JP2002516658A - 胎盤タンパク質１３ - Google Patents
胎盤タンパク質１３Info
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Abstract
(57)【要約】
胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）の完全アミノ酸及びＤＮＡ配列が開示される。種々のＰＰ１３由来のペプチド断片及びＰＰ１３の製造のための組換え方法も記載される。ＰＰ１３は妊娠関連合併症のためのスクリーニング及び診断方法に使用することができる。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は胎盤タンパク質（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びその使
用に関する。
用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 本明細書において括弧内の番号により示された参考文献は明細書の末尾に列挙
される。
される。
【０００３】 妊娠管理の目標は、母親及び新生児の両方の良好な状態に悪影響しうる合併症
（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を生じることなく成熟した健康な赤ん坊を出産
することである。有意な百分率の妊娠が種々の疾患により冒されている。これら
の合併症は中でも、早産（ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ）、子宮内成長遅延（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａ
ｒｄａｔｉｏｎ）及び子かん前症（ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）である。これら
の状態は、患者及び保健システムの両方に対する莫大なコストで冒された妊娠の
結果に負の強い影響を与える。
（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を生じることなく成熟した健康な赤ん坊を出産
することである。有意な百分率の妊娠が種々の疾患により冒されている。これら
の合併症は中でも、早産（ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ）、子宮内成長遅延（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａ
ｒｄａｔｉｏｎ）及び子かん前症（ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）である。これら
の状態は、患者及び保健システムの両方に対する莫大なコストで冒された妊娠の
結果に負の強い影響を与える。
【０００４】 胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）はヒト胎盤組織からこれまでに単離されたタ
ンパク質である（Ｂｏｈｎ等に対する米国特許第４５００４５１号、この内容は
引用により本明細書に組み込まれる）。このタンパク質は下記のパラメーター：
電気泳動移動度、等電点、沈降係数、超遠心分離により決定された分子量、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより決定された分子量、吸光係数及び炭水化物含有率により特徴
付けられる。アミノ酸組成（１００残基当たりの残基）は決定されたがアミノ酸
配列は決定されなかった。
ンパク質である（Ｂｏｈｎ等に対する米国特許第４５００４５１号、この内容は
引用により本明細書に組み込まれる）。このタンパク質は下記のパラメーター：
電気泳動移動度、等電点、沈降係数、超遠心分離により決定された分子量、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより決定された分子量、吸光係数及び炭水化物含有率により特徴
付けられる。アミノ酸組成（１００残基当たりの残基）は決定されたがアミノ酸
配列は決定されなかった。
【０００５】 ＰＰ１３は３つの特異的妊娠関連疾患；子宮内成長遅延、子かん前症及び早産
の早期検出のためのアッセイを開発するのに使用された（シルバーマン（Ｓｉｌ
ｂｅｒｍａｎ）への米国特許第５１９８３６６号）。それぞれ標識されたＰＰ１
３及び抗ＰＰ１３抗血清（ａｎｔｉ ＰＰ１３ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）を使用す
るラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が開示されている。ＰＰ１３の更なる性質についてはシルバーマン特許には開示
されていない。
の早期検出のためのアッセイを開発するのに使用された（シルバーマン（Ｓｉｌ
ｂｅｒｍａｎ）への米国特許第５１９８３６６号）。それぞれ標識されたＰＰ１
３及び抗ＰＰ１３抗血清（ａｎｔｉ ＰＰ１３ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）を使用す
るラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が開示されている。ＰＰ１３の更なる性質についてはシルバーマン特許には開示
されていない。
【０００６】 （本発明の簡単な要約） 本発明の目的は純粋なＰＰ１３タンパク質を提供することである。
【０００７】 本発明の更なる目的はＰＰ１３をコードしているＤＮＡ分子を提供することで
ある。
ある。
【０００８】 本発明の更に他の目的はＰＰ１３を製造するための組換え方法を提供すること
である。
である。
【０００９】 従って、本発明の目的は妊娠合併症の早期検出のためのＰＰ１３に基づく診断
アッセイを提供することである。
アッセイを提供することである。
【００１０】 本発明の他の目的はこのような診断アッセイに使用することができるＰＰ１３
由来の免疫原性ペプチドを提供することである。
由来の免疫原性ペプチドを提供することである。
【００１１】 本発明の１つの観点に従えば、（ａ）図２（配列番号：９）に示されたアミノ
酸配列を有する胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）、（ｂ）ＰＰ１３に含まれるア
ミノ酸の配列を有しそしてＰＰ１３に特異的に結合する抗体に結合するポリペプ
チド、（ｃ）ＰＰ１３に特異的に結合する抗体へのタンパク質又はポリペプチド
の結合能力を減少させることなく１つ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換され
ている（ａ）又は（ｂ）のタンパク質又はポリペプチド、及び（ｄ）（ａ）又は
（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はポ
リペプチドから成る群より選ばれるタンパク質又はポリペプチドが提供される。
酸配列を有する胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）、（ｂ）ＰＰ１３に含まれるア
ミノ酸の配列を有しそしてＰＰ１３に特異的に結合する抗体に結合するポリペプ
チド、（ｃ）ＰＰ１３に特異的に結合する抗体へのタンパク質又はポリペプチド
の結合能力を減少させることなく１つ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換され
ている（ａ）又は（ｂ）のタンパク質又はポリペプチド、及び（ｄ）（ａ）又は
