JP2002518157A - カチオン交換体による分離方法 - Google Patents
カチオン交換体による分離方法Info
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- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/04—Processes using organic exchangers
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Abstract
(57)【要約】
カチオン交換により溶液から化合物を分離する方法。特徴の１つは、使用するカチオン交換体が、多数のリガンドＸ−Ｙ(Ｚ)nを有し、標準的なカチオン交換体と比べて結合化合物の溶出に増加したイオン強度を必要とする。当該リガンドにおいて、ａ)Ｘは−Ｏ−、−Ｓ(Ｒ1)−または−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)−であり、ｂ)Ｙは、１)二重結合を含む５または６員環構造、好ましくは芳香族基、または２)脂環式Ｃ5−Ｃ6基または脂肪族性、直鎖状または分枝状のＣ1−Ｃ3基であって、ＸとＺとの鎖連結が、１または２つのエーテル酸素またはチオエステル硫黄原子によって妨げられている可能性を有しているが但しＸは-Ｏ-または-Ｓ-ではなく、ｃ)Ｚは、カチオン交換基であり、その陰性正味荷電またはプロトン化型を伴い、；そしてｄ)ｎは、０を超える整数である。当該方法は、当該リガンドが正味荷電を有するｐＨで結合が生ずることを更に特徴とする。
Description
【０００１】 有利なリガンドの別のグループは、Ｙが芳香族基(一般的にはベンゼン環(置換
または非置換フェニレン))であるものである。本事例では、ＸおよびＹは相互に
オルト、メタ、またはパラであり得る。とりわけ重要な種類は、ヒドロキシ安息
香酸、スルホサリチル酸またはヒドロキノンスルホネートから誘導されたリガン
ドであり、特にスペーサーへの結合が化合物の環に結合した水酸基の何れかを介
している場合は重要である。 Ｙが脂肪族基である場合、Ｃ2−Ｃ8グループが好ましく、さらにはＣ2−Ｃ6で
あり、好ましくはＣ2-Ｃ4グループであり、そしてこれらのグループは上記のＯ
Ｒ基で置換されていてもよい。この場合、ＹはＣ1グループであり、好ましい例
はＸ=-Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)-であり、式中、Ｒ1またはＲ2の１つは遊離電子対または水
素であり、もう一方はＮから２炭素原子の位置にある１、２または３ＯＲによる
アリルであり、ＲＯは上記定義のとおりである。
または非置換フェニレン))であるものである。本事例では、ＸおよびＹは相互に
オルト、メタ、またはパラであり得る。とりわけ重要な種類は、ヒドロキシ安息
香酸、スルホサリチル酸またはヒドロキノンスルホネートから誘導されたリガン
ドであり、特にスペーサーへの結合が化合物の環に結合した水酸基の何れかを介
している場合は重要である。 Ｙが脂肪族基である場合、Ｃ2−Ｃ8グループが好ましく、さらにはＣ2−Ｃ6で
あり、好ましくはＣ2-Ｃ4グループであり、そしてこれらのグループは上記のＯ
Ｒ基で置換されていてもよい。この場合、ＹはＣ1グループであり、好ましい例
はＸ=-Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)-であり、式中、Ｒ1またはＲ2の１つは遊離電子対または水
素であり、もう一方はＮから２炭素原子の位置にある１、２または３ＯＲによる
アリルであり、ＲＯは上記定義のとおりである。
【０００２】 本発明に使用されるカチオン交換体は、pＨ２-１２の間での、リボヌクレアー
ゼ、キモトリプシノーゲンＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、小麦-胚レクチンそ
してβ-ラクトグロブリンから選択される１つまたはそれ以上のタンパク質用で
あり、イオン交換基がスルホネート(-ＳＯ3-)でありそしてベースマトリクス、
スペーサーおよび置換度は同じであるがＸ基とＹ基が存在しない参照イオン交換
体上の同様のタンパク質で必要とされる最大溶出イオン強度と比較すると、より
高い、好ましくは２５％以上高い、さらに４０％以上でありそしてさらには１０
０％高い最大溶出イオン強度を示す。
ゼ、キモトリプシノーゲンＡ、シトクロムＣ、リゾチーム、小麦-胚レクチンそ
してβ-ラクトグロブリンから選択される１つまたはそれ以上のタンパク質用で
あり、イオン交換基がスルホネート(-ＳＯ3-)でありそしてベースマトリクス、
スペーサーおよび置換度は同じであるがＸ基とＹ基が存在しない参照イオン交換
体上の同様のタンパク質で必要とされる最大溶出イオン強度と比較すると、より
高い、好ましくは２５％以上高い、さらに４０％以上でありそしてさらには１０
０％高い最大溶出イオン強度を示す。
【０００３】 本発明の最も重要な態様は、陽性荷電化合物を溶液から分離するプロセスであ
る。このプロセスは、溶液がカチオン交換体と接触し、１つまたはそれ以上の陽
性荷電化合物がカチオン交換体など(所望により、溶出／吸着結合化合物)と結合
することを含む。関係する化合物は主として生体分子であり、特にタンパク質な
ど両性のものである。 このプロセスの特色となる特徴は、(a)カチオン交換体が式(I)に基づいており
、そして上記の同様の手法における参照スルホネートカチオン交換体について、
より高い最大溶出イオン強度を有する、そして(b)カチオン交換体と陽性荷電化
合物間の結合がpＨ値２-１４の区間内でおこり、ここでリガンド(-Ｘ-Ｙ(-Ｚ)n)
の相当部分、好ましくはその全部が陰性正味荷電を有する。n＝２またはそれ以
上のリガンドでは、リガンドが陰性正味荷電を有しているが、最大正味荷電(n＝
２またはそれ以上)ではないpＨで、吸着ステップを行なうのが好ましいであろう
。 この種類のカチオン交換体の選択は、同じpＨ値で上述の対照イオン交換体か
ら化合物を溶出するときに必要とされる溶出イオン強度より、より高いイオン強
度で、結合がしばしば起こり得ることを示す。対照は、pＨおよび他の条件を同
じにして用いられる。
る。このプロセスは、溶液がカチオン交換体と接触し、１つまたはそれ以上の陽
性荷電化合物がカチオン交換体など(所望により、溶出／吸着結合化合物)と結合
することを含む。関係する化合物は主として生体分子であり、特にタンパク質な
ど両性のものである。 このプロセスの特色となる特徴は、(a)カチオン交換体が式(I)に基づいており
、そして上記の同様の手法における参照スルホネートカチオン交換体について、
より高い最大溶出イオン強度を有する、そして(b)カチオン交換体と陽性荷電化
合物間の結合がpＨ値２-１４の区間内でおこり、ここでリガンド(-Ｘ-Ｙ(-Ｚ)n)
の相当部分、好ましくはその全部が陰性正味荷電を有する。n＝２またはそれ以
上のリガンドでは、リガンドが陰性正味荷電を有しているが、最大正味荷電(n＝
２またはそれ以上)ではないpＨで、吸着ステップを行なうのが好ましいであろう
。 この種類のカチオン交換体の選択は、同じpＨ値で上述の対照イオン交換体か
ら化合物を溶出するときに必要とされる溶出イオン強度より、より高いイオン強
度で、結合がしばしば起こり得ることを示す。対照は、pＨおよび他の条件を同
じにして用いられる。
【０００４】 結合が起こるとき、イオン強度が上記の対応する対照イオン交換体を使用する
場合より少なくとも２５％高く、さらには少なくとも４０％高くなるように(同
じpＨで測定)、本発明のカチオン交換体を選択することができる。必要であれば
、結合は、上記の対応する対照イオン交換体を使用する場合より１００％以上高
いイオン強度で起こり得る(同じpＨで測定)。 絶対値のうち、１５または２０mS/cmを超える、さらには３０mS/cmを超え、そ
して幾らかのケースで４０mS/cmを超えるイオン強度結合で行なわれるのを含み
得る。特定の場合の適当な値は、溶出されるリガンドおよび化合物の選択にかか
っているであろう。 本発明の実施態様の興味ある適用は、高いイオン強度を有する大量の粗生成物
をカチオン交換体に適用しなければならない大スケールプロセスである。一般的
に、対象化合物の、従来のイオン交換体への結合を可能とするためには希釈が必
要である。本発明のプロセスを使用することにより、希釈の必要性が多くの場合
で少なくなる。
場合より少なくとも２５％高く、さらには少なくとも４０％高くなるように(同
じpＨで測定)、本発明のカチオン交換体を選択することができる。必要であれば
、結合は、上記の対応する対照イオン交換体を使用する場合より１００％以上高
いイオン強度で起こり得る(同じpＨで測定)。 絶対値のうち、１５または２０mS/cmを超える、さらには３０mS/cmを超え、そ
して幾らかのケースで４０mS/cmを超えるイオン強度結合で行なわれるのを含み
得る。特定の場合の適当な値は、溶出されるリガンドおよび化合物の選択にかか
っているであろう。 本発明の実施態様の興味ある適用は、高いイオン強度を有する大量の粗生成物
をカチオン交換体に適用しなければならない大スケールプロセスである。一般的
に、対象化合物の、従来のイオン交換体への結合を可能とするためには希釈が必
要である。本発明のプロセスを使用することにより、希釈の必要性が多くの場合
