JP2002523783A - エネルギー転移色素 - Google Patents
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Abstract
Description
システムにおける標識としての使用に関係する。
。
濃度の測定に利用できる。蛍光顕微鏡では、細胞中のタンパク質および複合体の
位置測定するために、抗体のような特異的プローブに通常連結する蛍光色素が使
用される。
決定、イムノアッセイおよび種々ハイブリダイゼーション法が過去40年間以上
において一般的であった。ラジオイムノアッセイは、非常に低濃度のアナライト
を測定し得る放射性ヌクレオチドの高い特異活性のため、発達した。しかし、環
境およびヒトの健康への関心から、イムノアッセイにおけるラジオヌクレオチド
の使用は、一般的とはならなくなってきている。シグナルを増幅するイムノアッ
セイにおける酵素の使用は、環境またはヒトの健康を危険にさらさないため、イ
ムノアッセイの分野において非常に重要な進展をした。しかし、酵素結合イムノ
アッセイは、酵素の活性が温度に依存するため、問題となり得、酵素または基質
の不安定性から、標的リガンド量の蓄積が生じ得る。更に、他のイムノアッセイ
では、アナライト濃度の測定のために、酵素を伴ってもまたは伴っていなくとも
、シグナルとして蛍光をモニターする。
システムにおける新規な方法のモニタタリングプロセスを提供する。その色素の
蛍光性により、生物学的システムが含まれるプロセスをモニターすることが可能
となる。当該蛍光シグナルは、特定波長の蛍光分子を励起し、他の波長の蛍光の
放出を測定するように調節するフルオロメーターにより測定する。励起および放
出の波長における相違はストークスシフトとして言及される。
l., 1995年12月19日付け米国特許番号5,688,648、標題“Prob
es Labelled with Energy Transfer Coupled Dyes”、任意の図を含めて引用に
よりこの文書にすべて加え、それは、ドナーおよびアクセプター色素分子の対を
有する蛍光標識群を開示し、その場合、当該標識は、シーケンシングのために核
酸バックボーンに結合され得る。種々の蛍光標識を用いることにより複数核酸混
合物中の核酸を同定および検出する方法が含まれ、その場合、蛍光部分は、シア
ニン色素またはキサンテンのようなファミリーから選択される。当該蛍光標識に
は、フルオロホアの対が含まれ、その場合、1つのフルオロホアドナーは、励起
メンバーから他の対メンバーへのエネルギーが転移するようにフルオロホアアク
セプター吸収とオーバーラップする放出スペクトルを有する。
標題“Fluorescent Labelling Complexes with Large Stokes' Shifts Formed b
y Coupling Together Cyanine and Other Fluorochromes Capable of Resonance
Energy Transfer”、任意の図を含めて引用によりすべてこの文書に加え、それ
は、第一の吸収および放出スペクトルを有する第一蛍光色素ならびに第二の吸収
および放出スペクトルを有する第二蛍光色素を含む複合体を開示する。蛍光色素
間の当該リンカー基は、アルキル鎖である。当該色素の蛍光性により、それらを
シーケンシングおよび核酸検出に使用することができる。
ドナー分子間の距離であり、リンカー基の構造である。例えば、種々の大きさの
生物学的分子の選択に適合させるために、色素構成において更なる改善の余地が
ある。
む物質標識に使用し得ることが見出された。当該色素は、好ましくは、“カセッ
ト”型であり、種々の生物学的物質に結合し得る。カセットには、少なくとも2
つの蛍光性色素部分、リンカー基、および好ましくは生物学的物質または他の標
的物質に複合体を結合させるための反応基との、共有結合および複合体形成が含
まれる。当該反応基は、特定標的物質の官能基との共有結合の形成に適当なよう
に選択される。色素は、第一色素の放射スペクトルが第二色素の吸収スペクトル
とオーバーラップし、それによって、色素間でエネルギー転移が生ずるように選
択する。アリールおよびヘテロアリールリンカー基を含む色素カセットにより、
種々の大きさの生物学的分子が連結し、フルオロホア間でエネルギー転移を生ず
る特性を有する、安定で、強固な構造が得られる。
適当な第一色素であり、D2は、第一色素または任意の更なる添加色素を伴うエ
ネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプターとして適当な第二色素であ
る。] のエネルギー転移色素を提供する。Aには、独立して、(i)炭素、硫黄、窒素お
よび酸素から選択される原子に連結する5、および20までの鎖、および/また
は(ii)1以上のアリール、ヘテロアリールまたは他の芳香族炭化水素基(式中、
芳香族分子には、炭素、窒素および酸素から選択される環状結合原子が含まれる
。)が含まれる。本発明のこの態様および/または他の態様では、Aが、フェニ
ルであるとき、直接カルボニル基に連結し得るかまたは連結し得ない。好ましく
は、Aには、5−20結合原子が含まれる[式中、連結原子は、炭素環式または
複素環式の基のような少なくとも1つの環状基を含み、環状基の原子は炭素、窒
素、硫黄、酸素およびリンからなる群から独立して選択される。]。
望により置換され得、例えば、当該環は、アルキル、アルコキシ、アルキニル、
アルケニル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、アミノ、ニトロお
よびエステル部分からなる群から独立して選択される1つ、2つ、または3つの
置換基で置換されるか、またはOH、ハロ、メチル、水素またはエチル基から独
立して選択される1、2、3または4置換基で所望により置換されたC1,2, 3または4 直鎖状または分枝状アルキル、フェニル、またはアリールアルキルに
より置換された、芳香族または複素環式芳香族環であり得る。
は群、およびD1またはD2に結合させるために適合した原子または原子群が独
立して含まれる。
おいて結合する更なるリンカーへの結合に選択的に適合する原子または基が独立
して含まれ、その場合、当該第三色素は、第一色素(D1)と相互作用する第二色
素(D2)、および標的物質、例えば下記のような生物学的物質と結合する原子ま
たは基と相互作用する。
、L1およびL2において6から25の組合せ結合リンカー原子が存在し、より
好ましくは、9、10、11、12、13、14、または15リンカー原子が存
在する。好ましくは、Aは、L1またはL2に結合するC6芳香族炭化水素部分
である。L1は、当業者に既知の更なる基を含む、キサンチンまたはシアニン分
子に結合し得るC2−C4炭化水素鎖であり、L2は、当業者に既知の更なる基
を含む、キサンチンまたはシアニン分子および/または生物学的標的物質に結合
し得るC4炭化水素鎖である。
特定であろうと、または当該範囲の終点を特定することによる当該範囲の記載で
あろうと)、各終点を含む。より広い範囲内の各部分範囲の特定記載を更に含む
。例えば、範囲1−6には、1−4および3−6の部分範囲が含まれ、同時に他
の部分範囲も含まれる。
するエネルギー転移色素の結合に適当な任意の基であり得、それ自体、当業者に
既知である。好ましくは、標的物質に結合するための官能基L2は、カルボキシ
ル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシ
アネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシ
ンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート
、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群より選
択される。
基を含む色素であり得る。L1およびL2の当該結合基は、D1またはD2への
連結に任意に適当に適合し得る。好ましくは、L1および/またはL2の官能性
結合基は、PO3、NH−COまたはNH−CSである。
配置において関係し得るように選択され、本明細書中で更に示唆されるようなフ
ルオロホアである。
,000ダルトン未満、より好ましくは3,000または2,000ダルトン未
満、更により好ましくは1,500または1,200ダルトン未満である。
2つの蛍光色素が、色素間のエネルギー転移に適当な吸収および放射スペクトル
を有するように選択され、そして、第一色素(ドナー)の光励起により第一色素か
ら第二色素(アクセプター)へのエネルギー転移を生ずるため重要な物理的近接お
よび連結を位置付けることを意味する。1以上の更なる色素部分を含む更なるエ
ネルギー転移もまた作成され得る。
に関係し得る少なくとも2つの色素部分を有する蛍光色素複合体について言及し
、そのため、エネルギー転移カスケード配置は、2を超える色素部分、および3
つの色素部分の間のエネルギー転位に関連し得る少なくとも3つの色素を含む。
する波長におけるエネルギーを吸収する、即ち、アクセプターの吸収スペクトル
は、ドナーの放射スペクトルとオーバーラップする色素部分を意味する。
クセプター色素部分の吸収スペクトル内の少なくとも一部分の波長の光を放出す
る色素部分を意味する。
