JP2002523783A

JP2002523783A - エネルギー転移色素

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Publication number: JP2002523783A
Application number: JP2000567958A
Authority: JP
Inventors: シブ・クマー; サティアム・ナムパリ; マヘッシュ・コット
Original assignee: アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-30
Publication date: 2002-07-30
Anticipated expiration: 2019-08-30
Also published as: GB9920022D0; CA2341520A1; EP1110088B1; DE29915165U1; ATE252239T1; JP4659213B2; EP1110088A1; DE69912139D1; DE69912139T2; WO2000013026A1; AU5697099A; GB2341189B; GB2341189A; ES2209492T3; AU767840B2; CA2341520C; WO2000013026A9

Abstract

(57)【要約】エネルギー転子色素、その調製、および生物学的システムにおける標識としてのその使用を開示する。当該色素は、好ましくは、種々の生物学的物質に結合できるカセット型である。それらから製造される当該色素および試薬は、広範囲の可視スペクトルにおいて種々の蛍光適用に使用できる大きなストークシフトを伴う広範囲の種々の蛍光標識を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の分野本発明は、新規クラスのエネルギー転移色素、それらの調製、および生物学的
システムにおける標識としての使用に関係する。

【０００２】本発明の背景下記記載は、添付の請求項の分野よりも従前では認められない分野に関連する
。

【０００３】種々の方法が細胞における細胞または分子の視覚化および液体中のアナライト
濃度の測定に利用できる。蛍光顕微鏡では、細胞中のタンパク質および複合体の
位置測定するために、抗体のような特異的プローブに通常連結する蛍光色素が使
用される。

【０００４】アナライト濃度の測定には、目的のアナライトの検出、核酸分子の特定配列の
決定、イムノアッセイおよび種々ハイブリダイゼーション法が過去４０年間以上
において一般的であった。ラジオイムノアッセイは、非常に低濃度のアナライト
を測定し得る放射性ヌクレオチドの高い特異活性のため、発達した。しかし、環
境およびヒトの健康への関心から、イムノアッセイにおけるラジオヌクレオチド
の使用は、一般的とはならなくなってきている。シグナルを増幅するイムノアッ
セイにおける酵素の使用は、環境またはヒトの健康を危険にさらさないため、イ
ムノアッセイの分野において非常に重要な進展をした。しかし、酵素結合イムノ
アッセイは、酵素の活性が温度に依存するため、問題となり得、酵素または基質
の不安定性から、標的リガンド量の蓄積が生じ得る。更に、他のイムノアッセイ
では、アナライト濃度の測定のために、酵素を伴ってもまたは伴っていなくとも
、シグナルとして蛍光をモニターする。

【０００５】バイ−フルオロホアエネルギー転移色素は記載されており、それは、生物学的
システムにおける新規な方法のモニタタリングプロセスを提供する。その色素の
蛍光性により、生物学的システムが含まれるプロセスをモニターすることが可能
となる。当該蛍光シグナルは、特定波長の蛍光分子を励起し、他の波長の蛍光の
放出を測定するように調節するフルオロメーターにより測定する。励起および放
出の波長における相違はストークスシフトとして言及される。

【０００６】従来、バイフルオロホア色素の種々の組合せが述べられている。Mathies et a
l., １９９５年１２月１９日付け米国特許番号５，６８８，６４８、標題“Prob
es Labelled with Energy Transfer Coupled Dyes”、任意の図を含めて引用に
よりこの文書にすべて加え、それは、ドナーおよびアクセプター色素分子の対を
有する蛍光標識群を開示し、その場合、当該標識は、シーケンシングのために核
酸バックボーンに結合され得る。種々の蛍光標識を用いることにより複数核酸混
合物中の核酸を同定および検出する方法が含まれ、その場合、蛍光部分は、シア
ニン色素またはキサンテンのようなファミリーから選択される。当該蛍光標識に
は、フルオロホアの対が含まれ、その場合、１つのフルオロホアドナーは、励起
メンバーから他の対メンバーへのエネルギーが転移するようにフルオロホアアク
セプター吸収とオーバーラップする放出スペクトルを有する。

【０００７】 Waggoner et al.,１９９６年５月３０日付け英国特許番号２３０１８３３Ｂ、
標題“Fluorescent Labelling Complexes with Large Stokes' Shifts Formed b
y Coupling Together Cyanine and Other Fluorochromes Capable of Resonance
Energy Transfer”、任意の図を含めて引用によりすべてこの文書に加え、それ
は、第一の吸収および放出スペクトルを有する第一蛍光色素ならびに第二の吸収
および放出スペクトルを有する第二蛍光色素を含む複合体を開示する。蛍光色素
間の当該リンカー基は、アルキル鎖である。当該色素の蛍光性により、それらを
シーケンシングおよび核酸検出に使用することができる。

【０００８】バイフルオロホア色素構成おいて、特定の重要な態様は、アクセプターおよび
ドナー分子間の距離であり、リンカー基の構造である。例えば、種々の大きさの
生物学的分子の選択に適合させるために、色素構成において更なる改善の余地が
ある。

【０００９】本発明の要旨新規クラスのエネルギー転移色素が、シーケンシング反応および他の適用を含
む物質標識に使用し得ることが見出された。当該色素は、好ましくは、“カセッ
ト”型であり、種々の生物学的物質に結合し得る。カセットには、少なくとも２
つの蛍光性色素部分、リンカー基、および好ましくは生物学的物質または他の標
的物質に複合体を結合させるための反応基との、共有結合および複合体形成が含
まれる。当該反応基は、特定標的物質の官能基との共有結合の形成に適当なよう
に選択される。色素は、第一色素の放射スペクトルが第二色素の吸収スペクトル
とオーバーラップし、それによって、色素間でエネルギー転移が生ずるように選
択する。アリールおよびヘテロアリールリンカー基を含む色素カセットにより、
種々の大きさの生物学的分子が連結し、フルオロホア間でエネルギー転移を生ず
る特性を有する、安定で、強固な構造が得られる。

【００１０】よって、本発明の１つの態様は、式ＩＤ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、Ｄ_２は、第一色素または任意の更なる添加色素を伴うエ
ネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプターとして適当な第二色素であ
る。] のエネルギー転移色素を提供する。Ａには、独立して、(ｉ)炭素、硫黄、窒素お
よび酸素から選択される原子に連結する５、および２０までの鎖、および／また
は(ii)１以上のアリール、ヘテロアリールまたは他の芳香族炭化水素基(式中、
芳香族分子には、炭素、窒素および酸素から選択される環状結合原子が含まれる
。)が含まれる。本発明のこの態様および／または他の態様では、Ａが、フェニ
ルであるとき、直接カルボニル基に連結し得るかまたは連結し得ない。好ましく
は、Ａには、５−２０結合原子が含まれる[式中、連結原子は、炭素環式または
複素環式の基のような少なくとも１つの環状基を含み、環状基の原子は炭素、窒
素、硫黄、酸素およびリンからなる群から独立して選択される。]。

【００１１】当該鎖は、望ましいならば、エネルギー転位を妨げない当業者に既知の基で所
望により置換され得、例えば、当該環は、アルキル、アルコキシ、アルキニル、
アルケニル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、アミノ、ニトロお
よびエステル部分からなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つの
置換基で置換されるか、またはＯＨ、ハロ、メチル、水素またはエチル基から独
立して選択される１、２、３または４置換基で所望により置換されたＣ_１，２， _{３または４} 直鎖状または分枝状アルキル、フェニル、またはアリールアルキルに
より置換された、芳香族または複素環式芳香族環であり得る。

【００１２】Ｌ_１およびＬ_２には、Ａを生物学的分子に結合させるために適合した原子また
は群、およびＤ_１またはＤ_２に結合させるために適合した原子または原子群が独
立して含まれる。

【００１３】更に、Ｌ_２には、第三エネルギー転位色素がカスケードエネルギー転位配置に
おいて結合する更なるリンカーへの結合に選択的に適合する原子または基が独立
して含まれ、その場合、当該第三色素は、第一色素(Ｄ_１)と相互作用する第二色
素(Ｄ_２)、および標的物質、例えば下記のような生物学的物質と結合する原子ま
たは基と相互作用する。