（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はポ
リペプチドから成る群より選ばれるタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００１２】 本発明の他の観点によれば、上記のタンパク質又はポリペプチドをコードして
いるＤＮＡ分子が提供される。
いるＤＮＡ分子が提供される。
【００１３】 本発明の他の観点に従えば、（ａ）妊娠した婦人の血清サンプルを提供し、（
ｂ）該血清サンプル中のＰＰ１３又はＰＰ１３由来のペプチドのレベルを決定し
、そして（ｃ）該決定されたレベルを同じ妊娠年齢の婦人の所定の正常のレベル
と比較し、両レベル間の偏差が妊娠関連合併症を指示する、工程を含むことを特
徴とする妊娠関連合併症のスクリーニングの方法が提供される。
ｂ）該血清サンプル中のＰＰ１３又はＰＰ１３由来のペプチドのレベルを決定し
、そして（ｃ）該決定されたレベルを同じ妊娠年齢の婦人の所定の正常のレベル
と比較し、両レベル間の偏差が妊娠関連合併症を指示する、工程を含むことを特
徴とする妊娠関連合併症のスクリーニングの方法が提供される。
【００１４】 本発明の１つの態様によれば、工程（ｂ）の決定は該タンパク質又はポリペプ
チドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体によりなされる。
チドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体によりなされる。
【００１５】 本発明の更に他の観点によれば、該ＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、該発
現ベクターを宿主細胞に挿入し、そして挿入されたベクターの発現を許容する条
件下に該宿主細胞をインキュベーションすることを含むことを特徴とするＰＰ１
３の製造のための組換え方法が提供される。
現ベクターを宿主細胞に挿入し、そして挿入されたベクターの発現を許容する条
件下に該宿主細胞をインキュベーションすることを含むことを特徴とするＰＰ１
３の製造のための組換え方法が提供される。
【００１６】 本発明は、ＰＰ１３の全アミノ酸配列及びその全ｃＤＮＡ配列を初めて提供す
る。この情報は多数の用途に利用することができる。例えば、典型的には改変さ
れたタンパク質がＰＰ１３との７５％の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を保持して
いる、１つ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている改変されたＰＰ１３
タンパク質相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）及び類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）
を製造することができる。その全配列が知られているタンパク質のアミノ酸配列
を改変するための方法は当該技術分野において周知であり、そして例えば化学的
合成、制御された突然変異誘発及び組換え方法を包含する。このような改変され
たタンパク質は、例えば、シルバーマンに記載された妊娠関連疾患の早期検出の
ためのイムノアッセイで使用するための優れた免疫原性及び免疫特異性（例えば
改変されたタンパク質は他のタンパク質と共通の免疫エピトープが欠けているこ
とがある）のような種々の用途において自然のＰＰ１３に勝る優れた性質を有す
ることがある。
る。この情報は多数の用途に利用することができる。例えば、典型的には改変さ
れたタンパク質がＰＰ１３との７５％の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を保持して
いる、１つ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている改変されたＰＰ１３
タンパク質相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）及び類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）
を製造することができる。その全配列が知られているタンパク質のアミノ酸配列
を改変するための方法は当該技術分野において周知であり、そして例えば化学的
合成、制御された突然変異誘発及び組換え方法を包含する。このような改変され
たタンパク質は、例えば、シルバーマンに記載された妊娠関連疾患の早期検出の
ためのイムノアッセイで使用するための優れた免疫原性及び免疫特異性（例えば
改変されたタンパク質は他のタンパク質と共通の免疫エピトープが欠けているこ
とがある）のような種々の用途において自然のＰＰ１３に勝る優れた性質を有す
ることがある。
【００１７】 更に、ペプチド断片をＰＰ１３から製造することができ、そしてこのようなペ
プチドは完全タンパク質（ｆｕｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）に関して上記したように
改変されうる。これらのペプチドは種々の用途に使用することもできる。例えば
、免疫原性タンパク質は、該タンパク質に対する免疫応答を備える（ｍｏｕｎｔ
）ように免疫系を誘導する特異的アミノ酸配列又はエピトープを有することは周
知である。上記ペプチドはエピトープを同定するようにＰＰ１３のエピトープの
存在について試験されることができる。エピトープを含むペプチドは次いで妊娠
疾患のイムノアッセイに使用することができる。多数のＰＰ１３由来のペプチド
が以下に開示される。
プチドは完全タンパク質（ｆｕｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）に関して上記したように
改変されうる。これらのペプチドは種々の用途に使用することもできる。例えば
、免疫原性タンパク質は、該タンパク質に対する免疫応答を備える（ｍｏｕｎｔ
）ように免疫系を誘導する特異的アミノ酸配列又はエピトープを有することは周
知である。上記ペプチドはエピトープを同定するようにＰＰ１３のエピトープの
存在について試験されることができる。エピトープを含むペプチドは次いで妊娠
疾患のイムノアッセイに使用することができる。多数のＰＰ１３由来のペプチド
が以下に開示される。
【００１８】 純粋なＰＰ１３タンパク質又は誘導ペプチド（ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ）を使用してＰＰ１３に対する抗体を製造することができる。ポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体が当業者に周知の標準的方法により製造されうる。
ｅ）を使用してＰＰ１３に対する抗体を製造することができる。ポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体が当業者に周知の標準的方法により製造されうる。
【００１９】 上記抗体並びにタンパク質及びペプチドは、子宮内成長遅延、早産及び子かん
前症の如き妊娠関連合併症の検出のための診断又はスリーニングアッセイを作成
するのに使用することができる。このようなアッセイの例はシルバーマンに詳述
されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれ、そしてラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。一般に
、このようなアッセイは、妊娠した婦人の血清サンプルを得、イムノアッセイに
