【化１９】
【０１０６】 Ｃ）処方（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ） 組成物は液剤、懸濁剤、座剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル、軟膏またはク
リーム剤として処方できる。これらの組成物の処方においては、少なくとも一つ
の医薬担体が含まれるであろう。医薬担体の例には、溶剤（例えば、水または生
理学的食塩水）、可溶化剤（例えば、エタノール、ポリソルベートまたはＣｒｅ
ｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標））、等張性を作るための薬剤、保存剤、抗酸化
剤、賦形剤（例えば、ラクトース、デンプン、結晶性セルロース、マンニトール
マルトース、リン酸水素カルシウム、軽無水ケイ酸または炭酸カルシウム）、結
合剤（例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはアラビアゴム）、滑
沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは硬化油）または安定化
剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロ
ゴルまたはポリオキシエチレン硬化ビーバー油）が含まれる。必要に応じ、グリ
セリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤または水酸
化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸水素ナトリウム、ア
ルギニン、メグルミンまたはトリスアミノメタンのような塩基性物質が加えられ
る。もし組成物のゆっくりした放出が必要とされるならば、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラク
チド−コ−グリコチドまたはポリグリコチドのような生分解性ポリマーがバルク
マトリックスとして使用できる（例えば、米国特許第５，４１７，９８６、４，
６７５，３８１および４，４５０，１５０号を参照されたい）。液剤、錠剤、顆
粒剤またはカプセルのような医薬処方はこれらの成分で形成できる。もし、組成
物が経口で投与されるならば、芳香剤および着色剤が添加されるであろう。
リーム剤として処方できる。これらの組成物の処方においては、少なくとも一つ
の医薬担体が含まれるであろう。医薬担体の例には、溶剤（例えば、水または生
理学的食塩水）、可溶化剤（例えば、エタノール、ポリソルベートまたはＣｒｅ
ｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標））、等張性を作るための薬剤、保存剤、抗酸化
剤、賦形剤（例えば、ラクトース、デンプン、結晶性セルロース、マンニトール
マルトース、リン酸水素カルシウム、軽無水ケイ酸または炭酸カルシウム）、結
合剤（例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはアラビアゴム）、滑
沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは硬化油）または安定化
剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロ
ゴルまたはポリオキシエチレン硬化ビーバー油）が含まれる。必要に応じ、グリ
セリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤または水酸
化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸水素ナトリウム、ア
ルギニン、メグルミンまたはトリスアミノメタンのような塩基性物質が加えられ
る。もし組成物のゆっくりした放出が必要とされるならば、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラク
チド−コ−グリコチドまたはポリグリコチドのような生分解性ポリマーがバルク
マトリックスとして使用できる（例えば、米国特許第５，４１７，９８６、４，
６７５，３８１および４，４５０，１５０号を参照されたい）。液剤、錠剤、顆
粒剤またはカプセルのような医薬処方はこれらの成分で形成できる。もし、組成
物が経口で投与されるならば、芳香剤および着色剤が添加されるであろう。
【０１０７】 本発明の組成物中の化合物濃度は、投与される剤形および投与経路を含む多く
の因子に依存して変化するであろう。 Ｄ）投与 本発明の化合物および組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼
、脳室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内、槽内、腹腔内、局所、鼻孔内、エアロゾル、
乱切による非経口投与、および経口、口腔内、直腸、膣内または局所投与により
投与できる。本発明の組成物はまた、本発明の化合物を放出する手術的移植物の
使用によっても投与されるであろう。
の因子に依存して変化するであろう。 Ｄ）投与 本発明の化合物および組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼
、脳室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内、槽内、腹腔内、局所、鼻孔内、エアロゾル、
乱切による非経口投与、および経口、口腔内、直腸、膣内または局所投与により
投与できる。本発明の組成物はまた、本発明の化合物を放出する手術的移植物の
使用によっても投与されるであろう。
【０１０８】 一般的には、本発明の化合物は、典型的には患者がグラム陽性真正細菌または
マイコプラズマ感染に感受性があるまたは持っているかどうかを決定した後、非
経口投与のために約０．１から１０％ｗ／ｖの化合物を含んでいる水性生理学的
緩衝溶液の形で提供できる。一般的投与量範囲は１日当たり、体重ｋｇ当たりで
約０．０１ｍｇから約１ｇであり；好適な投与量範囲は１日当たり、体重ｋｇ当
たりで約５ｍｇから約１００ｍｇである。投与されるべき好適な投与量は取り扱
われている感染の型、進行の程度、患者全体の健康度、および投与経路に依存す
るであろう。局所および経口投与には、処方および用量は他の抗生物質（例えば
、エリスロマイシンまたはバンコマイシン）で使用されるものと同様であろう。実施例 本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、それは特許請求の範囲で定義
されている本発明の範囲を制限するものではない。 実施例１：グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩの各々の分子は亜鉛１分子を含んで いる 図１はグラム陽性真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのドメイン構造を図解し
たものである。ポリメラーゼ活性部位(ｐｏｌ）のＮ末端部分中の高度に保存さ
れたアミノ酸配列はジンクフィンガー構造を形成する能力を持っている。種々の
グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クロ
ストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔ
ｙｒｉｃｕｍ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）およびテルモトガ マリチマ（Ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ））および種々のマイコプラズマ（マイ
コプラズマ プルモニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、マイコ
プラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）およ
びマイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ））のこの領域からの配列のアラインメントは、提案されるジンクフィンガー
が亜鉛イオン配位のための４つのシステイン、または１つのヒスチジンおよび３
つのシステインを含んでいることを示している（四角で囲った配列）。枯草菌配
列で具体的に表現された、これら二つの潜在的ジンクフィンガー構造が表２に示
されている。前記の配列分析に基づき、亜鉛イオンがのジンクフィンガーへ強固
に結合されていることを確認する試みが行われた。
マイコプラズマ感染に感受性があるまたは持っているかどうかを決定した後、非
経口投与のために約０．１から１０％ｗ／ｖの化合物を含んでいる水性生理学的
緩衝溶液の形で提供できる。一般的投与量範囲は１日当たり、体重ｋｇ当たりで
約０．０１ｍｇから約１ｇであり；好適な投与量範囲は１日当たり、体重ｋｇ当
たりで約５ｍｇから約１００ｍｇである。投与されるべき好適な投与量は取り扱
われている感染の型、進行の程度、患者全体の健康度、および投与経路に依存す
るであろう。局所および経口投与には、処方および用量は他の抗生物質（例えば
、エリスロマイシンまたはバンコマイシン）で使用されるものと同様であろう。実施例 本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、それは特許請求の範囲で定義
されている本発明の範囲を制限するものではない。 実施例１：グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩの各々の分子は亜鉛１分子を含んで いる 図１はグラム陽性真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのドメイン構造を図解し
たものである。ポリメラーゼ活性部位(ｐｏｌ）のＮ末端部分中の高度に保存さ
れたアミノ酸配列はジンクフィンガー構造を形成する能力を持っている。種々の
グラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クロ
ストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔ
ｙｒｉｃｕｍ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）およびテルモトガ マリチマ（Ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ））および種々のマイコプラズマ（マイ
コプラズマ プルモニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、マイコ
プラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）およ
びマイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ））のこの領域からの配列のアラインメントは、提案されるジンクフィンガー
が亜鉛イオン配位のための４つのシステイン、または１つのヒスチジンおよび３
つのシステインを含んでいることを示している（四角で囲った配列）。枯草菌配
列で具体的に表現された、これら二つの潜在的ジンクフィンガー構造が表２に示
されている。前記の配列分析に基づき、亜鉛イオンがのジンクフィンガーへ強固
に結合されていることを確認する試みが行われた。
【０１０９】 図２に提案されたようなジンクフィンガー構造は典型的には、亜鉛：ＥＤＴＡ
錯体の親和性定数を超える定数で単一原子の亜鉛を結合している。従って、枯草
菌ｐｏｌＩＩＩにおける強固に結合されている（ＥＤＴＡ抵抗性）亜鉛の存在が
試験された。
錯体の親和性定数を超える定数で単一原子の亜鉛を結合している。従って、枯草
菌ｐｏｌＩＩＩにおける強固に結合されている（ＥＤＴＡ抵抗性）亜鉛の存在が
試験された。
【０１１０】 ｐｏｌＩＩＩの二つの形が試験された。一つ（いわゆる野生型ｐｏｌＩＩＩ）
は枯草菌で観察される天然の酵素と同一であった。他の形は、精製を容易にする
