JP2002517756A - リガンドの検出及び増幅 - Google Patents

リガンドの検出及び増幅

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Abstract

(57)【要約】 少なくとも１つのリセプター及び該リセプターと組み合わされた増幅機構からなり、増幅された信号がリセプターのリガンドとの結合の結果として発生されるリガンドの検出システム。好適な増幅機構の例としては、抗体が埋め込まれた液晶物質；酵素を閉じ込めるためのα−２−マクログロブリンの使用（これにより、酵素はリセプターによってその基質から分離される）；及びリガンドの不存在下においてのみ酵素の活性部位を阻害するように組換えられたリセプターを含む。リガンドの自動検出法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、一般的にはリセプターによるリガンドの検出に係る。さらに詳述す
れば、本発明は、極めて特異的なリセプター、及びリガンド、特に病原体及び／
又はそれらの毒素の迅速かつ自動的な検出のための増幅機構への該リセプターの
応用に係る。
【０００２】 リセプターによるリガンドの検出（例えば、微生物又は毒素の如き病原性因子
の抗体による検出；又は血液中の抗体の他の抗体による検出；又は神経ガスの如
き化学毒素のそのリセプターへの結合）は、病気原因因子にさらされた個人の診
断及び治療において重要である。病原性因子の早期検出は、症状が現れる又は悪
化する前の病気の予防又は治療にとって大いに有益であろう。
【０００３】 微生物のいずれの種、菌株又は毒素もユニークな表面リガンドを含有する。分
子組換え及び／又は免疫学的技術を使用することにより、前記リガンドと高度の
特異性をもってを結合するであろう抗体の如きリセプター分子が単離される。抗
体の如きリセプターを、結合の際に活性化される信号機構とリンクさせる方法も
提案されている。しかしながら、これまでのところ、ただ１つの又は少数のリガ
ンドの結合から発生されるリセプター信号を迅速かつ自動的に検出及び増幅でき
るシステムは開発されていない。このようなシステムは、リガンドの迅速かつ正
確な早期検出には避けられないものである。
【０００４】 最もよく利用される診断テストは抗体に基づくものであり、病気原因因子又は
該因子に応答して患者によって生産された生物学的生成物を検出するために使用
されている。現在、リガンド（抗原）認識用の抗体の製造については３つの汎用
されている方法がある：多数のエピトープに関する認識性を持つ動物全体におけ
るポリクロナール抗体の製造、ただ１つのエピトープ（スクリーニング後）に関
する認識性をもつ形質転換された細胞系におけるモノクロナール抗体の製造、及
びただ１つのエピトープ（スクリーニング後）の認識性をもつ細菌における分子
組換えファージ表示抗体の製造である。これらの各リセプターシステムはリガン
ドを結合及び同定できるが、それぞれの感度はインターフェースされる特殊なイ
ムノアッセイ検出システムに制限される。
【０００５】 固相酵素免疫測定法（ELISA）、酵素免疫測定法（EIA）、及び放射免疫測定法
（RIA）の如きイムノアッセイは抗原の検出に関してよく知られている。これら
測定法の多くにおける基本的な原理は、酵素−、クロモーゲン−、フルオロゲン
−、又はラジオヌクレオチド−結合抗体が抗体の結合時に抗原の検出を許容する
ことにある。この相互作用が色、蛍光又は放射活性の変化として検出されるよう
にするため、重大な数の抗体が多数の抗原エピトープに対応して結合されなけれ
ばならない。
【０００６】 このように、特に非常に少量で存在する際にも、迅速、信頼性よく、しかも自
動的にリガンドを検出し、その結果、測定可能な信号を提供するシステムが求め
られている。
【０００７】 従って、本発明の目的は、高い感度及び高い特異性をもってリガンドを検出で
きるシステムを提供することにある。
【０００８】 本発明の他の目的は、リガンドのリセプターへの結合によって発生された信号
を増幅できるシステムを提供することにある。
【０００９】 本発明の他の目的は、ケージ化酵素増幅機構を提供することにある。
【００１０】 本発明のさらに他の目的は、結合されたリセプターによって脱活性化された酵