る範囲で一般的に与えられる。例えば、アルキル基は、1から4の炭素原子を含
んでいる。その範囲の記載は、終点を含む特定範囲内の原子の数をそれぞれ含む
基を特定する記載を含むように意図されている。他の多くの原子および他の型の
原子は、下記の手法を示唆し、例えば、C1−4は、C1、C2、C3およびC 4 をそれぞれ個々に含み、当該範囲の任意のサブグループを含む。
素基について言及し、それは、好ましくは、1から6炭素原子を含み、より好ま
しくは1から4炭素原子を含む。好ましくは、炭化水素基は飽和している。当該
アルキル基は、所望により置換され、幾つかの好ましい置換基には、アルコキシ
、アルキルチオ、ハロゲン、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノおよびカルボ
キシ基が含まれる。
する脂肪族炭化水素について言及する。当該低級アルキル基は、所望により、置
換され得、好ましくは置換基には、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン、アミ
ノ、一置換アミノ、二置換アミノ、およびカルボキシが含まれる。
分枝状アルキル基は、好ましくは3から10原子、および最も好ましくは3から
6炭素原子である。当該分枝状アルキル基は、所望により置換され得、幾つかの
好ましい置換基には、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン(フッ素、臭素、塩
素およびヨウ素のような)、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノおよびカルボ
キシが含まれる。
及する。そのため、“フルオロアルキル”なる語は、フッ素で置換された低級ア
ルキル基について言及する。“ペルフルオロアルキル”なる語は、低級アルキル
基が主鎖に結合する場所を除く、すべての可能な位置においてフッ素で置換され
た低級アルキル基について言及する。
有し、炭素環式アリール(例えばフェニル)および複素環式アリール(例えばピリ
ジン)基の両方を含む芳香族基について言及する。
10炭素原子である。アリール部分には、単環式、二環式および三環式が含まれ
、その場合、各環は好ましくは5から6員環である。当該アリール部分は、所望
により、低級アルキルまたはアルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキ
シ、アルキルチオ、ハロゲン、ハロアルキル、メルカプト、アミノ、一置換アミ
ノおよび二置換アミノで独立して一置換または二置換され得る。
いて言及し、当該環のバックボーンを形成する原子がすべて炭素原子である。そ
のため、当該語は、環バックボーンに少なくとも非炭素原子を含む複素環と炭素
環を区別する。“シクロアルカン”または“環状アルカン”または“シクロアル
キル”は、炭素環基であり、当該環は、所望により、環状脂肪族炭化水素、すな
わち、好ましくは3、4、5または6環炭素原子を好ましくは有する環状アルキ
ル基である。そのため、“シクロプロピル”基は、3環炭素原子を含む。
水素を意味する。典型的には、アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル等が含ま
れる。ハロなる語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
合するか、または当該色素が結合する化合物または構造について言及する。
化合物を意味し、限定されないが、ポリペプチド、核酸分子、炭化水素および脂
質が含まれる。その化合物は、エネルギー転移色素の共有結合に適当な基を含む
ように適合するかまたは誘導され得る。当該語は、しばしば、当該色素が核酸抽
出物のような抽出物、または組織切片のような保存サンプルを含むサンプルに、
または核酸シーケンシング反応において、使用されるため、本発明の当該色素が
未処理生体に使用されなければならないことを意味するものではない。好ましく
は、当該生物学的物質の大きさは、400mwと1,000,000mwの間で
ある。より好ましくは、当該大きさは、400mwと100,000mwの間で
あり、最も好ましい大きさは、500と15,000mwの間である。
セプターはローダミンまたはシアニン色素である。好ましくは、L1およびL2 には、Aの構成部分である相当する官能または反応基への当該色素の結合に適当
な反応または官能基が含まれる。例えば、D1をL1鎖に結合させる場合、カル
ボキシルまたは活性化カルボキシル基を含む色素が好ましい。L1および/また
はL2鎖との共有結合の形成に適当な反応および官能基含有色素の選択は、当業
者に既知である。更に、鎖Aとの共有結合の形成に適当なL1および/またはL 2 用の反応および官能基の選択は、当業者に既知である。
セイン、6−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロ
ロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペン
チル)−3’−エチル−5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(
3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およ
びCy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’
−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カルボシアニン)が含まれる。
シペンチル)−1’−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4’
,5’−(1,3−ジスルホネート)ジベンゾ−カルボシアニン)、Cy5(1−(
ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−
5,5’−ジスルホネート−ジカルボシアニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキ
シペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4'
,5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベンゾ−ジカルボシアニン、Cy7(1−
(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル
−5,5’−ジスルホネート−トリカルボシアニンが含まれる。本発明のエネル
ギー転移色素における使用に適当なシアニン色素は、米国特許番号4,268,
486(Waggoner et al.: 任意の図を含めてすべて引用によりこの文書に加える
)に開示されている。
ローダミン(ローダミン110−5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン1
10−6)、5−カルボキシローダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、
6−カルボキシローダミン−6G(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’
,N’−テトラメチル−5−カルボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラ
メチル−6−カルボキシローダミン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ
−X−ローダミン、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε
−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5
,5’−ジスルホネート−カルボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシ
ペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',
5'−(1,3−ジスルホネート)ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カ
ルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネートジカルボシアニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチ
ル)−1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(
1,3−ジスルホネート)−ジベンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(
ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−
5,5’−ジスルホネート−トリカルボシアニンが含まれる。
418-430: Mujumdar et al., 1993, Bioconjugate Chemistry 4: 105-111; Waggo
