JP2002515022A - クラブラン酸カリウムの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 中間体アミン塩を形成することによって前精製されていないクラブラン酸をカリウム塩として直接沈殿させることによる、医薬上許容される品質のクラブラン酸カリウムの製造方法であって、ＰＣＴ／ＧＢ９５／００１９１の主題であるものを除く方法。

Description

【発明の詳細な説明】 クラブラン酸カリウムの製造方法 本発明は、クラブラン酸塩の新規製造方法に関する。 式（Ｉ）のクラブラン酸： は、β−ラクタマーゼ阻害剤であり、医薬処方の成分として商業的に用いられて おり、通常はその塩の形態である。クラブラン酸は、例えば、ＧＢ１５０８９７ ７に記載のごとく、微生物Streptomyces clavuligerusの培養により商業的に製 造されている。 クラブラン酸またはその塩を、培地から種々の方法により抽出できるが、かか る抽出手順を解しする前に、まず、濾過または遠心分離によりS.clavuligerus細 胞を培地から除去することが画一的に行われている。 種々の方法によりクラブラン酸またはその塩を清澄化培地から抽出できる。酸 性ｐＨ値に調節された冷却清澄化培地からの溶媒抽出、および中性ｐＨにおける クラブラン酸のアニオン的性質を用いる方法、例えば、アニオン交換樹脂を用い ることが特に有用であることがわかっている。さらに特に有用な方法は、クラブ ラン酸エステルを得て、エステルを精製し、それより酸またはその塩を再生する ことである。 クラブラン酸またはその塩を得るための抽出プロセスは、概念的には、一次単 離、ついで、さらなる精製プロセスに分けられる。 適当な一次単離プロセスは、遊離クラブラン酸の溶媒抽出を包含する。溶媒抽 出プロセスにおいて、酸性ｐＨに調節された全ブロスであってもよい冷却清澄化 培地から有機溶媒中にクラブラン酸を抽出する。 クラブラン酸の遊離酸についての１の溶媒抽出法において、清澄化培地を冷却 し、実質的に水と混和しない有機溶媒と混合しながら酸添加によりｐＨを低下さ せてｐＨ１ないし２の領域とする。ｐＨ低下に用いるのに適した酸には、塩酸、 硫酸、硝酸、リン酸、または同様な無機酸がある。適当な有機溶媒としては、ｎ −ブタノール、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチルおよびメチルイソブチルケトン、な らびに他の同様な溶媒が挙げられる。メチルイソブチルケトンは、酸性化培地濾 過物の抽出に特に好ましい溶媒である。相分離後、クラブラン酸は有機相中に見 出される。 例えば、クラブラン酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩が有機溶媒 に対してよりも水に対して高い溶解度を有していることを利用して、クラブラン 酸を有機溶媒から新たな水相中へと逆抽出してもよい。かくして、ｐＨをほぼ中 性、例えばｐＨ７に維持しながら、クラブラン酸を有機溶媒から、炭酸水素ナト リウム、リン酸水素カリウムバッファーまたは炭酸カルシウムのごときアルカリ 金属またはアルカリ土類金属塩基の水溶液または懸濁液または水中へと逆抽出し てもよい。相分離後、この水性抽出物を減圧濃縮してもよい。凍結乾燥を用いて クラブラン酸塩の固体粗標品を得てもよい。かかる固体標品は、−２０℃におい て乾燥固体として保存した場合、安定である。同様のプロセスがＧＢ１５６３１ ０３２に記載されている。このプロセスを既知方法で修飾してもよく、例えば、 さらなる精製工程を有機溶媒相に適用して高分子不純物を不純なクラブラン酸か ら除去してもよい。 