より血清サンプル中のＰＰ１３又は誘導ペプチドのレベルを決定し、そして決定
されたレベルを同じ妊娠年齢の婦人の所定の通常のレベルと比較する工程を含む
であろう。これらのレベル間の統計的に有意な偏差は妊娠関連合併症を指示する
であろう。
前症の如き妊娠関連合併症の検出のための診断又はスリーニングアッセイを作成
するのに使用することができる。このようなアッセイの例はシルバーマンに詳述
されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれ、そしてラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。一般に
、このようなアッセイは、妊娠した婦人の血清サンプルを得、イムノアッセイに
より血清サンプル中のＰＰ１３又は誘導ペプチドのレベルを決定し、そして決定
されたレベルを同じ妊娠年齢の婦人の所定の通常のレベルと比較する工程を含む
であろう。これらのレベル間の統計的に有意な偏差は妊娠関連合併症を指示する
であろう。
【００２０】 上記したように、ＰＰ１３の完全なｃＤＮＡがここで初めて開示される。ＰＰ
１３の全アミノ酸配列も開示されるので、遺伝子暗号の縮重によりＰＰ１３をコ
ードしている種々のＤＮＡ分子を製造することができる。更に、ストリンジェン
トな条件下にこれらのＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションすることができるＤ
ＮＡ分子を製造することもできる。このＤＮＡ分子はＰＰ１３の製造のための組
換え方法において使用することができる。このような方法は当該技術分野で周知
であり、そしてプラスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡの如き発現ベクターに
ＤＮＡ分子を挿入することを含む。次いで発現ベクターをバクテリア細胞又は真
核細胞、例えば酵母、植物、哺乳動物又は昆虫細胞の如き適合性宿主細胞（ｃｏ
ｍｐａｔｉｂｌｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）に挿入する。宿主細胞を挿入されたベ
クターの発現を誘発する条件下にインキュベーションし、それによりＰＰ１３を
生成させる。
１３の全アミノ酸配列も開示されるので、遺伝子暗号の縮重によりＰＰ１３をコ
ードしている種々のＤＮＡ分子を製造することができる。更に、ストリンジェン
トな条件下にこれらのＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションすることができるＤ
ＮＡ分子を製造することもできる。このＤＮＡ分子はＰＰ１３の製造のための組
換え方法において使用することができる。このような方法は当該技術分野で周知
であり、そしてプラスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡの如き発現ベクターに
ＤＮＡ分子を挿入することを含む。次いで発現ベクターをバクテリア細胞又は真
核細胞、例えば酵母、植物、哺乳動物又は昆虫細胞の如き適合性宿主細胞（ｃｏ
ｍｐａｔｉｂｌｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）に挿入する。宿主細胞を挿入されたベ
クターの発現を誘発する条件下にインキュベーションし、それによりＰＰ１３を
生成させる。
【００２１】 例えば、ＰＰ１３をコードしているＤＮＡはＬａｃＺプロモーター、Ｔ７又は
Ｔ４ポリメラーゼプロモーター、熱ショックプロモーター（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）等のような誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｐｒｏｍｏｔｏｒ）の制御下に発現ベクターに挿入されうる。発現ベクターの１
つの例はｐＱＥ発現ベクター（ＱＬＡＧＥＮ）である。ｐＱＥベクターは大腸菌
（Ｅ，ｃｏｌｉ）における６＊Ｈｉｓアフィニティタグ（６＊Ｈｉｓ ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ ｔａｇ）を含むタンパク質の高レベル発現を与える。ｐＱＥは大腸菌
ファージＴ５プロモーター及び２つのｌａｃオペレーター配列から成る調節可能
なプロモーター（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を含む。次いで
ベクターをコンピテントＭ１５［ＰＲＥＰ４］大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｖｉ
ｌｌａｒｅｊｏ ａｎｄ Ｚａｂｉｎ、１９７４）に挿入する。Ｍ１５宿主細胞
は、ｌａｃリプレッサーをコードしているｌａｃＩ遺伝子を有するプラスミドｐ
ＲＥＰＡの多数のコピーを含む。宿主細胞を、挿入されたベクターの発現を急速
に誘発するＩＰＴＧと共にインキュベーションし、それによりＰＰ１３を生成さ
せる。当業者には周知であるとおり、多くの他の系をＰＰ１３発現のために使用
することもできる。
Ｔ４ポリメラーゼプロモーター、熱ショックプロモーター（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）等のような誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｐｒｏｍｏｔｏｒ）の制御下に発現ベクターに挿入されうる。発現ベクターの１
つの例はｐＱＥ発現ベクター（ＱＬＡＧＥＮ）である。ｐＱＥベクターは大腸菌
（Ｅ，ｃｏｌｉ）における６＊Ｈｉｓアフィニティタグ（６＊Ｈｉｓ ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ ｔａｇ）を含むタンパク質の高レベル発現を与える。ｐＱＥは大腸菌
ファージＴ５プロモーター及び２つのｌａｃオペレーター配列から成る調節可能
なプロモーター（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を含む。次いで
ベクターをコンピテントＭ１５［ＰＲＥＰ４］大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｖｉ
ｌｌａｒｅｊｏ ａｎｄ Ｚａｂｉｎ、１９７４）に挿入する。Ｍ１５宿主細胞
は、ｌａｃリプレッサーをコードしているｌａｃＩ遺伝子を有するプラスミドｐ
ＲＥＰＡの多数のコピーを含む。宿主細胞を、挿入されたベクターの発現を急速
に誘発するＩＰＴＧと共にインキュベーションし、それによりＰＰ１３を生成さ
せる。当業者には周知であるとおり、多くの他の系をＰＰ１３発現のために使用
することもできる。
【００２２】 妊娠関連合併症を診断するためのキットを本発明に基づいて製造することがで
きる。このようなキットは、例えば、下記の成分：（１）ＰＰ１３に特異的に結
合することができる抗体、（２）例えばラジオアクテイブマーカー、蛍光マーカ
ー又は酵素マーカーにより標識されたＰＰ１３、（３）既知の濃度のＰＰ１３標
準溶液及び（４）アッセイにおいて生成された信号を検出するための手段を含ん
で成ることができる。このような手段は、例えば、ＰＰ１３結合性抗体に対して
生じた抗血清であることができる。
きる。このようなキットは、例えば、下記の成分：（１）ＰＰ１３に特異的に結
合することができる抗体、（２）例えばラジオアクテイブマーカー、蛍光マーカ
ー又は酵素マーカーにより標識されたＰＰ１３、（３）既知の濃度のＰＰ１３標
準溶液及び（４）アッセイにおいて生成された信号を検出するための手段を含ん
で成ることができる。このような手段は、例えば、ＰＰ１３結合性抗体に対して