ner and Ernst, Fluorescent Reagents for Flow Cytometry, Part 1: Principl
es of Clinical Flow Cytometry (1993) and Molecular Probes Handbook of Fl
ouresent Probes and Research Chemicals, Molecular Inc. 6th edition (1996
)Hauglandに記載されており、それらは、任意の図を含め引用によりすべてこの
文書に加える。
シアニン色素を含み得る。
むエネルギー転位色素を意味する。この型の配置では、当該第一色素は、第二色
素を伴うエネルギー転移配置中に存在し、その場合、第二色素は、第一色素から
のエネルギー転移の受容体となる。更に、この型の配置では、第二色素は、第一
色素からのエネルギーの転位を受容し、また第三色素へエネルギーを転移するエ
ネルギー転移配置中に存在する。好ましくは、更なるリンカーを使用し、第三色
素を、D2および生物学的物質の両方に結合可能なL2に結合させる。
に関係する。
質、炭水化物、脂質、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、オキシまたはジオキ
シリボポリ核酸、Koshkin et al., Tetrahedron Letters 1998 39: 4381-4384に
記載のようなLocked Nucleic Acids(LNA)および誘導され得る細胞であって、必
要ならば、エネルギー転移色素の結合に適当な1以上の基、例えばアミノ、ヒド
ロキシ、チオホスホリル、メルカプト(sulphydryl)またはカルボキシ基が含まれ
る細胞が含まれる。
サンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサンチ
ンまたはシアニンの何れかの適当な色素は上記のように考察されている。更にこ
の型の配置Dye2はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ロー
ダミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。また好ましくは、アリ
ール環は、鎖(C=C)を含むエチレン基または鎖(C=C)を含むアセチレン基の
ような飽和または不飽和側鎖で置換され得る。
、酸素、リン、窒素および硫黄からなる群から選択される。好ましくは、n1、
n2およびn3はNHである。
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Dye2はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Dye2はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Dye2はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Dye2はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。基‘n1’は好ましくは
1から10の結合炭化水素、および更なる態様では‘n1’は1に等しい。更な
る態様は、配置IIに記載するように含まれている。
を用い本発明のエネルギー転移色素を調製する方法を提供する: (i)Aを化合物L2にカップリングさせること、 (ii)反応(i)の生成物を、D1との結合の形成に適当な反応基により置換さ
れるL1とカップリングさせること、 (iii)反応(iii)の生成物をD1とカップリングさせること、 (iv)L2が、D2および生物学的分子との結合の形成に適当な反応基により
置換されるように、反応(iii)の生成物を反応させること、 (v)(iv)の生成物をD2とカップリングさせること。
明白である。他には、例えば、段階iおよびivにおいてD1をD2と置換し得
る。
リング”なる語は、2つの部分を連結、例えば、色素部分をエネルギー転移色素
のL1−A−L2部分と連結する共有結合の形成について言及する。“反応する
”なる語は、容易に共有性対分子(covalent partner molecule)に結合し得る反
応基を形成する基または部分の付加または除去について言及する。
得るため、封鎖されるかまたは保護され、次いで一連の反応の後の方の適当なと
きに、脱保護される反応に加わらないものを必要とし得る。
むか、またはその基を含むように修飾される。例えば、ヨードアセトアミドは、
キサンチン色素に適当な置換基であり、マレイミドは、シアニン色素に適当な置
換基である。
、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質およびヌクレオチドまた
は核酸(DNA、PNA、LNA(Locked Nucleic Acids, "Novel convenient Sy
ntheses of LNA [2.2.1]Bicyclo-Nucleosides", Koshkin et al., Tetrahedron
Letters 39: 4381-4384(1998))およびRNA)、ならびに標識複合体(または上記
のように複合体において反応基と共有結合を形成し得る官能基)における官能基
と共有結合を形成し得る少なくとも1つの反応基、および抗体、細胞、薬物、抗
原、細菌、ウイルスおよび他の微生物のような標的生物学的化合物に特異的であ
り、かつ当該標的生物学的化合物と共有結合を形成し得る少なくとも1つの第二
反応基(または場合により官能基)を含むかまたは含むように誘導された類似体の
ような担体物質に色素を共有結合することにより試薬を形成し得る。
それぞれ結合に適当な抗体またはDNAであり得る。担体物質が、反応基である
とき、当該担体は、例えばDNAまたは抗体への結合に適当なポリマー粒子また
は抗原であり得る。蛍光色素を、上記のような担体物質に共有結合する技術は、
当分野に既知であり、本文献において容易に利用し得る。
ヒドロキシ基の1つを含むように誘導したヌクレオチド、およびアミノ、チオホ
スホリル、メルカプト、カルボキシル、カルボニルまたはヒドロキシル基の1つ
を含むように誘導したオキシまたはデオキシ−リボポリ核酸または核酸を含み得
る。
質における官能基には、アミノ、カルボキシル、カルボニルおよびヒドロキシル
基が含まれる。
させそれにより第一部分を標識し、次いで標識第一部分を使用して第二部分と結
合させ、標識第二部分を形成する標識過程にも関係する。適当には、第一部分は
、特異的結合対(特異的結合パートナー)の1つのメンバーであり得る。次いで、
当該手順の第二段階では、蛍光性標識特異的結合パートナーを、特定親和性を有
する特異的結合対(第二部分)の第二メンバーへの結合にプローブとして使用する
。
子が含まれる。そのリガンド−レセプター対の例には、抗体および抗体が特異的
である相当する抗原が含まれる。標識された抗体の標的が細胞であるとき、当該
手順の第二段階を使用し、細胞の蛍光密度を決定することによりその型の細胞に
結合する標識抗体の量を決定する。この手順により、第一段階で本発明の蛍光化
合物で共有結合性標識されたモノクローナル抗体およびおよび他の部分を抗原プ
ローブとして使用し得る。
対には、例えば、ビオチン−(ストレプト)アビジン、ホルモン、レセプター−ホ
ルモン、DNA−相補性DNA、DNA−RNA、DNA−結合タンパク質、酵
素基質などが含まれる。特異的結合親和性を有する任意の2つの分子が用い得、
そのため、本発明のエネルギー転移色素は、次いで、相補的メンバーの検出に使
用し得る特異的結合対の1つのメンバーの標識に使用され得ることが理解し得る
。
グターミネーターに結合するエネルギー転移色素を含む容器中のDNA分子にハ
イブリダイズし得るプライマー分子とアニーリングしたDNA分子をインキュベ
ーションする段階からなり、その場合、当該結合は、色素とヌクレオチドの間は
少なくとも5およびより好ましくは少なくとも10原子のリンカーを伴い、そし
て大きさによってインキュベーション反応のDNA産物を分離し、それによって
DNA分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定し得る、DNA分子
のヌクレオチド塩基配列を決定する方法を特徴とする。その方法を実施例IIIに
記載し、図7および8は配列データおよび典型的な一群のエネルギー転移色素タ
ーミネーターを提供する。
e−5−REG−11−ddUTP、5−FAM−Phe−5−REG−11−
ddCTP、5−FAM−Phe−5−REG−11−ddATP、5−FAM
−Phe−5−REG−11−ddGTP、5−FAM−Phe−5−ROX−
11−ddCTP、5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddUTP、5−
FAM−Phe−5−ROX−11−ddATP、5−FAM−Phe−5−R
OX−11−ddGTP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11−ddG
TP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11−ddATP、5−FAM−
Phe−5−TAMRA−11−ddCTP、5−FAM−Phe−5−TAM
RA−11ddUTP、5−FAM−Phe−5−R110−11−ddATP