で少なくなる。
【０００５】 本発明のプロセスの溶出ステップは、タンパク質などの両性化合物および陽性
荷電し得る他の化合物用であり、主として４つの主な選択肢に従って行なわれる
： (a)溶出液のpＨ変化(上昇または低下)、 (b)イオン強度の増加または (c)pＨおよびイオン強度の変化の組み合わせ、または (d)溶出で使用される液体中のリガンド変異体の含有。 原則として、相互作用をもたらす結合をなくする、何れかの条件/方法の単独
または組み合わせを、脱着に利用することができる。 選択肢(c)中、イオン強度の変化は、pＨ変化が、相互作用をもたらす結合に対
して有する効果によって下降または上昇となり得る。 選択肢(d)では、リガンド変異体を選択肢a-cの何れか１つと組み合わせること
ができる。最も有利な選択肢は、一般的に、イオン強度の増加を必要とすること
なく相互作用をもたらす結合の効力をなくする。このようにして、溶出液は解離
物質を含み得、そして、当初に適用されたサンプルと比較して、より低い塩濃度
を有するであろう。従って脱塩の必要性は減少する。この考察から、溶出液のp
Ｈの変化(選択肢ａ)と組み合わせたイオン強度の低下による溶出が、選択肢(a)-
(c)の間で特に好ましい。リガンド類似物を伴う選択肢は、同様の利点を与え得
る。 溶出/脱着がpＨの変化を伴わない場合、イオン交換体の溶出/脱着は、通常、
上記の対応する対照イオン交換体で必要とされる対応溶出イオン強度より高いイ
オン強度で行なわれなければならない(同じpＨで測定して)。従って、このステ
ップにおけるイオン強度は、対照カチオン交換体よりも少なくとも２５％高く、
さらには少なくとも４０％高いのがよい。幾らかの極端な事例では、イオン強度
は、対応する対照イオン交換体よりも１００％以上高いことが必要となり得る(
同じpＨで測定)。
荷電し得る他の化合物用であり、主として４つの主な選択肢に従って行なわれる
： (a)溶出液のpＨ変化(上昇または低下)、 (b)イオン強度の増加または (c)pＨおよびイオン強度の変化の組み合わせ、または (d)溶出で使用される液体中のリガンド変異体の含有。 原則として、相互作用をもたらす結合をなくする、何れかの条件/方法の単独
または組み合わせを、脱着に利用することができる。 選択肢(c)中、イオン強度の変化は、pＨ変化が、相互作用をもたらす結合に対
して有する効果によって下降または上昇となり得る。 選択肢(d)では、リガンド変異体を選択肢a-cの何れか１つと組み合わせること
ができる。最も有利な選択肢は、一般的に、イオン強度の増加を必要とすること
なく相互作用をもたらす結合の効力をなくする。このようにして、溶出液は解離
物質を含み得、そして、当初に適用されたサンプルと比較して、より低い塩濃度
を有するであろう。従って脱塩の必要性は減少する。この考察から、溶出液のp
Ｈの変化(選択肢ａ)と組み合わせたイオン強度の低下による溶出が、選択肢(a)-
(c)の間で特に好ましい。リガンド類似物を伴う選択肢は、同様の利点を与え得
る。 溶出/脱着がpＨの変化を伴わない場合、イオン交換体の溶出/脱着は、通常、
上記の対応する対照イオン交換体で必要とされる対応溶出イオン強度より高いイ
オン強度で行なわれなければならない(同じpＨで測定して)。従って、このステ
ップにおけるイオン強度は、対照カチオン交換体よりも少なくとも２５％高く、
さらには少なくとも４０％高いのがよい。幾らかの極端な事例では、イオン強度
は、対応する対照イオン交換体よりも１００％以上高いことが必要となり得る(
同じpＨで測定)。
【０００６】 他の好ましい実施態様は、溶出インターバルが上記の対照イオン交換体と同じ
pＨ値で必要とされるインターバルより広くなるようなイオン強度勾配の使用に
よって溶出を行なうことができる式Ｉによるカチオン交換体の選択を含むもので
ある。これは、通常は、上記の好ましいモードによる式Ｉのカチオン交換体の選
択によって成し遂げられる。このインターバルは、溶出に適用されるのに最も低
いイオン強度で始まり、そして対象化合物で最も高い最大ピークでのイオン強度
で終了する。選択肢中、インターバルは、溶出中に現われる２つの異なる化合物
においてピーク最大の溶出イオン強度によって決定されたインターバルであり得
る。これは化合物分離の重大な可能性を意味しており、これは荷電を基準にして
相互に関連しており、および/またはこれらの化合物の収率を改善する。好まし
い実施態様として、本化合物(類)が溶出される範囲内の溶出インターバルは、上
記の対照イオン交換体の対応イオン強度インターバルより、少なくとも２０％、
好ましくは少なくとも４０％広い(その他のてんでは同じ状態で測定)。多くの場
合、イオン強度インターバルはさらに広くなり、そして上記の対照イオン交換体
に伴う対応イオン強度インターバルより少なくとも５０％、少なくとも７５％ま
たは少なくとも１００％広くなる(その他の点では同じ状態で測定)。 本化合物が溶出される範囲内のインターバル全体を考慮すると、通常、約１０
mS/cmまたは幾分広い範囲までのインターバルが、あらかじめ利用されている。
本発明に従って、式Ｉで定義されるカチオン交換体の選択を調節することにより
、少なくとも１５mS/cm、好ましくは少なくとも２０mS/cmまたはさらにより好ま
しくは少なくとも３０mS/cmの範囲でインターバルを広げることができる。特定
の場合で適用しうる数値は、分離されるリガンドおよび化合物(類)に依存する。 イオン強度および/またはpＨの変化は、段階勾配(１つ、２つまたはそれ以上
のステップを含む)としてまたは連続勾配として行なうことができる。段階勾配
または連続勾配の適用は、対象化合物(類)のリガンドへの結合の効力をなくする
のに使用される条件で、他の変化へも適用できる。
pＨ値で必要とされるインターバルより広くなるようなイオン強度勾配の使用に
よって溶出を行なうことができる式Ｉによるカチオン交換体の選択を含むもので
ある。これは、通常は、上記の好ましいモードによる式Ｉのカチオン交換体の選
択によって成し遂げられる。このインターバルは、溶出に適用されるのに最も低
いイオン強度で始まり、そして対象化合物で最も高い最大ピークでのイオン強度
で終了する。選択肢中、インターバルは、溶出中に現われる２つの異なる化合物
においてピーク最大の溶出イオン強度によって決定されたインターバルであり得
る。これは化合物分離の重大な可能性を意味しており、これは荷電を基準にして
相互に関連しており、および/またはこれらの化合物の収率を改善する。好まし
い実施態様として、本化合物(類)が溶出される範囲内の溶出インターバルは、上
記の対照イオン交換体の対応イオン強度インターバルより、少なくとも２０％、
好ましくは少なくとも４０％広い(その他のてんでは同じ状態で測定)。多くの場
合、イオン強度インターバルはさらに広くなり、そして上記の対照イオン交換体
に伴う対応イオン強度インターバルより少なくとも５０％、少なくとも７５％ま
たは少なくとも１００％広くなる(その他の点では同じ状態で測定)。 本化合物が溶出される範囲内のインターバル全体を考慮すると、通常、約１０
mS/cmまたは幾分広い範囲までのインターバルが、あらかじめ利用されている。
本発明に従って、式Ｉで定義されるカチオン交換体の選択を調節することにより
、少なくとも１５mS/cm、好ましくは少なくとも２０mS/cmまたはさらにより好ま
しくは少なくとも３０mS/cmの範囲でインターバルを広げることができる。特定
の場合で適用しうる数値は、分離されるリガンドおよび化合物(類)に依存する。 イオン強度および/またはpＨの変化は、段階勾配(１つ、２つまたはそれ以上
のステップを含む)としてまたは連続勾配として行なうことができる。段階勾配
または連続勾配の適用は、対象化合物(類)のリガンドへの結合の効力をなくする
のに使用される条件で、他の変化へも適用できる。
【０００７】 さらに、何れの適切な組み合わせにおいて種々のプロセス特性を利用すること
ができる。 本発明の異なるプロセス特性の他の好ましい態様は、カチオン交換体の好まし
い態様によって定義される。
ができる。 本発明の異なるプロセス特性の他の好ましい態様は、カチオン交換体の好まし
い態様によって定義される。
【０００８】 本発明のカチオン交換体中のベースマトリクスは、好ましくは親水性でありそ
してポリマー形態であり、これは不溶性で、水中で多かれ少なかれ膨張する。親
水性になるよう誘導された疎水性ポリマーも本定義中に含まれる。適切なポリマ
ーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランな
どの多糖類に基づくポリヒドロキシポリマー、およびポリアクリルアミド、ポリ
メタクリルアミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキ
シアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えばポリグリシジルメタ
クリレート)、ポリビニルアルコール、およびスチレンおよびジビニルベンゼン
由来のポリマーなどの完全合成ポリマー、および上記記載のポリマーに対応する
モノマーを２つまたはそれ以上含むコポリマーを含む。水に溶けるポリマーを誘
導し(例えば架橋化または吸着または共有結合を介して不溶性塊に結合させて)、
不溶性にすることができる。ＯＨに転換できるモノマー提示基のポリマー化によ