生じた抗血清であることができる。
【００２３】 （図面の詳細な説明） 本発明は下記の図面に関してなされる好ましい態様の詳細な説明からより良く
理解されるであろう。
理解されるであろう。
【００２４】 図１は、発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）（
ＥＳＴ）データベース（受け入れ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｒ２４６１４）からの
ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド及び推定されたアミノ酸配列を示す。配列決定され
たペプチドと同様な領域は下線を施している。ＰＰ１３由来のペプチド＃３（図
１）はこのｃＤＮＡとの部分的な同一性（ｐａｒｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）
を共有することが見いだされ（赤い下線を引いた文字）、そしてペプチド＃４、
＃５及び＃６はＥＳＴデータベース配列に１００％同じである。３９０塩基対ｃ
ＤＮＡ（３９０−ｂｃ ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列はオープンリーディング
フレーム（１１８アミノ酸）の翻訳を伴って示される。ヌクレオチド３３におけ
る推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むコザック様（Ｋｏｚａｋ−ｌｉｋｅ）翻訳開
始配列は星印を付けられている。ヌクレオチド番号は左に示されている。
ＥＳＴ）データベース（受け入れ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｒ２４６１４）からの
ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド及び推定されたアミノ酸配列を示す。配列決定され
たペプチドと同様な領域は下線を施している。ＰＰ１３由来のペプチド＃３（図
１）はこのｃＤＮＡとの部分的な同一性（ｐａｒｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）
を共有することが見いだされ（赤い下線を引いた文字）、そしてペプチド＃４、
＃５及び＃６はＥＳＴデータベース配列に１００％同じである。３９０塩基対ｃ
ＤＮＡ（３９０−ｂｃ ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列はオープンリーディング
フレーム（１１８アミノ酸）の翻訳を伴って示される。ヌクレオチド３３におけ
る推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むコザック様（Ｋｏｚａｋ−ｌｉｋｅ）翻訳開
始配列は星印を付けられている。ヌクレオチド番号は左に示されている。
【００２５】 図２は、ＲＡＣＥ分析から得られたＰＰ１３ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレ
オチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。６１１塩基対ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列はオープンリーディングフレームの翻訳（１３９アミノ酸）を伴って示され
ている。消化されたペプチドと同一である領域は番号をつけられそして下線が引
いてある。ヌクレオチド４１における推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むコザック
様翻訳開始配列は星印を付けられている。ヌクレオチド番号は左に示されている
。
オチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。６１１塩基対ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列はオープンリーディングフレームの翻訳（１３９アミノ酸）を伴って示され
ている。消化されたペプチドと同一である領域は番号をつけられそして下線が引
いてある。ヌクレオチド４１における推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むコザック
様翻訳開始配列は星印を付けられている。ヌクレオチド番号は左に示されている
。
【００２６】 図３は、ＰＰ１３及び好酸球リゾホスホリパーゼ（配列番号：１１）のアミノ
酸配列の整列を示す。ＰＰ１３タンパク質及び好酸球リゾホスホリパーゼ（ＥＰ
Ｌ）の同一のアミノ酸はボールド（ｂｏｌｄ）により示される。２つのタンパク
質間で約５４％の同一性がある。
酸配列の整列を示す。ＰＰ１３タンパク質及び好酸球リゾホスホリパーゼ（ＥＰ
Ｌ）の同一のアミノ酸はボールド（ｂｏｌｄ）により示される。２つのタンパク
質間で約５４％の同一性がある。
【００２７】 （好ましい態様の詳細な説明） 材料及び方法 材料 改変されたトリプシン及びＬｙｓＣ（配列決定銘柄）はプロメガ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び水素化トリトンＸ１００（
ＲＴＸ）はシグマ（Ｓｇｍａ）製であった。炭酸アンモニウム（ＡＣ）はリーデ
ル−デ・ヘン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）製であった。アセトニトリル（
ＡＣＮ）はビオルアプ（ＢｉｏＬａｂ）製であった。５′及び３′ＲＡＣＥシス
テムはギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ製であった。ｐＵＣ５７クローニングベクタ
ー（Ｔ−クローニングキット（Ｔ−Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ））は、エム・ビー
・アイ・ファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）製であった。
ｇａ）製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び水素化トリトンＸ１００（
ＲＴＸ）はシグマ（Ｓｇｍａ）製であった。炭酸アンモニウム（ＡＣ）はリーデ
ル−デ・ヘン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）製であった。アセトニトリル（
ＡＣＮ）はビオルアプ（ＢｉｏＬａｂ）製であった。５′及び３′ＲＡＣＥシス
テムはギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ製であった。ｐＵＣ５７クローニングベクタ
ー（Ｔ−クローニングキット（Ｔ−Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ））は、エム・ビー
・アイ・ファーメンタス（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）製であった。
【００２８】 ＰＰ１３タンパク質の配列決定 ＰＰ１３タンパク質を、胎盤タンパク質に対して生じさせたウサギポリクロー
ナル抗体を使用してイムノアフィニティ精製し、そしてＰＰ１３タンパク質に関
してアフィニティ精製した。ＰＰ１３タンパク質を更に精製しそしてそれをタン
パク質分解酵素により消化するために、我々は下記のとおりローゼンフェルド（
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）等（１９９２）の方法を使用した。ＰＰ１３タンパク質を
