CN116904504A - 茶树NAC转录因子CsNAC008c在黄酮醇合成中的应用 - Google Patents

茶树NAC转录因子CsNAC008c在黄酮醇合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茶树NAC转录因子CsNAC008c在茶树黄酮醇合成中的应用，所述茶树NAC转录因子CsNAC008c的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在拟南芥中过量表达CsNAC008c基因后，拟南芥中的黄酮醇含量显著提高；在茶树叶片中沉默CsNAC008c基因的表达后，茶树叶片中的黄酮醇含量下降。

Description

茶树NAC转录因子CsNAC008c在黄酮醇合成中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种茶树NAC转录因子CsNAC008c及其在调控黄酮醇类化合物代谢中的应用。
背景技术
茶以其特有的口味和强大的健康功用，成为全球最受欢迎的无糖饮料之一，受到了全球消费者的广泛认可(DAGLIA等2014)。类黄酮化合物是茶树叶片中的主要次生代谢产物，并且与茶的丰富味道有着密切的关系(ZHU等2014)。研究表明类黄酮化合物是造成茶汤苦涩味的主要原因(NARUKAWA等2010)。此外，在类黄酮化合物中，儿茶素、黄酮醇及其衍生物能够有效降低胆固醇的水平，抑制血栓的异常形成，减少血小板聚集，调节血脂，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移(SINIJA等2008)。
类黄酮是色原酮的衍生物，对于植物的生长发育具有重要的影响，它在植物中分布广泛并且具有很强的生物活性。植物类黄酮的生物合成受到一系列结构基因和转录因子的调控(高国应等2020)。结构基因可以编码催化PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR等类黄酮合成的关键结构酶，转录因子MYB、bHLH、WD40和NAC等转录因子则是通过直接或间接调控关键结构基因参与植物类黄酮的生物合成(宋建辉等2020)。
不同的转录因子组成的复合体蛋白可以调控多种下游靶基因，从而产生多种不同的生物学功能，这些功能可以在不同的环境下发挥作用，因此，研究转录因子如何参与调控类黄酮合成就显得尤为重要。zhou等研究发现，CmMYB012可以直接结合于黄酮合成酶CmFNS基因启动子的‘AACATT’顺式作用元件，抑制CmFNS的表达进而减弱菊花在高温下的适应性，同时，CmMYB012可以直接结合并抑制花青素合成结构基因的表达，包括CmCHS、CmDFR、CmANS、CmUFGT,减少花瓣中花青素的积累，从而导致菊花在高温下变得更浅(ZHOU等2021)。
对于茶树而言，类黄酮化合物的合成同样离不开MYB转录因子的调控。Sun等为了揭示茶树中花青素生物合成的潜在分子机制，从紫化茶树品种‘紫娟’中筛选出一个R2R3-MYB转录因子CsAN1，并对其进行了功能表征，结果发现CsAN1与CsGL3和CsEGL3相互作用，并且可与WD复合蛋白CsTTG1形成MYB-bHLH-WDR(MBW)复合体共同参与调控茶树花青素积累(SUNB等2016)。bHLH可以通过与调控类黄酮生物合成的MYB转录因子结合形成蛋白复合体，从而参与调控类黄酮化合物合成代谢(SUNB等2016，ZIMMERMANN等2004)。与MYB和bHLH转录因子相比，WD40的研究较少，WD40结构主要由44-60个氨基酸残基组成。An等研究发现MdTTG1在拟南芥中过度表达会导致类黄酮通路下游基因表达量上调，经过酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明，MdTTG1与bHLH蛋白之间相互作用可以控制花青素的积累(AN等2012)。