クラブラン酸のさらなる二次的精製プロセスは、例えば、ＥＰ００２６０４４ に記載されているものであり、該方法において、不純なクラブラン酸溶液をｔ− ブチルアミンと接触させてクラブラン酸のｔ−ブチルアミン塩を得て、ついで、 これを単離し、有機溶媒中の残存不純物からクラブラン酸を分離し、ついで、塩 をクラブラン酸に戻すか、あるいはアルカリ金属塩またはエステルのごときクラ ブラン酸誘導体に変換する。他の知られたクラブラン酸の二次的精製プロセスは 、ジエチルアミン、トリ−（低級アルキル）アミン、ジメチルアニリンおよびＮ ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミンのごとき他の有機アミンを用いてク ラブラン酸の塩および／または他の誘導体を得ることを包含する。これらの精製 プロセスは、最終製品中に痕跡量のアミンを残し、あるいは痕跡量のアミンとク ラブラン酸との塩を残すという本質的欠点を有する。 かかる逆抽出プロセスは、クラブラン酸カリウムを製造する場合に、クラブラ ン酸カリウムが特に水に感受性があるために、問題を生じる。慣用的な逆抽出プ ロセスにおいては、長時間、典型的には約１時間、クラブラン酸カリウムは水と 接触したままである可能性があり、通常用いられる比較的穏やかな混合および分 離条件下ではクラブラン酸溶液濃度が上昇し、このことにより加水分解による分 解が大いに進む可能性がある。さらにそのうえ、クラブラン酸がある種のアミン 塩を経由する上記のようなプロセスは比較的経費のかかるプロセスとなる。 本発明者らは、分解およびコストが減じられたクラブラン酸塩の改良製造方法 を見出した。 したがって、本発明は、中間体アミン塩を形成することによつて前精製されて いないクラブラン酸をカリウム塩として直接沈殿させることによる、医薬上許容 される品質のクラブラン酸カリウムの製造方法を提供するが、ＰＣＴ／ＧＢ９５ ／００１９１の主題は除く。 医薬上許容される品質のクラブラン酸カリウムは、遊離酸として少なくとも純 度８０％、より好ましくは遊離酸として少なくとも純度８２％、もっとも好まし くは遊離酸として少なくとも純度８３％の物質を包含する。 上記文献記載のごとく、発酵プロセスから得られたクラブラン酸の遊離酸を有 機溶媒中に抽出することにより上記プロセスを行ってもよく、上記文献記載の手 順により前処理してもよく、あるいは好ましくは後で説明する方法を用いて前処 理してもよい。上記文書に記載のごとき適当な有機溶媒を用いてもよい。 ついで、抽出されたクラブラン酸を当該分野において慣用的な方法を用いて、 あるいは本明細書で引用する文書に記載された方法、あるいは好ましくは後で説 明する方法を用いて、抽出されたクラブラン酸を濃縮してもよい。 ついで、適当には、有機酸のごとき酸の適当なカリウム塩を添加することによ りクラブラン酸のカリウム塩を得る。 ついで、かくして得られたカリウム塩を慣用的に単離し乾燥してもよく、ある いは本明細書記載の方法を用いて単離し乾燥してもよい。 別法として、クラブラン酸の遊離酸（上記のごとぐ調製）を、上記のごとく溶 媒中に抽出し、水性媒体中に逆抽出する前に慣用的方法を用いて濃縮してもよい 。ついで、慣用的方法あるいは本明細書記載の方法を用いて水性媒体を濃縮して もよい。適当には、有機酸のごとき酸のカリウム塩のような適当な形態のカリウ ムイオンを添加してもよい。例えば、アセトンまたはイソプロパノールのごとき 適当な沈殿溶媒を添加することにより、得られたクラブラン酸カリウムを沈殿さ せ、単離し、ついで、乾燥させてもよい。 