ミニゲルフォーマット（ｍｉｎｉ ｇｅｌ ｆｏｒｍａｔ）（１０×１０ｃｍ）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離せしめることにより他の汚染タンパク質から分離し
、続いてゲルを固定しそしてクーマシーブリリアントブルーでゲルを染色した。
ゲルを４０％エタノール＋１０％酢酸中で脱色させた。ＰＰ１３タンパク質を含
む染色したゲルバンドを清浄なかみそり刃で切り出し、そして５０％アセトニト
リル（ＡＣＮ）＋２００ｍＭの水中炭酸アンモニウム（ＡＣ）で洗浄した。この
処理はＳＤＳ、クーマシーブリリアントブルー及び酢酸のできるだけ多くを除去
するために行われた。洗浄されたゲル片を３０分間空気乾燥し、そしてそれに５
０〜１００μｌの、２００ｍＭＡＣ＋改変トリプシン０．５μｇ又はＬｙｓＣ０
．５μｇを含む１％ＲＴＸ緩衝液、を加えることにより再水和させた。３７℃で
１２時間穏やかに振とうしながらインキュベーションした後、ＰＰ１３タンパク
質から放出されたタンパク質分解ペプチドが、ゲル片を、０．１％ＴＦＡ＋６０
％ＡＣＮ、１００μｌ中で室温で６０分間２回振とうさせることによりゲル片か
ら溶離された。溶液を遠心分離によりゲル片から分離させそしてスピードバク（
Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）中で乾燥させて過剰のＡＣＮを除去した。４％ＡＣＮ＋０
．１％ＴＦＡから６０％ＡＣＮ＋０．０８５％ＴＦＡまでの有線勾配を有するビ
ダック（Ｖｙｄａｃ）１×１５０ｍｍ、Ｃ１８，３００カラムでの室温で４０μ
ｌ／分の流速での逆相ＨＰＬＣによりタンパク質分解ペプチドを分離した。ペプ
チドの溶離パターンは２１４ｎｍにおける紫外線吸光度により判定され、そして
ペプチドを含むフラクションを微小遠沈管中に手で集めそして−８０℃で保存し
た。ペプチドを含むフラクションのいくらかは、プロテイン−ペプチドシーケン
サー（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（モデル４７６
Ａ及び４９４Ａ、パーキンエルマー）で、製造社の標準エドマン化学及びサイク
ルを使用して配列決定された。
ナル抗体を使用してイムノアフィニティ精製し、そしてＰＰ１３タンパク質に関
してアフィニティ精製した。ＰＰ１３タンパク質を更に精製しそしてそれをタン
パク質分解酵素により消化するために、我々は下記のとおりローゼンフェルド（
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）等（１９９２）の方法を使用した。ＰＰ１３タンパク質を
ミニゲルフォーマット（ｍｉｎｉ ｇｅｌ ｆｏｒｍａｔ）（１０×１０ｃｍ）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離せしめることにより他の汚染タンパク質から分離し
、続いてゲルを固定しそしてクーマシーブリリアントブルーでゲルを染色した。
ゲルを４０％エタノール＋１０％酢酸中で脱色させた。ＰＰ１３タンパク質を含
む染色したゲルバンドを清浄なかみそり刃で切り出し、そして５０％アセトニト
リル（ＡＣＮ）＋２００ｍＭの水中炭酸アンモニウム（ＡＣ）で洗浄した。この
処理はＳＤＳ、クーマシーブリリアントブルー及び酢酸のできるだけ多くを除去
するために行われた。洗浄されたゲル片を３０分間空気乾燥し、そしてそれに５
０〜１００μｌの、２００ｍＭＡＣ＋改変トリプシン０．５μｇ又はＬｙｓＣ０
．５μｇを含む１％ＲＴＸ緩衝液、を加えることにより再水和させた。３７℃で
１２時間穏やかに振とうしながらインキュベーションした後、ＰＰ１３タンパク
質から放出されたタンパク質分解ペプチドが、ゲル片を、０．１％ＴＦＡ＋６０
％ＡＣＮ、１００μｌ中で室温で６０分間２回振とうさせることによりゲル片か
ら溶離された。溶液を遠心分離によりゲル片から分離させそしてスピードバク（
Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）中で乾燥させて過剰のＡＣＮを除去した。４％ＡＣＮ＋０
．１％ＴＦＡから６０％ＡＣＮ＋０．０８５％ＴＦＡまでの有線勾配を有するビ
ダック（Ｖｙｄａｃ）１×１５０ｍｍ、Ｃ１８，３００カラムでの室温で４０μ
ｌ／分の流速での逆相ＨＰＬＣによりタンパク質分解ペプチドを分離した。ペプ
チドの溶離パターンは２１４ｎｍにおける紫外線吸光度により判定され、そして
ペプチドを含むフラクションを微小遠沈管中に手で集めそして−８０℃で保存し
た。ペプチドを含むフラクションのいくらかは、プロテイン−ペプチドシーケン
サー（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（モデル４７６
Ａ及び４９４Ａ、パーキンエルマー）で、製造社の標準エドマン化学及びサイク
ルを使用して配列決定された。
【００２９】 ｃＤＮＡ３′及び５′末端分析 ＰＰ１３遺伝子の全ｃＤＮＡ配列を単離するために、我々はｃＤＮＡ末端の迅
速増幅（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ
）（ＲＡＣＥ）（２）と呼ばれる標準方法を使用して、ｃＤＮＡの既知の部分の
５′及び３′末端の両方をその末端まで伸長した。一般に、ＲＡＣＥ法は、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、転写産物における特定の点におけるｃ
ＤＮＡの既知のセグメント及びその３′又は５′末端の間の領域のコピーを増幅
させることによりｃＤＮＡを発生させる。これはｃＤＮＡの末端にアニールする
プライマーに対するメッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）の既知のセグメントに対して
相補的な合成ＤＮＡプライマー間のｃＤＮＡのコピーを作ることにより達成され
た。 ３′プライム末端決定のために、全胎盤ＲＮＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，ＩｎｃからのＴＲＩ試薬により製造された）４μｇ
及び３′末端プライマー：（１０６ｒａｓ）５′−ｇｇｃ ｃａｃ ｇｃｇ ｔ
ｃｇ ａｃｔ ａｇｔ ａｃｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔ−３′
を使用して逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。この後プライマー：（フォーワー
ド反応（ｆｏｒｗａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のための１０７ｒａｓ）５′−ｇ
ｇｃ ｃａｃ ｇｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ａｇｔ ａｃ−３′及びリバースプラ
イマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（１００ｒｓ、ペプチド＃４に対して
相同性）は５′−ｇｇｇ ａｔａ ｔｇｇ ａｔｇ ｔｔｇ ｇａｇ ｇａｇ
ａｃ−３′であった、の間のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で４５
分の２．５ミリモルＭｇＣｌ2変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、６０℃で４
５分のプライマーアニーリング及び７２℃で２分のプライマー伸長、３５サイク
