JP2002525118A - 植物プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋＤサブユニットに対する遺伝子プロモーター領域、または該遺伝子プロモーター領域の活性を保持している欠失フラグメントに関与する。このようなプロモーターは、塊茎において構成的であり、したがって塊茎の出芽を防止または阻害する遺伝子の発現の制御に用いられ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はプロモーターに関する。特に、本発明は植物の塊茎および茎において
構成的であるプロモーターに関する。

【０００２】 より詳細には、本発明は標的遺伝子を植物の貯蔵器官または茎において構成的
に発現させる方法に関する。

【０００３】 遺伝子発現は、核酸および蛋白質エレメントを含む種々の調節成分によって制
御されている。特に、遺伝子の発現は、一般に「プロモーター」と呼ばれる領域
によって制御されている。このプロモーターは、タンパク質をコードする領域の
上流（５’）に位置する。プロモーターは、構成的または、組織特異的、発生調
節的および／または誘導的であり得る。

【０００４】 プロモーター領域内にはいくつかのドメインが存在し、それらはプロモーター
が最大限に機能するために必要である。これらのドメインの最初のものは構造遺
伝子のすぐ上流に存在し、そして遺伝子のすぐ上流の通常７０塩基対の共通配列
を含む「コアプロモーター領域」を形成する。コアプロモーター領域は、特徴的
なＣＡＡＴボックスおよびＴＡＴＡボックス、ならびにその周辺配列を含有し、
そして構造遺伝子の転写開始点を規定する転写開始配列を表す。コアプロモータ
ー領域の正確な長さは不確定であるが、通常よく認知されている。このような領
域は、いくつかの変異を伴って、すべてのプロモーター中に通常存在する。十分
に特徴付けられた種々の「ボックス」間に存在する塩基配列はあまり重要ではな
いように思われる。

【０００５】 コアプロモーター領域の存在が、配列をプロモーターであるとして規定する：
この領域が存在しない場合、プロモーターは機能しない。さらに、コアプロモー
ター領域は、プロモーターの完全な活性を提供するには不十分である。コアの上
流の一連の調節配列が、プロモーターの残りを構成する。調節配列は発現レベル
、発現の空間的および時間的なパターン、ならびにプロモーターの重要なサブセ
ットについては、誘導条件下（光、温度、化学物質、ホルモンのような外部因子
による調節）における発現を決定する。

【０００６】 表現形の特徴（例えば、生産性または品質）を改変および／または改良するた
めの作物植物の操作は、植物組織において異形遺伝子の発現を必要とする。従っ
て、このような遺伝子操作は必要に応じて遺伝子発現を駆動および制御するため
の手段の利用可能性に依存する；例えば、植物において有効であり、そしてトラ
ンスジェニック植物において所望される効果を提供するように遺伝子発現を制御
する適切なプロモーターの利用可能性および使用に依存する。種々の異なるプロ
モーターの選択を有することは有利であり、その結果もっとも適切なプロモータ
ーが特定の遺伝子、構造物、細胞、組織、植物または環境に対して選択され得る
。

【０００７】 細菌、ウイルス、真菌および植物由来のプロモーター（および、他の調節成分
）が、植物細胞において遺伝子発現を制御するために用いられてきた。種々の外
来遺伝子（例えば、細菌のマーカー遺伝子）に融合された種々のプロモーター配
列を含むＤＮＡ構成物を用いた多くの植物形質転換実験は、有用なプロモーター
配列の同定を導いた。ほとんどの場合において５００−１０００塩基までの配列
が、外来遺伝子の調節された発現を可能にするのに十分であることが実証された
。しかし、１ｋｂよりもずっと長い配列が、トランスジェニック植物における高
レベルの遺伝子発現を可能にするという有用な特徴を有し得ることもまた示され
ている。一定範囲の天然に存在するプロモーターは植物において効果があること
が公知であり、植物の異形遺伝子（外因性および内因性の両方）の発現を駆動す
るために用いられてきた：例えば、構成的な３５Ｓカリフラワーモザイクウイル
スプロモーターおよび成熟で増強されるトマトポリガラクツロナーゼプロモータ
ー（Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，１１：６５１−６６２）、Ｅ８プロモーター（Ｄｉｅｋｍａｎ＆Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ，１９８８，ＥＭＢＯ，７：３３１５−３３２０）、および果実特異的２Ａ１
１プロモーター（Ｐｅａｒら，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１３：６３９−６５１）など。

【０００８】 発現の制御のために二つの主要な方法が公知である、すなわち：過剰発現およ
び過少発現。過剰発現は、選択した遺伝子の一つまたは一つより多い余分なコピ
ーを挿入することによって達成される。しかし、ヌクレオチド配列の一つまたは
一つより多い余分なコピーで最初に形質転換した植物またはその子孫が、過少発
現ならびに過剰発現の効果を示すことは未知ではない。

【０００９】 過少発現については二つの主要な方法が存在する。これらは一般的に「アンチ
センスダウンレギュレーション」および「センスダウンレギュレーション」（セ
ンスダウンレギュレーションは”「コサプレッション（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ）」とも呼ばれる）と当該分野で呼ばれる。一般的にこれらの方法は、「ジ
ーンサイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」といわれる。これらの
方法は両方とも標的遺伝子の発現阻害を起こす。他のあまり重要でない用いられ
る方法は、挿入された遺伝子のより高いまたはより低い発現を達成するために、
遺伝的制御エレメント、プロモーターおよび制御配列の改変を含む方法を包含す
る。センス／コサプレッションの技術の操作可能性は改変可能であることが疑う
べくもない。これは十分確立されており、世界中の研究室で慣用的に用いられて
おり、そしてそれが用いられた生成物が市場に出ている。

【００１０】 これらの方法のいずれかにより制御された遺伝子は、選択した遺伝子（一つま
たは多数）の植物材料への挿入を必要とし、この植物材料は植物へと再生され得
る。この形質転換の方法は多くの方法を介して実施され得る。例えば、Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法。

【００１１】 要約すると、センスおよびアンチセンス技術の両方についての必要要件は公知
であり、そして必要とされる配列が導入され得る方法は公知である。次に残され
ていることは、その調節が所望の効果を有すると予期される遺伝子を同定するこ
と、それらを単離するか、または十分に有効な長さのフラグメントを単離するこ
と、プロモーターと終止シグナルとの間に有効なフラグメントを挿入したキメラ
遺伝子を構築すること、そして形質転換によって標的の植物種の細胞にその構築
物を挿入することである。次いで、全植物を形質転換した細胞から再生し得る。

【００１２】 当業者は、所望される様式で遺伝子発現を調節するために適切な発現カセット
（一つ以上のプロモーターおよび他の成分を組み込んでいる）を使用し得る（例
えば、特定の組織または特定の発生段階での発現を増強または減少させることに
よる）。従って、異なる活性プロフィールを有する一定範囲のプロモーターから
適切なプロモーターを選択する能力は重要である。

【００１３】 ジャガイモ塊茎は非常に経済的に重要である。これらは、多くの食事において
炭水化物供給源となり、種々の加工製品の基本として使用される。デンプンに加
えて、塊茎は高品質の蛋白質、相当量のビタミン、ミネラルおよび微量元素を含
む。

【００１４】 ジャガイモは大半の生育地域においては一年を通じて生育させ得ない。従って
、生育時期でない時には貯蔵することが所望される。貯蔵中の潜在的にもっとも
多い被害の現象の一つは早熟の新芽が出ることである。出芽を抑制する現在の方
法は、冷却および化学的出芽抑制剤を含む。

【００１５】 冷却（周囲温度に空気を換気することにより、通常北欧で行われている）は出
芽を阻害する方法の一つである。付随するコストは別にして、４℃に長期間冷却
することで冷却スイートニング（ｃｏｌｄ ｓｗｅｅｔｅｎｉｎｇ）および黒化
（ダークニング（ｄａｒｋｅｎｉｎｇ））の問題が発生する。

【００１６】 低温貯蔵は好ましくない還元糖の蓄積を導くので、化学的出芽抑制剤の使用は
、加工および生鮮消費することになっているジャガイモの出芽を阻害するために
現在唯一可能性がある。化学薬品の使用ならびに、それらに付随するコストおよ
び不便さを取り除くこともまた望ましい。従って、塊茎のような栄養性貯蔵器官
の出芽を制御する代替方法に対する現実の必要性が存在する。出芽を遅らせるた
めの代替のアプローチは、静止状態の期間の延長を伴うトランスジェニック植物
の使用である。