実施例に記載した方法を、参照により本明細書に記載されたものとみなす。 特に高力価、例えば、水溶液中のクラブラン酸力価が１ミリリットルあたり１ ０００００ないし２０００００マイクログラム、より好ましくは１ミリリットル あたり約１４５０００マイクログラムであるクラブラン酸の有機抽出物またはク ラブラン酸の水性抽出物を用いることが特に望ましい。 好ましくは限外濾過により濾過され、好ましくは逆浸透により前濃縮さててい てもよい全ブロス発酵物からクラブラン酸を得る。水性の逆抽出物は、好ましく は１０ないし３０％、より好ましくは１５ないし２５％、最も好ましくは約２０ ％ ｗ／ｖの濃度である。 好ましくは、イソプロパノールのごとき共溶媒を水性濃縮物に添加してもよく 、ヤライトのベッドでの濾過のごとき慣用的手段により、生じた油状物質を除去 する。このことは、得られるクラブラン酸を必要な純度とすることにおいて特に 有利である。 ついで、適当には、イソプロパノールのごときさらなる水混和性溶媒（酢酸エ チルのごとき水不混和性溶媒と混合されていてもよい）を添加することにより、 あるいは別法として、水混和性溶媒添加し、ついで、水不混和姓溶媒をステップ ワイズ的に添加することにより、生成物を沈殿させる。 有機溶媒溶液から直接得られたカリウム塩を単離する場合には、好ましくは共 沸蒸留を用いて有機溶媒を乾燥させる。 適当な有機溶媒としては上記のもの、例えば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、 酢酸ｎ−ブチルおよび一般式Ｒ¹ＣＯ.Ｒ²（式中、Ｒ¹およびＲ²は独立してＣ_{1-1 0} アルキル基）で示されるケトン、詳細にはメチルイソブチルケトンが挙げられ る。溶液が最初の単離プロヤスにより得られる場合には、クラブラン酸の溶液に は不純物、例えば高分子不純物が存在していてもよいが、好ましくは、予備精製 プロセスに供して少なくともいくぶんかの不純物を除去しておく。適当な予備精 製プロセスとしては、濾過、および吸着性炭素での処理が挙げられる。溶液は少 量の溶解または懸濁された水を含んでいてもよいが、好ましくは、溶液が最初の 単離プロセスにより得られる場合には、溶液を脱水プロセスに供してもよく、例 えば、遠心分離して懸濁水の液滴を除去してもよい。 クラブラン酸またはその不安定な誘導体の溶液の適当な濃度は、クラブラン酸 含量で表せば約５００ないし２００００μｇ／ｍｌ（０.００２５Ｍないし０． １Ｍ）、例えば約１０００ないし５０００μｇ／ｍｌ（すなわち、０．００５Ｍ ないし０.０２５Ｍ）、典型的には約３０００±１０００μｇ／ｍｌ（すなわち 、０.０１５Ｍ±０.００５Ｍ）である。本明細書の用語「クラブラン酸」は、以 後、遊離クラブラン酸ならびにかかる不安定な誘導体の両方をいうのに用いられ る。 適当な塩形成カチオンは、アルカリ金属カチオンおよびアルカリ土類金属カチ オンであり、詳細にはカリウムである。適当な対アニオンとしては塩基性アニオ ンが挙げられ、例えば、炭酸水素、炭酸またはリン酸水素であり、詳細には、弱 有機カルボン酸のアニオン、例えばＲ−ＣＯ₂Ｈ（式中、ＲはＣ_1-20アルキル、 例えばＣ_1-18アルキル）で示されるものがある。適当なカルボン酸としては酢酸 、プロピオン酸、および２−エチルヘキサン酸のごときエチルヘキサン酸が挙げ られる。 それらのイオンを含む適当な塩前駆体化合物としては、炭酸水素ナトリウムま たはカリウム、リン酸水素カリウムまたは炭酸カルシウムが挙げられ、詳細には 、クラブラン酸カリウムの製造の場合には、２−エチルヘキサン酸カリウムであ る。