【００１４】Ｄ_１またはＤ_２がフルオレセイン／ローダミン対であるとき、好ましくは、Ａ
、Ｌ_１およびＬ_２において６から２５の組合せ結合リンカー原子が存在し、より
好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５リンカー原子が存
在する。好ましくは、Ａは、Ｌ_１またはＬ_２に結合するＣ_６芳香族炭化水素部分
である。Ｌ_１は、当業者に既知の更なる基を含む、キサンチンまたはシアニン分
子に結合し得るＣ_２−Ｃ_４炭化水素鎖であり、Ｌ_２は、当業者に既知の更なる基
を含む、キサンチンまたはシアニン分子および／または生物学的標的物質に結合
し得るＣ_４炭化水素鎖である。

【００１５】鎖または基中における原子数の値の範囲の特定は(当該範囲内の各整数の明示
特定であろうと、または当該範囲の終点を特定することによる当該範囲の記載で
あろうと)、各終点を含む。より広い範囲内の各部分範囲の特定記載を更に含む
。例えば、範囲１−６には、１−４および３−６の部分範囲が含まれ、同時に他
の部分範囲も含まれる。

【００１６】当該反応または官能基、Ｌ_２は、標的物質、好ましくは標的生物学的物質に対
するエネルギー転移色素の結合に適当な任意の基であり得、それ自体、当業者に
既知である。好ましくは、標的物質に結合するための官能基Ｌ_２は、カルボキシ
ル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシ
アネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシ
ンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート
、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群より選
択される。

【００１７】Ｄ_１またはＤ_２に適当な色素は、Ｌ_１またはＬ_２と連結し得る反応または官能
基を含む色素であり得る。Ｌ_１およびＬ_２の当該結合基は、Ｄ_１またはＤ_２への
連結に任意に適当に適合し得る。好ましくは、Ｌ_１および／またはＬ_２の官能性
結合基は、ＰＯ_３、ＮＨ−ＣＯまたはＮＨ−ＣＳである。

【００１８】本エネルギー転移色素の色素部分、例えばＤ_１またはＤ_２は、エネルギー転移
配置において関係し得るように選択され、本明細書中で更に示唆されるようなフ
ルオロホアである。

【００１９】好ましくは、本発明のエネルギー転移色素は、総分子量１０，０００または５
，０００ダルトン未満、より好ましくは３，０００または２，０００ダルトン未
満、更により好ましくは１，５００または１，２００ダルトン未満である。

【００２０】本発明のエネルギー転移色素と関係して、“エネルギー転移配置”なる語は、
２つの蛍光色素が、色素間のエネルギー転移に適当な吸収および放射スペクトル
を有するように選択され、そして、第一色素(ドナー)の光励起により第一色素か
ら第二色素(アクセプター)へのエネルギー転移を生ずるため重要な物理的近接お
よび連結を位置付けることを意味する。１以上の更なる色素部分を含む更なるエ
ネルギー転移もまた作成され得る。

【００２１】そのため、“エネルギー転移色素”は、２つの色素部分の間のエネルギー転移
に関係し得る少なくとも２つの色素部分を有する蛍光色素複合体について言及し
、そのため、エネルギー転移カスケード配置は、２を超える色素部分、および３
つの色素部分の間のエネルギー転位に関連し得る少なくとも３つの色素を含む。

【００２２】エネルギー転移配置における“アクセプター”は、ドナー色素部分により放出
する波長におけるエネルギーを吸収する、即ち、アクセプターの吸収スペクトル
は、ドナーの放射スペクトルとオーバーラップする色素部分を意味する。

【００２３】エネルギー転移配置における“ドナー”は、光からのエネルギーを吸収し、ア
クセプター色素部分の吸収スペクトル内の少なくとも一部分の波長の光を放出す
る色素部分を意味する。

【００２４】本発明の化合物の一般的な記載では、置換基ににおける特定型原子の数が、あ
る範囲で一般的に与えられる。例えば、アルキル基は、１から４の炭素原子を含
んでいる。その範囲の記載は、終点を含む特定範囲内の原子の数をそれぞれ含む
基を特定する記載を含むように意図されている。他の多くの原子および他の型の
原子は、下記の手法を示唆し、例えば、Ｃ_１−４は、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３およびＣ _４をそれぞれ個々に含み、当該範囲の任意のサブグループを含む。

【００２５】特記しない限り、“アルキル”なる語は、分枝状または非分枝状脂肪族炭化水
素基について言及し、それは、好ましくは、１から６炭素原子を含み、より好ま
しくは１から４炭素原子を含む。好ましくは、炭化水素基は飽和している。当該
アルキル基は、所望により置換され、幾つかの好ましい置換基には、アルコキシ
、アルキルチオ、ハロゲン、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノおよびカルボ
キシ基が含まれる。

【００２６】 “低級アルキル”なる語は、１から６炭素、好ましくは１から４炭素原子を有
する脂肪族炭化水素について言及する。当該低級アルキル基は、所望により、置
換され得、好ましくは置換基には、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン、アミ
ノ、一置換アミノ、二置換アミノ、およびカルボキシが含まれる。

【００２７】 “分枝状アルキル”なる語は、分枝状脂肪族炭化水素について言及する。当該
分枝状アルキル基は、好ましくは３から１０原子、および最も好ましくは３から
６炭素原子である。当該分枝状アルキル基は、所望により置換され得、幾つかの
好ましい置換基には、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン(フッ素、臭素、塩
素およびヨウ素のような)、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノおよびカルボ
キシが含まれる。

【００２８】 “ハロアルキル”なる語は、ハロゲンで置換された低級アルキル基について言
及する。そのため、“フルオロアルキル”なる語は、フッ素で置換された低級ア
ルキル基について言及する。“ペルフルオロアルキル”なる語は、低級アルキル
基が主鎖に結合する場所を除く、すべての可能な位置においてフッ素で置換され
た低級アルキル基について言及する。

【００２９】 “アリール”なる語は、共役性π電子システムを有する少なくとも１つの環を
有し、炭素環式アリール(例えばフェニル)および複素環式アリール(例えばピリ
ジン)基の両方を含む芳香族基について言及する。

【００３０】当該化学分野に既知の複素環基の特定の例には、以下のものが含まれる：

【化８】

【化９】当該アルキル基は、好ましくは、６から１４炭素であり、より好ましくは６から
１０炭素原子である。アリール部分には、単環式、二環式および三環式が含まれ
、その場合、各環は好ましくは５から６員環である。当該アリール部分は、所望
により、低級アルキルまたはアルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキ
シ、アルキルチオ、ハロゲン、ハロアルキル、メルカプト、アミノ、一置換アミ
ノおよび二置換アミノで独立して一置換または二置換され得る。

【００３１】 “炭素環”なる語は、１以上の共有結合性閉環構造を含む化合物または基につ
いて言及し、当該環のバックボーンを形成する原子がすべて炭素原子である。そ
のため、当該語は、環バックボーンに少なくとも非炭素原子を含む複素環と炭素
環を区別する。“シクロアルカン”または“環状アルカン”または“シクロアル
キル”は、炭素環基であり、当該環は、所望により、環状脂肪族炭化水素、すな
わち、好ましくは３、４、５または６環炭素原子を好ましくは有する環状アルキ
ル基である。そのため、“シクロプロピル”基は、３環炭素原子を含む。

【００３２】 “直鎖状または分枝状アルキル”なる語は、直鎖または分枝状飽和脂肪族炭化
水素を意味する。典型的には、アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル等が含ま
れる。ハロなる語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。

【００３３】本発明の文脈において、“標的物質”なる語は、エネルギー転位色素が共有結
合するか、または当該色素が結合する化合物または構造について言及する。

【００３４】 “生物学的物質”なる語は、生体により生成するか、または生体中に存在する
化合物を意味し、限定されないが、ポリペプチド、核酸分子、炭化水素および脂
質が含まれる。その化合物は、エネルギー転移色素の共有結合に適当な基を含む
ように適合するかまたは誘導され得る。当該語は、しばしば、当該色素が核酸抽
出物のような抽出物、または組織切片のような保存サンプルを含むサンプルに、
または核酸シーケンシング反応において、使用されるため、本発明の当該色素が
未処理生体に使用されなければならないことを意味するものではない。好ましく
は、当該生物学的物質の大きさは、４００ｍｗと１，０００，０００ｍｗの間で
ある。より好ましくは、当該大きさは、４００ｍｗと１００，０００ｍｗの間で
あり、最も好ましい大きさは、５００と１５，０００ｍｗの間である。

【００３５】好ましくは、当該エネルギー転移色素は、式(Ｉ) Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２である。