素を活性化するシステムを提供することにある。
【００１１】 本発明のさらに他の目的は、リガンドのリセプターへの結合の際に液晶アレイ
を歪曲させるシステムを提供することにある。
【００１２】 本発明の更なる目的は、環境又は身体を連続して監視し、リガンドが存在する
際にその所有者を表示する検出装置を提供することにある。
【００１３】 一般に、本発明は、少なくとも１つのリセプター及び該リセプターと組み合わ
された増幅機構（リセプターがリガンドに結合した結果として増幅された信号が
発生される）からなる病原性因子の如きリガンドの検出及び増幅システムを提供
する。
【００１４】 本発明では、リガンド−特異リセプターを増幅機構とインターフェースさせて
、リセプター−リガンドの相互作用がリセプターの配座を変化させ、信号を発生
する。好ましくは、増幅は、測光法で検出される色、蛍光又は複屈折のシフトを
介して生ずる。ついで、検出された信号を電子的に増幅してシステムを自動化す
る。
【００１５】 リガンド検出要素 リガンドのリセプターへの結合が検出可能なリセプターのディストーションを
生ずるものであれば、抗体又はリガンド用の生物学的／生物学的組換えリセプタ
ーの如きいかなるリセプターも装置に組み込むことができる。例えば、各種のモ
ノ特異性抗体（ポリクロナール、モノクロナール、又はファージ−表示）がリセ
プターとして有効に機能でき、このようなタイプの抗体の各々について以下に記
載する。ファージ−表示抗体は新しいリガンドの同定のために迅速に変性される
ものであり、この特許出願においてリセプターの例として使用されているが、各
種の物理的に歪曲可能なリセプター−リガンドの相互作用が検出要素として適し
ている。
【００１６】 ポリクロナール抗体：数１０年の間、抗体に基づく抗原検出法が開発されてき
た。製したリガンドの宿主動物への注射は、抗原上の各種の反応部位に対する一
連の抗体を生成する免疫システムを模倣するものである。いくつかのリンパ球は
異なる抗原エピトープに応答するため、多特異抗体カクテル（ポリクロナール）
が創造され、抗原検出のために精製される。
【００１７】 モノクロナール抗体：ただ１つの限定された特異性をもつほぼ無限の量の抗体
を提供するハイブリドーマを創造するために抗体−生産脾臓細胞（Ｂリンパ球）
を不死化ミエローマ細胞と融合させる。これらの「モノクロナール」抗体の菌株
間及び種間ハイブリッドが遺伝子組換え技術を介して生成される。これらの高度
に特異的な抗体は、U.S. Food and Drug Administrationの選ばれた病気の治療
に関するマウス−ヒトキメラ抗体の使用許可によって実証されているように、重
要な治療能力を有する。
【００１８】 ファージ−表示モノ−特異性抗体：各種の病原性因子に対するシングル鎖キメ
ラ抗体を単離するためにファージ−表示技術を使用する。Ｂリンパ球のゲノムDN
Aは、実質的にすべてのリガンド（抗原）に対して抗体を生産するコードを含有
する。ファージ表示抗体システム（PDA）において、抗体の長鎖をコード付けるD
NAと抗体の短鎖をコード付けるDNAとを結合させ、その間にリンカーをコード付
けるDNAを挿入することによって、自生抗体の超可変のリガンド−結合領域のシ
ングル鎖キメラをコード付けるDNAが合成される。リンカー領域の所望のアミノ
酸配列は、一定の増幅機構について要求される特性に左右される。リンカー領域
はタンパク質又は他の物質と相互作用及び／又は結合できなければならないであ
ろう。したがって、ポリペプチド配列は、例えば、特殊な配座、イオン又は水素
結合を誘発するように特異的に配置された官能基、又は増幅機構と適合する疎水
性を有していなければならないであろう。しかしながら、増幅機構の種類にかか
わらず、リンカー領域は、増幅機構をリセプターにインターフェイスすることに
おいて重要な役割を果たす。
【００１９】 シングル鎖キメラ抗体をコード付ける、好ましくはヒト又はマウスのDNAを、
ここに参考として引用する公知の技術（Marks ら, J. Mol. Biol. Vol. 222:581
(1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993)；及び Winters ら, Ann. Rev.