って、または例えば親水性ポリマーなどの適切な化合物の吸着による最終ポリマ
ーの親水性化によって、親水性基を疎水性ポリマーに導入することができる(例
えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー)。 マトリクスはシリカなどの無機物質由来のものでもよい。好ましいマトリクス
はシラン、エステルおよびアミド基などの加水分解に不安定な基がないものであ
る。 マトリクスは多くの場合多孔性である。 使用されている"親水性マトリクス"なる用語は、マトリクスの接触可能表面が
水性液体によって浸透されるという意味で親水性であることを意味する。一般的
には、親水性ベースマトリクス上の接触可能表面は、例えば酸素および/または
窒素原子を含む複数個の極性基にさらされている。当該極性基の例として、低級
アルキルのヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル(例えば(-Ｃ
Ｈ2ＣＨ2Ｏ-)nＨ、nは整数))がある。
してポリマー形態であり、これは不溶性で、水中で多かれ少なかれ膨張する。親
水性になるよう誘導された疎水性ポリマーも本定義中に含まれる。適切なポリマ
ーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランな
どの多糖類に基づくポリヒドロキシポリマー、およびポリアクリルアミド、ポリ
メタクリルアミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキ
シアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えばポリグリシジルメタ
クリレート)、ポリビニルアルコール、およびスチレンおよびジビニルベンゼン
由来のポリマーなどの完全合成ポリマー、および上記記載のポリマーに対応する
モノマーを２つまたはそれ以上含むコポリマーを含む。水に溶けるポリマーを誘
導し(例えば架橋化または吸着または共有結合を介して不溶性塊に結合させて)、
不溶性にすることができる。ＯＨに転換できるモノマー提示基のポリマー化によ
って、または例えば親水性ポリマーなどの適切な化合物の吸着による最終ポリマ
ーの親水性化によって、親水性基を疎水性ポリマーに導入することができる(例
えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー)。 マトリクスはシリカなどの無機物質由来のものでもよい。好ましいマトリクス
はシラン、エステルおよびアミド基などの加水分解に不安定な基がないものであ
る。 マトリクスは多くの場合多孔性である。 使用されている"親水性マトリクス"なる用語は、マトリクスの接触可能表面が
水性液体によって浸透されるという意味で親水性であることを意味する。一般的
には、親水性ベースマトリクス上の接触可能表面は、例えば酸素および/または
窒素原子を含む複数個の極性基にさらされている。当該極性基の例として、低級
アルキルのヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル(例えば(-Ｃ
Ｈ2ＣＨ2Ｏ-)nＨ、nは整数))がある。
【０００９】 本発明のイオン交換リガンドのマトリクスへの共有カップリング用に、在来型
のカップリング化学を、今後発展する技術を含めて使用することができる。これ
は、カチオン交換体中にマトリクスＭを有するイオン交換リガンド-Ｘ-Ｙ(-Ｚ)n
と結合するスペーサーＡが、在来型のイオン交換体と同じ形であり得ることを意
味する。加水分解安定性の要求は、加水分解に対して安定である基でできている
べきであることを必要とする。これは、例えば、直鎖状、分枝状、環状の飽和お
よび不飽和および芳香族炭化水素基(例えば、１-１０炭素原子までを有する)、
エーテル基(-Ｏ-)、チオエ−テル(-Ｓ-)アミド(ＣＯＮＨ-)および対応するまた
は許容され得る加水分解安定性を有する他の基から選択される基を含む。一般的
には、スペーサーはｓｐ3-混成軌道または芳香族炭素原子を介してＸと結合する
。 単独または相互に若しくは他の構造との組み合わせがスペーサーとして作用し
得る、共通構造要素の例は：-Ｏ-ＣＨ2-； -Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-；-Ｏ-Ｃ
Ｈ2-ＣＨ2-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ(ＣＨ3)-；-Ｓ-ＣＨ2-；-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ2；
および-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ2-ＣＨ2-
ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯ
Ｈ-ＣＨ2-(=特許の実施例のスルホネート対照イオン交換体中のスペーサー)であ
る。 代表的な安定なスペーサーは、同じ炭素原子に結合する、酸素、硫黄および窒
素から選択されるただ１つの原子を有する。
のカップリング化学を、今後発展する技術を含めて使用することができる。これ
は、カチオン交換体中にマトリクスＭを有するイオン交換リガンド-Ｘ-Ｙ(-Ｚ)n
と結合するスペーサーＡが、在来型のイオン交換体と同じ形であり得ることを意
味する。加水分解安定性の要求は、加水分解に対して安定である基でできている
べきであることを必要とする。これは、例えば、直鎖状、分枝状、環状の飽和お
よび不飽和および芳香族炭化水素基(例えば、１-１０炭素原子までを有する)、
エーテル基(-Ｏ-)、チオエ−テル(-Ｓ-)アミド(ＣＯＮＨ-)および対応するまた
は許容され得る加水分解安定性を有する他の基から選択される基を含む。一般的
には、スペーサーはｓｐ3-混成軌道または芳香族炭素原子を介してＸと結合する
。 単独または相互に若しくは他の構造との組み合わせがスペーサーとして作用し
得る、共通構造要素の例は：-Ｏ-ＣＨ2-； -Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-；-Ｏ-Ｃ
Ｈ2-ＣＨ2-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ(ＣＨ3)-；-Ｓ-ＣＨ2-；-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ2；
および-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ2-ＣＨ2-
ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-；-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯＨ-ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-ＣＨＯ
Ｈ-ＣＨ2-(=特許の実施例のスルホネート対照イオン交換体中のスペーサー)であ
る。 代表的な安定なスペーサーは、同じ炭素原子に結合する、酸素、硫黄および窒
素から選択されるただ１つの原子を有する。
【００１０】 本発明で使用されるカチオン交換体中のリガンドレベルは、通常は０.００１-
４mmole/ml、好ましくは０.０１-１mmole/mlマトリクス(水で膨張)のインターバ
ルから選択される。可能および好ましい範囲はマトリクスの構造によって決まっ
てくる。従って、リガンドのレベルは、アガロース由来マトリクスについては、
通常０.１-０.３mmole/ml膨張マトリクス(ゲル)内の範囲である。デキストラン
由来のマトリクスについては、当該インターバルを０.５-０.６mmole/ml膨張マ
トリクス(ゲル)まで広げることができる。
４mmole/ml、好ましくは０.０１-１mmole/mlマトリクス(水で膨張)のインターバ
ルから選択される。可能および好ましい範囲はマトリクスの構造によって決まっ
てくる。従って、リガンドのレベルは、アガロース由来マトリクスについては、
通常０.１-０.３mmole/ml膨張マトリクス(ゲル)内の範囲である。デキストラン
由来のマトリクスについては、当該インターバルを０.５-０.６mmole/ml膨張マ
トリクス(ゲル)まで広げることができる。
【００１１】 これから、本発明を幾つかの非限定的実施例でさらに例示説明する。
【００１２】 実験部Ｉ．イオン交換体の合成 アリルヒドロキシプロピルセファロース(Sepharose)ＨＰ(本発明のイオン交換体
)のアリル化、一般的産生方法： ＮａＯＨ存在下でエピクロルヒドリンとアガロースの反応により調製した架橋
アガロース(３０μm粒度)(Porath et al., (J. Chromatog. 60 (1971) 167-77お
よび米国特許第 3,959,251号)を、アリルレベル(０.０３-０.３０mmole/mlの(Ｃ
Ｈ2=ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2-))に基づき、ＮａＯＨを用いて、アリルグ
リシジルエーテルと反応させた。Ａ．対照Ｓ-イオン交換体(リガンドスルホネート)の４種の変異形の合成 上記の架橋アリル化アガロースから出発し(０.０３３、０.１１１、および０.