他の適当な塩前駆体化合物としては、イオン交換樹脂が挙げられ、固体であ って も液体であってもよく、クラブラン酸とともに塩を形成しうるカリウムのごとき 塩形成カチオンを含むものである。 前駆体化合物を溶媒に溶解または懸濁し、２つの溶液あるいは溶液および懸濁 液を混合することにより、クラブラン酸または誘導体を溶液中で塩前駆体化合物 と接触させてもよい。同じ有機溶媒をクラブラン酸ならびに前駆体に用いてもよ い。２−エチルヘキサン酸カリウムがメチルイソブチルケトンのごとき有機溶媒 中の溶液となっている塩前駆体化合物である場合、適当には、その濃度は０.５ ないし５.０Ｍ、例えば１.０ないし３.０Ｍ、適当には２.０±０.５Ｍである。 後で述べる多くの方法で水を接触領域に提供してもよく、これらの方法の１つ またはそれ以上のものを別法として用いて、あるいは組み合わせて用いてもよい 。例えば、水あるいは溶解された有機溶媒を含有する水に塩前駆体化合物を溶解 または懸濁してもよく、そのようなものとしてクラブラン酸溶液と接触させても よい。例えば、クラブラン酸溶液を上記のごとく水に溶解または懸濁してもよい 。例えば、塩前駆体化合物を、有機溶媒、例えば、クラブラン酸を溶解するのと 同じ溶媒に溶解または懸濁してもよく、これらの溶媒はそれ自体、溶解または懸 濁された水を含んでいてもよい。例えば、クラブラン酸ならびに前駆体用の有機 溶媒としてメチルイソブチルケトンを用いてもよく、メチルイソブチルケトンは ０.１ないし７.５体積％、典型的には１ないし３％、例えば２.０±０.５％の溶 解された水を含んでいてもよい。例えば、接触領域において接触する場合には、 水あるいは溶解した有機溶媒を含有する水のごとき水性媒体を添加することによ り、水をクラブラン酸溶液および有機溶媒中の塩前駆体の溶液または懸濁液に提 供してもよい。 例えば上記のごとき本発明プロセスに使用する有機溶媒中に溶解された水が存 在する場合には、その後、溶解したクラブラン酸塩が蓄積されるので、「塩析」 効果により水を水相として分離してもよい。 とりわけ、できるかぎり多くのクラブラン酸が有機溶媒中の溶液から水相へと その塩溶液として抽出され、水相中にクラブラン酸塩の濃縮溶液が形成されるよ うに、プロセスの操作条件、例えば、反応物濃度、使用溶液の割合、流速、接触 時間等を選択する。好ましい具体例におけるクラブラン酸カリウムの場合、水相 中のクラブラン酸カリウム濃度が約１０ないし４０重量％（約０.４ないし１.７ Ｍ）、例えば２０ないし３０重量％（約０.８ないし１.２Ｍ）となるように操作 条件を選択する。この濃度のクラブラン酸カリウムの溶液濃度では、最適な収率 および改善された純度が得られ、さらなる処理工程が促進されることがわかって いる。 プロセスにおいて、分離された水相中のクラブラン酸カリウムのごときクラブ ラン酸塩濃度を例えば比重によりまたは光学的にモニターすることは、他の操作 条件を決定または制御する適当な方法である。 クラブラン酸または塩前駆体化合物を導入して、まず化学量論的にクラブラン 酸よりも過剰な塩前駆体化合物が存在するようにすべきである。例えば、前駆体 を、クラブラン酸：前駆体化合物のモル比が１：１ないし１：２、典型的には１ ：１ないし１：１．５となるようにして、理論的に十分な塩前駆体化合物がすべ てのクラブラン酸に確実に結合するようにしてもよい。 クラブラン酸と塩前駆体化合物とが接触する領域に存在する水の量は、適当に は、水相中の塩、例えば上記クラブラン酸カリウムの所望濃度が実際に得られる のに最小必要量とすべきである。 