Immunol. 12:433 (1994)）を使用することによって、バクテリオファージ（フ
ァージ）ベクターにクローン化される。ついで、シングル鎖キメラ抗体は、外方
に向かって延びる超可変の抗原−結合部位をもつフィラメント状ファージの表面
で表示されるようになる。
【００２０】 リガンドの添加後、ここに参考として引用する公知の技術（Marks ら, J. Mol
. Biol. Vol. 222:581 (1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993)；及び W
inters ら, Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994)）を使用することによって、非
標的リガンドに対して反応性のファージがファージライブラリーから排除される
。残りのファージを、それらの特異リガンド及び選ばれた特異リガンドと反応性
であるファージと反応させる。ついで、これらのファージの各々を単離し、所望
の表面−表示抗体を含有する多量のファージを生成するために大腸菌（E. coli
）の如き細菌宿主において発現させる。DNAの合成及びクローン化、ファージの
排除、ファージの単離及び発現及びウイルスDNAの回収に関する各方法は公知で
あり、Marks ら, J. Mol. Biol. (1991)；Griffiths ら, EMBO J. 12:725 (1993
)；及び Winters ら, Ann. Rev. Immunol. 12:433 (1994)（これらのすべてを参
考として引用する）によって充分に記載されている。
【００２１】 増幅要素 リガンド−リセプター複合体形成の検出を可能にする各種の機構は増幅器とし
て機能し、装置に組み合わされる。３つの増幅機構が提案される。第１に、液晶
は、リガンドがリセプターに結合する際に生ずるディストーションを増幅する。
第２に、酵素が生物学的ケージ内に置かれ、リセプターが該生物学的ケージに付
着されて酵素−基質相互作用を阻止する。リガンドのリセプターへの付着は、基
質チャンネルを開き、その結果、酵素−基質の相互作用が生じ、これによって、
検出可能なレベルの反応生成物を生成できる。第３に、ファージ−表示抗体の如
きリセプターのリンカー領域を、酵素の活性部位を結合及び阻害するように組換
える。リセプター−リガンド複合体の形成時にリセプター−酵素複合体の分離が
生じ、その結果、酵素の活性化及び生成物の生成が生ずる。
【００２２】 液晶：液晶は、分子がいくかの配向秩序、ただし小さい位置秩序を示す物質の
状態である。この中間的オーダーリングは液晶を固体（位置及び配向秩序の両方
を有する）と等方性流体（長距離秩序を示さない）との間に位置させる。固体結
晶又は等方性流体は、温度を変化させる（サーモトロピック液晶を創製する）こ
とによって、又は適切な希釈溶媒を使用して固体結晶の濃度を変化させる（リオ
トロピック液晶を生成する）ことによって液晶へ遷移される。リオトロピック液
晶は本発明の増幅システムに使用される。
【００２３】 図１に見られるように、最良のリオトロピック液晶（符号１で示される）は、
バイフィリック分子３、例えば、極性（親水性）脂肪族部分４及び非極性（疎水
性）脂肪族部分５を有する分子用の溶媒として水２を使用して形成される。水２
がカチオン界面活性剤、塩化エチルピリジウム（C21H38ClN）の如きバイフィリ
ック分子３に添加される際、疎水性領域が合体して水２との相互作用を最少にす
ると共に、極性成分の水との相互作用を増大させるため二分子層６が形成する。
特異分子の濃度及び幾何学的形状は液晶の分子上の結晶秩序を限定する。分子は
凝集して、ネマッチク又はコレステリック相を形成するディスク様又はロッド様
のミセルと共に、ラメラを形成できる。C21H38ClNは、水及びバイフィリック分
子の交互層のラメラを形成する。配向秩序は水及びバイフィリック分子の交互層
によって創製され、このようにして、液晶は、液晶の平面に対して直角に配置さ
れた光源によって与えられる偏光７に対して不透明である（光学異方性を示す）
。
【００２４】 最良の生物学的リセプターは、親水性領域及び疎水性領域の両方を有し、この
ようにして、バイフィリックリオトロピック液晶に容易に組み込まれる。さらに
、不活性化されたリセプターは液晶の光学異方性を破壊せず、したがって、リセ
プター−富有化液晶は偏光に対して不透明ままである（図１Ｂ）。しかしながら
、光学異方性は、リセプターの配座がリセプター−リガンド複合体の形成の間に
シフトする際には崩壊される（図１Ｃ）。液晶の弾性はリセプター−リガンド複
合体の付近における局部的なディストーションを増大させ、これを光学的に検出
可能なミクロンより上のスケールまで拡大させる。生物学的物質はサーモトロピ
ック液晶の表面上で検出される（V.K. Guptaら, Science 279: 277-2080, 1998
）。しかしながら、リオトロピック液晶はリガンド−特異リセプターを容易に組