NAC类转录因子广泛参与植物生长发育和响应逆境胁迫(NAKASHIMA等2012)。然而，随着研究的不断深入，Morishita等人从拟南芥中筛选获取ANAC078转录因子，该转录因子有利于拟南芥在高光照状态下积累花青素以应对外界胁迫(MORISHITA等2009)。Mahmood等研究发现拟南芥处于胁迫状态下会积累花青素，ANAC032的表达受到外源蔗糖和强光环境的诱导，ANAC032过表达拟南芥中的花青素含量和调控花青素合成的关键基因(AtDFR、AtANS、AtTT8)的表达量均显著低于野生型拟南芥，ANAC032负调控拟南芥花青素的生物合成(MAHMOOD等2016)。虽然对于转录因子的研究随着生物技术的进步已经有了许多成果，但是相比于MYB、bHLH和WD40等类型的转录因子来说，转录因子仍有很大的探索空间。截止目前，茶树中转录因子调控黄酮醇类化合物合成的相关机理尚不明确，有待于进一步研究。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种茶树NAC转录因子CsNAC008c基因。
本发明的另一个目的在于提供上述茶树NAC转录因子CsNAC008c蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一对用于扩增茶树NAC转录因CsNAC008c基因的引物。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树NAC转录因子CsNAC008c的重组表达载体。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树NAC转录因子CsNAC008c的转基因植株。
本发明的另一个目的在于提供十对用于沉默茶树NAC转录因子CsNAC008c基因表达的引物。
本发明的另一个目的在于提供上述茶树NAC转录因子CsNAC008c在调控植物黄酮醇类合成过程中的应用。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，所述含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒按如下方法制备：将茶树NAC转录因子CsNAC008c基因插入含有35S启动子(CaMV35S启动子)的表达载体得到；
所述茶树NAC转录因子CsNAC008c基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该序列有292个氨基酸。
进一步，所述茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，最大开放阅读框(编码区)为876bp。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体为pCAMBIA2300。
在本发明的一个实施例中提供了一对用于扩增茶树NAC转录因子CsNAC008c的引物，包括上下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
在已经研究的NAC转录因子中发现相当一部分参与了植物类黄酮物质的生物合成。在苹果中发现MdNAC52在苹果着色的过程中转录水平提高，在苹果愈伤组织对该基因进行过表达发现它能够促进花色素的积累，此外还发现MdNAC52可与MdMYB9和MdMYB11的启动子相互作用，调控花青素的生物合成(Sunetal.,2019)。在MdNAC42表达水平较高的红瓤果实中，花色素的含量显著高于白瓤果实，在苹果愈伤组织中过表达MdNAC42后发现MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdANS和MdUFGT等类黄酮合成途径中的关键基因表达水平显著上调，促进花色素在苹果愈伤组织中的积累(Zhangetal.,2020)。
第二方面，本发明提供一种上述含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒转化农杆菌制备的转基因农杆菌。
第三方面，本发明还提供一种上述转基因农杆菌制备的过表达茶树NAC转录因子CsNAC008c的转基因植株。
在本发明的一个实施例中，所述转基因植株的宿主为拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
进一步，所述转基因植株按如下方法制备：培养所述的转基因农杆菌至菌液的OD600为0.8-1，离心，所得菌体沉淀用拟南芥转化液重悬至OD600为0.6-0.8，得到拟南芥侵染菌液；将拟南芥花序浸泡于所述拟南芥侵染菌液中进行浸染，培养，收种，得到种子；将所述的种子干燥后，种植培养至长出叶片，提取叶片DNA进行凝胶电泳验证，含有CsNAC008c基因目的片段条带的植株即为所述过表达茶树NAC转录因子CsNAC008c的转基因植株。可以重复培养、收种过程直至得到纯合体。
所述植株能产生更多黄酮醇。