【００１７】 ジャガイモ塊茎の出芽は、遺伝子工学の標的となり得るいくつかの独立した段
階を含む。最初の段階は、貯蔵物、主にデンプンの移動である。デンプンの分解
は、アミロプラストで起こる。サイトゾルへ移行した後、生成されたヘキソース
およびヘキソース−フォスフェートは、解糖とスクロース合成との間に分配され
る。第三段階は、サイトゾル内でのスクロース形成である。スクロース合成はエ
ネルギー依存的である。従って解糖および呼吸が必要である。第四段階は、発生
中の新芽へのスクロースの移行である。最後に、移入されたスクロースは、新芽
において成長および発生を支持するように利用される。

【００１８】 本発明者らは、ジャガイモのような植物の栄養性貯蔵組織および茎に構成的な
遺伝子プロモーターによって、出芽抑制遺伝子を，塊茎休眠のすべてのステージ
を通じて駆動した塊茎において出芽を抑制する手段を現在開発した。

【００１９】 従って、本発明は、栄養性貯蔵器官の発生、貯蔵および出芽を通し、ならびに
植物の茎において構成的に発現されるプロモーターを提供しようと探求している
。このようなプロモーターは、塊茎、そしてより詳細にはジャガイモ塊茎の出芽
の抑制において使用され得る。

【００２０】 本発明により、植物の栄養性貯蔵器官および茎において標的遺伝子を構成的に
発現する方法が提供される。この方法は、標的遺伝子配列に作動可能に連結され
、そしてこれを制御するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフ
ォーム（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｉｓｏｆｏｒ
ｍ ＩＩ）の２７ｋＤサブユニットに対する遺伝子プロモーター領域、または遺
伝子プロモーター領域の活性を保持しているその欠失フラグメントを含む第一の
ポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、植物のゲノムに組み込む工程、好
ましくは安定的に組み込む工程、を包含する。

【００２１】 好ましくは、このＤＮＡ構築物は第二のポリヌクレオチド配列をさらに含む。
第二のポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター領域に作動可能に連結され
、そしてこの制御下にある少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む。

【００２２】 好ましくは、標的遺伝子の発現によって貯蔵器官の出芽抑制が生じる。

【００２３】 好ましくは、第二のポリヌクレオチド配列の発現を誘導することによって、出
芽の抑制は中和される。

【００２４】 好ましくは、第二のポリヌクレオチド配列は、前述の第一のポリヌクレオチド
配列に対応するセンス、アンチセンス、もしくは部分的センス配列、または標的
遺伝子によってコードされるタンパク質の抑制を引き起こし得るＤＮＡ配列であ
る。好ましくは、第一および第二ポリヌクレオチド配列は転写終止領域をさらに
含む。

【００２５】 好ましくは、遺伝子プロモーターはトウモロコシのグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモータ
ー（ＧＳＴプロモーター、図８および配列番号１）であるが、他の生物体由来の
類似プロモーターもまた使用され得る。ＧＳＴプロモーターは本発明者らの以前
の特許出願公開番号ＷＯ９３／０１２９４およびＷＯ９７／１１１８９に記載さ
れている。さらに、これに対して実質的に相同性の配列番号１のＧＳＴプロモー
ターの改変体を使用することが可能である。

【００２６】 相同性または同一性の程度を決定する目的で核酸配列を比較する場合、ＢＥＳ
ＴＦＩＴおよびＧＡＰ（両方とも、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアパッケージ）のようなプロ
グラムが使用され得る。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、二つの配列を比較し、そし
て最も類似したセグメントの最適なアラインメントを作製する。ＧＡＰは、配列
が全長にそって整列されるのを可能にし、そして適切なようにいずれかの配列に
スペースを挿入することによって最適なアラインメントを見出す。適切には、核
酸配列の相同性を検討する場合に、本発明の比較の文脈において、その比較は、
それらの全長にそった配列アラインメントによってなされる。

【００２７】 好ましくは、実質的な相同性を有する配列とは、前述の配列と好ましくは増加
する順に、少なくとも５０％の配列相同性、望ましくは少なくとも７０％の配列
相同性、およびさらに望ましくは少なくとも８０％、９０％または少なくとも９
５％の配列相同性を有する。いくつかの場合においては、相同性は９９％または
それ以上であり得る。

【００２８】 望ましくは、用語「実質的な同一性」は、前述の配列が、先行技術の核酸配列
よりも本明細書中で記載されている配列のいずれかとより高程度の同一性を有す
るということを示す。

【００２９】 先に述べたように、配列番号１の改変体は、プロモーター配列として用いられ
得るが、約３５９０塩基から３８２２塩基までの配列が実質的に保存されている
か、または配列番号１と少なくとも８０％以上の相同性であることが非常に好ま
しい。

【００３０】 フラグメントが遺伝子プロモーター領域の活性を保持する限り、プロモーター
の欠失フラグメントを用いることもまた可能である。このようなフラグメントの
例は、本発明者らの以前の特許出願（ＷＯ９７／１１１８９として公開）に記載
されており、そしてこれはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブ
ユニットの以下の領域を含む： グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流８９７塩基対を含む配列；グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモーター配列の転写
開始点からすぐ上流５７０塩基対を含む配列；または グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモー
ター配列の転写開始点からすぐ上流３７８塩基対を含む配列。グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモーター配列の転写開
始点は、配列番号１の３７０１位にあるとしてＷＯ９３／０１２９４およびＷＯ
９７／１１１８９に定義されている。

【００３１】 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流５７０塩基対を含む一つの有用なフラグメ
ントは、図９（配列番号２）に示す６９３塩基のフラグメントである。

【００３２】 好ましくは、貯蔵器官は塊茎である。

【００３３】 好ましくは、植物はジャガイモ植物である。

【００３４】 本発明の好ましい実施態様に従って、標的遺伝子を植物の貯蔵器官または茎に
構成的に発現させる方法が提供される。この方法は、標的遺伝子配列に作動可能
に連結され、そしてこれを制御するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＩＩ型
アイソフォームの２７ｋＤサブユニットに対する遺伝子プロモーター領域、また
は遺伝子プロモーター領域の活性を保持しているその欠失フラグメントを含む第
一のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、植物のゲノムに組み込む工程
、好ましくは安定的に組み込む工程を包含する。ＤＮＡ構築物は第二のポリヌク
レオチド配列をさらに含む。第二のポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモータ
ー領域に作動可能に連結され、そしてこの制御下にある少なくとも一つのＤＮＡ
配列を含む。

【００３５】 本発明に関して用語「トランスジェニック」は、天然の環境において付随する
機能的な遺伝子と共に天然の環境における野生型の調節プロモーターを含まない
。

【００３６】 本発明に関して用語「標的遺伝子」は、目的の任意の遺伝子を意味する。標的
遺伝子は、当該植物にとって外来または天然のいずれかである任意の遺伝子であ
り得る。

【００３７】 用語「構築物」（「カセット」、「ハイブリッド」および「結合体」のような
用語と同義）は、カセットを形成するように、直接的または間接的に調節プロモ
ーターに連結された標的遺伝子を含む。間接的連結の例は、プロモーターと標的
遺伝子との間を介在するイントロン配列のような適切なスペーサー群の提供であ
る。同じことが本発明に関して「融合」についても当てはまり、これは直接的ま
たは間接的連結を含む。そのような構築物はまた、目的の細胞を形質転換するた
めに適切なプラスミドおよびファージを含む。

【００３８】 用語「誘導可能なプロモーター」は、化学的に誘導され得るプロモーターを含
む。外来性化学刺激物の適用によって制御されるプロモーター配列の使用は、特
に好ましい。外来性化学刺激物は、好ましくは農業的に受容可能な化学物質であ
り、その使用は農業的実施に適合性であり、そして植物または哺乳動物に有害で
はない。

【００３９】 「ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）」に関してもまた、サツマイモ（ｓｗｅｅｔ
ｐｏｔａｔｏ）および類似の植物のようなジャガイモファミリーの他の植物を含
む。

【００４０】 もっとも好ましい誘導性プロモーター領域は、例えば、公開された本発明者ら
の国際公開番号ＷＯ９３／２１３３４に記載のあるａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺伝子ス
イッチプロモーター系、および、本発明者らの国際公開番号ＷＯ９６／３７６０
９に記載のあるエクジソンスイッチ系（これらの教示を、本明細書中で参考とし
て援用する）のような二成分系のような誘導性スイッチプロモーター系を含む。
そのようなプロモーター系を、本明細書中では「スイッチプロモーター」という
。スイッチプロモーターとともに用いるスイッチ化学薬品は、この系を本発明の
方法において特に有用にさせる農業的に受容可能な化学薬品である。ａｌｃＡ／
ａｌｃＲプロモータースイッチ系の場合、好ましい化学的インデューサーは、液
体または蒸気の形態のいずれかのエタノールである。