２００mmole/mlのアリル基レベル)、３種の異なるＳセファロースイオン交換体
を、０.０３１、０.０９４および０.１４０mmole/mlのイオン交換能力を用いて
調製した。架橋アリル化アガロース ２５gを水で洗浄し、吊り下げマグネティッ
クスターラーを備えた１００mlビーカー中で、蒸留水 ３０mlおよび酢酸ナトリ
ウム １.８gと一緒にロードし、それから臭素水溶液を黄色が残るまで加えた。
蒸留水を用いてこのゲルをガラスフィルター上で洗浄し(>５ベッド容量)、１５-
３０秒間吸引乾燥した。それから、臭素処理したゲルを、吊り下げマグネティッ
クスターラーを有する３つ口１００ml Bellcoフラスコ中へ、蒸留水 ３０mlおよ
び亜硫酸ナトリウム ８gと一緒に入れた。ＰＨを約１０-１１に調節した。この
反応を５０℃で一晩(２３時間)続けた。 反応混合物を酢酸で中和した。このゲルを蒸留水で洗浄し(>１０ベッド容量)
、そして貯蔵用として２３％(w/w)エタノールを含む蒸留水を使用した。 ０.２２０mmole/mlのイオン交換能力を有するＳ-イオン交換体を得るために、
０.１４０mmole/mlの能力を有するイオン交換体を、もう一度(０.３０mmole/ml
のアリルレベルまで)、上記の二次亜硫酸塩カップリングを用いて、アリル化し
た。
)のアリル化、一般的産生方法： ＮａＯＨ存在下でエピクロルヒドリンとアガロースの反応により調製した架橋
アガロース(３０μm粒度)(Porath et al., (J. Chromatog. 60 (1971) 167-77お
よび米国特許第 3,959,251号)を、アリルレベル(０.０３-０.３０mmole/mlの(Ｃ
Ｈ2=ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2-))に基づき、ＮａＯＨを用いて、アリルグ
リシジルエーテルと反応させた。Ａ．対照Ｓ-イオン交換体(リガンドスルホネート)の４種の変異形の合成 上記の架橋アリル化アガロースから出発し(０.０３３、０.１１１、および０.
２００mmole/mlのアリル基レベル)、３種の異なるＳセファロースイオン交換体
を、０.０３１、０.０９４および０.１４０mmole/mlのイオン交換能力を用いて
調製した。架橋アリル化アガロース ２５gを水で洗浄し、吊り下げマグネティッ
クスターラーを備えた１００mlビーカー中で、蒸留水 ３０mlおよび酢酸ナトリ
ウム １.８gと一緒にロードし、それから臭素水溶液を黄色が残るまで加えた。
蒸留水を用いてこのゲルをガラスフィルター上で洗浄し(>５ベッド容量)、１５-
３０秒間吸引乾燥した。それから、臭素処理したゲルを、吊り下げマグネティッ
クスターラーを有する３つ口１００ml Bellcoフラスコ中へ、蒸留水 ３０mlおよ
び亜硫酸ナトリウム ８gと一緒に入れた。ＰＨを約１０-１１に調節した。この
反応を５０℃で一晩(２３時間)続けた。 反応混合物を酢酸で中和した。このゲルを蒸留水で洗浄し(>１０ベッド容量)
、そして貯蔵用として２３％(w/w)エタノールを含む蒸留水を使用した。 ０.２２０mmole/mlのイオン交換能力を有するＳ-イオン交換体を得るために、
０.１４０mmole/mlの能力を有するイオン交換体を、もう一度(０.３０mmole/ml
のアリルレベルまで)、上記の二次亜硫酸塩カップリングを用いて、アリル化し
た。
【００１３】Ｂ．ホスフェートイオン交換体の産生 上記Ａの架橋アリル化アガロース ２０gを水で洗浄し、そして蒸留水 ８０-１
００mlと酢酸ナトリウム ４.６gと共に、吊り下げマグネティックスターラーを
備えた１００ml Bellcoフラスコ中へ入れた。臭素水溶液を黄色残るまで加えた
。ゲルをガラス漏斗中で蒸留水で洗浄した(>５ベッド容量)。ゲルを１５-３０秒
間吸引乾燥した。 このゲルを吸引乾燥し、蒸留水 ３０ml、リン酸二カリウム ４３.１g(０.２４
７６mole)および水酸化ナトリウム ９.９０gと共に、吊り下げマグネティックス
ターラーを備えた３つ口２５mlBellcoフラスコ中へ入れた。この反応を４０℃で
一晩(１６-２２時間)続けた。濃ＨＣｌを使用してpＨを７.０まで下げて、この
反応を停止させ、それからゲルをガラスフィルター上で蒸留水(>１０ベッド容量
)を用いて洗浄した。 ＮａＯＨ溶液による置換マトリクス上での直接的平衡条件下での変曲点滴定で
は、乾燥吸引ゲルの０.０４mmole/gのリガンドレベルであった。
００mlと酢酸ナトリウム ４.６gと共に、吊り下げマグネティックスターラーを
備えた１００ml Bellcoフラスコ中へ入れた。臭素水溶液を黄色残るまで加えた
。ゲルをガラス漏斗中で蒸留水で洗浄した(>５ベッド容量)。ゲルを１５-３０秒
間吸引乾燥した。 このゲルを吸引乾燥し、蒸留水 ３０ml、リン酸二カリウム ４３.１g(０.２４
７６mole)および水酸化ナトリウム ９.９０gと共に、吊り下げマグネティックス
ターラーを備えた３つ口２５mlBellcoフラスコ中へ入れた。この反応を４０℃で
一晩(１６-２２時間)続けた。濃ＨＣｌを使用してpＨを７.０まで下げて、この
反応を停止させ、それからゲルをガラスフィルター上で蒸留水(>１０ベッド容量
)を用いて洗浄した。 ＮａＯＨ溶液による置換マトリクス上での直接的平衡条件下での変曲点滴定で
は、乾燥吸引ゲルの０.０４mmole/gのリガンドレベルであった。
【００１４】Ｃ．ヒドロキシ安息香酸由来のカチオン交換体の合成 上記Ａ由来の架橋アリル化アガロース １０g(０.２１mmol/mlゲルのアリル基
レベル)を水で洗浄し、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Be
llcoフラスコ中へ、緩衝剤として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
２.３gと共に入れた。最終的に黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留水(>５
ベッド容量)で洗浄を行なった。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、蒸留水で洗浄し、それから４-ヒドロキシ安
息香酸 １５.３６g(０.１１１２mole)および水酸化カリウム １４.６８g(>>０.