ルを含んでいた。 ５′末端決定のために、全胎盤ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｒ
ＮＡ）４μｇｒ及び特異的３′プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ３′ ｐｒｉｍ
ｅｒ）（１０１ｒａｓ）：５′−ｇｔｃ ｔｃｃ ｔｃｃ ａａｃ ａｔｃ ｃ
ａｔ ａｔｃ−３′を使用してＲＴ反応を行った。ｃＤＮＡの５′末端を、ＲＡ
ＣＥプロトコル及び試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してそれにポリ−ｄＣを
付加することにより伸長した。この後上記のような条件及び下記のプライマー：
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬにより供給された短縮された（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカー
プライマーを有するバックワードプライマー（ｂａｃｋｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
）及び前記したフォーワード反応プライマー１０１ｒｓを使用してＰＣＲ反応を
行った。
速増幅（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ
）（ＲＡＣＥ）（２）と呼ばれる標準方法を使用して、ｃＤＮＡの既知の部分の
５′及び３′末端の両方をその末端まで伸長した。一般に、ＲＡＣＥ法は、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、転写産物における特定の点におけるｃ
ＤＮＡの既知のセグメント及びその３′又は５′末端の間の領域のコピーを増幅
させることによりｃＤＮＡを発生させる。これはｃＤＮＡの末端にアニールする
プライマーに対するメッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）の既知のセグメントに対して
相補的な合成ＤＮＡプライマー間のｃＤＮＡのコピーを作ることにより達成され
た。 ３′プライム末端決定のために、全胎盤ＲＮＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，ＩｎｃからのＴＲＩ試薬により製造された）４μｇ
及び３′末端プライマー：（１０６ｒａｓ）５′−ｇｇｃ ｃａｃ ｇｃｇ ｔ
ｃｇ ａｃｔ ａｇｔ ａｃｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔ−３′
を使用して逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。この後プライマー：（フォーワー
ド反応（ｆｏｒｗａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のための１０７ｒａｓ）５′−ｇ
ｇｃ ｃａｃ ｇｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ａｇｔ ａｃ−３′及びリバースプラ
イマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（１００ｒｓ、ペプチド＃４に対して
相同性）は５′−ｇｇｇ ａｔａ ｔｇｇ ａｔｇ ｔｔｇ ｇａｇ ｇａｇ
ａｃ−３′であった、の間のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で４５
分の２．５ミリモルＭｇＣｌ2変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、６０℃で４
５分のプライマーアニーリング及び７２℃で２分のプライマー伸長、３５サイク
ルを含んでいた。 ５′末端決定のために、全胎盤ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｒ
ＮＡ）４μｇｒ及び特異的３′プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ３′ ｐｒｉｍ
ｅｒ）（１０１ｒａｓ）：５′−ｇｔｃ ｔｃｃ ｔｃｃ ａａｃ ａｔｃ ｃ
ａｔ ａｔｃ−３′を使用してＲＴ反応を行った。ｃＤＮＡの５′末端を、ＲＡ
ＣＥプロトコル及び試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してそれにポリ−ｄＣを
付加することにより伸長した。この後上記のような条件及び下記のプライマー：
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬにより供給された短縮された（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカー
プライマーを有するバックワードプライマー（ｂａｃｋｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
）及び前記したフォーワード反応プライマー１０１ｒｓを使用してＰＣＲ反応を
行った。
【００３０】 得られるＰＣＲ断片をｐＵＣ５７−Ｔクローニングベクター（Ｔ−Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ＃Ｋ１２１２ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）に挿入し、そして挿入
物を含むクローンを選びそしてＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｅｈ
ｏｖｏｔ，ＩｓｒａｅｌのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにおいて自
動化ＤＮＡにより配列決定した。
ｎｇ Ｋｉｔ＃Ｋ１２１２ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）に挿入し、そして挿入
物を含むクローンを選びそしてＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｅｈ
ｏｖｏｔ，ＩｓｒａｅｌのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにおいて自
動化ＤＮＡにより配列決定した。
【００３１】 結果 ＰＰ１３タンパク質からのペプチドの同定 ＰＰ１３タンパク質をコードしている遺伝子をクローニングするため及びその
遺伝子をデータバンクの１つにおいて同定するために、ＰＰ１３タンパク質の一
次アミノ酸配列を得ることが必要であった。ＰＰ１３タンパク質はそのアミノ末
端でブロックされていたので、内部アミノ酸配列はタンパク質をペプチド断片に
タンパク質分解により消化した後得られた。これらのペプチドを分離しそして逆
相ＨＰＬＣを使用してクロマトグラフイーにより精製し、そして分離されたペプ
チドのいくらかを配列決定した。首尾よく配列決定されたペプチドのアミノ酸配
列を表１に列挙する。
遺伝子をデータバンクの１つにおいて同定するために、ＰＰ１３タンパク質の一
次アミノ酸配列を得ることが必要であった。ＰＰ１３タンパク質はそのアミノ末
端でブロックされていたので、内部アミノ酸配列はタンパク質をペプチド断片に
タンパク質分解により消化した後得られた。これらのペプチドを分離しそして逆
相ＨＰＬＣを使用してクロマトグラフイーにより精製し、そして分離されたペプ
チドのいくらかを配列決定した。首尾よく配列決定されたペプチドのアミノ酸配
列を表１に列挙する。
【００３２】 表１．上記したトリプシン及びＬｙｓＣ消化の後得られたＰＰ１３由来のペプ