、5−FAM−Phe−5−R110−11−ddUTP、5−FAM−Phe
−5−R110−11−ddGTP、または5−FAM−Phe−5−R110
−11ddCTPからなる群から選択された化合物である。
番号09/018,695は(任意の図を含め、引用によりすべてこの文書に加
える)、色素とddNTPとの間のリンカーの長さの重要性について記載する。
種々のリンカーの構成および結合は、当分野によく知られている。リンカー構成
に適当な試薬には、式R−NH−(CH2)n−CO2R’またはR−NH−(C
H2)n−X(CH2)m−CO2R’[式中、Rは酸性−または塩基性−レービル
保護基であり、R’は反応性エステルまたは無水基であり、Xはアリール、O、
S、またはNHであり、nおよびmは0−12である。]の化合物のようなアミ
ノ保護アルキルまたはアリールアミノ酸の活性型からなる1以上の化合物が含ま
れる。N−またはO−またはS−アルキル化により構成される他のリンカーも適
当である。特定色素およびジデオキシヌクレオチドの組合せのための厳密な長さ
は、DNAシーケンシングにおけるバンド均一性をモニターすることにより経験
的に決定し得る。
囲から明白となる。
す新規エネルギー転移色素に関係する。これら新規エネルギー転移色素は、広範
囲の種々のアッセイまたは視覚化システムに適合する特定励起および放出波長に
同調させ得る。核酸またはタンパク質のような部分間の分子ハイブリダイゼーシ
ョンのようなアッセイ、または小細胞内容物のシーケンシングまたは電気泳動の
ような手順。
値ある一群の蛍光標識を提供し、重要なことには、細胞構造を通過する蛍光性複
合体で標識される物質として認められる十分低い分子量となる。そのため、当該
色素は、DNA、PNA、LNAおよび/またはRNAプローブによる使用に充
分適する。マルチパラメーター分析は、複数サンプルにおいて、標的生物学的化
合物の存在を検出し得る。各サンプルは、エネルギー転移色素を用いる既知標識
方法により標識される。
を、フルオレセイン、カスケードブルー、BODIPY色素、または1つのモノ
メチン厳密化色素(monomethine rigidized dyes)、またはCY3(SO3)2、こ
れらはすべて500−575nm波長の範囲(緑から橙色)で放出する、のような
単一蛍光色素と共にインキュベーションする。標的生物学的化合物を含むように
懸濁した第二サンプル(サンプル1と同じ化合物または異なる化合物)を、本発明
のエネルギー転移色素、例えば、N−5−テトラメチル−ローダミン−p−プロ
パルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラニン(490nmの光を吸収し、
選択ローダミン色素に依存して525nm−602nmの範囲で蛍光を放出する
)と共にインキュベーションする。他の標的化合物を含むように懸濁した更なる
サンプルを、同じアッセイで既に使用した色素とは異なる吸収および放出スペク
トルを有する本発明の他の色素と共にインキュベーションする。標的化合物と結
合する蛍光性標識し得る適当期間後、非結合標識を洗浄により除去し、標識サン
プルを混合する。
。各種々の標識サンプルは、特定標識の放出波長で異なる色の蛍光性を有し、個
々の標識により互いに識別される。
イムノアッセイを含む種々の免疫蛍光技術および他の既知の蛍光検出法に使用し
得ると認識される。各標識反応の条件、例えば、pH、温度および時間が当分野
に知られているが、一般的に室温が好ましい。pHは、既知技術により特定反応
基に最適な反応条件に基づき調節される。
ストークスシフトを有する広範囲の種々の蛍光標識が提供される。感度の限界に
おけるノイズに対するシグナルの割合を最大とするために、色素の当該ストーク
スシフトをできる限り大きくし、励起源からのノイズの測定を最小にする。10
0nmよりも大きいストークスシフトを有する色素の利用には非常に限界がある
。利用可能な色素の有用性を更に制限するためには、大きなストークスシフトを
有する殆どの色素が水に不溶性であるため水溶性サンプル中の当該色素の可溶性
が問題となり得る。小さなストークスシフトを有する色素の問題は、励起源から
光を透過する(filter out)モノクロメーターまたは効果な光学機器の使用による
フルオロメーターの工学において通常克服される。しかし、透過による光密度の
喪失を克服するために、例えば、あるものでは、高パワーの光源の使用を必要と
する。これら光源は、ヒートシンクまたはファンを用いる機器において放散しな
ければならない熱を生ずる。
マトリクスに色素を極めて近接させるため蛍光消失(fluorescence quenching)が
見られる。当該色素は、ドナー−アクセプターエネルギー転移し得る互いからの
エネルギー交換距離のET−カセットに位置付けられる。更に、アリールリンカ
ーは、フルオロホア間の特定距離の提供に適合する強固なバックボーンを提供す
る。更に、このリンカーは、ET−カセットを広範囲の種々の生物学的分子、上
記ような種々のものに結合し得る。
使用し得ると認める。また、当業者は、蛍光エネルギー転移を示す1以上の色素
対を種々の波長の蛍光を発する化合物のクラスにおいて生じる分子中にまたは分
子において組み込まれ得ると認識し得る。更に、本明細書に記載の発明性の技術
により、吸収体から、アクセプター(蛍光を発する)への中間体ドナーへのエネル
ギー転移のカスケードを同時に提供する、3以上の色素の分子中または分子上へ
の組み込みから、非常に長いストークスシフトを有する化合物の生成が生じ、ほ
ぼ非制限的な種々の励起および放出特性を有する化合物を生成し得る。
る。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
トの調製 1.1)N−Boc−p−N−プロパルギルトリフルオロアセトアミド−L−フ
ェニルアラニンの調製 Ar気流中、無水DMF(20ml)中のN−Boc−p−ヨード−L−フェニ
ルアラニン(1.0g、2.55mmol)およびCuI(97mg、0.51m
mol、0.2eq)の攪拌懸濁液に、N−プロパルギルトリフルオロアセトア
ミド(1.16g、7.67mmol、3eq)、トリエチルアミン(0.71m
L、5.1mmol、2eq)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)Pd(
0)(295mmol、0.1eq)を加えた。当該反応は、6時間続けた。次い
で、当該反応混合物を1:1MeOH−CH2Cl2で希釈し、AGIX8樹脂
(Bio−Rad)で15分間処置し、次いで、濾過し、当該樹脂を1:1MeO
H−CH2Cl2で洗浄した。当該合せた濾液を減圧下で濃縮し、得られた残渣
をカラムクロマトグラフィーのシリカゲルに吸収させた。CHCl3中の5−1
5%MeOHによる溶出からN−Boc−p−N−プロパルギルトリフルオロア
セトアミド−L−フェニルアラニンを得た。
アミド−L−フェニルアラニン(500mg、1.2mmol)の攪拌溶液に、3
0%NH4OHを加え、4時間インキュベーションした。次いで、減圧下で蒸発
させ、N−Boc−p−プロパルギルアミノ−L−フェニルアラニンを得た。
ミノ−L−フェニルアラニン(33mg、0.12mmol)の攪拌溶液に、ジイ
ソプロピルエチルアミン(276ml、1.58mmol、15eq)およびDM
SO溶液1mlおよび5FAM−NHSエステル(60mg、0.13mmol
、1.2eq)を加えた。室温で4時間後、当該反応混合物に、逆相カラムのH
PLCを行い、0.05%水性TFAからCH3CN中の0.05%TFAへの
勾配で30分間で溶出させた。5FAM標識L−フェニルアラニンを含む画分を
乾燥させ、N−Boc−p−プロパルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラ
ニンを提供した。この化合物を1:1水性TFAの氷冷溶液に加え、1時間室温
で攪拌し、p−プロパルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラニンを生成し
た。
ーダミン−p−プロパルギルアミド−5FAM−フェニルアラニンへの変換の手
順(図1) p−プロパルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラニン(15mg、0.
03mmol)をAr気流中無水DMSO(2ml)に溶解し、室温で攪拌した。
無水DMSO中のN,N’−ジイソプロピルエチルアミン(68ml、0.39
mmol、15eq)および5−ローダミン色素NHS−エステル(0.39mm
ol、1.2eq)を当該溶液に加えた。1−2時間後、当該溶液に、逆相Delta
Pak C18カラム(1.9×30cm)のHPLCを行い、0.1M TEAAから
CH3CNへの勾配で、20ml/min、30分間溶出した。ET−カセット
を含む画分を減圧下で濃縮した。
ROX−Phe−11−ddCTP)の調製(図1および3) N−5ROX−p−プロパルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラニンの
攪拌溶液にN,N’−ジスクシンイミジルカルボネートおよびDMAPの無水T
HF溶液を加えた。20分後、相当するNHSエステルを形成し、エステルを、