ためにそのＮ末端にヘキサヒスチジン親和性タグを取り込んでいた。
は枯草菌で観察される天然の酵素と同一であった。他の形は、精製を容易にする
ためにそのＮ末端にヘキサヒスチジン親和性タグを取り込んでいた。
【０１１１】 枯草菌ｐｏｌＩＩＩの両方の形は組換え体プラスミドベクターからの枯草菌ｐ ｏｌＣ 遺伝子の誘導可能発現により大腸菌中で発生させた。二つの異なったプラ
スミド系が発現に使用された。一つはプラスミドｐＫＣ３０および大腸菌ＡＲ１
２０に基づいており、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓ ｓ．Ｐｕｒｉｆ ．，３：６５−７０，１９９２、に記載されている。他の系はプ
ラスミドｐＳＧＡ０４に基づいており、発現プラスミドは除去可能Ｎ末端ヘキサ
ヒスチジンタグを持つ組換えタンパク質を発生するように設計されている（Ｇｈ
ｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７６：２４９−２５５，１９９６）。ｐｏ ｌＣ 配列のｐＳＧＡ０４内への遺伝子工学処理は以下の工程を必要とする：（１
）前もって１２４６位にＸｈｏＩ部位を含むように遺伝子工学処理されているｐ ｏｌＣ 形のヌクレオチド１６での新規ＨｐａＩ制限部位の導入（ＰＣＲによる）
（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６５：４５−５０，１９９５）；
（２）生じる１２２８ｂｐ ＨｐａＩ−ＸｈｏＩ断片の切り出し；（３）ベクタ
ーｐＫＣ３０中の完全野生型構築物内への後者の断片の再クローニング（Ｈａｍ
ｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．，３：６５
−７０，１９９２）；（４）最初の１５塩基を欠くｐｏｌＣ遺伝子のＨｐａＩ− ＢａｍＨＩ 断片としての切り出し；および、クレノーによる処理により満たされ
た付着末端を持ち、続いてＢａｍＨＩで切断されているＥｃｏＲＩ−切断ｐＳＧ
Ａ０４内への後者断片の挿入。この組換えｐｏｌＣベクターは、最初の６つのア
ミノ酸が以下の１９残基配列：ＮＨ2−Ｍ Ｇ Ｈ(6) Ｓ Ｇ Ｌ Ｆ Ｋ Ｒ Ｈ Ｍ Ｓ Ｒ Ｉ（配列ＩＤ番号：４）により置き換えられている枯草菌ｐ
ｏｌＩＩＩ形をコード化および発現した。下線を付けたアミノ酸はプロテアーゼ
Ｋｅｘ−２の切断部位を示している。
スミド系が発現に使用された。一つはプラスミドｐＫＣ３０および大腸菌ＡＲ１
２０に基づいており、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓ ｓ．Ｐｕｒｉｆ ．，３：６５−７０，１９９２、に記載されている。他の系はプ
ラスミドｐＳＧＡ０４に基づいており、発現プラスミドは除去可能Ｎ末端ヘキサ
ヒスチジンタグを持つ組換えタンパク質を発生するように設計されている（Ｇｈ
ｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７６：２４９−２５５，１９９６）。ｐｏ ｌＣ 配列のｐＳＧＡ０４内への遺伝子工学処理は以下の工程を必要とする：（１
）前もって１２４６位にＸｈｏＩ部位を含むように遺伝子工学処理されているｐ ｏｌＣ 形のヌクレオチド１６での新規ＨｐａＩ制限部位の導入（ＰＣＲによる）
（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６５：４５−５０，１９９５）；
（２）生じる１２２８ｂｐ ＨｐａＩ−ＸｈｏＩ断片の切り出し；（３）ベクタ
ーｐＫＣ３０中の完全野生型構築物内への後者の断片の再クローニング（Ｈａｍ
ｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．，３：６５
−７０，１９９２）；（４）最初の１５塩基を欠くｐｏｌＣ遺伝子のＨｐａＩ− ＢａｍＨＩ 断片としての切り出し；および、クレノーによる処理により満たされ
た付着末端を持ち、続いてＢａｍＨＩで切断されているＥｃｏＲＩ−切断ｐＳＧ
Ａ０４内への後者断片の挿入。この組換えｐｏｌＣベクターは、最初の６つのア
ミノ酸が以下の１９残基配列：ＮＨ2−Ｍ Ｇ Ｈ(6) Ｓ Ｇ Ｌ Ｆ Ｋ Ｒ Ｈ Ｍ Ｓ Ｒ Ｉ（配列ＩＤ番号：４）により置き換えられている枯草菌ｐ
ｏｌＩＩＩ形をコード化および発現した。下線を付けたアミノ酸はプロテアーゼ
Ｋｅｘ−２の切断部位を示している。
【０１１２】 前記プラスミドの両方が細菌を形質転換するために使用された。細菌はＬＢ発
現培地（０．５％酵母抽出物、１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌおよび０．１
５ｍｇ／ｍｌアンピシリン）で増殖させた。
現培地（０．５％酵母抽出物、１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌおよび０．１
５ｍｇ／ｍｌアンピシリン）で増殖させた。
【０１１３】 野生型枯草菌ｐｏｌＩＩＩは、ｐＫＣ３０ ｐｏｌＣプラスミドで大腸菌ＡＲ
１２０を形質転換して発現させた。発現の誘導および均質な酵素の精製はＨａｍ
ｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．、前記文献、に記載されているように実施された。
１２０を形質転換して発現させた。発現の誘導および均質な酵素の精製はＨａｍ
ｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．、前記文献、に記載されているように実施された。
【０１１４】 形質転換によりｐＳＧＡ０４が大腸菌ＳＧ１０１（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．
、前記文献）内へ導入された。個々の形質転換体は１５μｇ／ｍｌカナマイシン
を含んでいるＬＢ発現培地中、約１．０の吸光度（６００ｎｍ，１ｃｍ光路長）
まで３０℃で増殖させた。培養物は次に約１８℃へ冷却し、１ｍＭまでＩＰＴＧ
を加え、１８℃で振盪しながら約１８時間インキュベーションを続けた。細胞を
０℃に冷却し、遠心分離し、１ｍＭ ＰＭＳＦを含んでいるリン酸緩衝化塩溶液
（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸カリウム［ｐＨ７．６］）で一度
洗浄し、各々の１リットルの培養物に対して３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭリン酸
カリウム［ｐＨ７．５］、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２０％グリセロー
ル、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。
、前記文献）内へ導入された。個々の形質転換体は１５μｇ／ｍｌカナマイシン
を含んでいるＬＢ発現培地中、約１．０の吸光度（６００ｎｍ，１ｃｍ光路長）
まで３０℃で増殖させた。培養物は次に約１８℃へ冷却し、１ｍＭまでＩＰＴＧ
を加え、１８℃で振盪しながら約１８時間インキュベーションを続けた。細胞を
０℃に冷却し、遠心分離し、１ｍＭ ＰＭＳＦを含んでいるリン酸緩衝化塩溶液
（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸カリウム［ｐＨ７．６］）で一度
洗浄し、各々の１リットルの培養物に対して３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭリン酸
カリウム［ｐＨ７．５］、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２０％グリセロー
ル、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。
【０１１５】 誘導培養物１リットルからのヘキサヒスチジンタグ付けｐｏｌＩＩＩの精製は
４℃で実施された。細胞はフレンチプレスで砕き、約２７，０００ｘｇで２時間
遠心分離した。得られた粗上清をＩＭＡＣカラム緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウ
ム［ｐＨ７．５］、２ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび２０％グリセロール
）で平衡化したＮｉ+2−荷電ＩＭＡＣ−アガロース（Ｓｉｇｍａ；使用説明書に
従って調製）の１２．５ｍｌのカラムに加えた。カラムは２容量のＩＭＡＣカラ
ム緩衝液で洗浄し、１０％グリセロールを含んでいる同一の緩衝液の０−２００
ｍＭイミダゾール濃度勾配（２５０ｍｌの全濃度勾配容量）で溶出した。分画を
集め、ポリメラーゼ活性のアッセイを行い、ピーク分画をプールした。
４℃で実施された。細胞はフレンチプレスで砕き、約２７，０００ｘｇで２時間
遠心分離した。得られた粗上清をＩＭＡＣカラム緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウ
ム［ｐＨ７．５］、２ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび２０％グリセロール
）で平衡化したＮｉ+2−荷電ＩＭＡＣ−アガロース（Ｓｉｇｍａ；使用説明書に
従って調製）の１２．５ｍｌのカラムに加えた。カラムは２容量のＩＭＡＣカラ
ム緩衝液で洗浄し、１０％グリセロールを含んでいる同一の緩衝液の０−２００
ｍＭイミダゾール濃度勾配（２５０ｍｌの全濃度勾配容量）で溶出した。分画を
集め、ポリメラーゼ活性のアッセイを行い、ピーク分画をプールした。
【０１１６】 ポリメラーゼ活性は、鋳型として活性化ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ）および基質としてプライマーおよび［3Ｈ］ｄＴＴＰを用い、Ｂａｒｎｅ
ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６２：３５−４２，１９９
５、に記載されているように決定された。１単位のポリメラーゼ活性とは、３０
℃、１０分間で１ナノモルの［3Ｈ］ｄＴＭＰの取り込みを触媒する活性として
定義されている。ＤＮＡに対するポリメラーゼのＫMを決定するため、活性化ウ
シ胸腺ＤＮＡの濃度をアッセイの間に０−０．８ｍｇ／ｍｌに変化させた。ｄＧ
ＴＰに対するポリメラーゼのＫMを決定するため、［3Ｈ］ｄＴＭＰの取り込みが
ｄＧＴＰ濃度（０−０．５ｍＭ）の関数として追跡され、取り込みの値はｄＧＴ
Ｐ非依存性バックグラウンド取り込みで補正された。
ｏｎ）および基質としてプライマーおよび［3Ｈ］ｄＴＴＰを用い、Ｂａｒｎｅ
ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６２：３５−４２，１９９
５、に記載されているように決定された。１単位のポリメラーゼ活性とは、３０
℃、１０分間で１ナノモルの［3Ｈ］ｄＴＭＰの取り込みを触媒する活性として
定義されている。ＤＮＡに対するポリメラーゼのＫMを決定するため、活性化ウ
シ胸腺ＤＮＡの濃度をアッセイの間に０−０．８ｍｇ／ｍｌに変化させた。ｄＧ
ＴＰに対するポリメラーゼのＫMを決定するため、［3Ｈ］ｄＴＭＰの取り込みが
ｄＧＴＰ濃度（０−０．５ｍＭ）の関数として追跡され、取り込みの値はｄＧＴ
Ｐ非依存性バックグラウンド取り込みで補正された。
【０１１７】 エキソヌクレアーゼ活性は、基質としてその３’末端が［3Ｈ］ｄＴＭＰで標
識されている一本鎖ウシ胸腺ＤＮＡを使用し、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、前
記文献、に記載されているようにアッセイされた。１単位のエキソヌクレアーゼ
活性とは、３０℃、１０分間で１ナノモルの全ヌクレオチドの放出を触媒する活
性として定義されている。基質に対するポリメラーゼのＫMを決定するため、一
本鎖ＤＮＡの濃度を０−０．２ｍｇ／ｍｌで変化させた。
識されている一本鎖ウシ胸腺ＤＮＡを使用し、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、前
記文献、に記載されているようにアッセイされた。１単位のエキソヌクレアーゼ