【００３６】好ましくは、ドナー色素は、キサンチンまたはシアニン色素であり、当該アク
セプターはローダミンまたはシアニン色素である。好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２には、Ａの構成部分である相当する官能または反応基への当該色素の結合に適当
な反応または官能基が含まれる。例えば、Ｄ_１をＬ_１鎖に結合させる場合、カル
ボキシルまたは活性化カルボキシル基を含む色素が好ましい。Ｌ_１および／また
はＬ_２鎖との共有結合の形成に適当な反応および官能基含有色素の選択は、当業
者に既知である。更に、鎖Ａとの共有結合の形成に適当なＬ_１および／またはＬ _２用の反応および官能基の選択は、当業者に既知である。

【００３７】適当なキサンチンドナー色素には、限定されないが、５−カルボキシフルオレ
セイン、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロ
ロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペン
チル)−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(
３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およ
びＣｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’
−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カルボシアニン)が含まれる。

【００３８】適当なシアニン色素には、限定されたないが、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキ
シペンチル)−１’−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４’
，５’−(１，３−ジスルホネート)ジベンゾ−カルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(
ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−
５，５’−ジスルホネート−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキ
シペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'
，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベンゾ−ジカルボシアニン、Ｃｙ７(１−
(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル
−５，５’−ジスルホネート−トリカルボシアニンが含まれる。本発明のエネル
ギー転移色素における使用に適当なシアニン色素は、米国特許番号４，２６８，
４８６(Waggoner et al.: 任意の図を含めてすべて引用によりこの文書に加える
)に開示されている。

【００３９】適当なローダミンアクセプター色素には、限定されたないが、５−カルボキシ
ローダミン(ローダミン１１０−５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１
１０−６)、５−カルボキシローダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、
６−カルボキシローダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ
メチル−６−カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ
−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε
−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５
，５’−ジスルホネート−カルボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシ
ペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，
５'−(１，３−ジスルホネート)ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カ
ルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネートジカルボシアニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチ
ル)−１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(
１，３−ジスルホネート)−ジベンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(
ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−
５，５’−ジスルホネート−トリカルボシアニンが含まれる。

【００４０】上記および更なる色素が、例えば、Southwick et al., 1990, Cytometry 11:
418-430: Mujumdar et al., 1993, Bioconjugate Chemistry 4: 105-111; Waggo
ner and Ernst, Fluorescent Reagents for Flow Cytometry, Part 1: Principl
es of Clinical Flow Cytometry (1993) and Molecular Probes Handbook of Fl
ouresent Probes and Research Chemicals, Molecular Inc. 6^th edition (1996
)Hauglandに記載されており、それらは、任意の図を含め引用によりすべてこの
文書に加える。

【００４１】所望により、当該複合体には、適当なリンカー基を介してＬ_２に結合し、Ｄ_１およびＤ_２を伴うカスケードエネルギー転移配置中に存在する第三色素、例えば
シアニン色素を含み得る。

【００４２】 “カスケードエネルギー転移配置”なる語は、少なくとも３つの色素部分を含
むエネルギー転位色素を意味する。この型の配置では、当該第一色素は、第二色
素を伴うエネルギー転移配置中に存在し、その場合、第二色素は、第一色素から
のエネルギー転移の受容体となる。更に、この型の配置では、第二色素は、第一
色素からのエネルギーの転位を受容し、また第三色素へエネルギーを転移するエ
ネルギー転移配置中に存在する。好ましくは、更なるリンカーを使用し、第三色
素を、Ｄ_２および生物学的物質の両方に結合可能なＬ_２に結合させる。

【００４３】更なる態様では、本発明は、式(Ｉ)のエネルギー転移色素を含む生物学的物質
に関係する。

【００４４】適当な生物学的物質には、限定されないが、抗体、抗原、ペプチド、タンパク
質、炭水化物、脂質、ペプチド核酸(ＰＮＡ)ヌクレオチド、オキシまたはジオキ
シリボポリ核酸、Koshkin et al., Tetrahedron Letters 1998 39: 4381-4384に
記載のようなLocked Nucleic Acids(LNA)および誘導され得る細胞であって、必
要ならば、エネルギー転移色素の結合に適当な１以上の基、例えばアミノ、ヒド
ロキシ、チオホスホリル、メルカプト(sulphydryl)またはカルボキシ基が含まれ
る細胞が含まれる。

【００４５】他の態様では、本発明は、式(II)

【化１０】のエネルギー転移色素を提供する。

【００４６】好ましくは、この型の配置では、Ｄｙｅ１はドナー色素としての役割をし、キ
サンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサンチ
ンまたはシアニンの何れかの適当な色素は上記のように考察されている。更にこ
の型の配置Ｄｙｅ２はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ロー
ダミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。また好ましくは、アリ
ール環は、鎖(Ｃ＝Ｃ)を含むエチレン基または鎖(Ｃ＝Ｃ)を含むアセチレン基の
ような飽和または不飽和側鎖で置換され得る。

【００４７】ｎ１、ｎ２およびｎ３は、連結原子の鎖であり、その場合、当該原子は、炭素
、酸素、リン、窒素および硫黄からなる群から選択される。好ましくは、ｎ１、
ｎ２およびｎ３はＮＨである。

【００４８】更なる態様では、本発明は、式(III)

【化１１】のエネルギー転移色素を提供する。

【００４９】好ましくは、この型の配置では、Ｄｙｅ１は、ドナー色素としての役割をし、
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Ｄｙｅ２はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。

【００５０】更なる態様では、本発明は、式(IV)

【化１２】のエネルギー転移色素を提供する。

【００５１】好ましくは、この型の配置では、Ｄｙｅ１は、ドナー色素としての役割をし、
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Ｄｙｅ２はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。

【００５２】更なる態様では、本発明は、式(V)

【化１３】のエネルギー転移色素を提供する。

【００５３】好ましくは、この型の配置では、Ｄｙｅ１は、ドナー色素としての役割をし、
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Ｄｙｅ２はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。更なる態様は、配置IIに
記載するように含まれている。

【００５４】更なる態様では、本発明は、式(VI)

【化１４】のエネルギー転移色素を提供する。

【００５５】好ましくは、この型の配置では、Ｄｙｅ１は、ドナー色素としての役割をし、
キサンチンまたはシアニンからなる群から選択されるこれら色素を含む。キサン
チンまたはシアニンの何れかの適当な色素を上記で考察した。更に、この型の配
置では、Ｄｙｅ２はレシピエント色素としての役割をし、上記のような基ローダ
ミンまたはシアニンから選択されるこれら色素を含む。基‘ｎ１’は好ましくは
１から１０の結合炭化水素、および更なる態様では‘ｎ１’は１に等しい。更な
る態様は、配置IIに記載するように含まれている。

【００５６】更なる態様では、本発明は、好ましくは、少なくとも５つのカップリング反応
を用い本発明のエネルギー転移色素を調製する方法を提供する： (i)Ａを化合物Ｌ_２にカップリングさせること、 (ii)反応(i)の生成物を、Ｄ_１との結合の形成に適当な反応基により置換さ
れるＬ_１とカップリングさせること、 (iii)反応(iii)の生成物をＤ_１とカップリングさせること、 (iv)Ｌ_２が、Ｄ_２および生物学的分子との結合の形成に適当な反応基により
置換されるように、反応(iii)の生成物を反応させること、 (v)(iv)の生成物をＤ_２とカップリングさせること。

【００５７】他のカップリング段階を同じ目的に使用し得ることは、当業者にとって容易に
明白である。他には、例えば、段階ｉおよびｉｖにおいてＤ_１をＤ_２と置換し得
る。

【００５８】本エネルギー転移色素およびこれら色素の種々部分の結合に関して、“カップ
リング”なる語は、２つの部分を連結、例えば、色素部分をエネルギー転移色素
のＬ_１−Ａ−Ｌ_２部分と連結する共有結合の形成について言及する。“反応する
”なる語は、容易に共有性対分子(covalent partner molecule)に結合し得る反
応基を形成する基または部分の付加または除去について言及する。

【００５９】１つのカップリング反応に加わる任意の部分において幾つかの反応基が存在し
得るため、封鎖されるかまたは保護され、次いで一連の反応の後の方の適当なと
きに、脱保護される反応に加わらないものを必要とし得る。

【００６０】当該色素は、Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２基とのカップリング反応に適当な置換基を通常含
むか、またはその基を含むように修飾される。例えば、ヨードアセトアミドは、
キサンチン色素に適当な置換基であり、マレイミドは、シアニン色素に適当な置
換基である。