在本发明的一个实施例中，提供一种转基因植株的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的茶树NAC转录因子CsNAC008c基因插入到含有35S启动子的表达载体后，得到含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，将所述过表达质粒转化农杆菌感受态细胞，获得用于侵染拟南芥的转基因农杆菌；所述表达载体为pCAMBIA2300；
(2)将步骤(1)所述的转基因农杆菌培养至菌液OD600为0.8-1，离心，所得菌体沉淀用拟南芥转化液重悬至OD600为0.6-0.8，得到拟南芥侵染菌液；将拟南芥(Arabidopsisthaliana)花序浸泡于所述拟南芥侵染菌液中浸染1min，覆膜保湿后暗培养一天；在22℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d培养18-24hr后，收种子，得到T0代种子；
(3)将步骤(2)所述的T0代种子于体积比为99：1的75％酒精和TritionX-100的混合溶液中涡旋振荡10-15min，离心(12000rpm离心1min)，弃上清，依次加入无水乙醇、无菌水洗涤，离心(9000rpm)，所得沉淀加入无菌水混匀，均匀播种在含卡纳霉素(在本发明的一个实施例中终浓度50μg/mL)的MS筛选培养基上，4℃低温处理2天，22℃按照光照16hr/d、黑暗8hr/d的周期培养7天，挑选出T0代株系；如果转入的基因表达，具有卡纳抗生素的阳性拟南芥植株根系较长，而未转入基因的植株根系短且难以长出真叶；
(4)步骤(3)所述的T0代株系移入土中培养至第4周，提取叶片DNA进行PCR验证，CsNAC008c基因的阳性苗培养至收种，获得T1代种子；
(5)取步骤(4)所述的T1代种子按照步骤(3)培养，得到T1代株系，继续培养一周，收种，得到T2代种子；
(6)步骤(5)所述的T2代种子按照步骤(3)培养，得到T2代株系，同一T1代株系来源的能够正常生长的种子和不能正常生长的种子经卡方检验符合3：1比例的株系中，能够正常生长的即为纯合体或单拷贝插入的株系T2；
(7)取步骤(6)所述的纯合体或单拷贝插入的株系T2的T3代种子按照步骤(3)培养，挑选同一T2代株系来源的所有的T3代种子均可正常生长的植株，即为过表CsNAC008c的转基因纯合体拟南芥植株。
本发明提供了一种茶树NAC转录因子CsNAC008c在构建过表达黄酮醇的植株中的应用，所述茶树NAC转录因子CsNAC008c基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
进一步，所述植株为拟南芥。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的表达与植物的黄酮醇含量相关，在茶树中沉默该基因可显著降低茶树的黄酮醇含量；在拟南芥中过量表达CsNAC008c基因可以显著提高黄酮醇的含量。
附图说明
图1为CsNAC008c转录因子结构域示意图。
图2为CsNAC008c氨基酸序列分析图。
图3为CsNAC008c过表达载体的构建示意图。
图4为野生型拟南芥和过表达CsNAC008c基因拟南芥的黄酮醇含量图。
图5为黄酮醇合成途径关键结构基因FLS在野生型以及过表达CsNAC008c拟南芥中的表达量图。
图6为茶树沉默CsNAC008c基因后茶树叶片中CsNAC008c的表达量图。
图7为茶树沉默CsNAC008c基因后茶树叶片中黄酮醇含量图。
图8为CsNAC008c调控黄酮醇合成通路的模拟示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中培养育苗都是按22℃下光照16hr/d、黑暗8hr/d的周期进行培养。
实施例1茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的克隆和过表达载体的构建。
1、基因的获得：本发明前期对茶树‘紫娟’(Camellia sinensis CV.Zijuan)的不同发育阶段叶片进行转录组测序(百迈客生物科技有限公司)，在转录组数据库中分析获取CsNAC008c基因序列。