【００４１】 使用され得る適切なターミネーターもまた、当該分野において周知であり、そ
して例えば、ノパリンシンターゼのターミネーターおよびオクトピンシンターゼ
のターミネーターを含む。

【００４２】 ＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列は、形質転換されるホストに関して内在性または外
来性であり得る。

【００４３】 出芽を制御するために本発明において用いられ得る標的ＤＮＡ配列の例は、以
下のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む：休眠中の貯蔵物の移動（例えば
デンプン分解）に関与するタンパク質、すなわちデンプンホスホリラーゼ、アミ
ラーゼ（例えば、αアミラーゼまたはβアミラーゼ）およびマルターゼ；例えば
、解糖および引き続く代謝に関与するタンパク質、例えばホスホフルクトキナー
ゼ、ヘキソキナーゼ；スクロース生合成に関与するタンパク質、例えばスクロー
スシンターゼ；師部の負荷（ｐｈｌｏｅｍ ｌｏａｄｉｎｇ）に関与するような
休眠中の貯蔵物の輸送に関与するタンパク質、例えばＡＴＰａｓｅ；長距離の師
部輸送および師部非負荷（ｐｈｌｏｅｍ ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）に関与するタン
パク質、例えば無機ピロホスホリラーゼ（ｉＰＰａｓｅ）；ならびに同化産物分
解に関与するような休眠中の貯蔵物の利用（例えば生長中の出芽におけるスクロ
ース分解）に関与するタンパク質、すなわちインベルターゼ；ならびに同化産物
の利用（例えばスクロース由来代謝産物の利用）に関与するタンパク質、新芽形
成に必要なエネルギーの供給に関与するタンパク質、例えばアデニンヌクレオチ
ド輸送体（ＡＮＴ）およびリンゴ酸オキソグルタル酸塩（ｍａｌａｔｅ ｏｘｏ
ｇｌｕｔａｒａｔｅ）輸送体（ＭＯＴ）、そして脱共役タンパク質のようなそれ
らのインヒビター。有用なＤＮＡ配列の例はまた、ジャガイモの出芽に関与する
任意の他の配列を含む。

【００４４】 出芽を制御するために本発明の方法において用いられ得る好ましい標的ＤＮＡ
配列の例は、スクロースの移動および／または利用に関与するタンパク質、ジャ
ガイモの出芽に関与するタンパク質、および呼吸のようなミトコンドリアの機能
に関与するタンパク質に対するセンス、アンチセンス、または部分的センス配列
の生成を生じる配列、および／またはそれらをコードする配列を含む。

【００４５】 特に好ましい標的ＤＮＡ配列の例は、植物、細菌または真菌供給源由来（例え
ば、酵母由来）由来インベルターゼ、植物、細菌または真菌供給源由来のピロホ
スファターゼ、および植物、細菌または真菌供給源由来のアデノシンヌクレオチ
ド輸送体タンパク質（ＡＮＴ）またはミトコンドリアオキソグルタル酸塩輸送体
（ＭＯＴ）のようなミトコンドリアの機能に関与するタンパク質をコードする配
列を含む。

【００４６】 出芽の抑制は、様々な方法によって達成され得る。第一のＤＮＡ配列は、栄養
性貯蔵器官の休眠中に発現され得、次いで出芽が望まれる場合にはダウンレギュ
レートされ得る。出芽が望まれる場合、第二のＤＮＡ配列の発現によって、第一
のＤＮＡ配列のダウンレギュレーション、結果として出芽の回復へと誘導され始
める。

【００４７】 所望される標的ＤＮＡ配列のダウンレギュレーションは、例えば、リプレッサ
ータンパク質、センス、アンチセンス、部分的センス、および相補的タンパク質
の発現の使用によるような当該分野において周知の方法を用いて達成され得る。
適切なオペレーター／リプレッサー系の例は、例えば、ｌａｃ、ｔｅｔ、または
λ４３４系、およびＬａｃＩΔＨｉｓ変異体（Ｌｅｈｍｉｎｇ，Ｎ．，Ｓａｒｔ
ｏｒｉｓ，Ｊ．，Ｎｉｅｍｏｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅｎｇｅｒ，Ｇ．，ｖ．
Ｗｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｂ．およびＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，Ｂｅｎ
ｎｏ（１９８７），ＥＭＢＯ Ｊ．６（１０）３１４５−３１５３、（ＬａｃＩ
の１７番目のアミノ酸においてヒスチジンをチロシンに変えた変異体））のよう
なそれらの変異体を含む。あるいは、Ａｍｐｌｉｃｏｎ^TMは、遺伝子をダウンレ
ギュレートさせるために用いられ得る（Ａｎｇｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｂａｕｌｃｏ
ｍｂｅ，Ｄ．Ｃ．，（１９９７）１６，３６７５−３６８４）。これに関して、
その中に挿入された導入遺伝子を有する複製性ジャガイモウイルス（ＰＶＸ）Ｒ
ＮＡのｃＤＮＡが用いられ、ここではその導入遺伝子と相同性を共有する一過的
に発現したＲＮＡが抑制される。

【００４８】 あるいは、第一のポリヌクレオチド配列におけるＤＮＡ配列の発現は、出芽ま
たはＡｍｐｌｉｃｏｎ^TMの発現に関与する遺伝子を抑制するように作用するセン
ス、アンチセンス、または部分的センス配列の産生を生じ得る。この場合、出芽
は、第一のＤＮＡ配列におけるセンス、アンチセンスまたは部分的センス配列に
よってその発現が抑制されていたタンパク質またはそれに対応するタンパク質の
産生を生じる第二のポリヌクレオチド配列におけるＤＮＡ配列を開始させること
によって回復される。出芽はまた、適切なオペレーター／リプレッサー系を用い
て回復され得る。

【００４９】 構築物中のポリヌクレオチド配列のいずれか、または両方が、１つより多いＤ
ＮＡ配列を含む場合には、それらが、いかなるコサプレッション効果をも避ける
ために同一ではないことが好ましい。

【００５０】 構築物の第二のポリヌクレオチド配列におけるＤＮＡ配列は、誘導性プロモー
ター領域の制御下にある。

【００５１】 使用され得る適切な転写ターミネーターはまた、当該分野で周知であり、そし
て、例えば、ノパリンシンターゼのターミネーターおよびオクトピンシンターゼ
のターミネーターを含む。

【００５２】 本発明の方法において使用するための誘導性プロモーター領域は、好ましくは
ａｌｃＡ／ａｌｃＲプロモータースイッチ系である。出芽の回復は、切り替え可
能なアンチセンス、または切り替え可能なセンスもしくは部分的センス法を、本
明細書中により十分に記載されているように用いてか、あるいはＡｍｐｌｉｃａ
ｎ^TMの使用によるかまたは適切なオペレーター／リプレッサー系によって好まし
く達成される。部分的センスコサプレッションに起因する遺伝子活性のダウンレ
ギュレーションは、本発明者らの国際特許出願番号ＷＯ９１／０８２９９（この
開示を本明細書中で参考として援用する）に記載されており、そして必要である
ならば、これを、異なる生物体由来の遺伝子配列を用いることによって避け得る
。

【００５３】 本発明の利点は、塊茎の出芽まで塊茎の発生全体を通じて発現が維持されるこ
とである。

【００５４】 ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターは、もともとトウモロコシにおいて単離され
、そして本発明者らの国際公開番号ＷＯ９０／０８８２６およびＷＯ９３／０１
２９４に記載しているように、葉組織において誘導可能であることが示された。
本明細書と共に図８および９に示されるヌクレオチド配列を含むグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフォーム酵素の２７ｋＤサブユニット（Ｇ
ＳＴ−ＩＩ−２７）に対する遺伝子プロモーターをコードするゲノムＤＮＡ配列
は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの中のプラスミドｐＧＩＥ７として、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ
Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に受託番号ＮＣＩＭＢ４０４
２６に寄託された。さらに、根組織におけるＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターの
発現は、構成的であることが公知であるが（参考文献：Ｈｏｌｔ，Ｄ．Ｃ．，Ｌ
ａｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｅ．Ｄ．，Ｄｉｎｓｍｏｒｅ，Ａ．，Ｊｅｐｓ
ｏｎ，Ｉ．，Ｂｒｉｇｈｔ．Ｓ．Ｗ．Ｊ．，およびＧｒｅｅｎｌａｎｄ，Ａ．Ｊ
．（１９９５） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅ
ｎｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ＩＩ ｆｒｏｍ ｍａｉｚｅ． Ｐｌａｎｔａ １９６，
２９５−３０２を参照のこと）、茎および塊茎器官におけるＧＳＴ−ＩＩ−２７
プロモーターの構成的発現は予期しない発見であった。