込み、したがって、生物学的分子の検出には明らかに優れている。
【００２５】 リガンド検出システムの配置 例えば、本発明の考えられる１つの適用は、マルチウエルシステムにおけるも
のである。システムの各ウエルは、本発明の増幅機構とインターフェイスされた
病原性微生物の如き特異リガンドに対するPDAを収容する。微生物因子が抗体と
相互作用する際、生ずる抗体ディストーションが増幅機構のトリガーとなる。好
ましくは、ついで増幅された信号が認知可能な信号に変換される。したがって、
このようなシステムは医師のオフィスに配置され、日常の診断操作に使用される
ことが想像される。別法として、このようなシステムを戦場の兵士又はその近く
に配置することができ、兵士に対して毒薬の存在を警戒させるために本発明を使
用できる。さらに、後述するルシフェラーゼ又はケージ化酵素の如き他の具体例
についても使用できるが、マルチウエルシステムは、好ましくは、ここに記載の
液晶の例と組み合わせて使用される。
【００２６】 このように、図１Ｂ及び図１Ｃ概略して示す本発明の１具体例では、増幅機構
としてリオトロピック液晶物質が使用される。図１Ｂに示されるように、装置は
、光源１０、第１偏光子（図の平面内に偏光方向をもつ）１２、病原体検出シス
テム（バイフィリックリオトロピック液晶物質１４ｃ内に埋め込まれたモノ特異
性抗体１４ｂでなる）１４ａ、第２偏光子（図の平面に対して直角の偏光方向を
もつ）１６、及び光検出器１８でなる。
【００２７】 操作に当たって、第１偏光子１２は図の平面内で直線的に偏光された光ビーム
２２を発生する。不活性化された装置の光学軸２０は病原体検出システム１４ａ
に対して直角であり、このようにして、直線的に偏光された光ビーム２２の複屈
折は生じない。第２偏光子１６の偏光方向が直線的に偏光された光２２に対して
直角であるため、第２偏光子は光が光検出器１８に到達することを妨げる。
【００２８】 微生物の如きリガンド２４の抗体の如きリセプターへの結合は液晶１４ｃを歪
曲させ、複屈折を誘発し、このようにして、検出可能な光を発生させる。この活
性化法を図１Ｃに示す。リセプター（抗体）１４ｂがバイフィリックリオトロピ
ック液晶１４内に埋め込まれている。抗原−抗体複合体の形成によって生じた特
殊なディストーションは接触する液晶１４ｃに伝達される。液晶の弾性特性は、
ディストーションがリセプター−リガンド複合体のサイズよりもかなり広い領域
にわたって伝達されることを可能にする。これは、リセプター−リガンド複合体
によって生じたディストーションを検出するために複屈折の標準的な光学的現象
を利用することを許容する。変成された液晶秩序は光学軸２０を傾け、複屈折を
誘発する。換言すれば、入射偏光光２２は２つの屈折した光の波動、すなわち、
相互に直角の偏光をもつ通常の波動及び異常な波動を生ずる（ここで参考として
引用するMax Born 及びE. Wolf., Principals of Optics, ６版, Pergaman Pres
s, Oxford, 1980参照）。このようにして、光学部品が第２偏光子１６の方向で
振動する一部の光２６が存在する。第２偏光子（アナライザー）１６はこの光部
分が光検出器１８に通過することを許容する。光の強さにおける検出された変化
又は増幅は認知可能な信号に電子的に変換される。
【００２９】 図２Ａ−２Ｃに概略して示す本発明の他の具体例では、増幅のため酵素−基質
相互作用が利用される。図２Ａを参照して、酵素３０は、酵素３０と基質３４と
の時期尚早の相互作用を防止するためにケージ３２内に捕捉される。基質３４は
、潜在的に、ケージ３２を横切る１以上のチャンネルを通る酵素３０へのアクセ
スを獲得できる。しかしながら、チャンネル３６は、病原性因子の不存在下では
２倍の結合能力を有する１以上のリセプター（ディアボディー）３８によって、
矢印３７で示されるようにブロックされる。
【００３０】 ディアボディーを生産するため、好ましくは、ここに参考として引用するHoll
igerらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444, 1993）に従って、それぞ
れチャンネル３６及びリガンド４８に向かう２つの別個の抗原−結合領域４０及
び４１を有するディアボディー３８を形成するために２つの抗体を結合させる。
リガンド−結合領域４０は、長鎖免疫グロブリン４２ａ及び短鎖免疫グロブリン
４３ｂでなる。リガンド−結合領域４１は長鎖免疫グロブリン４３ｂ及び短鎖免
疫グロブリン４２ｂでなる。いかなる特別な理論によって拘束されることなく、
１以上のディアボディー３８に対する結合領域４０のケージ３２上のエピトープ
への結合はチャンネル３６をブロックし、基質−酵素の相互作用を阻止する。こ
のようにして、基質３４は非模倣条件下では処理されない。
【００３１】 図２Ｂを参照して、結合領域４１がリガンド４８に付着する際、ディアボディ
ー３８のリンカー領域４４及び４６は歪曲されて、チャンネル３６が非ブロック