2、RNA的提取：使用诺唯赞生物科技(南京)股份有限公司的UniversalPlant Total RNA Isolation Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒以‘紫娟’茶树新梢叶片为材料提取总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳分析检测RNA的完整性，使用Nanodrop检测RNA的浓度(OD260/OD280读数在1.8-2.1之间为高质量RNA)，剩余RNA在-80℃保存备用。
3、cDNA第一链的合成：使用杭州新景生物试剂开发有限公司的cDNA第一链合成试剂盒说明书反转录合成cDNA第一条链。在高压灭菌过RNase-Free离心管中依次加入反应试剂(表1)，42℃恒温反应3min去除RNA中的DNA。将去除DNA的反应产物，加入第一链cDNA合成试剂(表2)。在42℃孵育15min后，95℃孵育3min后，获得cDNA溶液。贮存于-20℃冰箱备用。
表1去除基因组DNA反应体系
表2第一链cDNA合成体系
4、PCR扩增：根据实施例1基因序列全长设计扩增CsNAC008c的特异引物：
F：5’-GTTACCTGCGGGAGTGAAGTTTG-3’
R：5’-AGCTTATTATGAGGAGCATCCGACC-3’；
反应条件：94℃预变性5min，94℃20s，58℃30s，72℃2min 30s，30个循环，72℃延伸7min；反应体系：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，25μL；上游引物(10μM)及下游引物(10μM)各2μL；cDNA,4μL；ddH2O，17μL。通过PCR反应扩增获得基因片段。用BamH I(TaKaRa)与Sal I(TaKaRa)双酶切pCAMBIA2300载体使其线性化后，采用ClonIIOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将pCAMBIA2300载体与PCR扩增产物进行连接。酶切体系：BamH I1μL+Sal I1μL+10×Buffer 2μL+质粒3μL+H2O补齐到10μL，37℃温育2hr，琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果后回收。将回收产物和连接试剂混匀(表3)，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，待转化。
表3ClonIIOne Step Cloning Kit的连接体系
5、大肠杆菌感受态的制备
(1)从-80℃冰箱中取出保存的大肠杆菌菌株DH5α，接种在YEP固体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L)上，37℃过夜培养(大约12h)；
(2)挑取YEP固体培养基上的单菌落，接种到3～5mL YEP液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L)中，37℃过夜震荡培养(大约12h)；
(3)将该菌液以1：100接种到YEP液体培养基，37℃震荡培养2～3hr至OD600＝0.5；
(4)将菌液移入50mL离心管中，在冰上放置10min；
(5)4℃，4000r/min离心10min，弃上清液；
(6)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液将菌体轻轻悬浮，冰上放置30min；
(7)4℃，4000r/min离心10min，弃上清液，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮菌液，冰上放置；
(8)将制备好的感受态细胞与30％甘油1:1混合(甘油终浓度为15％)；
(9)将感受态细胞分装为100μL/管，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。
6、重组质粒转化大肠杆菌感受态以及阳性克隆鉴定
(1)在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，取10μL重组产物加入100μL感受态细胞中，吸打混匀(避免剧烈震荡)，冰上放置30min；
(2)置于42℃水浴锅热激80s后，立即置于冰上放置3～5min；
(3)加入700μL YEP液体培养基，37℃200r/min摇菌1hr；
(4)将菌液室温5,000r/min离心5min，弃700μL上清液，用管中剩余培养基重悬菌体，涂布到含有50μg/mL的卡那霉素YEP固体筛选培养基上37℃培养12～16hr；