緩衝液(pH8.5)に溶解した5−(N−プロパルギル−6−アミノカプロイル(
aminocaproyl))ddCTPと結合させた。室温で1時間の攪拌後、溶媒および緩
衝液を減圧下で除去し、得られた残渣を、SiO2ゲルウォーターアスピレータ
ーバキュームカラムクロマトグラフィーを用い、MeOHに対するCHCl3中
のMeOHを2:8から1:1として溶出させ、それにより遊離色素およびN−
ヒドロキシスクシンイミド不純物を除去するとにより、精製した。画分を逆相H
PLC法により更に精製した。エネルギー転移色素結合の蛍光性促進が、単一R
OX−標識ddCTPの8.25倍となった。
、上記方法に従い本発明の相当するNHSエステルに結合し、本明細書に提供し
た図中の例示のような化合物を生成することが、上記実施例を使用し明らかとな
った。
トを用いるDNAのシーケンシング(図7) M13mp18鋳型DNAの配列を標準“−40”プライマーを用い作成した
。当該反応混合物(20μl)には、それぞれ200μMのdATP、dCTPお
よびdTTP、1000μM dITP、310nM 5−FAM−Phe−5−
TAMRA−11−ddGTP、140nM 5−FAM−Phe−5−R11
0−11−ddATP、275nM 5−FAM−Phe−5−R6G−11−
ddTTP、410nM 5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddCTP
、2pmol −40プライマー、M13mp18 DNA200ng、Thermo S
equenase II(Amersham Pharmacia Biotech)20ユニット、Thermoplasma acidop
hilum無機性ピロホスファターゼ0.0008ユニット、50mM Tris−H
CL pH8.5、35mM KClおよび5mM MgCl2を含めた。
キュラーでインキュベーションした。サイクリング後、当該反応生成物を標準的
な手順を用いエタノールで沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディングバッフ
ァーに再懸濁した。当該サンプルをApplied Biosystems model 377機器にロード
し、その結果を標準ソフトウェア法を用い分析した。
、シーケンシング反応に使用されることが、上記実施例を使用し明らかとなった
。
者の技術レベルが示される。本開示において引用するすべての参考文献を、それ
ぞれの参考文献をすべて個々に引用することにより加えるかのように、引用によ
りこの文書に加える。
有のものが得られるように適合されることを容易に認識する。好ましい実施態様
の典型として記載する当該色素、置換基および標的物質を例示し、本発明の範囲
の制限を目的とするものではない。本明細書の変化および他の使用は、当業者が
行うことができ、本発明の精神の中に含まれ、特許請求の範囲により定義される
。
く、本明細書に開示の本発明を創造し得ることが当業者にはには容易に判る。例
えば、当業者は、本エネルギー転移色素が種々の異なる色素部分、リンカー、結
合基、および反応基に組み込まれ、種々の異なる標的物質結合し得ることを容易
に認識する。そのため、更なる実施態様は、本発明の範囲および特許請求の範囲
内である。
または制限群(それらは特に開示しない)の非存在下で実施し得る。そのため、例
えば、本明細書の各例で、任意の“含む”、“本質的に…からなる”および“か
らなる”なる語は、何れか他の2つの語と置換され得る。用いている語および表
現を記述の語として使用し、制限せず、見られるおよび記載された任意の均等な
特徴またはその一部を排除する語および表現の使用を目的としたものではないが
、種々の修飾が、請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。その
ため、本発明は、好ましい実施態様および所望の特徴により特別に開示されるが
、本明細書に開示の修飾および種々の観念が当業者の頼りとなり得、その修飾お
よび変化は、添付の請求項により定義される本発明の範囲内にあると、理解すべ
きである。
グループに関して記載する場合、本発明はマーカッシュグループまたは他のグル
ープの任意の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーに関しても記載され
ると当業者は認識する。
セット、N−5ROX−p−プロパルギルアミド−5FAM−L−フェニルアラ
ニン−11−ddCTP(5FAM−ROX−Phe−11−ddCTP)および
他のターミネーターを調製する反応の概要である。
he−5−ROX−11−ddCTPの化学的構造(3a)および蛍光共鳴エネル
ギー転移データ(3b、c)である。
he−5−REG−11−ddUTPの化学的構造(4a)および蛍光共鳴エネル
ギー転移データ(4b、c)である。
he−5−TAMRA−11−ddGTPの化学的構造(5a)および蛍光共鳴エ
ネルギー転移データ(5b、c)である。
he−5−R110−ddATPの化学的構造(6a)および蛍光共鳴エネルギー
転移データ(6b、c)である。
子のシーケンシングデータの結果である。
ターである。 当該図は、常に一定の縮尺ではなく、本発明のある部分は縮尺で誇張され、明
瞭および簡潔の目的で概要図で示している。
適当な第一色素であり、 F2は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、 Bは、1から30結合原子を含む1以上のアルキル、アリールまたはヘテロアリ
ール基であり、当該基には、1以上の−NH−、−O−、−CH=CH−、−C = C−およびフェニル基が含まれ、当該基は、C1−4直鎖状または分枝状アル
キル、ヒドロキシル、ハロ、およびフェニルからなる群から選択され、 M3には、水素、または標的物質へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反
応もしくは官能基が含まれ、そして Dには、リンカー基Bに対するF2の結合に適合させた原子または基が含まれる
。] のエネルギー転移カセット。
適当な第一色素であり、 P2は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、 R4は、ハロゲンまたはC1−4アルキルであり、 R5は、ヒドロキシル、ハロ、メチルまたはエチルであり、 N1は、炭素、窒素、酸素、−CH=CH−、およびC=C−から独立して選択
される1から10の原子を含む連結基であり、 S3は、水素、または標的へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反応もし
くは官能基である。] のエネルギー転移色素。
Claims (81)
- 【請求項1】 式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための2から30の結合原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の結合原子の群に結合するように適合した2から30の結合原子の群が含まれ
る。] のエネルギー転移色素。 - 【請求項2】 当該芳香族環がフェニル環である、請求項1のエネルギー転
位色素。 - 【請求項3】 Aには、1以上のアリール環が含まれる、請求項1のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項4】 L1には、1以上の芳香族環が含まれる、請求項1のエネル
ギー転位色素。 - 【請求項5】 当該芳香族環がフェニル環である、請求項4のエネルギー転
移色素。 - 【請求項6】 L1には、1以上の複素環が含まれる、請求項4のエネルギ
ー転移色素。 - 【請求項7】 L2には、1以上の芳香族環が含まれる、請求項1のエネル
ギー転位色素。 - 【請求項8】 Aには、1以上のヘテロアリール基に連結する第一直鎖状炭
化水素鎖が含まれ、当該ヘテロアリール基は更に第二直鎖状炭化水素鎖が含まれ
る、請求項1のエネルギー転移色素。 - 【請求項9】 D1は、キサンチン色素およびシアニン色素からなる群から
選択され、D2はローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択される
、請求項1のエネルギー転移色素。 - 【請求項10】 D1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、D1によりエ
ネルギーがD2へ転移され得る、請求項9のエネルギー転移色素。 - 【請求項11】 D2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項9のエネルギー転移色素。 - 【請求項12】 リンカー基を介してL2に結合した第三色素が更に含まれ
、当該結合により、D2を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請
求項1のエネルギー転移色素。 - 【請求項13】 更なるリンカー基を介してL2に結合した第三色素が更に
含まれ、当該結合により、D2を伴うカスケードエネルギー転移配置または当該