化されるようになり、矢印４９で示されるように基質３４がチャンネル３６を通
り、酵素３０と相互作用する。リガンド４８によって活性化されると、チャンネ
ル３６は開放されたままになり、多量の基質３４が入ることができ、作用して生
成物３４ａ及び３４ｂ（発色性又は蛍光性である着色生成物である）を生産する
。ついで、生成物３４ａ及び３４ｂの一方又は両方が検出又は増幅され、認知可
能な信号に変換される。
【００３２】 当業者であれば、ケージ３２として各種の球状構造体、好ましくはタンパク質
が使用されることは理解できるであろうが、酵素ケージとしての作用については
α−２−マクログロブリンが特によく研究されているがこれは、いくつかの酵素
（トリプシン及びトロンビンを含む）がα−２−マクログロブリンを部分的に劣
化し、タンパク質に入り込み、及び単にα−２−マクログロブリン及び酵素を混
合することによって捕捉されるようになるためである。
【００３３】 酵素３０は、分子ケージに捕捉され、その基質の検出可能な変化を生ずるいか
なるものでもよい。当業者であれば、無数の酵素−基質ペアが検出可能であり、
したがって、好適であることが理解されるであろう。例えば、トロンビン及びト
リプシンは好適な２つの酵素である。好適な基質は、認識部位及び酵素−基質結
合の際に検出可能な発色の変化を生ずる発色団を有する。
【００３４】 リンカー領域４４及び４６は、基質３４がリガンド４８の抗原結合領域４１へ
の結合の際にチャンネル３６に入ることができるように組換えられる。リンカー
領域４４及び４６は好ましくは中位の長さのものである。当業者は、リンカー領
域の長さが短すぎる又は長すぎる場合には、これらの領域は、チャンネル３６を
脱ブロック化するようには適切に歪曲しないことを理解するであろう。リンカー
領域の長さの好適な範囲は、主としてケージ３２及びチャンネル３６の性質に左
右される。
【００３５】 リンカー領域４４及び４６も、好ましくは、イオン、水素、又は他の結合によ
って一緒に結合される。そうでなければ、リンカー領域４４及び４６は分離に影
響され易く、その結果、病原性因子の結合の際に不適切なディストーションを生
ずる。
【００３６】 図３Ａ−３Ｃに概略して示す本発明の他の具体例も酵素−基質増幅機構を使用
する。図３Ａに示されるように、シングル鎖キメラ抗体５０は、リンカー領域５
２が特異的に酵素５４と結合して、矢印５８によって示されるように酵素５４へ
の基質５６の結合を阻害するように組換えられる。この具体例では、リンカー領
域５２は、酵素５４の活性部位に対して相補性であるそのポリペプチド配列の一
部を有する。好適な相補性ポリペプチドの決定に関する技術は公知である。
【００３７】 図３Ｂに示されるように、抗体５０の結合領域６０がリガンド６２を結合する
と、リンカー領域における配座の変化は酵素５４からの抗体５０の解離を生ずる
。遊離された酵素５４は今や基質に作用できる。遊離された各々の酵素は多量の
基質と反応して、増幅された信号を提供できる。単なる例として、特に好適な具
体例を図３Ｃ（ルシフェラーゼの如き酵素がどのようにその基質を変性するか、
この例では、ルシフェラーゼの酸化及び解離を生ずるかを示す）に示した。この
反応は、反応生成物のピコグラムレベル以下で検出可能な蛍光性の化学種５７ａ
及び非蛍光性の化学種５７ｂを生成する。ついで、蛍光性の化学種５７は検出又
は増幅され、認知可能な信号に変換される。酵素５４は、その基質の検出可能な
変換を生ずるいかなる酵素でもよい。
【００３８】 実験例 液晶増幅機構 液晶増幅機構を使用するリガンド検出システムを開発した。大腸菌リポ多糖類
（LPS）（グラム陰性細菌について見られる表面抗原）に対するネズミ抗体を市
販の源（Biodesign International, cat. #C61212M, クローン #26-5, lot #5D1
197）から入手し、ｐＨ７.２の滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）で希釈（１
：１０）してサンプル100 ng/μlを得た。
【００３９】 大腸菌の後期対数期培養物をブレーンハートインフュージョン（BHI）中で増
殖させ、０.９％滅菌生理食塩水で洗浄して生育培地を除去した。細菌の数（600
nmにおける光学密度によって測定；コロニー−形成単位（CFUs））を増殖曲線デ
ータから外挿法によって定量した。ついで、細菌を滅菌生理食塩水での希釈によ
って４.６×１０1CFU／５μlに調節した。
【００４０】 混合物の相状態の制御を助けるため補助界面活性剤としてヘキサノールを使用
して、ラメラ相においてリオトロピック液晶溶液を調製した。塩化セチルピリジ
ウム（CpCl）をヘキサノールとヘキサノール／CpCl＝0.651（w/w）の割合で合わ
せた。ついで、混合物を食塩水（水中NaCl１％）によって食塩水８５重量％とな
るまで希釈した。得られた液晶はラメラではあるが、ミセル相に近いものであっ
た（Nastishin, Langmuir. Vol. 12, pp. 5011-5015, 1996；ここに参考として