活性とは、３０℃、１０分間で１ナノモルの全ヌクレオチドの放出を触媒する活
性として定義されている。基質に対するポリメラーゼのＫMを決定するため、一
本鎖ＤＮＡの濃度を０−０．２ｍｇ／ｍｌで変化させた。
【０１１８】 プールしたＩＭＡＣ分画は、６０ｍｌの緩衝液 （５０ｍＭリン酸カリウム［
ｐＨ７．５］、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）で洗浄
した２０ｍｌのＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加え、同
一緩衝液の０．１−０．６Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。全濃度勾配容量は
２４０ｍｌであった。２ミリリットルづつの分画を集め、前記のようにＤＮＡポ
リメラーゼ活性でアッセイした。均質なピーク分画をプールし、続いての分析で
使用した。その比活性、活性化ＤＮＡおよびｄＮＴＰに対するそのＫM、および
阻害性ｄＧＴＰ類似体ＴＭＡＵに対するその親和性に関しては、タグ付けｐｏｌ
ＩＩＩはｐＫＣ３０から発現された野生型ｐｏｌＩＩと区別が付かなかった。こ
の結果は、ｐｏｌＩＩＩのＮ末端修飾はｐｏｌＩＩＩ機能には影響しないことを
示している。従って、Ｎ末端タグセグメントは実験での使用に先立ってはタグ付
けｐｏｌＩＩＩから除去されなかった。
ｐＨ７．５］、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）で洗浄
した２０ｍｌのＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加え、同
一緩衝液の０．１−０．６Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。全濃度勾配容量は
２４０ｍｌであった。２ミリリットルづつの分画を集め、前記のようにＤＮＡポ
リメラーゼ活性でアッセイした。均質なピーク分画をプールし、続いての分析で
使用した。その比活性、活性化ＤＮＡおよびｄＮＴＰに対するそのＫM、および
阻害性ｄＧＴＰ類似体ＴＭＡＵに対するその親和性に関しては、タグ付けｐｏｌ
ＩＩＩはｐＫＣ３０から発現された野生型ｐｏｌＩＩと区別が付かなかった。こ
の結果は、ｐｏｌＩＩＩのＮ末端修飾はｐｏｌＩＩＩ機能には影響しないことを
示している。従って、Ｎ末端タグセグメントは実験での使用に先立ってはタグ付
けｐｏｌＩＩＩから除去されなかった。
【０１１９】 タンパク質の各々の形は９５％均一以上に精製され、Ｆｉｌｔｒｏｎ １０Ｋ
を使用して３０−５０μＭの濃度に達するまで容量を減少させた。野生型および
ｐｏｌＩＩＩのタグ付け型の両方とも、濃縮後に元々のポリメラーゼおよびエキ
ソヌクレアーゼ活性の８０％以上を保持していた。
を使用して３０−５０μＭの濃度に達するまで容量を減少させた。野生型および
ｐｏｌＩＩＩのタグ付け型の両方とも、濃縮後に元々のポリメラーゼおよびエキ
ソヌクレアーゼ活性の８０％以上を保持していた。
【０１２０】 大きなタンパク質、特に高システイン含量のタンパク質は亜鉛およびその他の
微量金属を非特異的に結合できることが知られている（Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２０３−２０８，１９７２）。こ
の非特異的結合亜鉛を除去するため、各々のｐｏｌＩＩＩ調製試料はＥＤＴＡ透
析緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］）に対する大規模な透
析が行われた。すべての透析過程は０℃で、金属を含まないプラスチック容器お
よび金属枯渇透析チューブを使用し、金属分析のためのメタロチオネイン調製に
ルーチン的に用いられる方法で実施した（Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．Ｒｅｖ ．，７３：７９−１１８，１９９３）。
微量金属を非特異的に結合できることが知られている（Ｃｏｒｎｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２０３−２０８，１９７２）。こ
の非特異的結合亜鉛を除去するため、各々のｐｏｌＩＩＩ調製試料はＥＤＴＡ透
析緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］）に対する大規模な透
析が行われた。すべての透析過程は０℃で、金属を含まないプラスチック容器お
よび金属枯渇透析チューブを使用し、金属分析のためのメタロチオネイン調製に
ルーチン的に用いられる方法で実施した（Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．Ｒｅｖ ．，７３：７９−１１８，１９９３）。
【０１２１】 精製されたｐｏｌＩＩＩは透析緩衝液で０．５−５μＭの濃度に調整され、１
００容量の透析緩衝液に対して１２時間透析された。この過程は透析緩衝液を使
用して５回、０．０１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含んでいるがＥＤＴＡ
を含んでいない透析緩衝液を使用して６回繰り返された。次に試料は亜鉛を含ま
ない濃縮器中（Ｆｉｌｔｒｏｎ １０Ｋ）遠心分離により濃縮し、２０−３０μ
Ｍの酵素を含んでいる溶液が得られた。野生型およびタグ付けｐｏｌＩＩＩ酵素
の両方とも、この透析および濃縮操作後に、元々のポリメラーゼおよびエキソヌ
クレアーゼ活性の８０％以上を日常的に保持していた。
００容量の透析緩衝液に対して１２時間透析された。この過程は透析緩衝液を使
用して５回、０．０１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含んでいるがＥＤＴＡ
を含んでいない透析緩衝液を使用して６回繰り返された。次に試料は亜鉛を含ま
ない濃縮器中（Ｆｉｌｔｒｏｎ １０Ｋ）遠心分離により濃縮し、２０−３０μ
Ｍの酵素を含んでいる溶液が得られた。野生型およびタグ付けｐｏｌＩＩＩ酵素
の両方とも、この透析および濃縮操作後に、元々のポリメラーゼおよびエキソヌ
クレアーゼ活性の８０％以上を日常的に保持していた。
【０１２２】 枯草菌ｐｏｌＩＩＩの化学量論的亜鉛含量はＥＤＴＡ−透析ｐｏｌＩＩＩの１
０−６０μＭ溶液をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２２８０フレーム装置を使用し
た原子吸光分光法にかけた。すべての測定は、適当な透析物対照の金属含量の決
定および差し引きを組み込んでいた。
０−６０μＭ溶液をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２２８０フレーム装置を使用し
た原子吸光分光法にかけた。すべての測定は、適当な透析物対照の金属含量の決
定および差し引きを組み込んでいた。
【０１２３】 ５つの独立して誘導されたｐｏｌＩＩＩ試料が分析された。４つの野生型形お
よび１つのタグ付け形。ＥＤＴＡ処理に先立っては、５つの試料は各々タンパク
質モル当たり５つ以上の亜鉛原子を含んでおり、亜鉛捕捉チオール基に富んだ大
きな非透析タンパク質では予想されるレベルであった（枯草菌ｐｏｌＩＩＩは１
５システイン残基を含んでいる）。１０ｍＭ ＥＤＴＡに対する５日の透析はこ
の非特異的結合亜鉛を酵素から除去し、さらに３日まで透析期間を延長してもさ
らに減少しないレベルへ亜鉛含量を減少させた。
よび１つのタグ付け形。ＥＤＴＡ処理に先立っては、５つの試料は各々タンパク
質モル当たり５つ以上の亜鉛原子を含んでおり、亜鉛捕捉チオール基に富んだ大
きな非透析タンパク質では予想されるレベルであった（枯草菌ｐｏｌＩＩＩは１
５システイン残基を含んでいる）。１０ｍＭ ＥＤＴＡに対する５日の透析はこ
の非特異的結合亜鉛を酵素から除去し、さらに３日まで透析期間を延長してもさ
らに減少しないレベルへ亜鉛含量を減少させた。
【０１２４】 ４つの透析ｐｏｌＩＩＩ試料および１つのタグ付けｐｏｌＩＩＩで、この骨の
折れる透析計画後に得られたＥＤＴＡ抵抗性亜鉛含量の代表的な値は、各々モル
タンパク質当たり１．２、１．２、１．０、０．８および１．１グラム原子であ
った。これらの値は、ｐｏｌＩＩＩ分子当たり１原子に等しい化学量論で亜鉛が
ｐｏｌＩＩＩに固く結合されていることを強く示唆している。 実施例２：ｐｏｌＩＩＩ亜鉛は求電子試薬ＭＭＴＳにより追い出される 枯草菌ｐｏｌＩＩＩ中、一つのＥＤＴＡ抵抗性亜鉛原子の存在は、図２に示し
た２つのジンクフィンガー構造の１つでのその配位と一致する。これらの仮定的
ジンクフィンガーの両方において亜鉛はシステインに配位しているので、メチル
メタンチオ−スルホネート（ＭＭＴＳ）修飾に対するジンクフィンガーの感受性
が試験された。ＭＭＴＳは受け入れ可能なシステインに基づくジンクフィンガー
から亜鉛を追い出すために広く使用されてきたチオール特異的試薬である（Ｓｍ
ｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：７６６−７７１，１９７５お
よびＪａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：５０３２
−５０３６，１９８４）。ＭＭＴＳは強い求電子試薬であり、配位しているシス
テインのチオレートをその各々のメチルジスルフィドへ変換し（構造ＣＨ3−Ｓ
−Ｓ−ＣＨ2−タンパク質を形成する）、それにより亜鉛へ配位するジンクフィ
ンガーの能力を破壊して亜鉛を追い出す。
折れる透析計画後に得られたＥＤＴＡ抵抗性亜鉛含量の代表的な値は、各々モル
タンパク質当たり１．２、１．２、１．０、０．８および１．１グラム原子であ
った。これらの値は、ｐｏｌＩＩＩ分子当たり１原子に等しい化学量論で亜鉛が
ｐｏｌＩＩＩに固く結合されていることを強く示唆している。 実施例２：ｐｏｌＩＩＩ亜鉛は求電子試薬ＭＭＴＳにより追い出される 枯草菌ｐｏｌＩＩＩ中、一つのＥＤＴＡ抵抗性亜鉛原子の存在は、図２に示し
た２つのジンクフィンガー構造の１つでのその配位と一致する。これらの仮定的
ジンクフィンガーの両方において亜鉛はシステインに配位しているので、メチル
メタンチオ−スルホネート（ＭＭＴＳ）修飾に対するジンクフィンガーの感受性
が試験された。ＭＭＴＳは受け入れ可能なシステインに基づくジンクフィンガー
から亜鉛を追い出すために広く使用されてきたチオール特異的試薬である（Ｓｍ
ｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：７６６−７７１，１９７５お
よびＪａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：５０３２
−５０３６，１９８４）。ＭＭＴＳは強い求電子試薬であり、配位しているシス
テインのチオレートをその各々のメチルジスルフィドへ変換し（構造ＣＨ3−Ｓ
−Ｓ−ＣＨ2−タンパク質を形成する）、それにより亜鉛へ配位するジンクフィ
ンガーの能力を破壊して亜鉛を追い出す。
【０１２５】 ｐｏｌＩＩＩは65Ｚｎ存在下、前記のｐｏｌＩＩＩ発現プラスミドで形質転換
された増殖細菌により標識された。ＬＢ発現培地を０．３容量のＣｈｅｌｅｘ−
Ｎａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と０℃で２４時間混合することによりＬＢ培地の二価の
微量金属を枯渇させた。枯渇培地には次にｐｏｌＩＩＩ発現と合致する大腸菌増
殖レベルを支えるために０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2を補給した。ｐＫＣ３０／ｐｏ
ｌＣベクターで形質転換した大腸菌ＡＲ１２０は、このマグネシウム補給培地中
、３０℃で増殖させた。培養が０．５の吸光度に達した時（６００ｎＭ、１ｃｍ
光路長）、１０ｍｌの培養物を、さらに１．１μＣｉ／ｍｌ培地の放射活性レベ
ルまでの［65Ｚｎ］Ｃｌ2（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；２．７
ｍＣｉ／μモルの比活性）が含まれている１リットルの亜鉛枯渇、マグネシウム
補給培地に加えた。インキュベーションは培養物が０．７５の吸光度に到達する