(5)挑取单克隆，使用一条载体上的通用引物或克隆基因的特异性引物
F：5’-GTTACCTGCGGGAGTGAAGTTTG-3’；
R：5’-AGCTTATTATGAGGAGCATCCGACC-3’；
进行PCR扩增，按照PCR反应体系(表4)使用北京擎科新业生物技术有限公司的T5DNA聚合酶进行阳性克隆的筛选。将阳性克隆的单菌落进行扩繁，送公司测序，序列比对正确后，提取质粒保存于-20℃备用。
表4菌落PCR体系
序列分析发现：CsNAC008c的开放阅读框为876bp，如SEQ ID NO：1所示，编码292个氨基酸(如SEQ ID NO：2所示)，具有NAC转录因子的保守结构域(见图1)。
实施例2茶树NAC转录因子CsNAC008c过表达菌株的获得。
1、农杆菌感受态的制备
(1)挑取农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens)单菌落，接种于10mL YEP培养基中，28℃振荡培养过夜；
(2)取400μL菌液置于50mL YEP培养液中，28℃振荡培养5～6h至OD600为0.5；
(3)菌液倒入50mL离心管中，6000rpm离心5min后，弃上清液；
(4)将菌体重悬于10mL 0.15M的NaCl中，之后6000rpm离心5min，弃上清液；
(5)菌体用l mL预冷的20mM CaCl2溶液轻轻悬浮，加入预冷的30％甘油，100μL分装，-80℃冰箱保存备用。
2、重组质粒转化农杆菌感受态细胞
(1)取-80℃保存的100μL农杆菌感受态细胞置冰上，完全解冻后轻轻将细胞悬浮；
(2)加入5μL质粒混匀后冰上放置30min；
(3)将离心管放入液氮中速冻5min，37℃水浴中热激1min，迅速转移至冰上，冰浴2min；
(4)加入1mLYEP液体培养基，28℃振荡培养1hr；
(5)4000rpm离心5min，加100μLYEP培养液悬浮细胞；
(6)将菌液涂布于含有50μg/ml Kana和50μg/ml Rifampicin的YEP固体培养基上，28℃培养32～48hr；
(7)挑取长出的农杆菌菌落使用特异性引物进行PCR扩增
pCAMBIA2300-CsNAC008c-F：5’-ATGACTTGGTGCAGTGACTGTAGC-3’，
pCAMBIA2300-CsNAC008c-R：5’-TCAAGAAACAATGGATGACCCG-3’，对菌落进行检测筛选阳性克隆。
(8)将筛选成功的单克隆于YEP液体培养基28℃摇菌24hr，将阳性克隆的单菌落进行扩繁，送公司测序，序列比对正确后，保存于-80℃备用。
实施例3茶树基因沉默方法：
(1)设计CsNAC008c反义寡聚核苷酸引物：使用网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl进行设计反义寡聚核苷酸引物；
(2)根据GC％和Oligo bindin genergy从网站给出的20对引物中筛选出10对，由擎科生物科技有限公司杭州分公司合成，引物序列：
S1-GAAGATCACAACCATCTACA、A1-TGTAGATGGTTGTGATCTTC；
S2-AAGATCACAACCATCTACAG、A2-CTGTAGATGGTTGTGATCTT；
S3-CCATCTACAGACAACACAGT、A3-ACTGTGTTGTCTGTAGATGG；
S4-CATCTACAGACAACACAGTT、A4-AACTGTGTTGTCTGTAGATG；
S5-ACAGACAACACAGTTATTGC、A5-GCAATAACTGTGTTGTCTGT；
S6-CGAAGAAAAGTACACACAGA、A6-TCTGTGTGTACTTTTCTTCG；
S7-GAAGAAAAGTACACACAGAC、A7-GTCTGTGTGTACTTTTCTTC；
S8-GCAAAGTGAAAGGTCATAAG、A8-CTTATGACCTTTCACTTTGC；
S9-AACCAGAGAAAACAAACTGG、A9-CCAGTTTGTTTTCTCTGGTT；
S10-ACCAGAGAAAACAAACTGGG、A10-CCCAGTTTGTTTTCTCTGGT。
(3)引物稀释：引物终浓度为5μM，用RNA-Free H2O稀释；
(4)选择待沉默样本(福鼎大白茶Camellia sinensis(L.)O.Kuntze'FudingDabaicha'第五叶)；
(5)沉默方法：