引用する）。この相では、リオトロピック液晶はバイフィリックであり、このよ
うにして、いくつかの異なった種類のリセプターと相互作用できる。
【００４１】 テスト用の検出システムを、ヘキサノール／CpCl／食塩水リオトロピック液晶
にリセプターを挿入することによって作製した。各アッセイについて、大腸菌（
LPS）に対して特異的に反応性の抗体（500ng）溶液５μlをリオトロピック液晶
溶液５μlに添加し、混合した。ついで、実験サンプル（５μl）を一定量（１０
μl）の液晶−抗体混合物に添加し、混合した。実験サンプルを次のように抗体
−液晶混合物に添加した：サンプルＡ−大腸菌（４.６×１０1 CFU）(システム
によって検出される予定の特殊な細菌)５μl；サンプルＢ−PBS５μl、又はサン
プルＣ−Ｓ．アウレウス（Ｓ. Aureus）（２×１０6 CFU）（システムが検出で
きない不適切な細菌）５μl。サンプルを遠心分離（3,500×ｇ；５秒）して泡を
除去し、反応混合物１０μlをエタノールで浄化した顕微鏡スライドに置き、エ
タノールで浄化したガラスカバースリップで覆い、偏光光を使用して複屈折につ
いて混合物を評価した。実験条件及び結果を表１に示す。抗体がその特異的な抗
原に結合した場合にのみ複屈折が生じ、複屈折における目視により認識可能な変
化は、４６−460 CFU／５μl程度の細菌濃度について検出された。
【００４２】
【表１】 サンプル 抗体(LPS) 大腸菌 S.アウレウス PBS 液晶 複屈折 Ａ 500 ng 4.6×101 − − ５μl 有 Ｂ 500 ng − − ５μl ５μl 無 Ｃ 500 ng − ２×106 − ５μl 無 他の実験では、LPS抗体、大腸菌（２.７×１０７CFU）及び液晶物質を、上記
実験例と同様にして反応させ、代表的な顕微鏡写真（110×倍率；図４Ａ、４Ｂ
及び４Ｃ）をBio-Quantイメージ分析システムによって評価した。イメージ分析
は、大腸菌、PBS、又はＳ．アウレウスをリセプター−リガンド結合システムに
よって評価した際の伝わる光の透過率を定量的に比較するために行ったものであ
る。写真イメージをデジタル化し、下記の式に従って積分光学密度（IOD）を自
動的に算定した。
【００４３】
【式１】
【００４４】 図５に示す得られたデータは、液晶が抗体の大腸菌（LPS）への結合を増幅す
る際の伝わる光の透過率の充分な増加が生じたことを示した。
【００４５】 ケージ化酵素増幅機構 α−２−マクログロブリン増幅機構の感受性を実証した。ヒトα−２−マクロ
グロブリン（α2Ｍ，Calbiochem Co., 生成物番号441251）、トリプシン（Sigma
Chemical Co., T-8003）及びトロンビン（Sigma Chemical Co., T-4648）の標
準２mg/100μl溶液を、０.１Ｍ HEPES 緩衝液（ｐＨ７.６）にプロテアーゼ又は
アンチプロテアーゼを溶解させることによって調製した。α2Ｍ及び酵素の１つ
に等しい容量（100μl）を混合し、室温において１０分間相互作用させ、ついで
４℃に冷却させた。サンプル200μlを、Sephadex Ｇ-100を充填したゲル瀘過カ
ラム（１cm×２４cm；床容量 18.8ml；流量 0.44ml/分；４℃の冷たい室内に設
置）に加えて、未複合化酵素からケージ化酵素を分離した。カラム溶離剤を１.
０mlのフラクションで集めた。各フラクションにおけるタンパク質濃度を測定す
るため280nmにおける光吸収率の変化を測定し、ケージ化酵素を含有するフラク
ションを同定するため酵素の活性度を測定した。これらの測定の結果（図６Ａ及
び６Ｂに示す）は、フラクション１５−１７がケージ化酵素の比較的純なサンプ
ルを含有していることを示した。これらのフラクションを次の評価に使用した。
【００４６】 それぞれケージ化トリプシン（図６Ｃ）及びケージ化トロンビン（図６Ｄ）の
酵素の活性度を測定するために、合成基質、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−arg−ｐ−ニ
トロアナライド及びＮ−ｐ−トシル−gly−pro−arg−ｐ−ニトロアナライドを
使用した。いずれのシステムも用量反応特性を発揮するが、ケージ化トロンビン
はより高い感度を示した。酵素の活性度は継時的にも劣化しない。ケージ化トリ
プシンの酵素活性度は、４℃で６日間保存した後も未変化にままであった。同様
に、ケージ化トロンビンの活性度は、調製後２４時間で測定した際にも安定であ
った。
【００４７】 ルシフェラーゼ増幅機構 ルシフェラーゼに基づく増幅機構の例外的な感度を、Berthold Lumat Luminom
eterを使用して実証した。Luminometerの反応チャンバーに、各種の量のルシフ
ェラーゼ（0.15％NaCl ４mg/ml，１０mM HEPES，１mM EDTA，２mM MgCl2，２mM
ジチオトレイトール；Sigma Chemical Co.）を添加した。反応チャンバーに、５