【００６１】当該蛍光性エネルギー転移色素を使用し、ポリマー粒子、細胞、ガラスビーズ
、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質およびヌクレオチドまた
は核酸(ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ(Locked Nucleic Acids, "Novel convenient Sy
ntheses of LNA [2.2.1]Bicyclo-Nucleosides", Koshkin et al., Tetrahedron
Letters 39: 4381-4384(1998))およびＲＮＡ)、ならびに標識複合体(または上記
のように複合体において反応基と共有結合を形成し得る官能基)における官能基
と共有結合を形成し得る少なくとも１つの反応基、および抗体、細胞、薬物、抗
原、細菌、ウイルスおよび他の微生物のような標的生物学的化合物に特異的であ
り、かつ当該標的生物学的化合物と共有結合を形成し得る少なくとも１つの第二
反応基(または場合により官能基)を含むかまたは含むように誘導された類似体の
ような担体物質に色素を共有結合することにより試薬を形成し得る。

【００６２】当該担体が官能基を有するとき、官能基は、抗原または相補的ＤＮＡ配列への
それぞれ結合に適当な抗体またはＤＮＡであり得る。担体物質が、反応基である
とき、当該担体は、例えばＤＮＡまたは抗体への結合に適当なポリマー粒子また
は抗原であり得る。蛍光色素を、上記のような担体物質に共有結合する技術は、
当分野に既知であり、本文献において容易に利用し得る。

【００６３】当該担体物質は、更に、アミノ、メルカプト、カルボキシ、カルボニルまたは
ヒドロキシ基の１つを含むように誘導したヌクレオチド、およびアミノ、チオホ
スホリル、メルカプト、カルボキシル、カルボニルまたはヒドロキシル基の１つ
を含むように誘導したオキシまたはデオキシ−リボポリ核酸または核酸を含み得
る。

【００６４】本発明の標識複合体の反応基と相補的、すなわち共有結合を形成し得る担体物
質における官能基には、アミノ、カルボキシル、カルボニルおよびヒドロキシル
基が含まれる。

【００６５】本発明は、第一段階で、本発明のエネルギー転移色素を、第一部分と共有結合
させそれにより第一部分を標識し、次いで標識第一部分を使用して第二部分と結
合させ、標識第二部分を形成する標識過程にも関係する。適当には、第一部分は
、特異的結合対(特異的結合パートナー)の１つのメンバーであり得る。次いで、
当該手順の第二段階では、蛍光性標識特異的結合パートナーを、特定親和性を有
する特異的結合対(第二部分)の第二メンバーへの結合にプローブとして使用する
。

【００６６】特異的結合対には、リガンドおよびレセプターと任意に呼ばれる広く種々の分
子が含まれる。そのリガンド−レセプター対の例には、抗体および抗体が特異的
である相当する抗原が含まれる。標識された抗体の標的が細胞であるとき、当該
手順の第二段階を使用し、細胞の蛍光密度を決定することによりその型の細胞に
結合する標識抗体の量を決定する。この手順により、第一段階で本発明の蛍光化
合物で共有結合性標識されたモノクローナル抗体およびおよび他の部分を抗原プ
ローブとして使用し得る。

【００６７】多くの他の例が当業者に既知である。そのため、更なるリガンド−レセプター
対には、例えば、ビオチン−(ストレプト)アビジン、ホルモン、レセプター−ホ
ルモン、ＤＮＡ−相補性ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−結合タンパク質、酵
素基質などが含まれる。特異的結合親和性を有する任意の２つの分子が用い得、
そのため、本発明のエネルギー転移色素は、次いで、相補的メンバーの検出に使
用し得る特異的結合対の１つのメンバーの標識に使用され得ることが理解し得る
。

【００６８】更なる態様では、本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡシーケンシン
グターミネーターに結合するエネルギー転移色素を含む容器中のＤＮＡ分子にハ
イブリダイズし得るプライマー分子とアニーリングしたＤＮＡ分子をインキュベ
ーションする段階からなり、その場合、当該結合は、色素とヌクレオチドの間は
少なくとも５およびより好ましくは少なくとも１０原子のリンカーを伴い、そし
て大きさによってインキュベーション反応のＤＮＡ産物を分離し、それによって
ＤＮＡ分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定し得る、ＤＮＡ分子
のヌクレオチド塩基配列を決定する方法を特徴とする。その方法を実施例IIIに
記載し、図７および８は配列データおよび典型的な一群のエネルギー転移色素タ
ーミネーターを提供する。

【００６９】好ましい態様では、エネルギー転移色素ターミネーターは、５−ＦＡＭ−Ｐｈ
ｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−
ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ
−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−
１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＵＴＰ、５−
ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ
ＯＸ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＧ
ＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−
Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭ
ＲＡ−１１ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＡＴＰ
、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ
−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＧＴＰ、または５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０
−１１ｄｄＣＴＰからなる群から選択された化合物である。

【００７０】１９９８年２月４日付け米国特許出願、標題“Dideoxy Dye Terminator”出願
番号０９／０１８，６９５は(任意の図を含め、引用によりすべてこの文書に加
える)、色素とｄｄＮＴＰとの間のリンカーの長さの重要性について記載する。
種々のリンカーの構成および結合は、当分野によく知られている。リンカー構成
に適当な試薬には、式Ｒ−ＮＨ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＣＯ_２Ｒ’またはＲ−ＮＨ−(Ｃ
Ｈ_２)_ｎ−Ｘ(ＣＨ_２)_ｍ−ＣＯ_２Ｒ’[式中、Ｒは酸性−または塩基性−レービル
保護基であり、Ｒ’は反応性エステルまたは無水基であり、Ｘはアリール、Ｏ、
Ｓ、またはＮＨであり、ｎおよびｍは０−１２である。]の化合物のようなアミ
ノ保護アルキルまたはアリールアミノ酸の活性型からなる１以上の化合物が含ま
れる。Ｎ−またはＯ−またはＳ−アルキル化により構成される他のリンカーも適
当である。特定色素およびジデオキシヌクレオチドの組合せのための厳密な長さ
は、ＤＮＡシーケンシングにおけるバンド均一性をモニターすることにより経験
的に決定し得る。

【００７１】本発明の他の特徴および利点は、下記の好ましい実施態様および特許請求の範
囲から明白となる。

【００７２】好ましい実施態様の記載本発明は、蛍光性エネルギー転移(ドナー−アクセプターエネルギー転移)を示
す新規エネルギー転移色素に関係する。これら新規エネルギー転移色素は、広範
囲の種々のアッセイまたは視覚化システムに適合する特定励起および放出波長に
同調させ得る。核酸またはタンパク質のような部分間の分子ハイブリダイゼーシ
ョンのようなアッセイ、または小細胞内容物のシーケンシングまたは電気泳動の
ような手順。

【００７３】本発明のエネルギー転移色素は、マルチパラメーター分析に特に有用である価
値ある一群の蛍光標識を提供し、重要なことには、細胞構造を通過する蛍光性複
合体で標識される物質として認められる十分低い分子量となる。そのため、当該
色素は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＲＮＡプローブによる使用に充
分適する。マルチパラメーター分析は、複数サンプルにおいて、標的生物学的化
合物の存在を検出し得る。各サンプルは、エネルギー転移色素を用いる既知標識
方法により標識される。

【００７４】例えば、標的生物学的化合物を含むよう懸濁した１つのサンプル(サンプル１)
を、フルオレセイン、カスケードブルー、ＢＯＤＩＰＹ色素、または１つのモノ
メチン厳密化色素(monomethine rigidized dyes)、またはＣＹ３(ＳＯ_３)_２、こ
れらはすべて５００−５７５ｎｍ波長の範囲(緑から橙色)で放出する、のような
単一蛍光色素と共にインキュベーションする。標的生物学的化合物を含むように
懸濁した第二サンプル(サンプル１と同じ化合物または異なる化合物)を、本発明
のエネルギー転移色素、例えば、Ｎ−５−テトラメチル−ローダミン−ｐ−プロ
パルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラニン(４９０ｎｍの光を吸収し、
選択ローダミン色素に依存して５２５ｎｍ−６０２ｎｍの範囲で蛍光を放出する
)と共にインキュベーションする。他の標的化合物を含むように懸濁した更なる
サンプルを、同じアッセイで既に使用した色素とは異なる吸収および放出スペク
トルを有する本発明の他の色素と共にインキュベーションする。標的化合物と結
合する蛍光性標識し得る適当期間後、非結合標識を洗浄により除去し、標識サン
プルを混合する。

【００７５】検出は、単一波長励起源、すなわち、レーザーライン４８８ｎｍで可能である
。各種々の標識サンプルは、特定標識の放出波長で異なる色の蛍光性を有し、個
々の標識により互いに識別される。