【００５５】 塊茎は、根組織ではないが、匍匐枝と呼ばれる地下茎として始まる。塊茎化は
、匍匐枝端の直下の最も若い伸長節間において始まる。匍匐枝の伸長が停止し、
細胞の伸長次いで分裂によって放射状生長が始まる。デンプンは、発生中の塊茎
に蓄積し、そして貯蔵糖タンパク質が形成される。塊茎は、節、節間および腋芽
を有するので、変更された茎として記載され得る。

【００５６】 要約すると、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターは、植物に適用されるいかなる
インデューサー非存在下においても発現されるので、茎および塊茎における構成
的プロモーターとして用いられ得る。ＧＳＴ−ＩＩ−２７インデューサーが適用
されない限り、これは葉組織においては発現しない。このような構成的プロモー
ターの適用は、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーター由来の塊茎出芽抑制遺伝子の発
現を含み、これは例えば、誘導性プロモーター由来のアンチセンスまたはコサプ
レッションによって逆転され得る。

【００５７】 標的遺伝子配列に作動可能に連結され、そしてこれを制御するグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プ
ロモーター領域またはこの遺伝子プロモーター領域の活性を保持するその欠失フ
ラグメントを含むＤＮＡ構築物は、本発明のさらなる局面を含む。

【００５８】 本発明のＤＮＡ構築物において、標的遺伝子は、一般に、その発現が、ジャガ
イモのような植物の栄養性貯蔵器官における出芽を抑制する遺伝子である。出芽
抑制遺伝子の好ましい型は、本発明の第一の局面に関連して上記されている通り
である。

【００５９】 本発明のＤＮＡ構築物における使用に特に適切な遺伝子プロモーターは、トウ
モロコシのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋ
Ｄサブユニットの遺伝子プロモーター（配列番号１）または上記に規定したよう
なそれに対して実質的に相同な配列である。遺伝子プロモーター領域の活性を保
持しているグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋ
Ｄサブユニットの遺伝子プロモーターのフラグメントもまた用いられ得る。すで
に述べたように、そのようなフラグメントは以下を含む： グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流８９７塩基対を含む配列； グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流５７０塩基対を含む配列；または グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流３７８塩基対を含む配列。

【００６０】 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点は、配列番号１の３７０１位にあるとしてＷＯ９３／０
１２９４およびＷＯ９７／１１１８９に定義されている。

【００６１】 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター配列の転写開始点からすぐ上流５７０塩基対を含む一つの有用なフラグメ
ントは、図９に示す６９３塩基のフラグメント（配列番号２）である。

【００６２】 本発明のＤＮＡ構築物はまた、誘導性プロモーター領域に作動可能に連結され
、そしてこの制御下にある少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む第二のポリヌクレ
オチドを含むことが好ましい。本発明の第一の局面に関連してすでに述べたよう
に、第二のポリヌクレオチド配列は、上述の第一のポリヌクレオチド配列に対応
するセンス、アンチセンスまたは部分的センス配列、あるいは標的遺伝子によっ
てコードされるタンパク質の抑制を引き起こし得るＤＮＡ配列であり得る。

【００６３】 構築物はまた、転写ターミネーター領域を含み得る。

【００６４】 本発明のＤＮＡ構築物は、ジャガイモファミリーの植物を、塊茎の出芽を抑制
するように形質転換するために用いられ得る。従って、本発明のさらなる局面に
おいて、上記に規定したようなＤＮＡ構築物を含むジャガイモ植物の生殖質が提
供される。

【００６５】 本発明はまた、上記に規定したようなＤＮＡ構築物を含むジャガイモ植物、ジ
ャガイモ種子、またはジャガイモ植物細胞を提供する。さらに、本発明のなおさ
らなる局面において、ジャガイモ塊茎における出芽を予防するまたは阻害する方
法が提供される。この方法は、上記に規定した標的配列を、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼＩＩ型アイソフォームの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
ーター領域、またはこの遺伝子プロモーター領域の活性を保持するその欠失フラ
グメントの制御下において、塊茎に発現させる工程を包含する。

【００６６】 本発明の好ましい種々の特色および実施態様は、ここで、添付する図面の参照
と共に、制限することのない実施例により記載される。

【００６７】 （実施例１） ＧＵＳレポーター遺伝子およびＮｏｓ３’終結区領域に融合したＧＳＴ−ＩＩ
−２７プロモーターの３８２２塩基対の５’領域を含む構築物を、ジャガイモに
形質転換した。図１０および１１は、全長および欠失型の両方のＧＳＴプロモー
ターを含む構築物を示す。

【００６８】 標準組換えＤＮＡ法を、プラスミドベクターの構築において採用した。ｐＧ１
Ｅ７から得たＧＳＴ−２７ ３．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ ５’隣接領域
を含むレポーター遺伝子構築物を、平滑末端化し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＴｉベクターｐＢＩ１０１のＳｍａＩ部位に連結した。ＧＳＴ−２７の予想さ
れた翻訳開始コドンに存在するＮｄｅＩ部位を、平滑化後に破壊した。このこと
は、ｐＢＩ１０１中のｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＥ．ｃｏｌ
ｉ ＵｉｄＡ遺伝子と融合するのに便利な点を形成した。結果としてできたキメ
ラレポーター遺伝子構築物ｐＧＳＴＴＡＫの構造を、制限酵素処理および配列分
析によって確認した。

【００６９】 配列番号２の欠失プロモーターを産生するために、ＧＳＴ−２７プロモーター
フラグメントの５’末端にｐＡＩ５オリゴを、および３’末端にｐＡＩ２オリゴ
を用いてＰＣＲ産物を合成した。５’ｐＡＩ５オリゴは、配列ＧＣＧＧＣＡＡＧ ＣＴＴ ＡＡＴＡＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡを有し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた
。ｐＡＩ２オリゴは、配列ＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴを
有し、ＰｓｔＩ部位を含むプロモーター配列とハイブリダイズした。精製したＰ
ＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩによって切断し、ｐＧＳＴＴ
ＡＫクローンのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩベクターフラグメントへ連結した。

【００７０】 他の構築物もまた、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターの欠失フラグメントを用
いて構築した。このような欠失フラグメントは、本発明者らの国際公開第ＷＯ９
７／１１１８９号に記載されている。

【００７１】 プラスミドｐＧＳＴ：：ＧＵＳを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｃ５８Ｃ１：ｐＧＶ２２６０の直接形質転換を、Ｈｏｅｆｇ
ｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８８）（Ｊ．ｌｏｃ ｃｉｔ）に記載さ
たように実行した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介遺伝子移入を用いたジャガ
イモ形質転換（ｓｏｌａｒａ）を、Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら（１９８９）（Ｊ．
ｌｏｃ ｃｉｔ）に記載されたように実施した。

【００７２】 （実施例２） これらのジャガイモ植物におけるＧＳＴ−２７発現パターンの解析を、実施し
た。種々の植物部分から得た組織を、未処理植物および除草剤毒性緩和剤である
Ｎ，Ｎ−ジアリル１−２，２−ジコロアセタミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉａｌｌｙｌ１−
２，２−ｄｉｃｈｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いて処理した植物から採取し
た。詳細には、ＧＳＴ：ＧＵＳ構築物を，化学的毒性緩和剤であるＮ，Ｎ−ジア
リル１−２，２−ジコロアセタミドを用いた根浸漬によってＳｏｌａｎｕｍ ｔ
ｕｂｅｒｏｓｕｍ変種ｓｏｌａｒａに誘導した。

【００７３】 葉組織における誘導に由来する結果を、図１Ａに示す。初代の解析は、生長培
地中に加えることによって、Ｎ，Ｎ−ジアリル１−２，２−ジコロアセタミド毒
性緩和剤を適用した後のＧＳＴ：ＧＵＳの鮮明な誘導を示す。１０％毒性緩和剤
濃度が、最大レベルの毒性緩和剤誘導を生じさせることがわかった。

【００７４】 異なる毒性緩和剤である３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１
，３−オキサゾリドンを用いた根浸漬誘導のさらなる徹底的な反復を、次に実施
した。葉組織の結果を、野生型およびＣａＭＶ ３５Ｓ植物の葉組織と比較した
。誘導倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を、図１Ｂに示す。２つの植物系
統は、毒性緩和剤適用後に高い誘導倍率およびレベルの高いＧＳＴ：ＧＵＳ発現
を示す。