注射：选择长势良好的‘福鼎大白茶’第五叶，分别将sense和antisense引物注射进同一片叶子的两半叶片，用1mL注射器抽取稀释好的5μM的引物溶液，用注射器针头轻轻摩擦茶叶叶背，注射引物，直至注射半片叶子，对照为相同浓度的正义链稀释引物溶液，注射后放进霍格兰营养液(硝酸钙945mg/L，硝酸钾607mg/L，磷酸铵115mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液2.5ml/L，微量元素5ml/L，pH＝6.0)中，并在植物培养室室温培养6天后进行下一步处理或者液氮速冻后-80℃保存，进行下一步检测分析；该实验不低于3个重复。
表5茶树CsNAC008c基因荧光定量引物序列
结果如图6、7所示，图6为茶树沉默CsNAC008c基因后的荧光定量结果，图7为茶树沉默CsNAC008c基因后的黄酮醇含量图。同一片茶树叶片中，沉默CsNAC008c的茶树叶片，黄酮醇含量显著下降。
实施例4NAC转录因子CsNAC008c过表达拟南芥植株的获得
(1)将实施例2得到的含有CsNAC008c过表达载体的阳性农杆菌划线培养于YEP固体培养基上，然后挑取单菌落，接种于10mL YEP培养基中，28℃振荡培养过夜；
(2)取400μL菌液置于50mL YEP培养液中，28℃振荡培养5～6h至OD600为0.8-1；
(3)将菌液以5000rpm的转速快速离心十分钟，弃掉上清液，然后加入拟南芥转化液(50g/L蔗糖，0.167‰的silwet L-77，溶剂为水)重悬菌体，直至OD600至0.6-0.8，得到拟南芥侵染菌液。
(4)将拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序浸泡于拟南芥侵染菌液中1min；
(5)将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜保湿，暗培养一天；
(6)将拟南芥取出，在22℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，将拟南芥培养至收获T0代种子；
(7)将收获的T0代种子分装至1.5mL的离心管，依次加入75％酒精990μL，TritionX-100 10μL，涡旋振荡10-15min；
(8)12000rpm离心1min，用200μL的移液枪慢慢吸出液体；
(9)加入1mL无水乙醇，用移液枪吸打1-2次后迅速吸出；
(10)无菌水清洗种子5次，9000rpm离心吸出液体；
(11)加入适量的无菌水混匀种子，用1000μL的移液枪将种子吸出并均匀种在MS固体筛选培养基(4.43g MS/L，pH5.8，8g琼脂/L,卡纳霉素50mg/L)
(12)4℃低温处理2天，放入22℃植物培养箱培养；
(13)种子萌发7天左右，挑选阳性苗。如果转入的基因表达，具有卡纳抗生素的阳性拟南芥植株根系较长，而未转入基因的植株短且难以长出真叶；
(14)将初步判定的阳性植株移入土中，待筛选拟南芥长到第四周，提取叶片DNA进行验证，表达CsNAC008c的拟南芥即为转基因拟南芥，将阳性苗培养至收获T1代转基因拟南芥种子；
(15)取T1代种子播种于MS筛选培养基，播种前处理同T0代阳性苗(7)-(12)；
(16)生长一周左右后，收种，得到T2代种子，播种前处理同T0代阳性苗(7)-(12)；生长一周左右后，筛选培养基上能够正常生长的种子和不能正常生长的种子经卡方检验符合3：1比例的株系，能够正常生长的即为纯合体或单拷贝插入的株系T2；
(17)选取20株左右的T2代能够正常生长的株系进行培育，收种，收获T3代种子；
(18)取一定量的T3代种子播种到筛选培养基上，播种前处理同T0代阳性苗(7)-(12)，一周之后若所有的种子均可正常生长，即为纯合转基因拟南芥。
实施例5NAC转录因子CsNAC008c过表达拟南芥植株中黄酮醇含量的测定(1)分别取野生型和过表达CsNAC008c转基因拟南芥叶片0.2g，在1mL提取液(含有0.1％盐酸的甲醇溶液)中均质，然后在4℃的黑暗环境中放置24hr。(2)使用TSKODS-80TsQA(4.6mm×250mm，5μm，Tosoh)柱通过HPLC分析黄酮醇的含量。流动像中溶剂A是10％的甲酸(水的体积分数)，溶剂B是纯甲醇。梯度条件为：0min，17％溶剂B；15min，35％溶剂B；40min，37％溶剂B；42min，100％溶剂B；44min，100％溶剂B；45min，17％溶剂B；46min，17％溶剂B。进样量为10μL，色谱柱柱温为40℃，流速为1.0mL/min，在360nm处检测黄酮醇的吸收峰面积。黄酮醇以槲皮素-3-葡萄糖苷为标准品计算含量。最终的黄酮醇含量用(样品的吸收峰面积/标准品的吸收峰面积)*标准品的浓度g-1(FW)表示。野生型拟南芥和过表达CsNAC008c基因拟南芥的黄酮醇含量如图4。