２２２４mole)を含む蒸留水 ２０ml溶液中へ入れた。第一アルカリ液(lye)およ
び水を混合した。吊り下げマグネティックスターラー撹拌子を有する３つ口２５
ml Bellcoフラスコ中でこの反応を行なった。この反応を４０℃で一晩(１６-２
２時間)行なった。 ゲルをガラスフィルター漏斗上へ移して反応を止め、数ベッド容量の蒸留水で
洗浄し、それからゲルを蒸留水中へ懸濁し、酢酸でpＨ値を約６に調節した。 それから、このゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、
２３％(w/w)エタノールを含む蒸留水を使用した。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的平衡条件下での変曲点滴定では、０
.１１mmole/g乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった。
レベル)を水で洗浄し、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Be
llcoフラスコ中へ、緩衝剤として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
２.３gと共に入れた。最終的に黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留水(>５
ベッド容量)で洗浄を行なった。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、蒸留水で洗浄し、それから４-ヒドロキシ安
息香酸 １５.３６g(０.１１１２mole)および水酸化カリウム １４.６８g(>>０.
２２２４mole)を含む蒸留水 ２０ml溶液中へ入れた。第一アルカリ液(lye)およ
び水を混合した。吊り下げマグネティックスターラー撹拌子を有する３つ口２５
ml Bellcoフラスコ中でこの反応を行なった。この反応を４０℃で一晩(１６-２
２時間)行なった。 ゲルをガラスフィルター漏斗上へ移して反応を止め、数ベッド容量の蒸留水で
洗浄し、それからゲルを蒸留水中へ懸濁し、酢酸でpＨ値を約６に調節した。 それから、このゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、
２３％(w/w)エタノールを含む蒸留水を使用した。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的平衡条件下での変曲点滴定では、０
.１１mmole/g乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった。
【００１５】Ｄ．スルファニル酸由来のカチオン交換体の合成 水で洗浄した上記Ａの架橋アリル化アガロース １０g(０.２１mmole/mlゲルの
アリル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
２.３gと共に、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Bellcoフ
ラスコ中へ入れた。その後、臭素水溶液を黄色が残るまで加えた。蒸留水(>５ベ
ッド容量)で洗浄を行なった。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ２０ml中の４-スルファ
ニル酸 １９.２６g(０.１１１２mole)および水素化カリウム(>８５％) ７.３４g
(>>０.１１１２mole)の溶液中へ入れた。第一アルカリ液と水を混合した。吊り
下げマグネティックスターラーを備えた３つ口２５ml Bellcoフラスコ中で反応
を行なった。この反応を４０℃で１６-２２時間行なった。反応をガラスフィル
ター漏斗上へ移して停止させ、数ベッド容量の蒸留水で洗浄し、それからゲルを
蒸留水中へ懸濁させ、１Ｍ ＨＣｌでpＨ約６になるまでpＨ値を調節した。 それから、ゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。２３％(w/w)エタノー
ルを含む蒸留水を貯蔵用として使用した。 ０.１２mmole/ml圧縮ゲルのリガンドレベルを、pＨ６でカラム中に封入したゲ
ル上での吸着ＴＲＩＳにより測定し、すぐに過剰量を洗浄し、そして吸着したＴ
ＲＩＳを塩化ナトリウム溶液で溶出した。溶出液中のＴＲＩＳ量は、ゲル上の陰
性基の量と等量であり、水酸化ナトリウムを使用する変曲点滴定で測定した。
アリル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
２.３gと共に、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Bellcoフ
ラスコ中へ入れた。その後、臭素水溶液を黄色が残るまで加えた。蒸留水(>５ベ
ッド容量)で洗浄を行なった。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ２０ml中の４-スルファ
ニル酸 １９.２６g(０.１１１２mole)および水素化カリウム(>８５％) ７.３４g
(>>０.１１１２mole)の溶液中へ入れた。第一アルカリ液と水を混合した。吊り
下げマグネティックスターラーを備えた３つ口２５ml Bellcoフラスコ中で反応
を行なった。この反応を４０℃で１６-２２時間行なった。反応をガラスフィル
ター漏斗上へ移して停止させ、数ベッド容量の蒸留水で洗浄し、それからゲルを
蒸留水中へ懸濁させ、１Ｍ ＨＣｌでpＨ約６になるまでpＨ値を調節した。 それから、ゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。２３％(w/w)エタノー
ルを含む蒸留水を貯蔵用として使用した。 ０.１２mmole/ml圧縮ゲルのリガンドレベルを、pＨ６でカラム中に封入したゲ
ル上での吸着ＴＲＩＳにより測定し、すぐに過剰量を洗浄し、そして吸着したＴ
ＲＩＳを塩化ナトリウム溶液で溶出した。溶出液中のＴＲＩＳ量は、ゲル上の陰
性基の量と等量であり、水酸化ナトリウムを使用する変曲点滴定で測定した。
【００１６】Ｅ．スルホサリチル酸由来のカチオン交換体の合成 水で洗浄した上記Ａの架橋アリル化アガロース ２０g(０.２１mmole/mlゲルの
アリル基レベル)を、蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム ４.６gを緩衝
液として共に使用して、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml B
ellcoフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留
水(>５ベッド容量)で洗浄を行なった。 このゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ４０ml中、５-スル
ホサリチル酸二水和物 ５６.５４g(０.２２２４mole)および水素化カリウム(>85
％) ４４.０４g(０.６６７２mole)、および水素化ホウ素ナトリウム ０.１gの溶
液中へ入れた。この反応を吊り下げマグネティックスターラーを備えた３つ口１
００ml Bellcoフラスコ中で行なった。この反応を、窒素ガス雰囲気下、４０℃
で一晩(１６-２２時間)行なった。 ゲルをガラスフィルター漏斗に移して反応を止め、そして数ベッド容量の蒸留
水で洗浄し、それからこのゲルを蒸留水中に懸濁化し、１Ｍ酢酸でpＨ値を７.５
に調節した。 それから、ゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、２３
％(w/w)エタノールを含む蒸留水を用いた。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的変曲点滴定では、０.０３４mmole/g
乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった(イオン交換能力 ０.０６８mmole/g)。
アリル基レベル)を、蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム ４.６gを緩衝
液として共に使用して、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml B
ellcoフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留
水(>５ベッド容量)で洗浄を行なった。 このゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ４０ml中、５-スル
ホサリチル酸二水和物 ５６.５４g(０.２２２４mole)および水素化カリウム(>85
％) ４４.０４g(０.６６７２mole)、および水素化ホウ素ナトリウム ０.１gの溶
液中へ入れた。この反応を吊り下げマグネティックスターラーを備えた３つ口１
００ml Bellcoフラスコ中で行なった。この反応を、窒素ガス雰囲気下、４０℃
で一晩(１６-２２時間)行なった。 ゲルをガラスフィルター漏斗に移して反応を止め、そして数ベッド容量の蒸留
水で洗浄し、それからこのゲルを蒸留水中に懸濁化し、１Ｍ酢酸でpＨ値を７.５
に調節した。 それから、ゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、２３
％(w/w)エタノールを含む蒸留水を用いた。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的変曲点滴定では、０.０３４mmole/g
乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった(イオン交換能力 ０.０６８mmole/g)。