【００７５】 （実施例３） ＧＳＴ：ＧＵＳ系統（系統６）植物の一つを用いた時間経過実験を、実施した
。未誘導の葉サンプルを、０時間時に採取し、そして３−ジクロロアセチル−２
，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリドン毒性緩和剤を、根浸漬によって
６週齢植物に適用した。葉組織を、その後間隔をおいて採取し、そして蛍光定量
的ＧＵＳアッセイを実施した。図２は、ＧＳＴ：ＧＵＳ発現が７２時間でピーク
になること、および５〜７日後に発現が減少することを示す。組織を植物から採
取し、そして蛍光定量アッセイを、実施した（図３Ａ参照）。Ｘ−ｇｌｕｃを用
いた組織化学的染色を、蛍光定量アッセイにおいて用いられる植物から得た組織
片に対して実施した。染色は、根および茎における構成的なＧＳＴ：ＧＵＳ発現
を示した；蛍光定量の結果は、高い未誘導のＧＳＴ：ＧＵＳの発現を示す。この
ＧＳＴ：ＧＵＳ発現は、毒性緩和剤を適用した時に上昇する。発現は、匍匐根に
おいては、青染色によって確認できなかったが、蛍光定量の結果は、高い未誘導
の発現を示し、この発現は化学物質適用後の上昇する（図３Ｂ参照）。図３Ｃに
よると、ＧＳＴ：ＧＵＳの構成的な発現は、染色された茎切片の維管束領域に主
に存在すること、そして図３Ｄによると、Ｘ−ｇｌｕｃを用いて染色された、毒
性緩和剤誘導植物の茎を貫く長軸切片染色は、茎の断面の両側において維管束組
織（木部、形成層、師部）に生じることがわかり得る。Ｘ−ｇｌｕｃを用いて染
色された未誘導の６週齢のジャガイモ茎を貫く横断切片(図４参照)は、木部（内
側）、形成層および師部（外側）が青く染色されたことを示し、茎の維管束の束
における高いＧＳＴ：ＧＵＳの発現を示す。茎の維管束組織におけるＧＳＴ：Ｇ
ＵＳの発現は、構成的である。

【００７６】 （実施例４） ４ヶ月齢のＧ４４系統およびＧ６系統、野生型および３５Ｓ：ＧＵＳを、３−
ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリドン毒性緩和
剤を用いて根浸漬した。これらの系統から得た塊茎を、化学薬品処理前および後
にＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染色した（図５Ａ参照）。ネガティブコン
トロールである野生型塊茎は、予想通り染色が見られない；ポジティブコントロ
ールであるＣａＭＶ ３５Ｓ塊茎は、濃い青に染色された。Ｇ４４は、未誘導の
塊茎の中心にわずかな呈色を示したが、Ｇ６塊茎は、未誘導および誘導された塊
茎において濃い青に染まり、このことは塊茎中のＧＳＴ：ＧＵＳ構成的な発現を
示す。

【００７７】 （実施例５） 未誘導および誘導された植物から得た塊茎の蛍光定量アッセイを実施した（図
５Ｂ参照）。野生型植物からは、発現は、観察されず、比較的高い発現が、Ｃａ
ＭＶ ３５Ｓ塊茎から観察された。Ｇ６系統およびＧ４４系統から得た塊茎は、
高い未誘導なＧＵＳ発現を有する。この発現は、Ｇ６において毒性緩和剤適用後
増加するが、Ｇ４４系統塊茎においては適用後減少する。組織化学的および蛍光
定量的な結果は、塊茎におけるＧＳＴ：ＧＵＳの構成的な発現を示し、Ｇ６は、
最も高く発現する系統であることを示す。

【００７８】 （実施例６） 貯蔵したＧ６系統およびＧ４４系統、ならびに野生型ネガティブコントロール
から得た６ヶ月齢の塊茎を、組織化学的に染色した。Ｇ６およびＧ４４は、Ｘ−
ｇｌｕｃを用いてよく染色された。図６Ａからわかり得るように、Ｇ６はＧ４４
よりも濃い青に染色され、このことはＧＳＴ：ＧＵＳのより高い発現を示す。こ
のことは、ＧＳＴ：ＧＵＳの発現は、休眠時を通じて続行し、６ヶ月齢の貯蔵の
間もまだ持続することを意味する。

【００７９】 （実施例７） 出芽の段階にある８ヶ月齢の塊茎を、組織化学的に染色した。図６Ｂからわか
り得るように、Ｇ６は、染色によって、濃い青の呈色を示し、そしてＧＳＴは、
休眠時および出芽時を通じて発現し、発現レベルが低下することはないように思
われることを示す。

【００８０】 図７Ａおよび７Ｂは、野生型およびＣａＭＶ ３５Ｓコントロールと比較した
、ジャガイモの生活環（２、４および８ヶ月）を通じての染色された塊茎を示す
。ＧＳＴ：ＧＵＳの発現が、休眠時を通じて、およびタネイモとして用いられる
新しい出芽の段階において高いままであることが明白にわかり得る。

【００８１】 （実施例８） この結果は、ＧＳＴ−２７プロモーター領域が、葉において誘導性であるが、
根、茎および塊茎においては、誘導剤の非存在下において発現するということを
示した。構成的な塊茎発現は、発達中の塊茎、休眠時の塊茎および出芽時の塊茎
において存在した。根組織におけるＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターの構成的な
発現は、すでに記載されているが、茎や塊茎器官におけるＧＳＴ−ＩＩ−２７プ
ロモーターの発現は、驚くべきことであった。

【００８２】 （実施例９） ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳトランスジェニック植物と３５Ｓ：ＧＵＳトラン
スジェニック植物との比較。

【００８３】 パタチン塊茎特異的プロモーター、３５Ｓプロモーター、および野生型塊茎に
対するに全長３８２２塩基対のプロモーターの比較を、ＧＵＳ発現を分析するこ
とにより実施する。

【００８４】 化学的毒性緩和剤である３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１
，３−オキサゾリドンの、ＧＳＴ−２７：ＧＵＳ（上述のＧ６系統、Ｇ４４系統
）、ＣａＭＶ３５Ｓ：ＧＵＳ、パタチン：ＧＵＳおよび野生型植物を含む種々の
植物系統への適用による誘導性の葉発現を、蛍光定量アッセイによって分析する
。

【００８５】 上述の系統の未誘導な塊茎遺伝子発現を、休眠時を通じたすべての段階におい
てＧＵＳ発現レベルを比較することによって、蛍光定量的および組織化学的に測
定する。このことは、塊茎におけるパタチンのプロモーターの発現と全長ＧＳＴ
−２７のプロモーターの発現と欠失ＧＳＴ−２７のプロモーターの発現とを直接
比較することを可能にする。パタチンプロモーターの発現レベルが、休眠の間に
塊茎において減少することのいくつかの証拠がある；塊茎休眠時および出芽期を
通じて一貫して高レベルに発現するプロモーターは、塊茎の出芽の抑制において
、標的遺伝子の発現を駆動するのに用いられ得る。ＧＳＴ−２７プロモーターの
発現を、パタチンプロモーターとの比較によって休眠時を通じて決定する。

【００８６】 ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーター領域の欠失バージョン（配列番号２）をまた
、調整し、そして試験した（図１１参照）。次いで、このプロモーター領域を、
３８２２塩基対の全長ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーター領域と比較し得る。

【００８７】 本発明はまた、抗体および貯蔵タンパク質の発現において有用であり得るとい
うことが考えられる。ジャガイモ塊茎は、重要な食料源であり、したがって、微
量栄養素、例えばカロテノイドまたはビタミンＥの発現を導く酵素の合成に関与
する遺伝子を発現するのに用いられ得る。本発明はまた、プラスチドの数または
大きさに影響に与え、変更されたまたは増加したデンプンの含有量または他のプ
ラスチド成分の沈積を導き得る遺伝子を発現するのに用いられ得ることが考えら
れる。

【００８８】 本発明に対する他の改変は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者にとっ
ては明らかである。

【００８９】 （実施例１０） ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターの欠失バージョン（配列番号２）を有する塊
茎を、１８週齢の植物から採取し、４℃に保存した。２２週において、塊茎を、
スライスし、ＧＵＳ発現を試験するためにＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染
色した（図１２参照）。染色された塊茎は、ＧＳＴが、化学的毒性緩和剤３−ジ
クロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリドンを適用する
ことなく塊茎においてＧＵＳの発現を駆動すること、そしてＧＳＴが塊茎中に構
成的に発現することを示す。