まで続けた。次に前記実施例１に説明したように培養物が誘導され、ｐｏｌＩＩ
Ｉが製造された。
された増殖細菌により標識された。ＬＢ発現培地を０．３容量のＣｈｅｌｅｘ−
Ｎａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と０℃で２４時間混合することによりＬＢ培地の二価の
微量金属を枯渇させた。枯渇培地には次にｐｏｌＩＩＩ発現と合致する大腸菌増
殖レベルを支えるために０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2を補給した。ｐＫＣ３０／ｐｏ
ｌＣベクターで形質転換した大腸菌ＡＲ１２０は、このマグネシウム補給培地中
、３０℃で増殖させた。培養が０．５の吸光度に達した時（６００ｎＭ、１ｃｍ
光路長）、１０ｍｌの培養物を、さらに１．１μＣｉ／ｍｌ培地の放射活性レベ
ルまでの［65Ｚｎ］Ｃｌ2（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；２．７
ｍＣｉ／μモルの比活性）が含まれている１リットルの亜鉛枯渇、マグネシウム
補給培地に加えた。インキュベーションは培養物が０．７５の吸光度に到達する
まで続けた。次に前記実施例１に説明したように培養物が誘導され、ｐｏｌＩＩ
Ｉが製造された。
【０１２６】 非特異的結合65Ｚｎおよび外因性チオールを除去するため、ｐｏｌＩＩＩは前
記実施例１に説明したように透析し、標識タンパク質は外因性チオールを除去す
るためさらにＨＮＥ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１００ｍＭ
ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で透析した。タンパク質濃度はＮＨＥ
緩衝液で約１μＭに調整した。試料当たり約２５，０００カウント／分を持って
いる１００μｌの試料をＭＭＴＳ不在下、または０．０１、０．０３、０．１０
または０．３ｍＭのＭＭＴＳ存在下、０℃でインキュベートした。６０分後、各
々の試料は遊離ＺｎＣｌ2からタンパク質を分離できる検定されたＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−２５カラムに加えた（１．０ｍｌベッド容量、０．３８ｍｌ空隙容量
；ＮＨＥ緩衝液で平衡化）。カラムは０．０５ｍｌステップで溶出した。各々の
ステップで溶出された分画は、タンパク質結合65Ｚｎ量（空隙容量）および遊離 65 Ｚｎ量（含有容量）を決定するために液体シンチレーション計数により分析し
た。
記実施例１に説明したように透析し、標識タンパク質は外因性チオールを除去す
るためさらにＨＮＥ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１００ｍＭ
ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で透析した。タンパク質濃度はＮＨＥ
緩衝液で約１μＭに調整した。試料当たり約２５，０００カウント／分を持って
いる１００μｌの試料をＭＭＴＳ不在下、または０．０１、０．０３、０．１０
または０．３ｍＭのＭＭＴＳ存在下、０℃でインキュベートした。６０分後、各
々の試料は遊離ＺｎＣｌ2からタンパク質を分離できる検定されたＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−２５カラムに加えた（１．０ｍｌベッド容量、０．３８ｍｌ空隙容量
；ＮＨＥ緩衝液で平衡化）。カラムは０．０５ｍｌステップで溶出した。各々の
ステップで溶出された分画は、タンパク質結合65Ｚｎ量（空隙容量）および遊離 65 Ｚｎ量（含有容量）を決定するために液体シンチレーション計数により分析し
た。
【０１２７】 ＭＭＴＳ不在下、すべての65Ｚｎ放射活性は期待されるようにタンパク質に結
合されて残っていた。０．０１ｍＭ ＭＭＴＳ存在下、約５０％の標識が放出さ
れた。３つのより高い濃度では実質的に完全に放出された（９５％以上）。これ
らの結果は、亜鉛イオンはｐｏｌＩＩＩシステインにより強く配位されているこ
とを示唆しており、亜鉛がｐｏｌＩＩＩジンクフィンガーにより結合されている
という仮説と一致する。 実施例３：ｐｏｌＩＩＩ亜鉛は鉄またはコバルトで置き換え可能である 図２に提案されているようなジンクフィンガー中、四面体型で配位している亜
鉛はしばしばＺｎ+2以外の金属イオンを収容することが知られている（Ｖａｌｌ
ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５：９４−１２８，１９７０）。枯草菌
ｐｏｌＩＩＩの亜鉛結合部位がこの性質を共有しているかどうかを決定するため
に、鉄原子でｐｏｌＩＩＩ亜鉛を置き換える能力が試験された。
合されて残っていた。０．０１ｍＭ ＭＭＴＳ存在下、約５０％の標識が放出さ
れた。３つのより高い濃度では実質的に完全に放出された（９５％以上）。これ
らの結果は、亜鉛イオンはｐｏｌＩＩＩシステインにより強く配位されているこ
とを示唆しており、亜鉛がｐｏｌＩＩＩジンクフィンガーにより結合されている
という仮説と一致する。 実施例３：ｐｏｌＩＩＩ亜鉛は鉄またはコバルトで置き換え可能である 図２に提案されているようなジンクフィンガー中、四面体型で配位している亜
鉛はしばしばＺｎ+2以外の金属イオンを収容することが知られている（Ｖａｌｌ
ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５：９４−１２８，１９７０）。枯草菌
ｐｏｌＩＩＩの亜鉛結合部位がこの性質を共有しているかどうかを決定するため
に、鉄原子でｐｏｌＩＩＩ亜鉛を置き換える能力が試験された。
【０１２８】 鉄が特別に豊富な培地中での組換えｐｏｌＩＩＩの発現に基づいた間接法が代
替法として使用された。前記実施例２の65Ｚｎ標識酵素を発生させるために使用
された微量金属欠如培地を利用して、添加金属無し、およびＺｎ+2、Ｃｏ+2およ
びＦｅ+2の各々の塩化物存在下（各々０．１ｍＭ濃度で）でｐｏｌＩＩＩを産生
した。各々の培養からの細胞を採取し、粗抽出物が調製されｐｏｌＩＩＩの比活
性を決定するために分析された。
替法として使用された。前記実施例２の65Ｚｎ標識酵素を発生させるために使用
された微量金属欠如培地を利用して、添加金属無し、およびＺｎ+2、Ｃｏ+2およ
びＦｅ+2の各々の塩化物存在下（各々０．１ｍＭ濃度で）でｐｏｌＩＩＩを産生
した。各々の培養からの細胞を採取し、粗抽出物が調製されｐｏｌＩＩＩの比活
性を決定するために分析された。
【０１２９】 各々の抽出物のポリメラーゼ比活性が決定され、通常のＬＢ発現培地でｐｏｌ
ＩＩＩを発現するように誘導された細胞の同一対照抽出物の比活性に規格化され
た。金属補給無しでは、規格化比活性は０．２であった。亜鉛の添加では比活性
は１．１であり、期待されるように対照と同じであった。鉄およびコバルトの補
給は各々１．２および１．０の比活性であり、鉄およびコバルトの両方ともｐｏ
ｌＩＩに結合されている亜鉛に対して機能的に置換できることを示している。
ＩＩＩを発現するように誘導された細胞の同一対照抽出物の比活性に規格化され
た。金属補給無しでは、規格化比活性は０．２であった。亜鉛の添加では比活性
は１．１であり、期待されるように対照と同じであった。鉄およびコバルトの補
給は各々１．２および１．０の比活性であり、鉄およびコバルトの両方ともｐｏ
ｌＩＩに結合されている亜鉛に対して機能的に置換できることを示している。
【０１３０】 前記抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は亜鉛−、鉄−およびコバルト−補給培養
は対照培養と等しい１６０ｋＤ枯草菌ｐｏｌＩＩＩポリペプチドレベルを産生し
たことを示している。従って、比活性で観察された相違および類似性はタンパク
質発現レベルの相違によるものではあり得ないであろう。
は対照培養と等しい１６０ｋＤ枯草菌ｐｏｌＩＩＩポリペプチドレベルを産生し
たことを示している。従って、比活性で観察された相違および類似性はタンパク
質発現レベルの相違によるものではあり得ないであろう。
【０１３１】 鉄置換ｐｏｌＩＩＩはさらに特徴付けされた。この酵素は精製プロファイル、
ポリメラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、基質親和性，ＴＭＡＵへの感受性
、およびＥＤＴＡ透析間の安定性に関して対照酵素と同一に振る舞った。均質な
、ＥＤＴＡ−透析鉄−ｐｏｌＩＩＩの一つの試料の原子吸光分光分析（その方法
は実施例１を参照されたい）はモルタンパク質当たり１．０５グラム原子の鉄含
量およびモルタンパク質当たり０．２グラム原子未満の亜鉛含量を示した。この
結果は、ｐｏｌＩＩＩ亜鉛結合部位は図２の提案されたジンクフィンガー構造の
構成と一致する構成を持っていることを示している。 実施例４：ｐｏｌＩＩＩからの亜鉛の除去はポリメラーゼ活性を完全に破壊する 実施例３に議論したように、亜鉛を含まない培地での枯草菌ｐｏｌＩＩＩの産
生は天然ｐｏｌＩＩＩのポリメラーゼ活性の２０％しか持っていない実質的に能
力の劣る酵素を生じた。最適ｐｏｌＩＩＩ活性のための亜鉛の機能的必要性を確
認するため、ｐｏｌＩＩＩからの亜鉛の直接的除去の影響が試験された。
ポリメラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、基質親和性，ＴＭＡＵへの感受性
、およびＥＤＴＡ透析間の安定性に関して対照酵素と同一に振る舞った。均質な
、ＥＤＴＡ−透析鉄−ｐｏｌＩＩＩの一つの試料の原子吸光分光分析（その方法
は実施例１を参照されたい）はモルタンパク質当たり１．０５グラム原子の鉄含
量およびモルタンパク質当たり０．２グラム原子未満の亜鉛含量を示した。この
結果は、ｐｏｌＩＩＩ亜鉛結合部位は図２の提案されたジンクフィンガー構造の
構成と一致する構成を持っていることを示している。 実施例４：ｐｏｌＩＩＩからの亜鉛の除去はポリメラーゼ活性を完全に破壊する 実施例３に議論したように、亜鉛を含まない培地での枯草菌ｐｏｌＩＩＩの産
生は天然ｐｏｌＩＩＩのポリメラーゼ活性の２０％しか持っていない実質的に能
力の劣る酵素を生じた。最適ｐｏｌＩＩＩ活性のための亜鉛の機能的必要性を確
認するため、ｐｏｌＩＩＩからの亜鉛の直接的除去の影響が試験された。
【０１３２】 キレート化合物での処理による亜鉛の除去。多数の強力な金属キレート剤が合
成され、ジンクフィンガー破壊活性が試験されている（Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：３２６４−３２７０，１９９５）。Ｏｔ
ｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１
９９６）で化合物２０と記載されている一つの関連するキレート剤が、放射活性 65 Ｚｎで標識された均質枯草菌ｐｏｌＩＩＩを利用する以下の実験で使用された
。同一の対照実験は化合物２０の不在下で実施された。
成され、ジンクフィンガー破壊活性が試験されている（Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：３２６４−３２７０，１９９５）。Ｏｔ
ｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：５０３−５０７（１
９９６）で化合物２０と記載されている一つの関連するキレート剤が、放射活性 65 Ｚｎで標識された均質枯草菌ｐｏｌＩＩＩを利用する以下の実験で使用された
。同一の対照実験は化合物２０の不在下で実施された。
【０１３３】 ０．２ナノモルのｐｏｌＩＩＩを０．３ｍＭの化合物２０を含んでいる０．１
ｍｌのＨＮＥ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０
％グリセロール［ｐＨ７．６］）と混合し、２５℃で１時間インキュベートした
。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカラムを通過させることにより化合物２０
からｐｏｌＩＩＩを取り除き、酵素のポリメラーゼ活性およびその放射活性亜鉛