【００７６】当業者ならば、本発明の蛍光エネルギー転移標識色素を、直接的および間接的
イムノアッセイを含む種々の免疫蛍光技術および他の既知の蛍光検出法に使用し
得ると認識される。各標識反応の条件、例えば、ｐＨ、温度および時間が当分野
に知られているが、一般的に室温が好ましい。ｐＨは、既知技術により特定反応
基に最適な反応条件に基づき調節される。

【００７７】本発明のエネルギー転移色素およびそれらから作成され得る試薬により、広い
ストークスシフトを有する広範囲の種々の蛍光標識が提供される。感度の限界に
おけるノイズに対するシグナルの割合を最大とするために、色素の当該ストーク
スシフトをできる限り大きくし、励起源からのノイズの測定を最小にする。１０
０ｎｍよりも大きいストークスシフトを有する色素の利用には非常に限界がある
。利用可能な色素の有用性を更に制限するためには、大きなストークスシフトを
有する殆どの色素が水に不溶性であるため水溶性サンプル中の当該色素の可溶性
が問題となり得る。小さなストークスシフトを有する色素の問題は、励起源から
光を透過する(filter out)モノクロメーターまたは効果な光学機器の使用による
フルオロメーターの工学において通常克服される。しかし、透過による光密度の
喪失を克服するために、例えば、あるものでは、高パワーの光源の使用を必要と
する。これら光源は、ヒートシンクまたはファンを用いる機器において放散しな
ければならない熱を生ずる。

【００７８】粒子中にまたは粒子上に組み込まれる蛍光性色素分子は、互いにおよび粒子の
マトリクスに色素を極めて近接させるため蛍光消失(fluorescence quenching)が
見られる。当該色素は、ドナー−アクセプターエネルギー転移し得る互いからの
エネルギー交換距離のＥＴ−カセットに位置付けられる。更に、アリールリンカ
ーは、フルオロホア間の特定距離の提供に適合する強固なバックボーンを提供す
る。更に、このリンカーは、ＥＴ−カセットを広範囲の種々の生物学的分子、上
記ような種々のものに結合し得る。

【００７９】当業者は、本発明の色素が広範囲の可視スペクトルを超えて種々の蛍光適用に
使用し得ると認める。また、当業者は、蛍光エネルギー転移を示す１以上の色素
対を種々の波長の蛍光を発する化合物のクラスにおいて生じる分子中にまたは分
子において組み込まれ得ると認識し得る。更に、本明細書に記載の発明性の技術
により、吸収体から、アクセプター(蛍光を発する)への中間体ドナーへのエネル
ギー転移のカスケードを同時に提供する、３以上の色素の分子中または分子上へ
の組み込みから、非常に長いストークスシフトを有する化合物の生成が生じ、ほ
ぼ非制限的な種々の励起および放出特性を有する化合物を生成し得る。

【００８０】実施例下記実施例は、本発明のエネルギー転移色素の調製を解説するための役割をす
る。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

【００８１】実施例１：ＦＭＡフェニルアラニン−リンカーローダミンエネルギー転移カセッ
トの調製１．１)Ｎ−Ｂｏｃ−ｐ−Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトアミド−Ｌ−フ
ェニルアラニンの調製Ａｒ気流中、無水ＤＭＦ(２０ｍｌ)中のＮ−Ｂｏｃ−ｐ−ヨード−Ｌ−フェニ
ルアラニン(１．０ｇ、２．５５ｍｍｏｌ)およびＣｕＩ(９７ｍｇ、０．５１ｍ
ｍｏｌ、０．２ｅｑ)の攪拌懸濁液に、Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトア
ミド(１．１６ｇ、７．６７ｍｍｏｌ、３ｅｑ)、トリエチルアミン(０．７１ｍ
Ｌ、５．１ｍｍｏｌ、２ｅｑ)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)Ｐｄ(
０)(２９５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ)を加えた。当該反応は、６時間続けた。次い
で、当該反応混合物を１：１ＭｅＯＨ−ＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、ＡＧＩＸ８樹脂
(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)で１５分間処置し、次いで、濾過し、当該樹脂を１：１ＭｅＯ
Ｈ−ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。当該合せた濾液を減圧下で濃縮し、得られた残渣
をカラムクロマトグラフィーのシリカゲルに吸収させた。ＣＨＣｌ_３中の５−１
５％ＭｅＯＨによる溶出からＮ−Ｂｏｃ−ｐ−Ｎ−プロパルギルトリフルオロア
セトアミド−Ｌ−フェニルアラニンを得た。

【化１５】

【００８２】１．２)Ｎ−Ｂｏｃ−ｐ−プロパルギルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの調製ＭｅＯＨ(５ｍｌ)中のＮ−Ｂｏｃ−ｐ−Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセト
アミド−Ｌ−フェニルアラニン(５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ)の攪拌溶液に、３
０％ＮＨ_４ＯＨを加え、４時間インキュベーションした。次いで、減圧下で蒸発
させ、Ｎ−Ｂｏｃ−ｐ−プロパルギルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンを得た。

【化１６】

【００８３】１．３)ｐ−プロパギルアミド−５ＦＡＭ−フェニルアラニンの調製室温、Ａｒ気流中、無水ＤＭＳＯ(３ｍｌ)中のＮ−Ｂｏｃ−ｐ−プロパギルア
ミノ−Ｌ−フェニルアラニン(３３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ)の攪拌溶液に、ジイ
ソプロピルエチルアミン(２７６ｍｌ、１．５８ｍｍｏｌ、１５ｅｑ)およびＤＭ
ＳＯ溶液１ｍｌおよび５ＦＡＭ−ＮＨＳエステル(６０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ
、１．２ｅｑ)を加えた。室温で４時間後、当該反応混合物に、逆相カラムのＨ
ＰＬＣを行い、０．０５％水性ＴＦＡからＣＨ_３ＣＮ中の０．０５％ＴＦＡへの
勾配で３０分間で溶出させた。５ＦＡＭ標識Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を
乾燥させ、Ｎ−Ｂｏｃ−ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラ
ニンを提供した。この化合物を１：１水性ＴＦＡの氷冷溶液に加え、１時間室温
で攪拌し、ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラニンを生成し
た。

【化１７】

【００８４】１．４)ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラニンをＮ−５ロ
ーダミン−ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−フェニルアラニンへの変換の手
順(図１) ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラニン(１５ｍｇ、０．
０３ｍｍｏｌ)をＡｒ気流中無水ＤＭＳＯ(２ｍｌ)に溶解し、室温で攪拌した。
無水ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン(６８ｍｌ、０．３９
ｍｍｏｌ、１５ｅｑ)および５−ローダミン色素ＮＨＳ−エステル(０．３９ｍｍ
ｏｌ、１．２ｅｑ)を当該溶液に加えた。１−２時間後、当該溶液に、逆相Delta
Pak C18カラム(１．９×３０ｃｍ)のＨＰＬＣを行い、０．１ＭＴＥＡＡから
ＣＨ_３ＣＮへの勾配で、２０ｍｌ／ｍｉｎ、３０分間溶出した。ＥＴ−カセット
を含む画分を減圧下で濃縮した。

【００８５】実施例２：ジデオキシヌクレオチドに結合したエネルギー転移色素(５ＦＡＭ−
ＲＯＸ−Ｐｈｅ−１１−ｄｄＣＴＰ)の調製(図１および３) Ｎ−５ＲＯＸ−ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラニンの
攪拌溶液にＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネートおよびＤＭＡＰの無水Ｔ
ＨＦ溶液を加えた。２０分後、相当するＮＨＳエステルを形成し、エステルを、
緩衝液(ｐＨ８．５)に溶解した５−(Ｎ−プロパルギル−６−アミノカプロイル(
aminocaproyl))ｄｄＣＴＰと結合させた。室温で１時間の攪拌後、溶媒および緩
衝液を減圧下で除去し、得られた残渣を、ＳｉＯ_２ゲルウォーターアスピレータ
ーバキュームカラムクロマトグラフィーを用い、ＭｅＯＨに対するＣＨＣｌ_３中
のＭｅＯＨを２：８から１：１として溶出させ、それにより遊離色素およびＮ−
ヒドロキシスクシンイミド不純物を除去するとにより、精製した。画分を逆相Ｈ
ＰＬＣ法により更に精製した。エネルギー転移色素結合の蛍光性促進が、単一Ｒ
ＯＸ−標識ｄｄＣＴＰの８．２５倍となった。

【００８６】デオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのような他の生物学的分子が
、上記方法に従い本発明の相当するＮＨＳエステルに結合し、本明細書に提供し
た図中の例示のような化合物を生成することが、上記実施例を使用し明らかとな
った。