【００９０】 （実施例１１） 全長３．８ｋｂのＧＳＴプロモーターを含む多数のＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵ
Ｓ系統を生長させ、そして１５週時に植物にまだ付着させたままで誘導した。未
誘導の塊茎を、化学的毒性緩和剤３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチ
ル−１，３−オキサゾリドンを適用する前の植物からサンプリングした。毒性緩
和剤を、２０ｍｇ／４０ｍｌ（０．５ｇ／ｌ）の割合で適用した。塊茎サンプル
は、毒性緩和剤適用後にもまた採取された。塊茎を、スライスし、そしてＧＵＳ
活性を検出するためにＸ−ｇｌｕｃを用いて染色した。図１３は、染色後の３．
８ｋｂ ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ系統を示す。未誘導の系統は、青く染色さ
れ、これは化学的インデューサー適用前のＧＵＳ活性を示す。誘導された系統は
また、青く染色され、そして未誘導の系統と匹敵し得るＧＵＳ活性を有する。こ
のことは、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターを含む多くの他の系統が、塊茎にお
いて構成的な発現を有すること、そしてＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６系統およ
びＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ４４系統に独特のことではないことを示す。

【００９１】 （実施例１２） 塊茎生活環を通じてのＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーター、パタチンプロモータ
ーおよびＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下でのＧＵＳレポーター遺伝子発
現の分析。

【００９２】 下記の実験において、以下の緩衝液を用いた。

【００９３】

【表１】 組織培養植物の以下に示す系統を、９８年７月２２日にガラス温室に移植した
：

【００９４】

【表２】 一系統につき二つの植物を、三つの節の段階において組織培養からガラス温室
へ移植した。最初の４週間の間は、植物を、５０％のシンクレア（Ｓｉｎｃｌａ
ｉｒｓ）鉢植えおよび花壇用コンポストと５０％のジョンイネス番号３（Ｊｏｈ
ｎ Ｉｎｎｅｓ Ｎｏ．３）との混合物中で、３インチの鉢の中で生育させた。
この間、植物を１８℃、湿度６５％、１２時間明環境、そして１２℃、湿度７５
％、１２時間暗環境の条件で、生育キャビネットの中で育てた。植物に、開花す
るまで３：０：１（窒素肥料：リン酸：カリウム）の液体肥料を週に一回、そし
て１：０：２の比率の液体肥料を週に二回与えた。植物が定着した後、植物を、
１８℃、湿度５０％、１６時間明環境、そして１４℃、湿度７０％、８時間暗環
境という条件のガラス温室区画へ移動した。ガラス温室の光レベルは、平均４３
キロルクスであった。

【００９５】 植物が、老化の兆候を示したときに、塊茎を、収穫した；この時点で、植物は
１８週間土中に存在した。塊茎を、水中で洗い、乾燥させ、そしてナイロン袋の
中に置いた。この袋を、当初１３℃、湿度３０％の暗環境の種子貯蔵庫に５週間
保存し；この保存した塊茎を、２３週の時点でこの貯蔵庫から４℃、湿度３０％
の冷蔵貯蔵庫へ移した。

【００９６】 塊茎サンプルを、下記のように塊茎生活環を通じて規則的な間隔で植物から採
取した。

【００９７】

【表３】 いずれの時期においても、一系統あたり二つの塊茎（植物あたり一つの塊茎）
をサンプリングした。二つの穿孔物が、金属製穴あけ器（０．５ｃｍ幅、そして
長さ１．５ｃｍ〜２ｃｍ）を用いていずれの塊茎から回収した。塊茎の穿孔を、
すべてのサンプルを集収するまで、−８０℃でＧＵＳ抽出緩衝液中に保存した。
塊茎スライスをまた、各時点でサンプリングした塊茎から切り出し、そしてＸ−
ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染色した。この染色は、ＧＵＳ活性の最初の基準
を与える。

【００９８】 最後の塊茎サンプルを、出芽後に集収したとき、各時点におけるすべての穿孔
物を、−８０℃から取り出した。サンプルを破砕し、遠心分離し、そしてＧＵＳ
アッセイを、すべての系統における休眠時を通じてのＧＵＳ発現のレベルを蛍光
定量的に測定するために、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄグルクロニド（Ｍ
ＵＧ）を用いて遠心上清について実施した。ＧＵＳ活性およびタンパク質レベル
は、いずれの標本においても測定した。ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６系統およ
びＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ４４系統を、ＧＵＳ発現が高いパタチン：ＧＵＳ
系統および３５Ｓ：ＧＵＳ系統と比較した。

【００９９】 実験の結果は、図１４から１６に示す。

【０１００】 （結論） すべての系統は、Ｘ−ｇｌｕｃを用いた染色後青い呈色を示したが、この呈色
は、強度が系統ごとに変化した（写真参照）。このことは、分析したすべての系
統がＧＵＳを発現することを示した。

【０１０１】 ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６は、休眠時および化学的インデューサーの非存
在下での休眠打破を通じて塊茎組織に発現される（図１４，１５，１６ｂ）。か
すかな変動が、生長中の塊茎（８週）におけるＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６の
発現レベルにおいて観察される（図１６ｂ）。全体的に、ＧＳＴ−ＩＩ−２７は
、塊茎の生活環を通じて等しいレベルで発現する。

【０１０２】 パタチンの発現は、塊茎の生活環を通じて発現の一般的な減少を示す（図１４
、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ）。

【０１０３】 パタチン：ＧＵＳ系統８４２−０７は、本明細書中で試験した中で、発現する
パタチンが最も低い系統であり、そして休眠打破後のＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵ
Ｓ６よりも低いＧＵＳ発現を有する（図１６ｅ）。

【０１０４】 本明細書中で解析したパタチン：ＧＵＳ高発現系統は、解析されたＧＳＴ−Ｉ
Ｉ−２７：ＧＵＳ系統（例えば、８４２−０６）よりも高いレベルの発現を有す
る（図１４）。

【０１０５】 ８４２−０３パタチン：ＧＵＳ系統および８４２−０６パタチン：ＧＵＳ系統
は、塊茎において試験されたＣａＭＶ ３５Ｓ：ＧＵＳ系統（４１０−８９、４
１０−９２、４１０−９５）よりも高い発現レベルを有する（図１５）。

【０１０６】 ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターは、ジャガイモ塊茎の発育、休眠時および休
眠打破を通じて構成的に発現される。本明細書中で用いたＧＳＴ−ＩＩ−２７系
統は、解析したパタチンプロモーター系統よりも低いレベルでＧＵＳを発現する
；しかし、発現のレベルは、ＧＳＴ−ＩＩ−２７系統においてさらに均一的であ
ることがわかり得る。

【０１０７】 （実施例１３） ＧＳＴ塊茎系統を、パタチン：ＧＵＳ塊茎系統（８４２）、３５Ｓ：ＧＵＳ塊
茎系統（４１０）および野生型塊茎系統の生活環を通じて比較した。塊茎を、規
則的な間隔で植物から採取し、貯蔵中にサンプリングした。塊茎をスライスし、
そしてＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染色した。図１７は、塊茎発育の間の
すべての段階における染色された塊茎を示す。ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６は
、休眠時内（ｅｎｄｏｄｏｒｍａｎｃｙ）、休眠時外（ｅｃｏｄｏｒｍａｎｃｙ
）および不規則休眠時（ｐａｒａｄｏｒｍａｎｃｙ）を通じて、均一のレベルで
構成的に発現することが明白に示される。ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ４４は、
塊茎生活環を通じて、３５Ｓ：ＧＵＳ系統およびパタチン：ＧＵＳ系統よりも低
いレベルで発現する。

【０１０８】 （実施例１４） 図１８は、ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６系統、ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ
４４系統、３５Ｓ：ＧＵＳ（４１０）系統、パタチン：ＧＵＳ（８４２）系統お
よび野生型の塊茎における新芽の大きさを示す。塊茎は、４７週時に貯蔵庫から
取り出し、そして長さが０．５ｃｍと３ｃｍとの間の新芽を含んでいた。塊茎を
、組織化学的（図１７参照）および蛍光定量的ＧＵＳ分析のためにサンプリング
した。

【０１０９】 （実施例１５） ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６系統の塊茎を、４７週時にサンプリングした。
塊茎は、出芽しており、そしてこれをスライスし、そしてＸ−ｇｌｕｃを用いて
組織化学的に染色された。塊茎は、出芽時のＧＵＳ活性の発現を示す（図１９）
。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ変種ｓｏｌａｒａの葉組織に
おけるＧＳＴプロモーターの誘導を示すグラフである。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＧＳＴプロモーターのさらなる根浸漬（ｒｏｏｔ ｄｒｅｎｃｈ）
誘導を示すグラフである。