の含量をアッセイした（前に説明した方法を参照されたい）。化合物存在下でイ
ンキュベートしたｐｏｌＩＩＩ試料は対照ｐｏｌＩＩＩ活性の１％未満、および
対照の放射活性亜鉛含量の２％未満を示した。
ｍｌのＨＮＥ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０
％グリセロール［ｐＨ７．６］）と混合し、２５℃で１時間インキュベートした
。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカラムを通過させることにより化合物２０
からｐｏｌＩＩＩを取り除き、酵素のポリメラーゼ活性およびその放射活性亜鉛
の含量をアッセイした（前に説明した方法を参照されたい）。化合物存在下でイ
ンキュベートしたｐｏｌＩＩＩ試料は対照ｐｏｌＩＩＩ活性の１％未満、および
対照の放射活性亜鉛含量の２％未満を示した。
【０１３４】 亜鉛欠損不活性ポリメラーゼを再構築するため、ｐｏｌＩＩＩが前記のように
化合物から分離され、０．０１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下または
不在下で、０．０１ｍＭ ＺｎＣｌ2と２５℃で１２時間インキュベートされた
。３０分間隔で試料を採取し、ｐｏｌ活性をアッセイした。残余バックグラウン
ドを超えるｐｏｌ活性の再活性化が観察されないばかりか、同一条件下、ＤＴＴ
存在下または不在下でＺｎＣｌ2とインキュベートされた非処理対照ｐｏｌＩＩ
Ｉで有意なポリメラーゼ活性の不活性化が観察された。
化合物から分離され、０．０１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下または
不在下で、０．０１ｍＭ ＺｎＣｌ2と２５℃で１２時間インキュベートされた
。３０分間隔で試料を採取し、ｐｏｌ活性をアッセイした。残余バックグラウン
ドを超えるｐｏｌ活性の再活性化が観察されないばかりか、同一条件下、ＤＴＴ
存在下または不在下でＺｎＣｌ2とインキュベートされた非処理対照ｐｏｌＩＩ
Ｉで有意なポリメラーゼ活性の不活性化が観察された。
【０１３５】 ＭＭＴＳによる配位しているチオレート処理による亜鉛の追い出し。化合物Ｍ
ＭＴＳは前記実施例２に説明されている。０．２ナノモルの65Ｚｎ標識枯草菌ｐ
ｏｌＩＩＩを、０．２ｍＭ ＭＭＴＳを含むまたは含まないＨＮＥ緩衝液と１時
間インキュベートし、化合物２０で処理したｐｏｌＩＩＩで説明したように試料
をアッセイした。ＭＭＴＳ存在下でインキュベートしたｐｏｌＩＩＩ試料は対照
ｐｏｌＩＩＩ活性の１％未満、および対照の放射活性亜鉛含量の２％未満を示し
た。
ＭＴＳは前記実施例２に説明されている。０．２ナノモルの65Ｚｎ標識枯草菌ｐ
ｏｌＩＩＩを、０．２ｍＭ ＭＭＴＳを含むまたは含まないＨＮＥ緩衝液と１時
間インキュベートし、化合物２０で処理したｐｏｌＩＩＩで説明したように試料
をアッセイした。ＭＭＴＳ存在下でインキュベートしたｐｏｌＩＩＩ試料は対照
ｐｏｌＩＩＩ活性の１％未満、および対照の放射活性亜鉛含量の２％未満を示し
た。
【０１３６】 不活性ポリメラーゼを再構築するため、酵素を０．０１ｍＭ ＺｎＣｌ2およ
び０．０１ｍＭ ＤＴＴを含んでいる溶液と２５℃で１２時間インキュベートし
た。３０分間隔で試料を採取し、ｐｏｌ活性をアッセイした。残余バックグラウ
ンドを超えるｐｏｌ活性の再活性化が観察されないばかりか、同一条件下、亜鉛
およびＤＴＴとインキュベートされた対照ｐｏｌＩＩＩで有意なポリメラーゼ活
性の不活性化が観察された。
び０．０１ｍＭ ＤＴＴを含んでいる溶液と２５℃で１２時間インキュベートし
た。３０分間隔で試料を採取し、ｐｏｌ活性をアッセイした。残余バックグラウ
ンドを超えるｐｏｌ活性の再活性化が観察されないばかりか、同一条件下、亜鉛
およびＤＴＴとインキュベートされた対照ｐｏｌＩＩＩで有意なポリメラーゼ活
性の不活性化が観察された。
【０１３７】 上記の結果は、亜鉛の除去はグラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩのポリメラーゼ
活性を著しく阻害し（９５％以上の阻害）、そのような除去および酵素的不活性
化は不可逆的であったことを示している。 実施例５：重要なジンクフィンガー残基の位置指定突然変異誘発はｐｏｌＩＩＩ 活性に影響する 図２に提案されたジンクフィンガー構造の一つは確実であることをさらに確認
するため、提案された配位しているシステインまたはヒスチジンの各々をアラニ
ンへ突然変異させるために位置指定突然変異誘発が使用された。
活性を著しく阻害し（９５％以上の阻害）、そのような除去および酵素的不活性
化は不可逆的であったことを示している。 実施例５：重要なジンクフィンガー残基の位置指定突然変異誘発はｐｏｌＩＩＩ 活性に影響する 図２に提案されたジンクフィンガー構造の一つは確実であることをさらに確認
するため、提案された配位しているシステインまたはヒスチジンの各々をアラニ
ンへ突然変異させるために位置指定突然変異誘発が使用された。
【０１３８】 オリゴヌクレオチドに基づいた系（Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ，Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）が推定ジンクフィンガーをコード化しているｐｏｌＣセグメント内へ突然
変異を導入するために使用された。突然変異はｐＺＦ−１５０、ｐｏｌＣヌクレ
オチド２４１０−２８９９を包含し、および特異的制限部位ＳａｌＩおよびＣｌ ａＩ （前者は位置指定突然変異誘発により作り出された）により閉ざされている
サブクローン化断片内へ導入された。各々の突然変異誘発オリゴヌクレオチドは
、突然変異が標的内に特有の診断的制限部位を同時に作り出すように設計された
。ｐＺＦ−１５０の突然変異体形は、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位を使用してｐ ｏｌＣ 配列内へ再クローン化された。各々の突然変異体ｐｏｌＣ構築物は次に（
１）関連ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）中のＳａｌＩ、ＣｌａＩ切断野生型構築物内への再クローニング
；および（２）ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ Ｂｌｕｅｓｃｒｌｐｔ断片のＸｈｏＩ、Ｃ ｌａＩ −切断ｐＳＧＡ０４内へのサブクローニングによりｐＳＧＡ０４ ｈｉｓ
６発現プラスミド内へ組み込まれた。
ｇａ）が推定ジンクフィンガーをコード化しているｐｏｌＣセグメント内へ突然
変異を導入するために使用された。突然変異はｐＺＦ−１５０、ｐｏｌＣヌクレ
オチド２４１０−２８９９を包含し、および特異的制限部位ＳａｌＩおよびＣｌ ａＩ （前者は位置指定突然変異誘発により作り出された）により閉ざされている
サブクローン化断片内へ導入された。各々の突然変異誘発オリゴヌクレオチドは
、突然変異が標的内に特有の診断的制限部位を同時に作り出すように設計された
。ｐＺＦ−１５０の突然変異体形は、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位を使用してｐ ｏｌＣ 配列内へ再クローン化された。各々の突然変異体ｐｏｌＣ構築物は次に（
１）関連ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）中のＳａｌＩ、ＣｌａＩ切断野生型構築物内への再クローニング
；および（２）ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ Ｂｌｕｅｓｃｒｌｐｔ断片のＸｈｏＩ、Ｃ ｌａＩ −切断ｐＳＧＡ０４内へのサブクローニングによりｐＳＧＡ０４ ｈｉｓ
６発現プラスミド内へ組み込まれた。
【０１３９】 各々の残基がアラニンへ突然変異され、亜鉛配位チオレート側鎖を中性メチル
基で置き換えた。もしこれら５つの配位体が密接に亜鉛配位に関与しているなら
ば、メチル基によるその置換は、亜鉛に対する酵素の親和性を著しく弱める（効
果的に破壊しないにしても）と期待されるであろう。
基で置き換えた。もしこれら５つの配位体が密接に亜鉛配位に関与しているなら
ば、メチル基によるその置換は、亜鉛に対する酵素の親和性を著しく弱める（効
果的に破壊しないにしても）と期待されるであろう。
【０１４０】 タグ付け野生型およびｐｏｌＩＩＩの突然変異形は前記実施例１の方法を使用
して９５％以上の相同性で得られた。タンパク質は次にＥＤＴＡに基づいた透析
にかけられ、実施例１に記載したように亜鉛含量が分析された。結果は下記表１
の最も左の欄に要約されている。
して９５％以上の相同性で得られた。タンパク質は次にＥＤＴＡに基づいた透析
にかけられ、実施例１に記載したように亜鉛含量が分析された。結果は下記表１
の最も左の欄に要約されている。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】 表１のデータは前記実施例１で説明した方法により得られた。”*”は全ｐｏ
ｌドメイン（即ち、ａａ１０００−１４３７）が欠けている端が切り取られたタ
ンパク質を示している。”ｎｄ”は検出不能を意味している。”−−”はパラメ
ーターまたは値が決定されなかったことを意味している。
ｌドメイン（即ち、ａａ１０００−１４３７）が欠けている端が切り取られたタ
ンパク質を示している。”ｎｄ”は検出不能を意味している。”−−”はパラメ
ーターまたは値が決定されなかったことを意味している。
【０１４３】 表１で注目されるように、５つの突然変異体酵素の内の２つ、Ｈ９０９Ａおよ
びＣ９３７Ａは亜鉛分析を行うことができなかった。Ｈ９０９Ａ酵素は完全長タ
ンパク質として発現されているが、金属分析には十分な量で容易に産生されなか
った。１１０ｋＤの端が切り取られたタンパク質として精製されたＣ９３７Ａ酵
素もまた収率が悪かった。この端が切り取られたｐｏｌＩＩＩはジンクフィンガ
ー内の翻訳の中断により発生されたようであった。いずれにしても、端が切り取
られたタンパク質は完全長タンパク質との比較のための正当な候補とは考えられ
なかった。
びＣ９３７Ａは亜鉛分析を行うことができなかった。Ｈ９０９Ａ酵素は完全長タ
ンパク質として発現されているが、金属分析には十分な量で容易に産生されなか
った。１１０ｋＤの端が切り取られたタンパク質として精製されたＣ９３７Ａ酵
素もまた収率が悪かった。この端が切り取られたｐｏｌＩＩＩはジンクフィンガ
ー内の翻訳の中断により発生されたようであった。いずれにしても、端が切り取
られたタンパク質は完全長タンパク質との比較のための正当な候補とは考えられ
なかった。
【０１４４】 ３つの完全長突然変異体の各々は（Ｃ９１２Ａ、Ｃ９１５ＡおよびＣ９４０Ａ
）、野生型酵素との比較で亜鉛に対する親和性の減少を示した（亜鉛含量）。Ｃ
９１５Ａタンパク質は親和性で野生型に最も近く、約４０％を保持していた。Ｃ
９４０ＡおよびＣ９１２Ａタンパク質は著しく害されており、各々野生型亜鉛含
量の１０％および７％のみしか保持していなかった。
）、野生型酵素との比較で亜鉛に対する親和性の減少を示した（亜鉛含量）。Ｃ
９１５Ａタンパク質は親和性で野生型に最も近く、約４０％を保持していた。Ｃ
９４０ＡおよびＣ９１２Ａタンパク質は著しく害されており、各々野生型亜鉛含
量の１０％および７％のみしか保持していなかった。
【０１４５】 表１の５つの精製突然変異体酵素の各々が、その天然の、非透析形で直接的に
分析され、（１）エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性；（２）エキソヌ
クレアーゼおよびポリメラーゼ基質に対する親和性；および（３）グラム陽性真
正細菌のｐｏｌＩＩＩを阻害するｄＧＴＰ類似体、ＴＭＡＵに対するポリメラー
ゼ活性の感受性（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒａｐ ．，４７：４４７−４９７，１９９０）に対する各々の突然変異の影響が評価さ
れた。結果は表１に要約されている。
分析され、（１）エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性；（２）エキソヌ