【００１７】Ｆ．ジヒドロキシベンゼンスルホン酸由来のカチオン交換体の合成 水洗浄した上記Ａの架橋アリル化アガロース ２０g(０.２１mmole/mlゲルのア
リル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム ４
.６gを共に用いて、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Bellc
oフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留水で
洗浄を行なった(>５ベッド容量)。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ３０ml中のジヒドロキシ
ベンゼンスルホン酸カリウム塩 ５６.５４g(０.２４７６mole)および水素化カリ
ウム(>８５％) １３.９g、および水素化ホウ素ナトリウム ０.１gの溶液中へ入
れた。この反応を、吊り下げマグネティックスターラーを備えた３つ口１００ml
Bellcoフラスコ中で行なった。この反応を４０℃で一晩(１６-２２時間)続けた
。 ゲルをガラスフィルター漏斗上に移して反応を止めて、数ベッド容量の蒸留水
で洗浄し、それからこのゲルを蒸留水中に懸濁させ、そして１Ｍ酢酸でpＨ値を
約６に調節した。 それからゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、２３％(
w/w)エタノールを含む水を使用した。 上記の、ゲル吸着そしてその後の置換ＴＲＩＳの、変曲点滴定は、０.１０mmo
le/ml圧縮ゲルのイオン交換能力であった。
リル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム ４
.６gを共に用いて、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml Bellc
oフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留水で
洗浄を行なった(>５ベッド容量)。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、それから、蒸留水 ３０ml中のジヒドロキシ
ベンゼンスルホン酸カリウム塩 ５６.５４g(０.２４７６mole)および水素化カリ
ウム(>８５％) １３.９g、および水素化ホウ素ナトリウム ０.１gの溶液中へ入
れた。この反応を、吊り下げマグネティックスターラーを備えた３つ口１００ml
Bellcoフラスコ中で行なった。この反応を４０℃で一晩(１６-２２時間)続けた
。 ゲルをガラスフィルター漏斗上に移して反応を止めて、数ベッド容量の蒸留水
で洗浄し、それからこのゲルを蒸留水中に懸濁させ、そして１Ｍ酢酸でpＨ値を
約６に調節した。 それからゲルを蒸留水(>１０ベッド容量)で洗浄した。貯蔵用として、２３％(
w/w)エタノールを含む水を使用した。 上記の、ゲル吸着そしてその後の置換ＴＲＩＳの、変曲点滴定は、０.１０mmo
le/ml圧縮ゲルのイオン交換能力であった。
【００１８】Ｇ．ＴＡＰＳ-イオン交換体の合成。リガンド(ＴＡＰＳ)としてＮ-[トリス(ヒド
ロキシメチル)メチル]-３-アミノプロパンスルホン酸と結合させる 水で洗浄した上記Ａの架橋アリル化アガロース ２０g(０.２１mmole/mlゲルの
アリル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
４.６gを共に使用して、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml B
ellcoフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留
水で洗浄を行なった(>５ベッド容量)。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、蒸留水 ３０ml、水酸化ナトリウム １０g(
０.２５mole)およびＮ-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-３-アミノ-プロパン
-スルホン酸 ６０.２５g(０.２４７６５mole)を共に用い、吊り下げマグネティ
ックスターラーを備えた３つ口１００ml Bellcoフラスコ中へ入れた。反応を４
０℃で一晩(１６-２２時間)行なった。 濃ＨＣｌでpＨを７.０まで下げて反応を止めて、それからゲルを蒸留水(>１０
ベッド容量)で洗浄した。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的変曲点滴定では、０.１０±０.０２
mmole/g乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった。アミノ基のｐＫａを測定し、
約８.４であった。
ロキシメチル)メチル]-３-アミノプロパンスルホン酸と結合させる 水で洗浄した上記Ａの架橋アリル化アガロース ２０g(０.２１mmole/mlゲルの
アリル基レベル)を、緩衝液として蒸留水 ８０-１００mlおよび硫酸ナトリウム
４.６gを共に使用して、吊り下げマグネティックスターラーを備えた１００ml B
ellcoフラスコ中へ入れた。その後、黄色が残るまで臭素水溶液を加えた。蒸留
水で洗浄を行なった(>５ベッド容量)。 ゲルを１５-３０秒間吸引乾燥し、蒸留水 ３０ml、水酸化ナトリウム １０g(
０.２５mole)およびＮ-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-３-アミノ-プロパン
-スルホン酸 ６０.２５g(０.２４７６５mole)を共に用い、吊り下げマグネティ
ックスターラーを備えた３つ口１００ml Bellcoフラスコ中へ入れた。反応を４
０℃で一晩(１６-２２時間)行なった。 濃ＨＣｌでpＨを７.０まで下げて反応を止めて、それからゲルを蒸留水(>１０
ベッド容量)で洗浄した。 ＮａＯＨ溶液置換マトリクス上での直接的変曲点滴定では、０.１０±０.０２
mmole/g乾燥吸引ゲルのリガンドレベルであった。アミノ基のｐＫａを測定し、
約８.４であった。
【００１９】II．タンパク質のクロマトグラフィー結果 図１：溶出イオン強度−pＨ８での異なるカチオン交換リガンドの比較 Ａ−Ｄ．Ｓ-リガンド(０.０３、０.０９、０.１４および０.２２mmole/ml)； Ｅ． ホスフェート(０.０４mmole/g)； Ｆ． ＢＰＲ-ブタン-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)
； Ｇ． スルホプロピル-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.２５mmole/ml)
； Ｈ． ヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)； Ｉ． スルホサリチル酸(０.０３４mmole/g)； Ｊ． ＴＡＰＳ(０.１０mmole/g)； Ｋ． スルファニル酸(０.１２mmole/ml)； Ｌ． ４-ヒドロキシ安息香酸(０.１１mmole/g)；
； Ｇ． スルホプロピル-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.２５mmole/ml)
； Ｈ． ヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)； Ｉ． スルホサリチル酸(０.０３４mmole/g)； Ｊ． ＴＡＰＳ(０.１０mmole/g)； Ｋ． スルファニル酸(０.１２mmole/ml)； Ｌ． ４-ヒドロキシ安息香酸(０.１１mmole/g)；
【００２０】 図２：溶出イオン強度−pＨ４での異なるカチオン交換リガンドの比較 Ａ−Ｄ．Ｓ-リガンド(０.０３、０.０９、０.１４および０.２２mmole/ml)； Ｅ． ホスフェート(０.０４mmole/g)； Ｆ． ＢＰＲ-ブタン-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)
； Ｇ． スルホプロピル-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.２５mmole/ml)
； Ｈ． ヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)； Ｉ． スルホサリチル酸(０.０３mmole/g)； Ｊ． ＴＡＰＳ(０.１０mmole/g)； Ｋ． スルファニル酸(０.１２mmole/ml)； Ｌ． ４-ヒドロキシ安息香酸(０.１１mmole/g)；
； Ｇ． スルホプロピル-修飾したヒドロキノンスルホネート(０.２５mmole/ml)
； Ｈ． ヒドロキノンスルホネート(０.１０mmole/ml)； Ｉ． スルホサリチル酸(０.０３mmole/g)； Ｊ． ＴＡＰＳ(０.１０mmole/g)； Ｋ． スルファニル酸(０.１２mmole/ml)； Ｌ． ４-ヒドロキシ安息香酸(０.１１mmole/g)；
【００２１】図１と図２の共通点 ：各調製イオン交換体のリガンドのレベルを括弧中に示す。
重量表示(g)は、ガラスフィルター漏斗上に減圧排出したゲルに関する。
重量表示(g)は、ガラスフィルター漏斗上に減圧排出したゲルに関する。
【００２２】クロマトグラフィー(タンパク質)。上記の架橋アガロースゲルと結合した、異な
るカチオン交換リガンドの比較 上記合成に記載のイオン交換ゲルをＨＲ１０/２カラム中に封入し(Amersham P
harmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)、約１気圧の背圧でゲル高さ２-２.５c
mにした。 Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, SwedenによるＦＰＬＣシステムの