【００８７】実施例３：エネルギー転移色素標識したジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
トを用いるＤＮＡのシーケンシング(図７) Ｍ１３ｍｐ１８鋳型ＤＮＡの配列を標準“−４０”プライマーを用い作成した
。当該反応混合物(２０μｌ)には、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰお
よびｄＴＴＰ、１０００μＭｄＩＴＰ、３１０ｎＭ５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−
ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＧＴＰ、１４０ｎＭ５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１
０−１１−ｄｄＡＴＰ、２７５ｎＭ５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ６Ｇ−１１−
ｄｄＴＴＰ、４１０ｎＭ５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ
、２ｐｍｏｌ −４０プライマー、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ２００ｎｇ、Thermo S
equenase II(Amersham Pharmacia Biotech)２０ユニット、Thermoplasma acidop
hilum無機性ピロホスファターゼ０．０００８ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＬｐＨ８．５、３５ｍＭＫＣｌおよび５ｍＭＭｇＣｌ_２を含めた。

【００８８】反応混合物を、９５℃ ３０秒、６０℃ ６０秒の２５サイクルのサーマルサー
キュラーでインキュベーションした。サイクリング後、当該反応生成物を標準的
な手順を用いエタノールで沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディングバッフ
ァーに再懸濁した。当該サンプルをApplied Biosystems model 377機器にロード
し、その結果を標準ソフトウェア法を用い分析した。

【００８９】本発明の他のエネルギー転移色素が、相当するＤＮＡターミネーターに結合し
、シーケンシング反応に使用されることが、上記実施例を使用し明らかとなった
。

【００９０】本明細書中のすべての特許および刊行物により、本発明に該当する分野の当業
者の技術レベルが示される。本開示において引用するすべての参考文献を、それ
ぞれの参考文献をすべて個々に引用することにより加えるかのように、引用によ
りこの文書に加える。

【００９１】当業者は、本発明が目的を達成し、記述の目的および利点、ならびにそれに固
有のものが得られるように適合されることを容易に認識する。好ましい実施態様
の典型として記載する当該色素、置換基および標的物質を例示し、本発明の範囲
の制限を目的とするものではない。本明細書の変化および他の使用は、当業者が
行うことができ、本発明の精神の中に含まれ、特許請求の範囲により定義される
。

【００９２】種々の置換基および修飾により、本発明の範囲および精神から出発することな
く、本明細書に開示の本発明を創造し得ることが当業者にはには容易に判る。例
えば、当業者は、本エネルギー転移色素が種々の異なる色素部分、リンカー、結
合基、および反応基に組み込まれ、種々の異なる標的物質結合し得ることを容易
に認識する。そのため、更なる実施態様は、本発明の範囲および特許請求の範囲
内である。

【００９３】本明細書に適当に解説的に記載した本発明は、任意の要素または要素群、制限
または制限群(それらは特に開示しない)の非存在下で実施し得る。そのため、例
えば、本明細書の各例で、任意の“含む”、“本質的に…からなる”および“か
らなる”なる語は、何れか他の２つの語と置換され得る。用いている語および表
現を記述の語として使用し、制限せず、見られるおよび記載された任意の均等な
特徴またはその一部を排除する語および表現の使用を目的としたものではないが
、種々の修飾が、請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。その
ため、本発明は、好ましい実施態様および所望の特徴により特別に開示されるが
、本明細書に開示の修飾および種々の観念が当業者の頼りとなり得、その修飾お
よび変化は、添付の請求項により定義される本発明の範囲内にあると、理解すべ
きである。

【００９４】加えて、本発明の特徴または態様をマーカッシュグループまたは代わりの他の
グループに関して記載する場合、本発明はマーカッシュグループまたは他のグル
ープの任意の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーに関しても記載され
ると当業者は認識する。

【００９５】そのため、更なる実施態様は本発明および特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の、エネルギー転移(ＥＴ)色素ターミネーターカ
セット、Ｎ−５ＲＯＸ−ｐ−プロパルギルアミド−５ＦＡＭ−Ｌ−フェニルアラ
ニン−１１−ｄｄＣＴＰ(５ＦＡＭ−ＲＯＸ−Ｐｈｅ−１１−ｄｄＣＴＰ)および
他のターミネーターを調製する反応の概要である。

【図２】ブルーＥＴ色素ターミネーターの表である。

【図３】図３ａ、ｂおよびｃは、ＥＴ色素ターミネーター５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰの化学的構造(３ａ)および蛍光共鳴エネル
ギー転移データ(３ｂ、ｃ)である。

【図４】図４ａ、ｂおよびｃは、ＥＴ色素ターミネーター５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＵＴＰの化学的構造(４ａ)および蛍光共鳴エネル
ギー転移データ(４ｂ、ｃ)である。

【図５】図５ａ、ｂおよびｃは、ＥＴ色素ターミネーター５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＧＴＰの化学的構造(５ａ)および蛍光共鳴エ
ネルギー転移データ(５ｂ、ｃ)である。

【図６】図６ａ、ｂおよびｃは、ＥＴ色素ターミネーター５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−Ｒ１１０−ｄｄＡＴＰの化学的構造(６ａ)および蛍光共鳴エネルギー
転移データ(６ｂ、ｃ)である。

【図７】図７は、本明細書で開示のエネルギー転位色素を用いるＤＮＡ分
子のシーケンシングデータの結果である。

【図８】図８は、一群の、４色のブルー−エネルギー転位色素ターミネー
ターである。当該図は、常に一定の縮尺ではなく、本発明のある部分は縮尺で誇張され、明
瞭および簡潔の目的で概要図で示している。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月２３日（２０００．１１．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】の化合物。

【化２】の化合物。

【化３】の化合物。

【化４】の化合物。

【化５】の化合物。

【化６】 [式中、Ｆ^１は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、Ｆ^２は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、Ｂは、１から３０結合原子を含む１以上のアルキル、アリールまたはヘテロアリ
ール基であり、当該基には、１以上の−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−およびフェニル基が含まれ、当該基は、Ｃ_１−４直鎖状または分枝状アル
キル、ヒドロキシル、ハロ、およびフェニルからなる群から選択され、Ｍ^３には、水素、または標的物質へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反
応もしくは官能基が含まれ、そしてＤには、リンカー基Ｂに対するＦ^２の結合に適合させた原子または基が含まれる
。] のエネルギー転移カセット。