クレアーゼおよびポリメラーゼ基質に対する親和性；および（３）グラム陽性真
正細菌のｐｏｌＩＩＩを阻害するｄＧＴＰ類似体、ＴＭＡＵに対するポリメラー
ゼ活性の感受性（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒａｐ ．，４７：４４７−４９７，１９９０）に対する各々の突然変異の影響が評価さ
れた。結果は表１に要約されている。
【０１４６】 各々の突然変異はエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性の両方を減少さ
せた。しかしながら、減少は著しくポリメラーゼ特異的であって、４つの関連す
る場合でポリメラーゼの相対的減少はエキソヌクレアーゼ活性の減少よりも大き
かった。突然変異体で観察された最も低いエキソヌクレアーゼ活性は野生型の２
０％であったが、一方、ポリメラーゼ活性は、野生型酵素と合理的に比較可能な
４つの完全長突然変異体で野生型の１０％から０．１％未満の範囲であった。
せた。しかしながら、減少は著しくポリメラーゼ特異的であって、４つの関連す
る場合でポリメラーゼの相対的減少はエキソヌクレアーゼ活性の減少よりも大き
かった。突然変異体で観察された最も低いエキソヌクレアーゼ活性は野生型の２
０％であったが、一方、ポリメラーゼ活性は、野生型酵素と合理的に比較可能な
４つの完全長突然変異体で野生型の１０％から０．１％未満の範囲であった。
【０１４７】 アッセイされた４つの突然変異体タンパク質のどれも（端が切り取られたＣ９
３７Ａタンパク質を含んで）一本鎖基質ＤＮＡに対して親和性を示さず、それは
野生型と著しく異なっていた。突然変異Ｃ９１５ＡおよびＣ９４０Ａのどちらも
ｄＧＴＰ基質親和性およびＴＭＡＵ感受性には影響しなかった。ＤＮＡおよび酵
素またはｄＧＴＰおよび酵素のＫMは野生型の値の２倍未満で変化した。ＴＭＡ
Ｕに対するＩＣ50値は２倍未満の変化であった。
３７Ａタンパク質を含んで）一本鎖基質ＤＮＡに対して親和性を示さず、それは
野生型と著しく異なっていた。突然変異Ｃ９１５ＡおよびＣ９４０Ａのどちらも
ｄＧＴＰ基質親和性およびＴＭＡＵ感受性には影響しなかった。ＤＮＡおよび酵
素またはｄＧＴＰおよび酵素のＫMは野生型の値の２倍未満で変化した。ＴＭＡ
Ｕに対するＩＣ50値は２倍未満の変化であった。
【０１４８】 これらの結果は、図２のジンクフィンガー構造のどちらが天然のタンパク質で
働いているのかを区別する助けにはならなかった。しかしながら、突然変異分析
はｐｏｌＩＩ機能において、これらの鍵となる残基の決定的な役割を明瞭に確立
している。従って、この結果はグラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩ中のジンクフィ
ンガー構造と一致および支持している。 実施例６：６−（メタ−ジスルフィドメチルアニリノ）ウラシルの製造 ６−クロロウラシル（ｌｍｍｏｌ）およびメタ−アミノベンジルアルコール（
２．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの２−メトキシエタノールに溶解して反応混合物を
形成させた。混合物は１０時間加熱環流して、８６％の収率で６−（メタ−ヒド
ロキシメチルアニリノ）ウラシルを形成させた。ヒドロキシメチルアニリノ−ウ
ラシル（０．５ｍｍｏｌ）と３０％ＨＢｒの酢酸溶液（１０ｍｌ）を反応させる
ことによりヒドロキシ基をブロモ基で置き換え、９０％の収率で６−（メタ−ブ
ロモメチルアニリノ）ウラシルが形成された。ブロモ基は、０．４ｍｍｏｌの６
−（メタ−ブロモメチルアニリノ）ウラシルと２ｍｍｏｌのＫＳＣＮを反応させ
ることによりチオシアナート基によりさらに置き換えられ、８０％の収率で６−
（メタ−メルカプトシアノメチルアニリノ）ウラシル（ｍＭＣＭＡＵ）を形成さ
せた。ｍＭＣＭＡＵは５ｍＬの２Ｎ ＮａＯＨ中で６−（メタ−チオメチルアニ
リノ）ウラシルへ加水分解した。最終生成物、６−（メタ−ジスルフィドメチル
アニリノ）ウラシルは６−（メタ−チオメチルアニリノ）ウラシルを２モル過剰
のメチルメタンチオスホナートと反応させることにより定量的に形成された。 実施例７：ｐｏｌＩＩＩから亜鉛を除去する化合物のスクリーニング 65Ｚｎ−標識枯草菌ｐｏｌＩＩＩは実施例２に記載したように製造および精製
された。約２５，０００ｃｐｍの放射能を含んでいる標識ｐｏｌＩＩＩの１００
μｇ／ｍｌ溶液の１００マクロリットルを１マイクログラムの候補抗菌化合物と
２５ ℃で１時間混合した。混合物は次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカ
ラムを通過させ、溶出物（タンパク質）をシンチレーションカウンターで計数し
た。溶出液の分当たりのカウントを、化合物の代わりに混合物へ関連対照溶媒の
みが加えられた対照反応と比較した。化合物により放出された放射能が、反応へ
溶媒単独を加えたものより多かったら、化合物は抗菌剤として有効であろうこと
を示している。陽性結果を確認するため、統計的に有意な決定が行われるまで本
過程を繰り返す。 実施例８：ｐｏｌＩＩＩポリメラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング 枯草菌ｐｏｌＩＩＩの適当な希釈液の５マイクロリットルを候補抗菌化合物を
含むまたは含まない２０μｌのポリメラーゼアッセイ混合物（１８．７５ｍＭト
リス［ｐＨ７．５］、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３１．２５μｍ ｄＡＴ
Ｐ、３１．２５μｍ ｄＣＴＰ、３１．２５μｍ ｄＧＴＰ、１２．５μｍ［メ
チル−3Ｈ］ｄＴＴＰ［１．５μＣｉ／μｍｏｌ］、１．２５ｍＭ ＤＴＴ、２
０％グリセロール、および０．５ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ）と迅速に混合し、３
０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍｌの冷１０％トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することにより停止さ
せる。０℃で約１０分後、試料はＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルターで濾過し
、最初に冷１Ｍ ＨＣｌ含有１００ｍＭピロリン酸ナトリウム、続いて冷エタノ
ールで洗浄する。フィルターを乾燥させ、計数した。もし、候補抗菌化合物の存
在がポリメラーゼ活性の少なくとも２５％阻害を導いたら、化合物はポリメラー
ゼ活性の阻害剤であるとみなされる。
働いているのかを区別する助けにはならなかった。しかしながら、突然変異分析
はｐｏｌＩＩ機能において、これらの鍵となる残基の決定的な役割を明瞭に確立
している。従って、この結果はグラム陽性真正細菌ｐｏｌＩＩＩ中のジンクフィ
ンガー構造と一致および支持している。 実施例６：６−（メタ−ジスルフィドメチルアニリノ）ウラシルの製造 ６−クロロウラシル（ｌｍｍｏｌ）およびメタ−アミノベンジルアルコール（
２．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの２−メトキシエタノールに溶解して反応混合物を
形成させた。混合物は１０時間加熱環流して、８６％の収率で６−（メタ−ヒド
ロキシメチルアニリノ）ウラシルを形成させた。ヒドロキシメチルアニリノ−ウ
ラシル（０．５ｍｍｏｌ）と３０％ＨＢｒの酢酸溶液（１０ｍｌ）を反応させる
ことによりヒドロキシ基をブロモ基で置き換え、９０％の収率で６−（メタ−ブ
ロモメチルアニリノ）ウラシルが形成された。ブロモ基は、０．４ｍｍｏｌの６
−（メタ−ブロモメチルアニリノ）ウラシルと２ｍｍｏｌのＫＳＣＮを反応させ
ることによりチオシアナート基によりさらに置き換えられ、８０％の収率で６−
（メタ−メルカプトシアノメチルアニリノ）ウラシル（ｍＭＣＭＡＵ）を形成さ
せた。ｍＭＣＭＡＵは５ｍＬの２Ｎ ＮａＯＨ中で６−（メタ−チオメチルアニ
リノ）ウラシルへ加水分解した。最終生成物、６−（メタ−ジスルフィドメチル
アニリノ）ウラシルは６−（メタ−チオメチルアニリノ）ウラシルを２モル過剰
のメチルメタンチオスホナートと反応させることにより定量的に形成された。 実施例７：ｐｏｌＩＩＩから亜鉛を除去する化合物のスクリーニング 65Ｚｎ−標識枯草菌ｐｏｌＩＩＩは実施例２に記載したように製造および精製
された。約２５，０００ｃｐｍの放射能を含んでいる標識ｐｏｌＩＩＩの１００
μｇ／ｍｌ溶液の１００マクロリットルを１マイクログラムの候補抗菌化合物と
２５ ℃で１時間混合した。混合物は次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５スピンカ
ラムを通過させ、溶出物（タンパク質）をシンチレーションカウンターで計数し
た。溶出液の分当たりのカウントを、化合物の代わりに混合物へ関連対照溶媒の
みが加えられた対照反応と比較した。化合物により放出された放射能が、反応へ
溶媒単独を加えたものより多かったら、化合物は抗菌剤として有効であろうこと
を示している。陽性結果を確認するため、統計的に有意な決定が行われるまで本
過程を繰り返す。 実施例８：ｐｏｌＩＩＩポリメラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング 枯草菌ｐｏｌＩＩＩの適当な希釈液の５マイクロリットルを候補抗菌化合物を
含むまたは含まない２０μｌのポリメラーゼアッセイ混合物（１８．７５ｍＭト
リス［ｐＨ７．５］、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３１．２５μｍ ｄＡＴ
Ｐ、３１．２５μｍ ｄＣＴＰ、３１．２５μｍ ｄＧＴＰ、１２．５μｍ［メ
チル−3Ｈ］ｄＴＴＰ［１．５μＣｉ／μｍｏｌ］、１．２５ｍＭ ＤＴＴ、２
０％グリセロール、および０．５ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ）と迅速に混合し、３
０℃で１０分間インキュベートする。反応は、０．５ｍｌの冷１０％トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）含有１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加することにより停止さ
せる。０℃で約１０分後、試料はＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルターで濾過し
、最初に冷１Ｍ ＨＣｌ含有１００ｍＭピロリン酸ナトリウム、続いて冷エタノ
ールで洗浄する。フィルターを乾燥させ、計数した。もし、候補抗菌化合物の存
在がポリメラーゼ活性の少なくとも２５％阻害を導いたら、化合物はポリメラー
ゼ活性の阻害剤であるとみなされる。
【０１４９】 すぐ上のスクリーニングアッセイで試験陽性の阻害剤は、細菌ＤＮＡ合成を選
択的に阻害する能力が評価された（即ち、細菌ＲＮＡ合成を有意に阻害すること
なく）。各々の阻害剤は、対数的に増殖している枯草菌中のＤＮＡおよびＲＮＡ
内への放射性標識アデニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ塩基）の取り込みを阻害する能
力でアッセイされる（Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ，６７：１４５４−１４６０，１９７０）。このアッセイにおいて、もし候
補阻害剤が放射性アデニンのＤＮＡ内への取り込みの少なくとも５０％の阻害、
およびＲＮＡ内への放射性アデニン取り込みの１５％未満の阻害を達成できたら
、候補阻害剤はＤＮＡ選択的とみなされる。 実施例９：殺菌化合物のスクリーニング 候補抗菌化合物は滅菌ＤＭＳＯに溶解され、ミリリットル当たり約１０6コロ
ニー形成単位（ｃｆｕ）で対数増殖期のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴ
ＣＣ番号２９２１３号）を含んでいるミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ；Ｄｉ