チド断片のアミノ酸配列 ペプチド番号 アミノ酸配列 １．（配列番号：１） ＬＰＶＳＬＳＶＧ ２．（配列番号：１） ＶＩＩＫ ３．（配列番号：３） ＧＴＰＩＨＳＦＩＮＤＰＱＬＱＶＤＦ ４．（配列番号：４） ＥＦＧＩＷＭＬＥＥＴＴＤＹＶＰＦＥ ５．（配列番号：５） ＱＦＥＬＣＩＹ ６．（配列番号：６） ＶＨＹＮＥＹ ７．（配列番号：７） ＧＦＶＨＲペプチド配列のデータバンクとの比較 インターネットを通して入手可能なＤＮＡ及びタンパク質データバンクを得ら
れたＰＰ１３ペプチド配列に対する相同性について調べた。ペプチド断片の４つ
をコードしているｃＤＮＡ配列（配列番号：８）は同定された（ＥＳＴ受け入れ
Ｒ２４６１４）。同定されたｃＤＮＡにおいて１つより多くのペプチド配列に対
する相同性が存在したという事実は、このｃＤＮＡがＰＰ１３製造の主成分であ
るタンパク質をコードしている遺伝子の産物であるらしいことを示す。
チド断片のアミノ酸配列 ペプチド番号 アミノ酸配列 １．（配列番号：１） ＬＰＶＳＬＳＶＧ ２．（配列番号：１） ＶＩＩＫ ３．（配列番号：３） ＧＴＰＩＨＳＦＩＮＤＰＱＬＱＶＤＦ ４．（配列番号：４） ＥＦＧＩＷＭＬＥＥＴＴＤＹＶＰＦＥ ５．（配列番号：５） ＱＦＥＬＣＩＹ ６．（配列番号：６） ＶＨＹＮＥＹ ７．（配列番号：７） ＧＦＶＨＲペプチド配列のデータバンクとの比較 インターネットを通して入手可能なＤＮＡ及びタンパク質データバンクを得ら
れたＰＰ１３ペプチド配列に対する相同性について調べた。ペプチド断片の４つ
をコードしているｃＤＮＡ配列（配列番号：８）は同定された（ＥＳＴ受け入れ
Ｒ２４６１４）。同定されたｃＤＮＡにおいて１つより多くのペプチド配列に対
する相同性が存在したという事実は、このｃＤＮＡがＰＰ１３製造の主成分であ
るタンパク質をコードしている遺伝子の産物であるらしいことを示す。
【００３３】 配列はワシントン大学により創られたＥＳＴデータバンクにおいて見いだされ
そしてＢＬＡＳＴサーチプログラムを使用してナショナル・センター・フォー・
ザ・バイオテクノロジー・インフォーメーション（ＮＣＢＩ）を介して調査され
た。Ｒ２４６１４ｃＤＮＡはコザック様翻訳開始配列及び１１８アミノ酸ポリペ
プチドをコードしている３５８塩基対オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
を含む。Ｒ２４６１４オープンリーディングフレームによりコードされたポリペ
プチドの計算された分子量は、１３.９Ｋｄａであった。配列決定されたペプチ
ドの４つはＲ２４６１４ｃＤＮＡ（図１）の大きなオープンリーディングフレー
ムの推定配列の一部に対する相同性を有する。ペプチド＃３の得られたアミノ酸
配列はＥＳＴｃＤＮＡと部分的一致を共有することが見いだされそしてペプチド
番号４、５及び６はＲ２４６１４配列におけるＯＲＦの異なるセグメントと同じ
であった。
そしてＢＬＡＳＴサーチプログラムを使用してナショナル・センター・フォー・
ザ・バイオテクノロジー・インフォーメーション（ＮＣＢＩ）を介して調査され
た。Ｒ２４６１４ｃＤＮＡはコザック様翻訳開始配列及び１１８アミノ酸ポリペ
プチドをコードしている３５８塩基対オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
を含む。Ｒ２４６１４オープンリーディングフレームによりコードされたポリペ
プチドの計算された分子量は、１３.９Ｋｄａであった。配列決定されたペプチ
ドの４つはＲ２４６１４ｃＤＮＡ（図１）の大きなオープンリーディングフレー
ムの推定配列の一部に対する相同性を有する。ペプチド＃３の得られたアミノ酸
配列はＥＳＴｃＤＮＡと部分的一致を共有することが見いだされそしてペプチド
番号４、５及び６はＲ２４６１４配列におけるＯＲＦの異なるセグメントと同じ
であった。
【００３４】 データバンクから得られたＲ２４６１４のオープンリーディングフレーム配列
はＰＰ１３タンパク質の全コード化領域を含まないので、全ｃＤＮＡ配列を得る
ことが必要であった。
はＰＰ１３タンパク質の全コード化領域を含まないので、全ｃＤＮＡ配列を得る
ことが必要であった。
【００３５】 ＰＰ１３の完全なｃＤＮＡ配列の同定 全ｃＤＮＡ配列を得るために、我々はｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を
使用した。これまでに見いだされたペプチド４の領域からの配列（図１）に対し
て相同性の内部特異的プライマー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒ
ｉｍｅｒｓ）によるＲＡＣＥ法を使用して、我々はＰＰ１３メッセージの３′及
び５′末端を発見した。全ＰＰ１３アミノ酸配列（配列番号：９）及びｃＤＮＡ
（配列番号：１０）は図２に示されている。
使用した。これまでに見いだされたペプチド４の領域からの配列（図１）に対し
て相同性の内部特異的プライマー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒ
ｉｍｅｒｓ）によるＲＡＣＥ法を使用して、我々はＰＰ１３メッセージの３′及
び５′末端を発見した。全ＰＰ１３アミノ酸配列（配列番号：９）及びｃＤＮＡ
（配列番号：１０）は図２に示されている。
【００３６】 全ｃＤＮＡはコザック様翻訳開始配列及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるその移
動から計算されるＰＰ１３タンパク質の分子量のほぼ同じサイズである１５．１
ＫＤａの予想された質量を有する１３９アミノ酸ポリペプチドをコードしている
４１７塩基対オープンリーディングフレームを含む。全ｃＤＮＡ配列の主オープ
ンリーディングフレームは、逆相精製されたタンパク質分解ペプチドのエドマン
配列決定によりこれまでに見いだされたペプチド配列のすべてを含む（図１）。
動から計算されるＰＰ１３タンパク質の分子量のほぼ同じサイズである１５．１
ＫＤａの予想された質量を有する１３９アミノ酸ポリペプチドをコードしている
４１７塩基対オープンリーディングフレームを含む。全ｃＤＮＡ配列の主オープ
ンリーディングフレームは、逆相精製されたタンパク質分解ペプチドのエドマン
配列決定によりこれまでに見いだされたペプチド配列のすべてを含む（図１）。
【００３７】 他のタンパク質に対する類似性 新規な遺伝子は、免疫及び妊娠疾患において重要性の知られたタンパク質であ
る好酸球リゾホスホリパーゼ（３）に対する配列類似性を含むことが分かった（
図３）。ＰＰ１３及び好酸球リゾホスホリパーゼは約５４％アミノ酸一致及び５
６％の核酸一致を有する。ペプチド、特にペプチド番号４及び６の領域における
２つのタンパク質の一致は低く、それ故これらのタンパク質は異なっているが、
相同性及び一致は、それらが同じタンパク質ファミリーに属していることを示唆
している可能性がある。
る好酸球リゾホスホリパーゼ（３）に対する配列類似性を含むことが分かった（
図３）。ＰＰ１３及び好酸球リゾホスホリパーゼは約５４％アミノ酸一致及び５
６％の核酸一致を有する。ペプチド、特にペプチド番号４及び６の領域における
２つのタンパク質の一致は低く、それ故これらのタンパク質は異なっているが、
相同性及び一致は、それらが同じタンパク質ファミリーに属していることを示唆
している可能性がある。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【図１】 発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（受け入れＲ２４６１４）からのｃＤＮ
Ａの部分ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