实施例6黄酮醇合成酶基因FLS在野生型和CsNAC008c过表达拟南芥中的表达分析
本实施例研究了黄酮醇合成途径酶基因FLS在野生型和过表达CsNAC008c拟南芥中的表达情况。具体步骤为，根据目的基因的序列设计特异引物和内参基因Actin引物(见表6)，使用天根生化科技(北京)有限公司的RNA prep Pμre多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对拟南芥的叶片进行总RNA的提取，然后使用莫纳生物科技有限公司的MonScriptTMRTIIISuper Mix with dsDNase反转录试剂盒反转成cDNA，将cDNA稀释10倍作为qRT-PCR的模板。使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行qRT-PCR反应，每个反应设3次重复，qRT-PCR反应体系如下：cDNA模板2μL，2×SYBR Green MIX10μL，10μmol L-1正向引物0.4μL，10μmol L-1，加水至总体积达到20μL。qRT-PCR程序：95℃,10min；95℃,10s；58℃,10s；72℃,15s；35个循环；72℃，20min。反应产物用融解曲线分析。使用耶拿分析仪器(北京)有限公司的实时荧光定量PCR仪收集数据，FLS基因的相对表达量用CT值的2-△△CT法计算，结果见图5。
表6拟南芥AtFLS基因表达分析引物序列
<210>1
<211>876
<212>DNA
<213>CsNAC008c的ORF
<400>1
Atgacttggtgcagtgactgtagcgatgagccggcgattgtgagaagatcacaaccatctacagacaacacagttattgccggaaaacacgaatgcattcgaagaactaaaactaaaagctgtccttcatgtggtcatcagatcaaatgtcaagaaaagactggaattcatgatctaccggggttacctgcgggagtgaagtttgatccgagtgatcaagaacttcttgagcatttggaggcgaaggcatggtcggatgctcctcataataagcttcatcctctaattgatgagttcatccctacacttgaaggagaggatggaatttgctacacccacccagagaggttaccaggagtaagcaaagatgggttaatccgacatttcttccacaggccatccaaagcatacaccaccggaacaagaaagcgaagaaaagtacacacagacatagatggcaacgagactcgttggcacaaaacaggcaagacaaggcctgttttcattaatggcaaagtgaaaggtcataagaagatactcgttctctacaccaactatggaaaacaaagaaaaccagagaaaacaaactgggttatgcatcagtaccaccttggcaacaacgaagacgagagagatggagagttagtggtttcaaaggttttctaccaaacacaacctagacaatgtggctctatcatgaaagaaccatcaccttcgaaatcaaagggtctgaaatttaaggaacatagtaacattgttgaatactacaatccaacactcatctccttcgatcaaggtgaccactgcgatccggcaagtcctccgccggtgattcccaattttaatgtccatgtcgggtcatccattgtttcttga
<210>2
<211>292
<212>PRT
<213>CsNAC008c氨基酸序列
<400>2