第三色素を生ずる、請求項1のエネルギー転移色素。 - 【請求項14】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項12のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項15】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項13のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項16】 式 【化1】 の化合物。
- 【請求項17】 式 【化2】 の化合物。
- 【請求項18】 式 【化3】 の化合物。
- 【請求項19】 式 【化4】 の化合物。
- 【請求項20】 式 【化5】 の化合物。
- 【請求項21】 Dye#1は、5−カルボキシフルオレセイン、6−カル
ボキシフルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−
ジメトキシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エ
チル−5,5’−ジメチルオキサカルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキ
シペンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)、Cy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)およびCy5(1−(ε−カルボキシペン
チル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5’−ジスル
ホネート−ジカルボシアニンからなる群から選択され、当該Dye#1によりD
ye#2へエネルギーが転移され得る、請求項16−20の何れかの化合物。 - 【請求項22】 Dye#2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン1
10−5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキ
シローダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン
−6G(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5
−カルボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシロ
ーダミン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カ
ルボキシ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−
1’−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート
−カルボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル
−3,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネ
ート)ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカ
ルボシアニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
−ジベンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)
−1’−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート
−トリカルボシアニンからなる群から選択され、Dye#2によりDye#1へ
エネルギーが転移され得る、請求項16−20の何れかの化合物。 - 【請求項23】 5−FAM−Phe−5−REG−11−ddUTP、5
−FAM−Phe−5−REG−11−ddCTP、5−FAM−Phe−5−
REG−11−ddATP、5−FAM−Phe−5−REG−11−ddGT
P、5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddCTP、5−FAM−Phe
−5−ROX−11−ddUTP、5−FAM−Phe−5−ROX−11−d
dATP、5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddGTP、5−FAM−
Phe−5−TAMRA−11−ddGTP、5−FAM−Phe−5−TAM
RA−11−ddATP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11−ddC
TP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11ddUTP、5−FAM−P
he−5−R110−11−ddATP、5−FAM−Phe−5−R110−
11−ddUTP、5−FAM−Phe−5−R110−11−ddGTP、ま
たは5−FAM−Phe−5−R110−11ddCTPからなる群から選択さ
れる、エネルギー転移色素ターミネーター。 - 【請求項24】 式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための4から30の結合原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の原子の群に結合するように適合した4から30の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を製造する方法であって、 (a)Aを化合物L2にカップリングさせること、 (b)反応(a)の生成物を、D1との結合の形成に適当な反応基により置換さ
れるL1とカップリングさせること、 (c)反応(b)の生成物をD1とカップリングさせること、 (d)L2が、D2との結合の形成に適当な反応基により置換されるように(
c)の生成物を反応させること、その場合、L2の第二部分は生物学的標的への
結合の形成に適当な反応基により置換されており、 (e)(d)の生成物をD2とカップリングさせ、それにより当該結合を形成す
ること、 を含む方法。 - 【請求項25】 (a)式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための4から30の原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の原子の群に結合するように適合した4から30の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を、当該生物学的物質を含む液体に添加すること、 (b)当該色素を当該生物学的物質と共有結合的反応および当該生物学的物質を標
識するように当該色素を反応させること、 を含む、生物学的物質を蛍光的に標識するための方法。 - 【請求項26】 当該生物学的物質は、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質
、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、オキシ、デオキシ、またはデオキシリボ核酸
またはポリ核酸、ならびに1以上のアミノ、ヒドロキシ、チオホスホリル、メル
カプト(sulphydryl)またはカルボキシ基が含まれるように所望により誘導された
細胞からなる群から選択される、請求項25の方法。 - 【請求項27】 Aには、C6−C17炭化水素鎖が含まれ、当該炭化水素
鎖には少なくとも1つのヘテロアリール基が含まれる、請求項25の方法。 - 【請求項28】 D1が、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、D2がローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択
される、請求項25の方法。 - 【請求項29】 D1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、D1によりD
2へエネルギーが転移され得る、請求項28の方法。 - 【請求項30】 D2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項28の方法。 - 【請求項31】 当該エネルギー転移色素には、L1が、アミノ、カルボキ
シル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオ
シアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スク
シンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネー
ト、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群から
選択される化合物が含まれる、請求項25の方法。 - 【請求項32】 当該エネルギー転移色素には、L2が、アミノ、カルボキ
シル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオ
シアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スク
シンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネー
ト、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群から
選択される化合物が含まれる、請求項25の方法。 - 【請求項33】 当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該L 2 に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項25の方法。 - 【請求項34】 当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該L2に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項25の方法。 - 【請求項35】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項33の方法。
- 【請求項36】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項34の方法。
- 【請求項37】 第一部分を蛍光的に標識し、次いで、サンプルにおける第
二部分の存在の検出に当該標識第一部分を用いる方法であって、 (a)式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための2から30の原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の原子の群に結合するように適合した2から30の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を当該第一部分を含む液体に加えること、 (b)当該色素を当該第一部分と共有結合的に反応させそれにより当該第一部分を
標識するために、当該第一部分と当該色素を反応させること、 (c)当該サンプルに当該標識第一部分を提供し、存在するならば当該第二部分に
当該標識第一部分を結合し得ること、 (d)存在するならば、光学的方法による蛍光標識を検出することにより、当該第
二部分を検出すること、 を含む、方法。 - 【請求項38】 Aには、C6−C17炭化水素鎖が含まれ、当該炭化水素
鎖には少なくとも1つのヘテロアリール基が含まれる、請求項37の方法。 - 【請求項39】 D1が、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、D2がローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択
される、請求項37の方法。 - 【請求項40】 D1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、D1によりD
2へエネルギーが転移され得る、請求項37の方法。 - 【請求項41】 D2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項39の方法。 - 【請求項42】 当該標的物質には、生物学的物質が含まれる、請求項37
の方法。 - 【請求項43】 L1が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、、請求項37の方
法。 - 【請求項44】 L2が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、請求項37の方法
。 - 【請求項45】 当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該L 2 に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項37の方法。 - 【請求項46】 当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該L2に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項37の方法。 - 【請求項47】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項45の方法。
- 【請求項48】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項45の方法。
- 【請求項49】 (a)式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための4から30の原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の原子の群に結合するように適合した4から30の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素、 (b)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも1つの反応基、またはエネルギー
転移色素において反応基と共有結合を形成し得、かつ共有結合する官能基を含む
かまたは含むように誘導された担体物質 を含む試薬。 - 【請求項50】 当該担体物質が、ポリマー粒子、細胞、ガラスビーズ、抗
体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質および核酸からなる群から選
択される、請求項49の試薬。 - 【請求項51】 当該エネルギー試薬には、Aにヘテロアリール基が含まれ
る化合物が含まれる、請求項49の試薬。 - 【請求項52】 D1は、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、当該D2はローダミン色素およびシアニン色素からなる群から
選択される、請求項49の試薬。 - 【請求項53】 D1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、D1によりエ
ネルギーがD2へ転移され得る、請求項52の試薬。 - 【請求項54】 D2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項52の試薬。 - 【請求項55】 当該標的物質には、生物学的物質が含まれる、請求項49
の試薬。 - 【請求項56】 L2が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、請求項49の試薬
。 - 【請求項57】 当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該L 2 に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項49の試薬。 - 【請求項58】 当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該L2に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該D2を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項49の試薬。 - 【請求項59】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項57の試薬。
- 【請求項60】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項58の試薬。
- 【請求項61】 (a)式 D1−L1−A−L2−D2 [式中、D1は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、 D2は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、 Aには、5−20結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも1つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、 L1には、当該D1に結合するための4から30の原子の群が含まれ、 L2には、当該D2、および生物学的標的に結合させるために適合した4から3
0の原子の群に結合するように適合した4から30の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素、 (b)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも1つの反応基、またはエネルギー
転移色素において反応基と共有結合を形成し得、かつ共有結合する官能基を含む
かまたは含むように誘導された担体物質 を含む結合エネルギー転移色素を伴う、生物学的物質。 - 【請求項62】 式 【化6】 [式中、F1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、 F2は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、 Bは、1から30原子を含む1以上のアルキル基であり、当該原子には、1以上