【図２】 図２は、ＧＳＴ：ＧＵＳ系統６植物を用いた時間経過実験を示すグラフである
。

【図３Ａ】 図３Ａは、毒性緩和剤（ｓａｆｅｎｅｒ）である３−ジクロロアセチル−２，
２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリドンを用いて根浸漬した６週齢の植物
の組織の蛍光定量的なＧＵＳアッセイを示すグラフである。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、蛍光定量アッセイに用いた植物から得た組織片をＸ-ｇｌｕｃ（５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（５−Ｂｒｏｍ
ｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ
））を用いた組織化学的な染色を示す写真である。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、未誘導および誘導された、染色された茎切片における組織化学的な
染色を示す写真である。

【図３Ｄ】 図３Ｄは、Ｘ−ｇｌｕｃを用いて染色した、毒性緩和剤誘導された植物の茎を
貫いた長軸切片を示す写真である。

【図４】 図４は、Ｘ−ｇｌｕｃによって染色した未誘導な６週齢のジャガイモの茎を貫
いた横断切片を示す写真である。

【図５Ａ】 図５Ａは、３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１，３−オキサ
ゾリドン毒性緩和剤を用いた根浸漬の前後に回収し、そしてＸ−ｇｌｕｃを用い
て染色した４ヶ月齢植物から得た塊茎の組織化学的染色を示す写真である。示し
た塊茎を、野生型、３５ＳＧＵＳおよびＧＵＳレポーター遺伝子に融合した３８
２２塩基対のＧＳＴ−２７プロモーターを含むトランスジェニック植物から得た
。トランスジェニック系統の２つから得た塊茎を、本図に示す。これらの系統は
、Ｇ６およびＧ４４として公知である。これらは、初代形質転換体において、Ｇ
ＳＴ−２７：ＧＵＳの高発現体として同定された。これは、初代形質転換体を根
浸漬で毒性緩和剤によって処置し、ＧＵＳタンパク質についての蛍光定量手段に
よって葉組織をアッセイすることによって達成された（図１Ｂ参照）。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、未誘導および誘導された植物から得た塊茎の蛍光定量的アッセイを
示すグラフである。

【図６Ａ】 図６Ａは、Ｇ６系統およびＧ４４系統ならびに野生型ネガティブコントロール
から得た貯蔵（ｓｔｏｒａｇｅ）の６ヶ月齢の塊茎の組織化学的染色を示す写真
である。

【図６Ｂ】 図６Ｂは、組織化学的に染色した出芽段階の８ヶ月齢の塊茎を示す写真である
。

【図７Ａ】 図７Ａは、野生型およびＣａＭＶ３５Ｓコントロールと比較した、ジャガイモ
の生活環（２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月および８ヶ月）を通じて染色した塊茎を示す
写真である。

【図７Ｂ】 図７Ｂは、野生型およびＣａＭＶ３５Ｓコントロールと比較した、ジャガイモ
の生活環（２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月および８ヶ月）を通じて染色した塊茎を示す
写真である。

【図８】 図８は、３８２２塩基対を含む全長のＧＳＴプロモーター配列を示す。欠失Ｇ
ＳＴプロモーター配列を含む部分を、強調する。

【図９】 図９は、６９３塩基を含む欠失ＧＳＴプロモーター配列を示す。

【図１０】 図１０は、全長のＧＳＴプロモーター配列を含む構築物を示す。

【図１１】 図１１は、欠失ＧＳＴプロモーター配列を含む構築物を示す。

【図１２】 図１２は、Ｇ６系統から得た塊茎のスライスと比較した、ＧＵＳレポーター遺
伝子に融合させたＧＳＴ−２７プロモーターの配列番号２のフラグメントを含む
トランスジェニック植物から得た塊茎のスライスを示す写真のセットである。こ
のスライスは、ＧＵＳ発現を試験するためにＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に
染色される。

【図１３】 図１３は、野生型塊茎からのスライスと比較した、ＧＵＳレポーター遺伝子に
融合させた３．８ｋｂの全長ＧＳＴプロモーターを含むトランスジェニック植物
から得た塊茎の二セットのスライスを示す写真のセットである。一セット目のス
ライスは、未誘導のものであり、そして二番目のセットは、２０ｍｇ／４０ｍｌ
（０．５ｇ／ｌ）の割合で適用された化学的毒性緩和剤３−ジクロロアセチル−
２，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリドンで処理した。これらのスライ
スは、ＧＵＳ発現を試験するためにＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染色され
る。

【図１４】 図１４は、種々の植物の生活環を通じた、ＧＵＳのＧＳＴ制御発現およびパタ
チン制御発現を示すプロットである。

【図１５】 図１５は、野生型、ＣａＭＶ３５Ｓ、パタチン：ＧＵＳおよびＧＳＴ：ＧＵＳ
植物を含む種々の植物について、塊茎組織におけるＧＵＳ活性の経時的比較を示
すプロットである。

【図１６ａ】 図１６ａから１６ｅは、以下のえり抜きの植物に対して塊茎生活環を通じての
ＧＵＳの発現を示す一連のプロットである：野生型（図１６ａ）、Ｇ６（図１６
ｂ）、８４２−０６（図１６ｃ）、８４２−０７（図１６ｄ）および８４２−０
３（図１６ｅ）。８４２と命名された植物は、パタチンプロモーターを含む。

【図１６ｂ】 図１６ａから１６ｅは、以下のえり抜きの植物に対して塊茎生活環を通じての
ＧＵＳの発現を示す一連のプロットである：野生型（図１６ａ）、Ｇ６（図１６
ｂ）、８４２−０６（図１６ｃ）、８４２−０７（図１６ｄ）および８４２−０
３（図１６ｅ）。８４２と命名された植物は、パタチンプロモーターを含む。

【図１６ｃ】 図１６ａから１６ｅは、以下のえり抜きの植物に対して塊茎生活環を通じての
ＧＵＳの発現を示す一連のプロットである：野生型（図１６ａ）、Ｇ６（図１６
ｂ）、８４２−０６（図１６ｃ）、８４２−０７（図１６ｄ）および８４２−０
３（図１６ｅ）。８４２と命名された植物は、パタチンプロモーターを含む。

【図１６ｄ】 図１６ａから１６ｅは、以下のえり抜きの植物に対して塊茎生活環を通じての
ＧＵＳの発現を示す一連のプロットである：野生型（図１６ａ）、Ｇ６（図１６
ｂ）、８４２−０６（図１６ｃ）、８４２−０７（図１６ｄ）および８４２−０
３（図１６ｅ）。８４２と命名された植物は、パタチンプロモーターを含む。

【図１６ｅ】 図１６ａから１６ｅは、以下のえり抜きの植物に対して塊茎生活環を通じての
ＧＵＳの発現を示す一連のプロットである：野生型（図１６ａ）、Ｇ６（図１６
ｂ）、８４２−０６（図１６ｃ）、８４２−０７（図１６ｄ）および８４２−０
３（図１６ｅ）。８４２と命名された植物は、パタチンプロモーターを含む。

【図１７】 図１７は、野生型およびＧＵＳレポーター遺伝子に融合されたプロモーターを
含むトランスジェニック植物から得た塊茎のスライスを示す写真１２である。こ
のスライスは、これらの植物の生長および貯蔵の間の種々の時間に採取した。そ
して、ＧＵＳ発現を試験するためにＸ−ｇｌｕｃを用いて組織化学的に染色され
る。

【図１８】 図１８は、ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ６系統、ＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ
４４系統、３５Ｓ：ＧＵＳ（４１０）系統、パタチン：ＧＵＳ（８４２）系統お
よび野生型の塊茎における新芽の大きさを示す写真である。塊茎は、４７週時に
貯蔵から取り出し、０．５ｃｍと３ｃｍとの間の長さの新芽を含んでいた。塊茎
は、組織化学的および蛍光定量的ＧＵＳ分析のためにサンプリングされた。