ｆｃｏ）内へ１００倍に希釈する。対照培養物にはＤＭＳＯのみが加えられる。
化合物および対照培養物は３７℃でインキュベートし、続いての２４時間の間の
３時間毎に培養物から試料を採取する。各々の試料は１０Ｘおよび１００ＸでＭ
ＨＢに希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種することにより、細菌量（ｃｆｕ／ｍｌ
で）をアッセイする。候補化合物が６時間の時点およびその後、少なくとも５０
％細菌量を減少させると、化合物は殺菌剤であることが示される。 実施例１０：インビボで細菌感染を減少させる化合物のスクリーニング 試験細菌で感染させる前に、６匹の６週齢の病原体を持たないＩＣＲ／Ｓｗｉ
ｓｓマウスは、シクロホスファミドの腹腔内注射による２回投与で好中球を減少
させる（血液ミリリットル当たり１００好中球未満）。最初の注射は細菌感染の
４日前に１５０ｍｇ／ｋｇで行われ、第二の注射は細菌感染の１日前に１００ｍ
ｇ／ｋｇで行われる。好中球減少は、広範囲の細菌が続いての感染で使用できる
ように誘導される。
択的に阻害する能力が評価された（即ち、細菌ＲＮＡ合成を有意に阻害すること
なく）。各々の阻害剤は、対数的に増殖している枯草菌中のＤＮＡおよびＲＮＡ
内への放射性標識アデニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ塩基）の取り込みを阻害する能
力でアッセイされる（Ｂｒｏｗｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ，６７：１４５４−１４６０，１９７０）。このアッセイにおいて、もし候
補阻害剤が放射性アデニンのＤＮＡ内への取り込みの少なくとも５０％の阻害、
およびＲＮＡ内への放射性アデニン取り込みの１５％未満の阻害を達成できたら
、候補阻害剤はＤＮＡ選択的とみなされる。 実施例９：殺菌化合物のスクリーニング 候補抗菌化合物は滅菌ＤＭＳＯに溶解され、ミリリットル当たり約１０6コロ
ニー形成単位（ｃｆｕ）で対数増殖期のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴ
ＣＣ番号２９２１３号）を含んでいるミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ；Ｄｉ
ｆｃｏ）内へ１００倍に希釈する。対照培養物にはＤＭＳＯのみが加えられる。
化合物および対照培養物は３７℃でインキュベートし、続いての２４時間の間の
３時間毎に培養物から試料を採取する。各々の試料は１０Ｘおよび１００ＸでＭ
ＨＢに希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種することにより、細菌量（ｃｆｕ／ｍｌ
で）をアッセイする。候補化合物が６時間の時点およびその後、少なくとも５０
％細菌量を減少させると、化合物は殺菌剤であることが示される。 実施例１０：インビボで細菌感染を減少させる化合物のスクリーニング 試験細菌で感染させる前に、６匹の６週齢の病原体を持たないＩＣＲ／Ｓｗｉ
ｓｓマウスは、シクロホスファミドの腹腔内注射による２回投与で好中球を減少
させる（血液ミリリットル当たり１００好中球未満）。最初の注射は細菌感染の
４日前に１５０ｍｇ／ｋｇで行われ、第二の注射は細菌感染の１日前に１００ｍ
ｇ／ｋｇで行われる。好中球減少は、広範囲の細菌が続いての感染で使用できる
ように誘導される。
【０１５０】 各々のマウスに対する細菌感染は１００μｌの培地中の１０6ｃｆｕメチシリ
ン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ番号第２９２１３号）を右大腿筋内へ接種す
ることにより実施される。化合物および対照混合物は、感染２、６、１２および
１８時間後、動物の尾静脈内へ静脈内で投与される。２匹のマウスには各々の時
間点で生理学的食塩水の陰性対照混合物、５０μｌが注射された。別の対のマウ
スは各々の時間点で４０ｍｇ／ｋｇ体重バンコマイシン食塩水の陽性対照混合物
が注射された。最後の２匹のマウスは各々の時間点で４０ｍｇ／ｋｇ体重候補化
合物食塩水が注射された。
ン感受性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ番号第２９２１３号）を右大腿筋内へ接種す
ることにより実施される。化合物および対照混合物は、感染２、６、１２および
１８時間後、動物の尾静脈内へ静脈内で投与される。２匹のマウスには各々の時
間点で生理学的食塩水の陰性対照混合物、５０μｌが注射された。別の対のマウ
スは各々の時間点で４０ｍｇ／ｋｇ体重バンコマイシン食塩水の陽性対照混合物
が注射された。最後の２匹のマウスは各々の時間点で４０ｍｇ／ｋｇ体重候補化
合物食塩水が注射された。
【０１５１】 感染２４時間後、すべての動物を殺し、各々のマウスの右大腿筋を取り出した
。筋肉は次にポリトロン組織ホモジナイザーを用い、１０ｍｌの冷滅菌食塩水中
でホモジナイズする。１００Ｘ希釈ホモジネートをＬＢ寒天プレート上に播種す
る。３７℃で２４時間インキュベートした後、各々のプレート上のコロニー数を
計数する。化合物処置マウスからの両方の筋肉試料は５０コロニーまたはそれ未
満であったが、一方、陰性対照（食塩水のみを注射）からの筋肉試料は各々のプ
レートで約５００コロニーが得られた。バンコマイシン処置マウスからの筋肉試
料は各々のプレートで約４０コロニーが得られた。化合物処置は細菌量の５０％
以上の減少を導いたので、化合物は有効な殺菌剤であるといわれる。他の態様 本発明はその詳細な記述に関連して説明されてきたが、前記の記述は例示を意
図しており、特許発明の範囲で定義される本発明の範囲を制限するものではない
ことを理解されたい。他の態様、利点および変形も特許請求の範囲内に含まれて
いる。
。筋肉は次にポリトロン組織ホモジナイザーを用い、１０ｍｌの冷滅菌食塩水中
でホモジナイズする。１００Ｘ希釈ホモジネートをＬＢ寒天プレート上に播種す
る。３７℃で２４時間インキュベートした後、各々のプレート上のコロニー数を
計数する。化合物処置マウスからの両方の筋肉試料は５０コロニーまたはそれ未
満であったが、一方、陰性対照（食塩水のみを注射）からの筋肉試料は各々のプ
レートで約５００コロニーが得られた。バンコマイシン処置マウスからの筋肉試
料は各々のプレートで約４０コロニーが得られた。化合物処置は細菌量の５０％
以上の減少を導いたので、化合物は有効な殺菌剤であるといわれる。他の態様 本発明はその詳細な記述に関連して説明されてきたが、前記の記述は例示を意
図しており、特許発明の範囲で定義される本発明の範囲を制限するものではない
ことを理解されたい。他の態様、利点および変形も特許請求の範囲内に含まれて
いる。
【図１】 図１は枯草菌のモデルグラム陽性真正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの構成図
であり、３’−５’エキソヌクレアーゼ（３’−５’Ｅｘｏ；黒く塗りつぶされ
たボックス）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ；オープンボックス）ドメインを示し
ている。ｐｏｌドメイン内の斜線を付けた部分はジンクフィンガーの位置を示し
ており、点を付けた部分はＨＰＵｒａ様化合物（米国特許第５，５１６，９０５
号に記載されている）の結合領域を示している。本図はまた選択されたグラム陽
性真正細菌およびマイコプラズマｐｏｌＩＩＩからのジンクフィンガー配列（上
から下の順序で配列ＩＤ番号：５から１２）、ならびに構成図の下に共通配列（
配列ＩＤ番号：１３）のアラインメントを示している。ジンクフィンガー配列は
四角で囲まれており、ｐｏｌドメイン中のジンクフィンガーに対してすぐのＣ末
端側の触媒アスパラギン酸は２つのアステリスクにより示されている。
であり、３’−５’エキソヌクレアーゼ（３’−５’Ｅｘｏ；黒く塗りつぶされ
たボックス）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ；オープンボックス）ドメインを示し
ている。ｐｏｌドメイン内の斜線を付けた部分はジンクフィンガーの位置を示し
ており、点を付けた部分はＨＰＵｒａ様化合物（米国特許第５，５１６，９０５
号に記載されている）の結合領域を示している。本図はまた選択されたグラム陽
性真正細菌およびマイコプラズマｐｏｌＩＩＩからのジンクフィンガー配列（上
から下の順序で配列ＩＤ番号：５から１２）、ならびに構成図の下に共通配列（
配列ＩＤ番号：１３）のアラインメントを示している。ジンクフィンガー配列は
四角で囲まれており、ｐｏｌドメイン中のジンクフィンガーに対してすぐのＣ末
端側の触媒アスパラギン酸は２つのアステリスクにより示されている。
【図２】 図２は枯草菌ｐｏｌＩＩＩのジンクフィンガー（配列ＩＤ番号：２）により形
成される２つの可能なジンクフィンガー構造を描いたものである。
成される２つの可能なジンクフィンガー構造を描いたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｄ 239/54 Ｃ０７Ｄ 417/12 417/12 473/16 473/16 473/18 473/18 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/48 Ｚ 1/48 Ｃ１２Ｎ 9/12 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｎ 9/12 ＺＮＡ Ｃ０７Ｄ 239/54 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バーンズ，マージョリー・エイチ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01545， シュルーズベリ，レイクサイド・ドライブ 66 (72)発明者 ライト，ジョージ・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01602， ウースター，ハイランド・アベニュー 298 Ｆターム(参考） 4B050 CC07 DD02 HH01 KK01 LL03 4B063 QA06 QQ06 QQ28 QR08 QR50 QR75 QS24 QX01 4C063 AA01 BB07 BB09 CC62 CC67 DD31 EE01 4C086 AA01 AA03 BC42 BC43 CB07 MA04 NA14 ZB35
Claims (36)
- 【請求項１】 グラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感染を防止するた
めの化合物であって、該化合物は ジンクフィンガー反応性部分； リンカー；および リンカーを介してジンクフィンガー反応性部分に連結されたグラム陽性真
正細菌またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含ん
でいる前記化合物。 - 【請求項２】 次式： Ａ−（Ｌ−Ｂ）m （式中、 Ｂはジンクフィンガー反応性部分であり； Ｌはリンカーであり、および Ａが化１ 【化１】 式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件で
；Ｒ1およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、
または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル
、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；ｍは１または２であり；
およびｎは０、１または２である； から成る群より選択されるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分である。
） を有する請求項１に記載の化合物またはその塩。 - 【請求項３】 Ａが次式 【化２】 （式中、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件で；
Ｒ1は水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3お
よびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、
または−Ｌ−Ｂであり；およびｎは０、１または２である） である請求項２の化合物またはその塩。 - 【請求項４】 Ｒ1が−Ｌ−Ｂである請求項３に記載の化合物；またはその
塩。 - 【請求項５】 Ａが式 【化３】 （式中、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件で；
Ｒ1は水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3お
よびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、
または−Ｌ−Ｂであり；およびｎは０、１または２である。） である請求項２の化合物またはその塩。 - 【請求項６】 Ｒ1が−Ｌ−Ｂである請求項５に記載の化合物；またはその
塩。 - 【請求項７】 Ａが式 【化４】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件
で；Ｒ1およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル
、または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキ
ル、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；ｍは１または２であり
；およびｎは０、１または２である。） である請求項２の化合物またはその塩。 - 【請求項８】 Ｒ1およびＲ2の各々が独立して−Ｌ−Ｂである請求項７に記
載の化合物またはその塩。 - 【請求項９】 Ａが式 【化５】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つが−Ｌ−Ｂであるという条件
で；Ｒ1およびＲ2の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキル、Ｃ1-3ハロアルキル
、または−Ｌ−Ｂであり；Ｒ3およびＲ4の各々は独立して、水素、Ｃ1-3アルキ
ル、ハロ、Ｃ1-3ハロアルキル、または−Ｌ−Ｂであり；ｍは１または２であり
；およびｎは０、１または２である。） である請求項２の化合物またはその塩、 - 【請求項１０】 Ｒ1およびＲ2の各々が独立して−Ｌ−Ｂである請求項９に
記載の化合物またはその塩。 - 【請求項１１】 Ｌが直接結合かまたはＣ1-18アルキレン鎖であり；アルキ
レン鎖は任意に１から５のエーテル基、チオエーテル基、アミン基、エステル基
、チオエステル基またはアミド基を含んでいる請求項２の化合物、またはその塩
。 - 【請求項１２】 Ｂがアゾジ（ビス）尿素基、芳香族または脂肪族ジスルフ
ィド基、芳香族または脂肪族ニトロソ基、チオスルホナート基またはチアゾリド
ン基を含んでいる請求項２の化合物、またはその塩。 - 【請求項１３】 Ｂが化６ 【化６】 （式中、ＲaおよびＲbの一つが−Ｌ−Ａであり、ＲaおよびＲbは同時には−Ｌ−
Ａではないという条件で、ＲaおよびＲbの各々は独立して、水素、Ｃ1-6アルキ
ル、フェニル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、アミンまたは−
Ｌ−Ａであり；およびｐは１、２、３または４である。） から成る群より選択される請求項１２に記載の化合物、またはその塩。 - 【請求項１４】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ
活性を阻害する方法であって、該方法はＤＮＡポリメラーゼ中のジンクフィンガ
ーに結合している亜鉛イオンを化合物が除去するのに十分な条件下、ＤＮＡポリ
メラーゼを化合物と接触させることを含んでおり、それによりポリメラーゼ活性
を阻害することを含む前記方法。 - 【請求項１５】 化合物が ジンクフィンガー反応性部分； リンカー；および リンカーを介してジンクフィンガー部分に連結されたグラム陽性真正細菌
またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含んでいる
請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼがグラム陽性真
正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼが枯草菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩである請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼがマイコプラズ
マＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１９】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細
菌の細胞分裂速度を減少させる方法であって、該方法は化合物が細菌に入り込み
、ＤＮＡポリメラーゼ中のジンクフィンガーへ結合している亜鉛イオンと相互作
用するのに十分な条件下、細菌を化合物に暴露することを含んでおり、それによ
り細胞分裂速度を減少させることを含む前記方法。 - 【請求項２０】 化合物が ジンクフィンガー反応性部分； リンカー；および リンカーを介してジンクフィンガー部分に連結されたグラム陽性真正細菌
またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含んでいる
請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼがグラム陽性真
正細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２２】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼがマイコプラズ
マＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２３】 化合物がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含ん
でいる細菌の細胞分裂速度を減少させるかどうかを試験する方法であって、該方
法は 化合物が細菌に入り込むのに十分な条件下、ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリ
メラーゼを含んでいる細菌を化合物に暴露すること；および 亜鉛イオンがＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガーに結合されているかどう
かを決定すること； を含み、 ここで化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合するが、化合物存
在下では結合しないことは、化合物が細菌の細胞分裂速度を減少させることを示
している、上記方法。 - 【請求項２４】 細菌がグラム陽性真正細菌である請求項２３に記載の方法
。 - 【請求項２５】 細菌がマイコプラズマである請求項２３に記載の方法。
- 【請求項２６】 亜鉛イオンが65Ｚｎイオンである請求項２３に記載の方法
。 - 【請求項２７】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼが配列： Ｚ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ15-27−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１４）
（式中、ＺはＨｉｓまたはＣｙｓであり、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸
であり、およびＸ15-27は任意の１５から２７の連続したアミノ酸である。） を含む請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２８】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼが配列ＩＤ番号
：１と少なくとも７０％同一である請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼが配列ＩＤ番号
：２を含む請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼが配列： Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ−Ｘ19-21−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号：１５）
（式中、Ｘ2は任意の２つの連続したアミノ酸であり、およびＸ19-21は任意の１
９から２１の連続したアミノ酸である。） を含む請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３１】 化合物がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害
するかどうかを試験する方法であって、該方法は： ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼのジンクフィンガーを含んでいるポ
リペプチドを含む混合物を提供すること； 化合物がジンクフィンガーに接触するのを可能にするのに十分な条件下、化合
物と該混合物を混合すること；および 亜鉛イオンがジンクフィンガーに結合されているかどうかを決定すること、 を含み、 ここで化合物不在下で亜鉛イオンはジンクフィンガーへ結合するが、化合物存
在下では結合しないことは、化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻害することを示し
ている、前記方法。 - 【請求項３２】 混合物が該ポリペプチドを含んでいる細胞を含む請求項３
１に記載の方法。 - 【請求項３３】 化合物がジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを阻害
するかどうかを決定する方法であって、該方法は： ジンクフィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる細菌を含む混合物を提
供すること； 化合物が細菌内のＤＮＡポリメラーゼと接触するのを可能にするのに十分な条
件下、化合物と混合物を混合すること（化合物はジンクフィンガー中の亜鉛と相
互作用する基を含んでいる）；および 化合物存在下でのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を測定する、 ここで化合物存在下でのポリメラーゼ活性が化合物不在下でのポリメラーゼ活
性よりも低いことは化合物がＤＮＡポリメラーゼを阻害していることを示してい
る、前記方法。 - 【請求項３４】 望ましくないグラム陽性真正細菌またはマイコプラズマ感
染に感染しやすいまたは感染している哺乳動物を処置する方法であって、該方法
はＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性が阻害されるように、細菌内ジンクフ
ィンガー含有ＤＮＡポリメラーゼ中の亜鉛と相互作用するのに十分な化合物量を
哺乳動物に投与し、それにより哺乳動物を処置することを含む、前記方法。 - 【請求項３５】 化合物が ジンクフィンガー反応性部分； リンカー；および リンカーを介してジンクフィンガー部分に連結されたグラム陽性真正細菌
またはマイコプラズマＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性部位結合部分を含んでいる
請求項３４に記載の方法。 - 【請求項３６】 感染がグラム陽性真正細菌感染である請求項３４に記載の
方法。
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