の−NH−、−O−、−CH=CH−、−C=C−およびフェニル基が含まれ、
当該原子は、C1−4直鎖状または分枝状アルキル、ヒドロキシル、ハロ、また
はフェニルからなる群から選択され、 M3には、水素、または標的物質へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反
応もしくは官能基が含まれ、そして Dには、リンカー基Bに対するF2の結合に適合させた原子または基が含まれる
。] のエネルギー転移カセット。 - 【請求項63】 少なくとも1つのアルキル基がフェニル環である、請求項
62のエネルギー転移色素。 - 【請求項64】 Bには、1つ以上のアリールまたはヘテロアリール環が含
まれる、請求項62のエネルギー転移色素。 - 【請求項65】 F1には、1以上の芳香族環が含まれる、請求項62のエ
ネルギー転移色素。 - 【請求項66】 当該芳香族環が、フェニル環である、請求項65のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項67】 F1には、1以上の複素環が含まれる、請求項65のエネ
ルギー転移色素。 - 【請求項68】 F2には、1以上の芳香族環が含まれる、請求項62のエ
ネルギー転移色素。 - 【請求項69】 Bには、1以上のヘテロアリール基に連結する第一直鎖状
炭化水素鎖が含まれ、当該ヘテロアリール基が、第二直鎖状炭化水素鎖にさらに
連結する、請求項62のエネルギー転移色素。 - 【請求項70】 F1が、キサンチン色素およびシアニン色素からなる群か
ら選択され、F2が、ローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択さ
れる、請求項62のエネルギー転移色素。 - 【請求項71】 F1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、F1によりF
2へエネルギーが転移され得る、請求項70のエネルギー転移色素。 - 【請求項72】 F2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項70のエネルギー転移色素。 - 【請求項73】 リンカー基を介してF2に結合する第三色素が更に含まれ
、当該結合により当該F2を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、
請求項62のエネルギー転移色素。 - 【請求項74】 更なるリンカー基を介してF2に結合する第三色素が更に
含まれ、当該結合によりF2を伴うカスケードエネルギー転移配置または当該第
三色素を生ずる、請求項62のエネルギー転移色素。 - 【請求項75】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項73のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項76】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項74のエネル
ギー転移色素。 - 【請求項77】 式 【化7】 [式中、P1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、 P2は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、 R4は、ハロゲンまたはC1−4アルキルであり、 R5は、ヒドロキシル、ハロ、メチルまたはエチルであり、 N1は、炭素、窒素、酸素、−CH=CH−、およびC=C−から独立して選択
される1から10の原子を含む連結基であり、 S3は、水素、または標的へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反応もし
くは官能基である。] のエネルギー転移色素。 - 【請求項78】 (i)耐熱性DNAポリメラーゼ、ならびに、5−FAM−
Phe−5−REG−11−ddUTP、5−FAM−Phe−5−REG−1
1−ddCTP、5−FAM−Phe−5−REG−11−ddATP、5−F
AM−Phe−5−REG−11−ddGTP、5−FAM−Phe−5−RO
X−11−ddCTP、5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddUTP、
5−FAM−Phe−5−ROX−11−ddATP、5−FAM−Phe−5
−ROX−11−ddGTP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11−d
dGTP、5−FAM−Phe−5−TAMRA−11−ddATP、5−FA
M−Phe−5−TAMRA−11−ddCTP、5−FAM−Phe−5−T
AMRA−11ddUTP、5−FAM−Phe−5−R110−11−ddA
TP、5−FAM−Phe−5−R110−11−ddUTP、5−FAM−P
he−5−R110−11−ddGTP、または5−FAM−Phe−5−R1
10−11ddCTPからなる群から選択される式の化合物を含む容器中の当該
DNA分子にハイブリダイズし得るプライマー分子とアニーリングしたDNA分
子をインキュベーションすること、 (ii)大きさによってインキュベーション反応のDNA産物を分離し、それによっ
て当該DNA分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定し得る、 段階を含むDNA分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法。 - 【請求項79】 サンプル中の1以上の分子の存在を決定する方法であって
、 当該サンプル中の少なくとも1つの当該分子に特異的な結合パートナーを選択す
ること、 当該結合パートナーのそれぞれを、請求項1の個々のエネルギー転移色素へ独立
して連結すること、その場合、D1は個々の化合物の各々と同じであり、D2は
異なる、 当該サンプルを伴う式1の個々化合物に独立して連結する、当該結合パートナー
を混合すること、 種々の放出スペクトルに基づき当該分子の存在を決定すること、 の段階を含む方法。 - 【請求項80】 D1が、5−カルボキシフルオレセイン、6−カルボキシ
フルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメト
キシフルオレセイン、CyA(3−(ε−カルボキシペンチル)−3’−エチル−
5,5’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Cy2(3−(ε−カルボキシペ
ンチル)−3’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびCy3(3−(ε−カル
ボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチル−5,5
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、D1によりエ
ネルギーがD2へ転移され得る、請求項79の方法。 - 【請求項81】 D2は、5−カルボキシローダミン(ローダミン110−
5)、6−カルボキシローダミン(ローダミン110−6)、5−カルボキシロー
ダミン−6G(R6G−5またはREG−5)、6−カルボキシローダミン−6G
(R6G−6またはREG−6)、N,N,N’,N’−テトラメチル−5−カル
ボキシローダミン、N,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシローダミ
ン(TAMRAまたはTMR)、5−カルボキシ−X−ローダミン、6−カルボキ
シ−X−ローダミン(ROX)、Cy3(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−
エチル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Cy3.5(3−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3
,3,3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Cy5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチ
ル −3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Cy5.5(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル −3,3,
3',3'−テトラメチル−4,5,4',5'−(1,3−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびCy7(1−(ε−カルボキシペンチル)−1’
−エチル−3,3,3',3'−テトラメチル−5,5’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該D2は、D1からエネルギーを受
容することができる、請求項79の方法。
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