【化７】 [式中、Ｐ^１は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、Ｐ^２は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、Ｒ^４は、ハロゲンまたはＣ_１−４アルキルであり、Ｒ^５は、ヒドロキシル、ハロ、メチルまたはエチルであり、Ｎ^１は、炭素、窒素、酸素、−ＣＨ＝ＣＨ−、およびＣ＝Ｃ−から独立して選択
される１から１０の原子を含む連結基であり、Ｓ^３は、水素、または標的へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反応もし
くは官能基である。] のエネルギー転移色素。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０９Ｋ 9/02 Ｃ０９Ｋ 9/02 Ｚ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ４Ｈ０５６Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 21/78 ＣＧ０１Ｎ 21/78 Ｃ０７Ｄ 407/14 // Ｃ０７Ｄ 407/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 800 ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌＡｖｅｎｕｅ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ 08855−1327，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ (72)発明者サティアム・ナムパリアメリカ合衆国44124オハイオ州メイフィールド・ハイツ、ソム・センター・ロード 1414番 (72)発明者マヘッシュ・コットアメリカ合衆国44106オハイオ州クリーブランド、シーダー・ロード12495番Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB25 CB01 DA12 DA13 DA14 DA35 DA50 FA11 FB02 FB03 FB07 FB11 FB12 GC12 GC15 2G054 AA08 AB07 BB08 CA22 CA23 CE02 EA03 GA04 GB02 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR32 QR42 QR56 QR62 QS03 QS34 QS36 QX02 4C063 AA05 BB07 CC79 DD31 EE10 4H045 AA10 AA20 AA30 BA70 EA50 FA41 4H056 BA03 BB05 BC01 BD05 BF09F BF35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための２から３０の結合原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の結合原子の群に結合するように適合した２から３０の結合原子の群が含まれ
る。] のエネルギー転移色素。
【請求項２】当該芳香族環がフェニル環である、請求項１のエネルギー転
位色素。
【請求項３】Ａには、１以上のアリール環が含まれる、請求項１のエネル
ギー転移色素。
【請求項４】Ｌ_１には、１以上の芳香族環が含まれる、請求項１のエネル
ギー転位色素。
【請求項５】当該芳香族環がフェニル環である、請求項４のエネルギー転
移色素。
【請求項６】Ｌ_１には、１以上の複素環が含まれる、請求項４のエネルギ
ー転移色素。
【請求項７】Ｌ_２には、１以上の芳香族環が含まれる、請求項１のエネル
ギー転位色素。
【請求項８】Ａには、１以上のヘテロアリール基に連結する第一直鎖状炭
化水素鎖が含まれ、当該ヘテロアリール基は更に第二直鎖状炭化水素鎖が含まれ
る、請求項１のエネルギー転移色素。
【請求項９】Ｄ_１は、キサンチン色素およびシアニン色素からなる群から
選択され、Ｄ_２はローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択される
、請求項１のエネルギー転移色素。
【請求項１０】Ｄ_１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｄ_１によりエ
ネルギーがＤ_２へ転移され得る、請求項９のエネルギー転移色素。
【請求項１１】Ｄ_２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項９のエネルギー転移色素。
【請求項１２】リンカー基を介してＬ_２に結合した第三色素が更に含まれ
、当該結合により、Ｄ_２を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請
求項１のエネルギー転移色素。
【請求項１３】更なるリンカー基を介してＬ_２に結合した第三色素が更に
含まれ、当該結合により、Ｄ_２を伴うカスケードエネルギー転移配置または当該
第三色素を生ずる、請求項１のエネルギー転移色素。
【請求項１４】当該第三色素がシアニン色素である、請求項１２のエネル
ギー転移色素。
【請求項１５】当該第三色素がシアニン色素である、請求項１３のエネル
ギー転移色素。
【請求項１６】式【化１】の化合物。
【請求項１７】式【化２】の化合物。
【請求項１８】式【化３】の化合物。
【請求項１９】式【化４】の化合物。
【請求項２０】式【化５】の化合物。
【請求項２１】Ｄｙｅ＃１は、５−カルボキシフルオレセイン、６−カル
ボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−
ジメトキシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エ
チル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキ
シペンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)およびＣｙ５(１−(ε−カルボキシペン
チル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５’−ジスル
ホネート−ジカルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄｙｅ＃１によりＤ
ｙｅ＃２へエネルギーが転移され得る、請求項１６−２０の何れかの化合物。
【請求項２２】Ｄｙｅ＃２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１
１０−５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキ
シローダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン
−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５
−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシロ
ーダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カ
ルボキシ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−
１’−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート
−カルボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル
−３，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネ
ート)ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカ
ルボシアニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
−ジベンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)
−１’−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート
−トリカルボシアニンからなる群から選択され、Ｄｙｅ＃２によりＤｙｅ＃１へ
エネルギーが転移され得る、請求項１６−２０の何れかの化合物。
【請求項２３】５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＵＴＰ、５
−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−
ＲＥＧ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＧＴ
Ｐ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ
−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄ
ｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−
Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭ
ＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＣ
ＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−
１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＧＴＰ、ま
たは５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１ｄｄＣＴＰからなる群から選択さ
れる、エネルギー転移色素ターミネーター。
【請求項２４】式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための４から３０の結合原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の原子の群に結合するように適合した４から３０の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を製造する方法であって、 (ａ)Ａを化合物Ｌ_２にカップリングさせること、 (ｂ)反応(ａ)の生成物を、Ｄ_１との結合の形成に適当な反応基により置換さ
れるＬ_１とカップリングさせること、 (ｃ)反応(ｂ)の生成物をＤ_１とカップリングさせること、 (ｄ)Ｌ_２が、Ｄ_２との結合の形成に適当な反応基により置換されるように(
ｃ)の生成物を反応させること、その場合、Ｌ_２の第二部分は生物学的標的への
結合の形成に適当な反応基により置換されており、 (ｅ)(ｄ)の生成物をＤ_２とカップリングさせ、それにより当該結合を形成す
ること、を含む方法。
【請求項２５】 (ａ)式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための４から３０の原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の原子の群に結合するように適合した４から３０の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を、当該生物学的物質を含む液体に添加すること、 (ｂ)当該色素を当該生物学的物質と共有結合的反応および当該生物学的物質を標
識するように当該色素を反応させること、を含む、生物学的物質を蛍光的に標識するための方法。
【請求項２６】当該生物学的物質は、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質
、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、オキシ、デオキシ、またはデオキシリボ核酸
またはポリ核酸、ならびに１以上のアミノ、ヒドロキシ、チオホスホリル、メル
カプト(sulphydryl)またはカルボキシ基が含まれるように所望により誘導された
細胞からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】Ａには、Ｃ_６−Ｃ_１７炭化水素鎖が含まれ、当該炭化水素
鎖には少なくとも１つのヘテロアリール基が含まれる、請求項２５の方法。
【請求項２８】Ｄ_１が、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、Ｄ_２がローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択
される、請求項２５の方法。
【請求項２９】Ｄ_１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｄ_１によりＤ
_２へエネルギーが転移され得る、請求項２８の方法。
【請求項３０】Ｄ_２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項２８の方法。
【請求項３１】当該エネルギー転移色素には、Ｌ_１が、アミノ、カルボキ
シル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオ
シアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スク
シンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネー
ト、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群から
選択される化合物が含まれる、請求項２５の方法。
【請求項３２】当該エネルギー転移色素には、Ｌ_２が、アミノ、カルボキ
シル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオ
シアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スク
シンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネー
ト、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合性反応する基からなる群から
選択される化合物が含まれる、請求項２５の方法。
【請求項３３】当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該Ｌ _２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項２５の方法。
【請求項３４】当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該Ｌ_２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項２５の方法。
【請求項３５】当該第三色素がシアニン色素である、請求項３３の方法。
【請求項３６】当該第三色素がシアニン色素である、請求項３４の方法。
【請求項３７】第一部分を蛍光的に標識し、次いで、サンプルにおける第
二部分の存在の検出に当該標識第一部分を用いる方法であって、 (ａ)式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための２から３０の原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の原子の群に結合するように適合した２から３０の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素を当該第一部分を含む液体に加えること、 (ｂ)当該色素を当該第一部分と共有結合的に反応させそれにより当該第一部分を
標識するために、当該第一部分と当該色素を反応させること、 (ｃ)当該サンプルに当該標識第一部分を提供し、存在するならば当該第二部分に
当該標識第一部分を結合し得ること、 (ｄ)存在するならば、光学的方法による蛍光標識を検出することにより、当該第