下記の指示の条件およびサンプルのもとで、クロマトグラフィー評価を行なった
。pＨ８ サンプル：リボヌクレアーゼＡ １mg/ml、キモトリプシノゲンＡ １mg/ml、 シトクロムＣ １mg/ml、リゾチーム １mg/ml、 ループ容量：１００μl 緩衝液Ａ：ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ ２０mM、pＨ８.０ 緩衝液Ｂ：ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ ２０mM、ＮａＣｌ ０.５または１.０Ｍ、 pＨ８.０ 流速：０.５ml/min 勾配スロープ：０.０５M/ml ＵＶ検出器：２８０nm ０.０５AU 最大伝導度＝１００mS/cmpＨ４ サンプル： 小麦-胚レクチン(３ピーク) mg/mlおよびp-ラクトグロブリン １mg/
ml ループ容量：１００μl 緩衝液Ａ：ギ酸-ＮａＯＨ ２０mM、pＨ８.０ 緩衝液Ｂ：ギ酸-ＮａＯＨ ２０mM、ＬｉＣｌ ０.７５または１.０Ｍ、 pＨ８.０ 流速：０.５ml/min 勾配スロープ：０.０７５M/ml ＵＶ検出器：２８０nm ０.０５AU 最大伝導度＝１００mS/cm
るカチオン交換リガンドの比較 上記合成に記載のイオン交換ゲルをＨＲ１０/２カラム中に封入し(Amersham P
harmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)、約１気圧の背圧でゲル高さ２-２.５c
mにした。 Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, SwedenによるＦＰＬＣシステムの
下記の指示の条件およびサンプルのもとで、クロマトグラフィー評価を行なった
。pＨ８ サンプル：リボヌクレアーゼＡ １mg/ml、キモトリプシノゲンＡ １mg/ml、 シトクロムＣ １mg/ml、リゾチーム １mg/ml、 ループ容量：１００μl 緩衝液Ａ：ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ ２０mM、pＨ８.０ 緩衝液Ｂ：ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ ２０mM、ＮａＣｌ ０.５または１.０Ｍ、 pＨ８.０ 流速：０.５ml/min 勾配スロープ：０.０５M/ml ＵＶ検出器：２８０nm ０.０５AU 最大伝導度＝１００mS/cmpＨ４ サンプル： 小麦-胚レクチン(３ピーク) mg/mlおよびp-ラクトグロブリン １mg/
ml ループ容量：１００μl 緩衝液Ａ：ギ酸-ＮａＯＨ ２０mM、pＨ８.０ 緩衝液Ｂ：ギ酸-ＮａＯＨ ２０mM、ＬｉＣｌ ０.７５または１.０Ｍ、 pＨ８.０ 流速：０.５ml/min 勾配スロープ：０.０７５M/ml ＵＶ検出器：２８０nm ０.０５AU 最大伝導度＝１００mS/cm
【００２３】結果： 図１は、調製イオン交換体の実験モデルタンパク質に対する、pＨ ８.０での
溶出イオン強度(mS/cm)を示す。与えられた条件で陰性正味荷電を有するリガン
ドおよび本発明に基づく有用な官能基を示すイオン交換体は、カチオン交換クロ
マトグラフィーによって実験モデルタンパク質を相互に分離する様々な能力を有
する。１つの相違点は有意な動力学的増加、すなわち、より広いイオン強度イン
ターバルに広がった分離に含まれた、サンプル物質の溶出イオン強度値である。
他の相違点は、使用したサンプル物質全てを溶出するために、より高いまたは相
当に非常に高い溶出イオン強度が必要とされることである。これらの効果は、多
かれ少なか同時に現われる。 図２は、pＨ４での幾つかのクロマトグラフィー操作の結果を示す。この低pＨ
値で、実施例のリガンドは陰性正味荷電がないかまたは減少している。ＴＡＰＳ
-リガンドは、正味荷電が０であり、そしてサンプル物質付着がないリガンドの
例である。 スルファニル酸基は、pＨ４で僅かに陽性の正味荷電を有する。アミノ基は完
全に荷電化しており(pKaはちょうど７を超える)、スルホネート基(pKa 約３)は
非荷電化し始める。
溶出イオン強度(mS/cm)を示す。与えられた条件で陰性正味荷電を有するリガン
ドおよび本発明に基づく有用な官能基を示すイオン交換体は、カチオン交換クロ
マトグラフィーによって実験モデルタンパク質を相互に分離する様々な能力を有
する。１つの相違点は有意な動力学的増加、すなわち、より広いイオン強度イン
ターバルに広がった分離に含まれた、サンプル物質の溶出イオン強度値である。
他の相違点は、使用したサンプル物質全てを溶出するために、より高いまたは相
当に非常に高い溶出イオン強度が必要とされることである。これらの効果は、多
かれ少なか同時に現われる。 図２は、pＨ４での幾つかのクロマトグラフィー操作の結果を示す。この低pＨ
値で、実施例のリガンドは陰性正味荷電がないかまたは減少している。ＴＡＰＳ
-リガンドは、正味荷電が０であり、そしてサンプル物質付着がないリガンドの
例である。 スルファニル酸基は、pＨ４で僅かに陽性の正味荷電を有する。アミノ基は完
全に荷電化しており(pKaはちょうど７を超える)、スルホネート基(pKa 約３)は
非荷電化し始める。
【００２４】 スルファニル酸-リガンド中で部分的に非荷電化したスルホネート基の結果は
相互作用が複合していることを示しており、そしてこの結果は機械的に解釈する
のが困難であろう。４-ヒドロキシ安息香酸-リガンドのカルボキシル基もまたp
Ｈ４で非荷電化するが、一方、ヒドロキノンスルホネート-リガンドはpＨ４で荷
電化し、強力な結合が生じる。ヒドロキノンサルフェートリガンドの水酸基をエ
ーテル基に変えると、結合能力が劇的に変化するであろう(例えば、(a)アリル化
およびその後の二重結合のスルホネート基への変換、または(b)ＢＰＲ-ブタン(
１,４-ジグリシジルブチルエーテル)のアルキル化)。この種類の変更は、芳香族
基は立体的に遮蔽され、同時にフェノール類の水酸基はエーテル結合の１部とな
ることを意味している。結果として、サンプル物質は対照イオン交換体(スルホ
ネートリガンド)の作用に非常によく似ている溶出作用を有し得る。
相互作用が複合していることを示しており、そしてこの結果は機械的に解釈する
のが困難であろう。４-ヒドロキシ安息香酸-リガンドのカルボキシル基もまたp
Ｈ４で非荷電化するが、一方、ヒドロキノンスルホネート-リガンドはpＨ４で荷
電化し、強力な結合が生じる。ヒドロキノンサルフェートリガンドの水酸基をエ
ーテル基に変えると、結合能力が劇的に変化するであろう(例えば、(a)アリル化
およびその後の二重結合のスルホネート基への変換、または(b)ＢＰＲ-ブタン(
１,４-ジグリシジルブチルエーテル)のアルキル化)。この種類の変更は、芳香族
基は立体的に遮蔽され、同時にフェノール類の水酸基はエーテル結合の１部とな
ることを意味している。結果として、サンプル物質は対照イオン交換体(スルホ
ネートリガンド)の作用に非常によく似ている溶出作用を有し得る。
【図１】 図１は、調製イオン交換体の実験モデルタンパク質に対する、p
Ｈ ８.０での溶出イオン強度(mS/cm)を示す。
Ｈ ８.０での溶出イオン強度(mS/cm)を示す。
【図２】 図２は、pＨ４での幾つかのクロマトグラフィー操作の結果を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レンナート・セデルバリィ スウェーデン、エス−755 98ウプサラ、 エクシャガルナ、クルセンバリィ
Claims (21)
- 【請求項１】 陽性荷電化合物、主として生体分子、特にタンパク質のよう
な両性化合物を溶液から分離する方法であって、当該溶液をイオン交換体と、１
個またはそれ以上の陽性荷電化合物が当該イオン交換体に結合できる条件下に、
接触させ、必要に応じて結合化合物を溶出させる工程を含み、当該カチオン交換
体が (i)式(Ｉ) Ｍ-Ａ-Ｘ-Ｙ(-Ｚ)n （Ｉ） を有しており、そして (ii)pＨ２-１４の区間でのリボヌクレアーゼ、キモトリプシノーゲンＡ、シトク
ロムＣ、リゾチーム、小麦-胚レクチンそしてβ-ラクトグロブリンから選択され
る１つまたはそれ以上のタンパク質の最大溶出イオン強度が、イオン交換基(Ｚ)
がスルホネート(-ＳＯ3 -)でありそしてベースマトリクス、スペーサーおよび置
換度は式Ｉのカチオン交換体と同じであるがＸ基とＹ基が存在しない対照イオン
交換体上で同じ条件で測定した対応溶出イオン強度より高く、 当該カチオン交換体と陽性荷電化合物(類)との結合をpＨ値２−１４の範囲内で
進行させ、ここでリガンド−Ｘ−Ｙ(−Ｚ)nが陰性正味荷電を有することを特徴
とする、方法。 但し、式中、 a)Ｍは、式Ｉの付加電荷交換リガンドを含む親水性マトリクスであり； b)Ａは、スペーサーであり、 c)Ｘ−Ｙ(−Ｚ)nは、カチオン交換リガンドであり； d)Ｘは、-Ｏ-、-Ｓ(Ｒ1)-または-Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)-であり、式中、Ｒ1およびＲ2は
Ｈ、遊離電子対、Ａ−Ｘ−Ｙ(−Ｚ)n、Ｙ(−Ｚ)nまたは直鎖状、環状もしくは分
枝状から選択され、好ましくは飽和した脂肪族Ｃ1−Ｃ6基であり、ここでＣ2-6
アルキルの場合、１ないし４の水素原子はＯＨ基により置換されており、ここで
、ただ１つのＲ1およびＲ2が遊離電子対となり得ることを条件として水素が低級
アルキルによって置換されていてもよい； e)Ｙは、 １)二重結合を含む５または６員環構造、好ましくは芳香族基、または ２)脂環式Ｃ5−Ｃ6基または脂肪族性、直鎖状または分枝状、好ましくは飽和
したＣ1−Ｃ8基であり、ＸとＺとの鎖連結が、１または２つのエーテル酸素また
はチオエステル硫黄原子によって妨げられている可能性を有しているが但しＸは
-Ｏ-または-Ｓ-ではない； f)Ｚは、カチオン交換基である。 - 【請求項２】 (a)カチオン交換体が、請求項１で定義された対照イオン交