０mM HEPES緩衝液（ｐＨ７.８）中に０.５nmルシフェラーゼ（Progema, E1483）
、０.５mMアデノシン三リン酸（Sigma Chemical Co., A-7699）、５mM MgSO4、
１.０mMジチオトレイトール（Sigma Chemical Co.）を含む溶液を迅速に注入す
ることによって酵素の反応を開始させた。図７Ｂは、酵素濃度わずか0.0017％で
検出可能なルシフェラーゼの活性度が測定され、酵素濃度における進行評価によ
って活性度の直線的な増加が観察されることを示している。
【００４８】 いかなる変更も請求の範囲に記載した発明の範囲に属するものであり、特異抗
体、ケージ化酵素、リセプター−脱活性化酵素又は液晶の選択は、ここに開示し
、記載した発明の精神を逸脱することなく決定されることが理解されなければな
らない。また、特に病原体の検出について研究されているが、本発明はいかなる
リガンドの検出も包含するものであることが理解されなければならない。さらに
、本発明の範囲は請求の範囲に記載した範囲に属するすべての変形及び変更も包
含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 水及びバイフィリック分子の交互相によって形成されたリオトロピック液晶の
層状構造体を概略して示す図である。
【図１Ｂ】 リオトロピック液晶に挿入されたリセプターをもつ増幅機構を概略して示す図
である。
【図１Ｃ】 液晶の変形及び偏光の透過率の変更を生ずるリセプターに結合した特異リガン
ドをもつ増幅機構を概略して示す図である。
【図２Ａ】 １以上のリセプターがリガンドの不存在下において酵素につながるチャンネル
をブロックするケージ化酵素増幅機構を概略して示す図である。
【図２Ｂ】 リガンドがリンカー領域のディストーション及び酵素につながるチャンネルの
非ブロッキングを生ずるリセプターに結合するケージ化酵素増幅機構を概略して
示す図である。
【図２Ｃ】 リセプターへのリガンドの結合によって活性化された後、酵素につながるチャ
ンネルは開放されたままであり、多量の基質が酵素と相互作用できるケージ化抗
体増幅機構を概略して示す図である。
【図３Ａ】 分子組換えされたリセプターによって非活性化された酵素を概略して示す図で
ある。
【図３Ｂ】 酵素の活性部位が基質にさらされる際、リセプターのリガンドからの解離を生
ずる分子組換えされたリセプターへのリガンドの結合を概略して示す図である。
【図３Ｃ】 ピコレベルのリガンドがリセプターに結合された後における酵素による基質の
変換を概略して示す図である。
【図４Ａ】 特異リガンドのリセプターへの結合に応答して液晶−リセプターアレイを通る
偏光された光の複屈折を表す写真である。
【図４Ｂ】 液晶、リセプター及びPBSを含有する反応混合物では液晶−リセプターアレイ
を通る偏光された光の複屈折が存在しないことを表す写真である。
【図４Ｃ】 液晶、リセプター及び不適切なリガンドを含有する反応混合物では液晶−リセ
プターアレイを通る偏光された光の複屈折が存在しないことを表す写真である。
【図５】 非選択的リセプター−リガンド結合及びバックグラウンドリセプター−リガン
ド結合と比較して、選択的リセプター−リガンド結合用のリガンド検出システム
の液晶−リセプターアレイを通る偏光された光の複屈折の定量分析を表すグラフ
である。
【図６Ａ】 α−２−マクログロブリン−トリプシン複合体を含有する溶出フラクションの
酵素活性度を表すグラフである。
【図６Ｂ】 α−２−マクログロブリン−トリプシン複合体を含有する溶出フラクションの
タンパク質濃度（μg/ml）を表すグラフである。
【図６Ｃ】 時間（分）に対する検出可能な酵素活性度に及ぼすケージ化トリプシンの濃度
の影響を表すグラフである。
【図６Ｄ】 時間（分）に対する検出可能な酵素活性度に及ぼすケージ化トロンビンの濃度
の影響を表すグラフである。
【図６Ｅ】 時間（日）に対するケージ化トリプシンの安定性を表すグラフである。
【図７Ａ】 時間（秒）に対するルシフェラーゼの活性度（相対光単位）を表すグラフであ
る。
【図７Ｂ】 ルシフェラーゼの濃度（pg/μl）を関数とするルシフェラーゼの活性度（相対
光単位）を表すグラフである。
【符号の説明】
１ リオトロピック液晶 ２ 水 ３ バイフィリック分子 ４ 極性脂肪族部分 ５ 非極性脂肪族部分 ６ 二分子層 １０ 光源 １２ 第１偏光子 １４ａ 病原体検出システム １４ｂ モノ特異性抗体 １４ｃ バイフィリックリオトロピック液晶物質 １６ 第２偏光子 １８ 光検出器 ２２ 光ビーム ２６ 光 ３０、５４ 酵素 ３２ ケージ ３４、５６ 基質 ３６ チャンネル ３８ ディアボディー ４０、４１ リガンド結合領域 ４２ａ、４３ｂ 長鎖免疫グロブリン ４２ｂ、４３ａ 短鎖免疫グロブリン ４４、４６ リンカー領域 ４８ リガンド ５０ シングル鎖キメラ抗体 ５７ａ 蛍光化学種 ５７ｂ 非蛍光化学種