二部分を検出すること、を含む、方法。
【請求項３８】Ａには、Ｃ_６−Ｃ_１７炭化水素鎖が含まれ、当該炭化水素
鎖には少なくとも１つのヘテロアリール基が含まれる、請求項３７の方法。
【請求項３９】Ｄ_１が、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、Ｄ_２がローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択
される、請求項３７の方法。
【請求項４０】Ｄ_１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｄ_１によりＤ
_２へエネルギーが転移され得る、請求項３７の方法。
【請求項４１】Ｄ_２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項３９の方法。
【請求項４２】当該標的物質には、生物学的物質が含まれる、請求項３７
の方法。
【請求項４３】Ｌ_１が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、、請求項３７の方
法。
【請求項４４】Ｌ_２が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、請求項３７の方法
。
【請求項４５】当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該Ｌ _２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項３７の方法。
【請求項４６】当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該Ｌ_２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項３７の方法。
【請求項４７】当該第三色素がシアニン色素である、請求項４５の方法。
【請求項４８】当該第三色素がシアニン色素である、請求項４５の方法。
【請求項４９】 (ａ)式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための４から３０の原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の原子の群に結合するように適合した４から３０の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素、 (ｂ)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも１つの反応基、またはエネルギー
転移色素において反応基と共有結合を形成し得、かつ共有結合する官能基を含む
かまたは含むように誘導された担体物質を含む試薬。
【請求項５０】当該担体物質が、ポリマー粒子、細胞、ガラスビーズ、抗
体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質および核酸からなる群から選
択される、請求項４９の試薬。
【請求項５１】当該エネルギー試薬には、Ａにヘテロアリール基が含まれ
る化合物が含まれる、請求項４９の試薬。
【請求項５２】Ｄ_１は、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる
群から選択され、当該Ｄ_２はローダミン色素およびシアニン色素からなる群から
選択される、請求項４９の試薬。
【請求項５３】Ｄ_１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｄ_１によりエ
ネルギーがＤ_２へ転移され得る、請求項５２の試薬。
【請求項５４】Ｄ_２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項５２の試薬。
【請求項５５】当該標的物質には、生物学的物質が含まれる、請求項４９
の試薬。
【請求項５６】Ｌ_２が、アミノ、カルボキシル、スクシンイミジルエステ
ル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよび
ホスホラミダイト、ならびにカルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ
−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラ
ミダイトと共有結合性反応する基からなる群から選択される、請求項４９の試薬
。
【請求項５７】当該エネルギー転移色素には、リンカー基を介して当該Ｌ _２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該第三色
素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項４９の試薬。
【請求項５８】当該エネルギー転移色素には、更なるリンカー基を介して
当該Ｌ_２に結合する第三色素が更に含まれ、当該結合により当該Ｄ_２を伴う当該
第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、請求項４９の試薬。
【請求項５９】当該第三色素がシアニン色素である、請求項５７の試薬。
【請求項６０】当該第三色素がシアニン色素である、請求項５８の試薬。
【請求項６１】 (ａ)式Ｄ_１−Ｌ_１−Ａ−Ｌ_２−Ｄ_２ [式中、Ｄ_１は、エネルギー転移配置におけるアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素部分であり、Ｄ_２は、当該第一色素を伴うエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプ
ターとして適当である第二色素部分であり、Ａには、５−２０結合原子が含まれ{式中、当該連結原子には、少なくとも１つ
のアリールまたはヘテロアリールが含まれ、当該原子は、炭素、窒素、硫黄、酸
素、リンからなる群から独立して選択される。}、Ｌ_１には、当該Ｄ_１に結合するための４から３０の原子の群が含まれ、Ｌ_２には、当該Ｄ_２、および生物学的標的に結合させるために適合した４から３
０の原子の群に結合するように適合した４から３０の原子の群が含まれる。] のエネルギー転移色素、 (ｂ)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも１つの反応基、またはエネルギー
転移色素において反応基と共有結合を形成し得、かつ共有結合する官能基を含む
かまたは含むように誘導された担体物質を含む結合エネルギー転移色素を伴う、生物学的物質。
【請求項６２】式【化６】 [式中、Ｆ^１は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、Ｆ^２は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、Ｂは、１から３０原子を含む１以上のアルキル基であり、当該原子には、１以上
の−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−およびフェニル基が含まれ、
当該原子は、Ｃ_１−４直鎖状または分枝状アルキル、ヒドロキシル、ハロ、また
はフェニルからなる群から選択され、Ｍ^３には、水素、または標的物質へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反
応もしくは官能基が含まれ、そしてＤには、リンカー基Ｂに対するＦ^２の結合に適合させた原子または基が含まれる
。] のエネルギー転移カセット。
【請求項６３】少なくとも１つのアルキル基がフェニル環である、請求項
６２のエネルギー転移色素。
【請求項６４】Ｂには、１つ以上のアリールまたはヘテロアリール環が含
まれる、請求項６２のエネルギー転移色素。
【請求項６５】Ｆ^１には、１以上の芳香族環が含まれる、請求項６２のエ
ネルギー転移色素。
【請求項６６】当該芳香族環が、フェニル環である、請求項６５のエネル
ギー転移色素。
【請求項６７】Ｆ^１には、１以上の複素環が含まれる、請求項６５のエネ
ルギー転移色素。
【請求項６８】Ｆ^２には、１以上の芳香族環が含まれる、請求項６２のエ
ネルギー転移色素。
【請求項６９】Ｂには、１以上のヘテロアリール基に連結する第一直鎖状
炭化水素鎖が含まれ、当該ヘテロアリール基が、第二直鎖状炭化水素鎖にさらに
連結する、請求項６２のエネルギー転移色素。
【請求項７０】Ｆ^１が、キサンチン色素およびシアニン色素からなる群か
ら選択され、Ｆ^２が、ローダミン色素およびシアニン色素からなる群から選択さ
れる、請求項６２のエネルギー転移色素。
【請求項７１】Ｆ^１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｆ^１によりＦ
^２へエネルギーが転移され得る、請求項７０のエネルギー転移色素。
【請求項７２】Ｆ^２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項７０のエネルギー転移色素。
【請求項７３】リンカー基を介してＦ^２に結合する第三色素が更に含まれ
、当該結合により当該Ｆ^２を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置を生ずる、
請求項６２のエネルギー転移色素。
【請求項７４】更なるリンカー基を介してＦ^２に結合する第三色素が更に
含まれ、当該結合によりＦ^２を伴うカスケードエネルギー転移配置または当該第
三色素を生ずる、請求項６２のエネルギー転移色素。
【請求項７５】当該第三色素がシアニン色素である、請求項７３のエネル
ギー転移色素。
【請求項７６】当該第三色素がシアニン色素である、請求項７４のエネル
ギー転移色素。
【請求項７７】式【化７】 [式中、Ｐ^１は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして
適当な第一色素であり、Ｐ^２は、第一色素を伴うエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプター
として適当な第二色素であり、Ｒ^４は、ハロゲンまたはＣ_１−４アルキルであり、Ｒ^５は、ヒドロキシル、ハロ、メチルまたはエチルであり、Ｎ^１は、炭素、窒素、酸素、−ＣＨ＝ＣＨ−、およびＣ＝Ｃ−から独立して選択
される１から１０の原子を含む連結基であり、Ｓ^３は、水素、または標的へのエネルギー転移色素の結合に適合させた反応もし
くは官能基である。] のエネルギー転移色素。
【請求項７８】 (i)耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに、５−ＦＡＭ−
Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１
１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−Ｆ
ＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＥＧ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯ
Ｘ−１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＵＴＰ、
５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５
−ＲＯＸ−１１−ｄｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄ
ｄＧＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ、５−ＦＡ
Ｍ−Ｐｈｅ−５−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＣＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｔ
ＡＭＲＡ−１１ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＡ
ＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＵＴＰ、５−ＦＡＭ−Ｐ
ｈｅ−５−Ｒ１１０−１１−ｄｄＧＴＰ、または５−ＦＡＭ−Ｐｈｅ−５−Ｒ１
１０−１１ｄｄＣＴＰからなる群から選択される式の化合物を含む容器中の当該
ＤＮＡ分子にハイブリダイズし得るプライマー分子とアニーリングしたＤＮＡ分
子をインキュベーションすること、 (ii)大きさによってインキュベーション反応のＤＮＡ産物を分離し、それによっ
て当該ＤＮＡ分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定し得る、段階を含むＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法。
【請求項７９】サンプル中の１以上の分子の存在を決定する方法であって
、当該サンプル中の少なくとも１つの当該分子に特異的な結合パートナーを選択す
ること、当該結合パートナーのそれぞれを、請求項１の個々のエネルギー転移色素へ独立
して連結すること、その場合、Ｄ_１は個々の化合物の各々と同じであり、Ｄ_２は
異なる、当該サンプルを伴う式１の個々化合物に独立して連結する、当該結合パートナー
を混合すること、種々の放出スペクトルに基づき当該分子の存在を決定すること、の段階を含む方法。
【請求項８０】Ｄ_１が、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ
フルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメト
キシフルオレセイン、ＣｙＡ(３−(ε−カルボキシペンチル)−３’−エチル−
５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン)、Ｃｙ２(３−(ε−カルボキシペ
ンチル)−３’−エチル−オキサ−カルボシアニン)およびＣｙ３(３−(ε−カル
ボキシペンチル)−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−５，５
’−ジスルホネート−カルボシアニン)からなる群から選択され、Ｄ_１によりエ
ネルギーがＤ_２へ転移され得る、請求項７９の方法。
【請求項８１】Ｄ_２は、５−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−
５)、６−カルボキシローダミン(ローダミン１１０−６)、５−カルボキシロー
ダミン−６Ｇ(Ｒ６Ｇ−５またはＲＥＧ−５)、６−カルボキシローダミン−６Ｇ
(Ｒ６Ｇ−６またはＲＥＧ−６)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カル
ボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキ
シ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−
エチル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−カル
ボシアニン)、Ｃｙ３．５(３−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３
，３，３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)
ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチ
ル −３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネートジカルボシ
アニン、Ｃｙ５．５(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’−エチル −３，３，
３'，３'−テトラメチル−４，５，４'，５'−(１，３−ジスルホネート)−ジベ
ンゾ−ジカルボシアニン、およびＣｙ７(１−(ε−カルボキシペンチル)−１’
−エチル−３，３，３'，３'−テトラメチル−５，５’−ジスルホネート−トリ
カルボシアニンからなる群から選択され、当該Ｄ_２は、Ｄ_１からエネルギーを受
容することができる、請求項７９の方法。