換体から、同じpＨ値で１またはそれ以上の当該化合物の溶出に必要とされる溶
出イオン強度より、より高いイオン強度、好ましくは２５％高く、さらに好まし
くは少なくとも４０％高く、最も好ましくは少なくとも１００％高い、での結合
を可能にし、そして (b)そのように高いイオン強度で結合を起こさせる ことを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。 - 【請求項３】 結合中の溶液のイオン強度が、１５または２０mS/cmを超え
、好ましくは３０mS/cmまたは４０mS/cmを超えることを特徴とする、請求項１な
いし２の何れか１つに記載のプロセス。 - 【請求項４】 当該溶出が化合物(類)とリガンドの結合を中和する条件で行
なわれることを特徴とする、請求項１ないし３の何れか１つに記載のプロセス。 - 【請求項５】 当該溶出が、結合が行なわれたpＨから離れているpＨで行わ
れることを特徴とする、請求項１ないし４の何れか１つに記載のプロセス。 - 【請求項６】 当該溶出が、結合時に適用されたイオン強度を超えるイオン
強度で行われることを特徴とする、請求項１ないし５の何れか１つに記載のプロ
セス。 - 【請求項７】 請求項１に定義の対照イオン交換体における化合物を溶出す
る相当インターバルよりも、２０％広い、好ましくは少なくとも４０％広いイン
ターバルにわたるイオン強度の変化を適用することにより溶出を行うことを特徴
とする、請求項１−６の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項８】 請求項１に定義され、下記以外は同じ条件下で測定したとき
、対照イオン交換体の相当インターバルより、少なくとも５０％広い、好ましく
は少なくとも７５％広い、さらに好ましくは少なくとも１００％広いインターバ
ルにわたるイオン強度の変化を適用することにより溶出を行うことを特徴とする
、請求項１−７の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項９】 少なくとも１つの化合物の溶出に使用する、イオン強度イン
ターバルが１５ｍＳ／ｃｍを超える、例えば、２０ｍＳ／ｃｍまたは５０ｍＳ／
ｃｍを超えることを特徴とする、請求項１−９に記載の方法。 - 【請求項１０】 １−４個のＯＲ'基が、基Ｒ1およびＲ2のうち何れか１つ
において存在し、Ｒ1およびＲ2と同じ基から選択されるＲ'を伴い、好ましくは
Ｈであることを特徴とする、請求項１−９の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｘが−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)−であることを特徴とする、請求項１
−１０の何れかに記載のイオン交換体。 - 【請求項１２】 Ｘ＝−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)であり、１−４個、例えば１−３個の
ＯＲ'基が、−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)−[式中、Ｒ'はＲ1およびＲ2と同じ基から選択され
る]の窒素原子から２または３炭素原子離れて存在することを特徴とする、請求
項１−１１の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｙおよび／またはＡが、−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)−の窒素原子から
２または３炭素原子離れて水酸基を供することを特徴とする、請求項１１−１２
の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｙ、Ｒ'、Ｒ1およびＲ2において、原子が硫黄原子、酸素
原子および窒素原子から１つのみ選択され、それぞれ炭素原子に結合することを
特徴とする、請求項１−１３の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｚが、荷電プロトン化型を含む、カルボキシレート、スル
ホネート、ホスホネート、ホスフェートから選択されることを特徴とする、請求
項１−１４の何れかに記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｘが、−Ｏ−または−Ｓ(Ｒ1)−であることを特徴とする
、請求項１−８および１４−１５の何れか１つに記載の方法。 - 【請求項１７】 Ｙが、芳香族基、好ましくはベンゼン環であることを特徴
とする、請求項１−１６の何れかに記載の方法。 - 【請求項１８】 リガンド−Ｘ−Ｙ(−Ｚ)nが、ヒドロキシ安息香酸および
／またはスルホロサリチル酸から誘導され、好ましくはパラ型であり、好ましく
はスペーサーに対しＯＨ基が結合する環の結合を介することを特徴とする、請求
項１−１７の何れかに記載の方法。 - 【請求項１９】 リガンド−Ｘ−Ｙ(−Ｚ)nが、硫酸ヒドロキノンから誘導
され、好ましくはスペーサーに対しＯＨ基が結合する環の結合を介し、好ましく
は当該ＯＨ基は、−ＳＯ3 -に対しメタまたはオルトである(Ｚ1＝−ＳＯ3 -および
Ｚ2＝−ＯＨ／−Ｏ-；およびｎ＝２)ことを特徴とする、請求項１−１８の何れ
かに記載の方法。 - 【請求項２０】 Ｙが、Ｃ2−Ｃ6基、好ましくはＣ2−Ｃ4から選択される脂
肪族基であることを特徴する、請求項１−１６の何れかの方法。 - 【請求項２１】 Ｘが、−Ｎ(Ｒ1)(Ｒ2)−であり、Ｒ1が、遊離電子対また
は水素原子であり、Ｒ2は、トリス(ヒドロキシメチル)メチルであり、Ｙが、−
ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−であり、Ｚが、ＳＯ3 -であり
、そしてｎが、１であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| SE9802214-8 | 1998-06-18 | ||
| SE9802214A SE9802214D0 (sv) | 1998-06-18 | 1998-06-18 | Jonbytare och användning därav |
| PCT/SE1999/001082 WO1999065607A1 (en) | 1998-06-18 | 1999-06-16 | Method for separation on cation exchangers |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002518157A true JP2002518157A (ja) | 2002-06-25 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000554474A Expired - Lifetime JP4643006B2 (ja) | 1998-06-18 | 1999-06-16 | カチオン交換体による分離方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004532182A (ja) * | 2000-12-31 | 2004-10-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | 低濃度の塩を含有する組成物の製造方法 |
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| SE0002688D0 (sv) | 2000-07-17 | 2000-07-17 | Amersham Pharm Biotech Ab | Adsorption method and ligands |
| SE0004932D0 (sv) * | 2000-12-31 | 2000-12-31 | Apbiotech Ab | A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents |
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|---|---|---|---|---|
| WO1997029825A1 (en) * | 1996-02-19 | 1997-08-21 | Amersham Pharmacia Biotech Aktiebolag | Process for chromatographic separation of peptides and nucleic acid, and new high affinity ion exchange matrix |
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|---|---|---|---|---|
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-
1998
- 1998-06-18 SE SE9802214A patent/SE9802214D0/xx unknown
-
1999
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| WO1997029825A1 (en) * | 1996-02-19 | 1997-08-21 | Amersham Pharmacia Biotech Aktiebolag | Process for chromatographic separation of peptides and nucleic acid, and new high affinity ion exchange matrix |
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