【図１９】 図１９は、４７週時においてサンプリングされたＧＳＴ−ＩＩ−２７：ＧＵＳ
系統６の塊茎のスライスを示す写真である。塊茎は、出芽していた。このスライ
スは、出芽時におけるＧＵＳ活性の発現を示すためにＸ−ｇｌｕｃを用いて組織
化学的に染色された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒ ｅ，Ｓｕｒｒｅｙ ＧＵ27 ３ＪＥ，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 ペイン， ジャクリーン アン メアリー イギリス国 アールジー42 ６イーティー バークシャー， ブラックネル， ジー ロッツ ヒル リサーチ ステーション， ゼネカ アグロケミカルズ (72)発明者 ジェプソン， イアン イギリス国 アールジー42 ６イーティー バークシャー， ブラックネル， ジー ロッツ ヒル リサーチ ステーション， ゼネカ アグロケミカルズ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CA19 CB02 4B024 AA08 BA10 BA12 BA13 CA02 DA01 EA04 FA02 FA07 GA11 4B065 AA01Y AA72Y AA88X AA88Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA29 CA31 CA32 CA53

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物の貯蔵器官または茎において、標的遺伝子を構成的に発
   現させる方法であって、標的遺伝子配列に作動可能に連結されており、そして該
   標的遺伝子配列を制御する、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ型アイ
   ソフォームの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモーター領域、または該遺伝子
   プロモーター領域の活性を保持するその欠失フラグメントを含む第一のポリヌク
   レオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、該植物のゲノム中に組み込む工程、好まし
   くは安定的に組み込む工程、を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記ＤＮＡ構築物が、誘導性プロモーター領域に作動可能に
   連結されており、そして該誘導性プロモーター領域の制御下にある少なくとも一
   つのＤＮＡ配列を含む第二のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 植物の貯蔵器官または茎において、標的遺伝子を構成的に発
   現させる方法であって、標的遺伝子配列に作動可能に連結されており、そして該
   標的遺伝子配列を制御する、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ型アイ
   ソフォームの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモーター領域、または該遺伝子
   プロモーター領域の活性を保持するその欠失フラグメントを含む第一のポリヌク
   レオチド配列を含むＤＮＡ構築物を、該植物のゲノム中に組み込む工程、好まし
   くは安定的に組み込む工程、を包含し、該ＤＮＡ構築物が、誘導性プロモーター
   領域に作動可能に連結されており、そして該誘導性プロモーター領域の制御下に
   ある少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む第二のポリヌクレオチド配列をさらに含
   む、方法。
4. 【請求項４】 前記標的遺伝子の発現が、前記貯蔵器官の出芽の抑制を引き
   起こす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記出芽の抑制が、前記第二のポリヌクレオチド配列の発現
   を誘導することによって中和される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法
   。
6. 【請求項６】 前記第二のポリヌクレオチド配列が、前記第一のポリヌクレ
   オチド配列または前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の抑制を起こ
   し得るＤＮＡ配列に対応するセンス、アンチセンスまたは部分的センス配列であ
   る、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記第一および第二のポリヌクレオチド配列が、転写ターミ
   ネーター領域をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記遺伝子プロモーターが、トウモロコシのグルタチオン−
   Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットＩＩ型アイソフォーム遺伝子プ
   ロモーター（配列番号１）、もしくは該プロモーターに対して８０％以上の同一
   性を持つ配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記遺伝子プロモーターが、該遺伝子プロモーター領域の活
   性を保持するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットＩ
   Ｉ型アイソフォームの遺伝子プロモーターのフラグメントである、請求項１〜８
   のいずれか一項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記フラグメントが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
    ーゼの２７ｋＤのサブユニットの以下に示す領域： グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
    ーター配列の転写開始点のすぐ上流８９７塩基対を含む配列； グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
    ーター配列の転写開始点のすぐ上流５７０塩基対を含む配列； グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモ
    ーター配列の転写開始点のすぐ上流３７８塩基対を含む配列；または 配列番号２の６９３塩基フラグメント、のうちの一つである、請求項９に記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 前記貯蔵器官が、塊茎である、請求項１〜１０のいずれか
    一項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記植物がジャガイモ植物である、請求項１〜１１のいず
    れか一項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記標的ＤＮＡ配列が、以下： 休眠中の貯蔵物の移動（例えば、デンプン分解）に関与するタンパク質、すなわ
    ちデンプンホスホリラーゼ、アミラーゼ（例えば、αアミラーゼまたはβアミラ
    ーゼ）またはマルターゼ；例えば、解糖および引き続く代謝に関与するタンパク
    質、例えばホスホフルクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ； スクロース生合成に関与するタンパク質、例えばスクロースシンターゼ； 師部の負荷に関与するような休眠中の貯蔵物の輸送に関与するタンパク質、例え
    ばＡＴＰａｓｅ； 長距離の師部輸送および師部非負荷に関与するタンパク質、例えば無機ピロホス
    ホリラーゼ（ｉＰＰａｓｅ）；ならびに、 同化産物分解に関与するような休眠中の貯蔵物の利用（例えば生長中の出芽にお
    けるスクロース分解）に関与するタンパク質、すなわちインベルターゼ；ならび
    に同化産物の利用（例えば、スクロース由来代謝産物の利用）に関与するタンパ
    ク質、出芽形成に必要なエネルギーの供給に関与するタンパク質、例えばアデニ
    ンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）およびリンゴ酸オキソグルタル酸輸送体（ＭＯ
    Ｔ）、そして脱共役タンパク質のようなそれらのインヒビター；またはジャガイ
    モの出芽に関与する配列、 からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１〜１２のいずれか
    一項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記標的ＤＮＡ配列が、前記スクロースの移動および／ま
    たは利用に関与するタンパク質、ジャガイモの出芽に関与するタンパク質、およ
    び呼吸のようなミトコンドリアの機能に関与するタンパク質に対するセンス、ア
    ンチセンス、または部分的センス配列の生成を生じる配列、および／または該タ
    ンパク質をコードするセンス、アンチセンス、または部分的センス配列の生成を
    生じる配列の一つである、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記標的ＤＮＡ配列が、植物、細菌または真菌供給源（例
    えば、酵母）由来インベルターゼ、植物、細菌または真菌供給源由来のピロホス
    ファターゼ、および植物、細菌または真菌供給源由来のアデノシンヌクレオチド
    輸送体タンパク質（ＡＮＴ）またはミトコンドリアオキソグルタル酸輸送体（Ｍ
    ＯＴ）のようなミトコンドリアの機能に関与するタンパク質をコードする配列の
    一つである、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項４または１３〜１５のいずれか一項に記載に規定さ
    れた標的遺伝子配列に作動可能に連結されており、そして該標的遺伝子配列を制
    御する、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットＩＩ型
    アイソフォームの遺伝子プロモーター領域、または該遺伝子プロモーター領域の
    活性を保持しているその欠失フラグメントを含むＤＮＡ構築物の、植物の貯蔵器
    官または茎において該標的遺伝子を構成的に発現させるための、使用。
17. 【請求項１７】 前記遺伝子プロモーターが、トウモロコシのグルタチオン
    Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットのＩＩ型アイソフォームの遺伝
    子プロモーター（配列番号１）、または該プロモーターに対して８０％以上の同
    一性を有する配列である、請求項１６に記載のＤＮＡ構築物の使用。
18. 【請求項１８】 前記フラグメントが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
    ーゼ２７ｋＤサブユニットの以下に示す領域： グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモー
    ター配列の転写開始点からすぐ上流８９７塩基対を含む配列； グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモー
    ター配列の転写開始点からすぐ上流５７０塩基対を含む配列； グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサブユニットの遺伝子プロモー
    ター配列の転写開始点からすぐ上流３７８塩基対を含む配列； または配列番号２の６９３塩基のフラグメント、 のうちの一つである、請求項１６に記載のＤＮＡ構築物の使用。
19. 【請求項１９】 誘導性のプロモーター領域に作動可能に連結されており、
    該領域の制御下にある少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む第二のポリヌクレオチ
    ド配列をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物の
    使用。
20. 【請求項２０】 前記第二のポリヌクレオチド配列が、前記第一のポリヌク
    レオチド配列に対応するセンス、アンチセンスもしくは部分的センス配列、また
    は前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の抑制を引き起こし得るＤＮ
    Ａ配列である、請求項１９に記載のＤＮＡ構築物の使用。
21. 【請求項２１】 前記第一および第二のポリヌクレオチド配列が、転写ター
    ミネーター領域をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ
    構築物の使用。
22. 【請求項２２】 ジャガイモ塊茎において出芽を防止または阻害するための
    方法であって、該方法は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ｋＤサ
    ブユニットＩＩ型アイソフォームの遺伝子プロモーター領域、または該遺伝子プ
    ロモーター領域の活性を保持しているその欠失フラグメントの制御下で、請求項
    ４または１３〜１５のいずれか一項に記載の標的配列を、該塊茎において発現さ
    せる工程を含む、方法。