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ドーン キャサリーン ジェー アメリカ合衆国 オハイオ 44266 ラベ ンナ レイクウッド・ロード 4751 (72)発明者 ラブレントビチ オレグ アメリカ合衆国 オハイオ 44240 ケン ト ロク・マリー・アベニュー 5933 (72)発明者 シュミット スティーブン ピー アメリカ合衆国 オハイオ 44313 アク ロン オーチャード・ロード 44 (72)発明者 サインズ スティーブン エー アメリカ合衆国 オハイオ 44236 ハド ソン グロトン・ドライブ 1616

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リガンドを検出するためのシステムにおいて、少なくとも１つのリセプター；
    及び該リセプターと組み合わされた増幅機構からなり、前記増幅機構はリセプタ
    ーがリガンドに結合する際に増幅された信号を発生することを特徴とする、リガ
    ンド検出システム。
  2. 【請求項２】 リセプターが、モノクロナール、ポリクロナール及び分子組換抗体でなる群か
    ら選ばれる抗体である、請求項１記載のシステム。
  3. 【請求項３】 リガンドが病原性因子である、請求項１記載のシステム。
  4. 【請求項４】 増幅機構が、組み込まれたリセプターを有する液晶物質を含むものである、請
    求項１記載のシステム。
  5. 【請求項５】 増幅された信号が液晶物質の光学的特性の変化によって発生される、請求項１
    記載のシステム。
  6. 【請求項６】 増幅機構が生物学的／分子ケージ３２内の酵素３０からなり；及びリセプター
    ３８が生物学的／分子ケージ３２に結合され、及び増幅された信号が、リセプタ
    ーがリガンドに結合した後に多くの基質分子に対して酵素が作用することによっ
    て発生される、請求項１記載のシステム。
  7. 【請求項７】 生物学的／分子ケージが球状タンパク質である、請求項６記載のシステム。
  8. 【請求項８】 生物学的／分子ケージがα−２−マクログロブリンである、請求項６記載のシ
    ステム。
  9. 【請求項９】 リセプターが、モノクロナール、ポリクロナール及び分子組換抗体でなる群か
    ら選ばれる抗体である、請求項６記載のシステム。
  10. 【請求項１０】 リセプターが特異リガンドに結合する、請求項６記載のシステム。
  11. 【請求項１１】 リセプターが、リガンド−結合領域、及びリンカー領域によって接続されたケ
    ージ−結合領域を有する抗体である、請求項６記載のシステム。
  12. 【請求項１２】 リセプターがリガンドの結合前にチャンネルをブロックするものであり、及び
    ケージがリガンドの結合後に基質分子が通過するチャンネルを有するものである
    、請求項６記載のシステム。
  13. 【請求項１３】 リセプターが抗体であり、リガンドが病原性因子である、請求項６記載のシス
    テム。
  14. 【請求項１４】 増幅機構が基質のための活性部位を有する酵素を含むものであり、及びリセプ
    ターがリガンドの結合前では基質−酵素相互作用を阻害し、及び酵素がリガンド
    の結合の際に遊離され、及び増幅された信号が基質−酵素相互作用の結果として
    発生される、請求項１記載のシステム。
  15. 【請求項１５】 リセプターが抗体であり、リガンドが病原性因子である、請求項１４記載のシ
    ステム。
  16. 【請求項１６】 増幅された信号が蛍光光度の変化である、請求項１４記載のシステム。
  17. 【請求項１７】 酵素がルシフェラーゼである、請求項１４記載のシステム。
  18. 【請求項１８】 抗体が、モノクロナール、ポリクロナール及び分子組換抗体でなる群から選ば
    れるものである、請求項１４記載のシステム。
  19. 【請求項１９】 リセプターが、リガンドの結合前に酵素の活性部位をに結合するリンカー領域
    を有するものである、請求項１４記載のシステム。
  20. 【請求項２０】 リガンドの存在を検出及び監視するための装置において、各々予め決められた
    リセプターを有する多数のウエル；及び特異リガンドがその予め決められたリセ
    プターに結合する際に活性化される前記予め決められたリセプターと組み合わさ
    れた増幅機構からなることを特徴とする、リガンドの存在を検出及び監視する装
    置。
  21. 【請求項２１】 リセプターが抗体である、請求項２０記載の装置。
  22. 【請求項２２】 抗体が、モノクロナール、ポリクロナール及び分子組換抗体でなる群から選ば
    れるものである、請求項２１記載の装置。
  23. 【請求項２３】 増幅機構が結合の際に増幅された信号を発生する、請求項２２記載の装置。
  24. 【請求項２４】 前記増幅された信号が認知可能な信号に変換される、請求項２３記載の装置。
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