Ａの部分ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図２】 ＲＡＣＥ分析から得られたＰＰ１３ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配
列及び推定アミノ酸配列を示す。
列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図３】 ＰＰ１３及び好酸球リゾホスホリパーゼ（配列番号：１１）のアミノ酸配列の
整列を示す。
整列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スロトキ，ロニト イスラエル・34467ハイフア・ガルガルス トリート８ (72)発明者 マンデル，シルビア イスラエル・34403ハイフア・レアストリ ート28／１ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 BB10 BB24 BB48 BB51 FB02 FB03 4B024 AA11 BA80 CA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS14 QS25 QS33 QS34 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA46 DA76 DA86 EA50 FA74 GA26
Claims (11)
- 【請求項１】 （ａ）図２（配列番号：９）に示されたアミノ酸配列を有す
る胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）、 （ｂ）ＰＰ１３に含まれるアミノ酸の配列を有しそしてＰＰ１３に特異的に結
合する抗体に結合するポリペプチド、 （ｃ）ＰＰ１３に特異的に結合する抗体へのタンパク質又はポリペプチドの結
合能力を減少させることなく１つ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されてい
る（ａ）又は（ｂ）のタンパク質又はポリペプチド、及び （ｄ）（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有す
るタンパク質又はポリペプチド、 から成る群より選ばれるタンパク質又はポリペプチド。 - 【請求項２】 下記のペプチド群： ＬＰＶＳＬＳＶＧ（配列番号：１） ＶＩＩＫ（配列番号：２） ＧＴＰＩＨＳＦＩＮＤＰＱＬＱＶＤＦ（配列番号：３） ＥＦＧＩＷＭＬＥＥＴＴＤＹＶＰＦＥ（配列番号：４） ＱＦＥＬＣＩＹ（配列番号：５） ＶＨＹＮＥＹ（配列番号：６） ＧＦＶＨＲ（配列番号：７） から選ばれるＰＰ１３のサブ配列に対応するペプチド。
- 【請求項３】 請求項１のタンパク質又はポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ分子。 - 【請求項４】 図２（配列番号：１０）に表されているヌクレオチド配列を
有する請求項３に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 ストリンジェントな条件下に請求項３又は４のＤＮＡ分子に
ハイブリダイゼーションすることができるＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項１のタンパク質又はポリペプチドに特異的に結合する
ことができる抗体。 - 【請求項７】 （ａ）妊娠した婦人の血清サンプルを提供し、 （ｂ）該血清サンプル中の請求項１（ａ）のタンパク質又は請求項１（ｂ）の
ポリペプチドのレベルを決定し、そして （ｃ）該決定されたレベルを同じ妊娠年齢の婦人の所定の正常のレベルと比較
し、両レベル間の偏差が妊娠関連合併症を指示する、 工程を含むことを特徴とする妊娠関連合併症のスクリーニングの方法。 - 【請求項８】 工程（ｂ）の決定が請求項１のタンパク質又はポリペプチド
に特異的に結合することができる抗体による請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 該妊娠関連合併症が子宮内成長遅延、早産及び子かん前症か
ら成る群より選ばれる請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 （ａ）請求項３に記載のＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入
し、 （ｂ）該発現ベクターを宿主細胞に挿入し、そして （ｃ）挿入されたベクターの発現を許容する条件下に該宿主細胞をインキュベ
ーションし、それによりＰＰ１３を産生させる、 ことを特徴とするＰＰ１３の製造のための組換え方法。 - 【請求項１１】 （ａ）請求項１のタンパク質又はポリペプチドに特異的に
結合することができる抗体、 （ｂ）標識されたＰＰ１３、及び （ｃ）ＰＰ１３標準溶液、 を含んでなる妊娠関連合併症を診断するためのキット。
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|---|---|---|---|
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| PCT/IL1999/000036 WO1999038970A1 (en) | 1998-01-29 | 1999-01-21 | Placental protein 13 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2002516658A5 JP2002516658A5 (ja) | 2006-02-23 |
Family
ID=11071151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000529430A Pending JP2002516658A (ja) | 1998-01-29 | 1999-01-21 | 胎盤タンパク質１３ |
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| WO2007086067A1 (en) * | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Diagnostic Technologies Ltd. | Method for monitoring tocolytic treatment |
| CN101416060A (zh) * | 2006-02-02 | 2009-04-22 | 诊断技术有限公司 | 用于确定先兆子痫治疗有效性的方法 |
| CN101627131A (zh) * | 2007-02-01 | 2010-01-13 | 诊断技术有限公司 | 确定先兆子痫风险的方法 |
| CN112341533A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-09 | 东北师范大学 | 无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用 |
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| DE3230996A1 (de) * | 1982-08-20 | 1984-02-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung |
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