MTWCSDCSDEPAIVRRSQPSTDNTVIAGKHECIRRTKTKSCPSCGHQIKCQEKTGIHDLPGLPAGVKFDPSDQELLEHLEAKAWSDAPHNKLHPLIDEFIPTLEGEDGICYTHPERLPGVSKDGLIRHFFHRPSKAYTTGTRKRRKVHTDIDGNETRWHKTGKTRPVFINGKVKGHKKILVLYTNYGKQRKPEKTNWVMHQYHLGNNEDERDGELVVSKVFYQTQPRQCGSIMKEPSPSKSKGLKFKEHSNIVEYYNPTLISFDQGDHCDPASPPPVIPNFNVHVGSSIVS*。

Claims (10)

1.一种含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，其特征在于所述含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒按如下方法制备：将茶树NAC转录因子CsNAC008c基因插入含有35S启动子的表达载体得到；
所述茶树NAC转录因子CsNAC008c基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，其特征在于：所述茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA2300。
4.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒转化农杆菌制备的转基因农杆菌。
5.如权利要求4所述的转基因农杆菌制备的过表达茶树NAC转录因子CsNAC008c的转基因植株。
6.如权利要求5所述所述的转基因植株，其特征在于：所述转基因植株的宿主为拟南芥。
7.如权利要求6所述所述的转基因植株，其特征在于：所述转基因植株按如下方法制备：培养所述的转基因农杆菌至菌液的OD600为0.6-0.8，离心，所得菌体沉淀用拟南芥转化液重悬至OD600为0.6-0.8，得到拟南芥侵染菌液；将拟南芥花序浸泡于所述拟南芥侵染菌液中进行浸染，培养，收种，得到种子；将所述的种子干燥后，种植培养至长出叶片，提取叶片DNA进行凝胶电泳验证，含有CsNAC008c基因目的片段条带的植株即为所述过表达茶树NAC转录因子CsNAC008c的转基因植株。
8.如权利要求7所述所述的转基因植株，其特征在于所述转基因植株按如下方法制备：
(1)将所述的茶树NAC转录因子CsNAC008c基因插入到含有35S启动子的表达载体后，得到含茶树NAC转录因子CsNAC008c基因的过表达质粒，将所述过表达质粒转化农杆菌感受态细胞，获得用于侵染拟南芥的转基因农杆菌；所述表达载体为pCAMBIA2300；
(2)将步骤(1)所述的转基因农杆菌培养至菌液OD600为0.8-1，离心，所得菌体沉淀用拟南芥转化液重悬至OD600为0.6-0.8，得到拟南芥侵染菌液；将拟南芥花序浸泡于所述拟南芥侵染菌液中浸染1min，覆膜保湿后暗培养一天；在22℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d培养18-24hr后，收种子，得到T0代种子；
(3)将步骤(2)所述的T0代种子于体积比为99：1的75％酒精和TritionX-100的混合溶液中涡旋振荡10-15min，离心，弃上清，依次加入无水乙醇、无菌水洗涤，离心，所得沉淀加入无菌水混匀，均匀播种在含卡纳霉素的MS筛选培养基上，4℃低温处理2天，22℃按照光照16hr/d、黑暗8hr/d的周期培养7天，挑选出T0代株系；
(4)步骤(3)所述的T0代株系移入土中培养至第4周，提取叶片DNA进行PCR验证，CsNAC008c基因的阳性苗培养至收种，获得T1代种子；
(5)取步骤(4)所述的T1代种子按照步骤(3)培养，得到T1代株系，继续培养一周，收种，得到T2代种子；
(6)步骤(5)所述的T2代种子按照步骤(3)培养，得到T2代株系，同一T1代株系来源的能够正常生长的种子和不能正常生长的种子经卡方检验符合3：1比例的株系中，能够正常生长的即为纯合体或单拷贝插入的株系T2；
(7)取步骤(6)所述的纯合体或单拷贝插入的株系T2的T3代种子按照步骤(3)培养，挑选同一T2代株系来源的所有的T3代种子均可正常生长的植株，即为过表CsNAC008c的转基因纯合体拟南芥植株。
9.如权利要求8所述的转基因植株，其特征在于：所述拟南芥转化液由以下终浓度的各组分组成：50g/L蔗糖，0.167‰的silwet L-77，溶剂为水。
10.如权利要求8所述的转基因植株，其特征在于：所述含卡纳霉素的MS筛选培养基中，卡纳霉素的浓度为50μg/mL。
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