本発明方法は、既知精製プロセスによれば混入される、上記精製プロセスにお いて使用されるアミンのごとき痕跡量の不純物を含まないクラブラン酸塩、例え ばクラブラン酸カリウムを提供する。かかる不純物を含まないクラブラン酸塩は 研究室スケールでは知られているが、医薬処方の製造に使用されるかかる塩、詳 細にはクラブラン酸カリウムの大量生産は新規である。 したがって、本発明のさらなる態様は、細菌感染の治療のための医薬処方を提 供し、該処方は、クラブラン酸塩、例えば上記のもの、詳細にはクラブラン酸カ リウムを含んでなり、実質的にｔ−ブチルアミン、ジエチルアミン、トリ−（低 級アルキル）アミン、メチルアニリンまたはＮ，Ｎ'−ジイソプロピルエチレン ジアミンのごとき有機アミン（遊離アミンとしてもその誘導体もしくは塩として も）を含まない。 適当には、処方は、処方中に存在するクラブラン酸塩の重量に対して０.０５ 重量％未満、例えば０.００５重量％未満、好ましくは０.０００５重量％未満、 望ましくは０.００００５重量％未満の有機アミンを含む。 処方は、１種またはそれ以上の抗生物質、適当にはペニシリンおよびセファロ スポリンのごときβ−ラクタム抗生物質を含んでいてもよい。適当な抗生物質は 、既知の抗生物質処方においてクラブラン酸と混合される抗生物質、例えばアモ キシシリン（例えば、その三水和物形態）およびチカルシリンを包含する。処方 は、クラブラン酸：抗生物質の比がかかる組み合わせを用いる場合に知られてい る範囲、例えば、もとのクラブラン酸と抗生物質との比が重量比で１２：１ない し１：１であってもよい。 処方は、既知の添加物および賦形剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、発泡剤 、着色料、香料、乾燥剤等、例えばＧＢ２００５５３８においてクラブラン酸カ リウム含有処方に用いるためにリストされたものを含んでいてもよい。処方は、 セルロース誘導体、例えばAvicel（商標）またはSyloid（商標）のごとき微細結 晶セルロース、二酸化ケイ素またはショ糖のごとき物質をクラブラン酸カリウム とともに含んでいてもよい。処方は、例えば、セルロース誘導体、二酸化ケイ素 またはショ糖とクラブラン酸カリウムとの、例えば１：１の混合物を含んでいて もよい。 また本発明は、上記の実質的に有機アミンを含まないクラブラン酸塩の、細菌 感染治療のための医薬処方の製造における使用を提供する。 下記実施例は本発明を例示説明する。 実施例１ 約２００００μｇ／ｍｌの力価のクラブラン酸粗水溶液を、下記手順のいずれ かにより調製する。 ａ）ブロスのＲＶＦ濾過、ついで、発酵ブロスのイオン交換クロマトグラフィー ｂ）ブロスの限外濾過、ついで、発酵ブロスのＲＯ濃縮 硫酸を用いてｐＨを１.５として酢酸エチルで水溶液を抽出する。活性化粒状 炭素のカラムに通す前にクラブラン酸豊富溶媒を冷却し、脱水する。ついで、精 製溶媒抽出物を共沸蒸留して含量約２００００μｇ／ｍＬ水分含量０.２％のク ラブラン酸溶液を得る。ＩＰＡ中のヘキサン酸エチルカリウム溶液を濃縮溶液に 添加してクラブラン酸をカリウム塩として沈殿させる。単離生成物は、結晶形態 を改善するために再結晶が必要であるかもしれない。 実施例２ 上記ａ）またはｂ）により調製された力価約２００００μｇ／ｍｌのクラブラ ン酸粗水溶液を、硫酸でｐＨ１.５としてＭＩＢＫで抽出する。活性化粒状炭素 のカラムに通す前にクラブラン酸豊富溶媒を冷却し、脱水する。ついで、溶媒中 のＫＥＨを用いてｐＨ５.１において精製溶媒抽出物を水で逆抽出する。全操作 を連続的に行なう。使用済み溶媒をリサイクルさせてさらなる抽出に使用し、２ ０ないし２５重量％の濃度となるまで水性抽出物をリサイクルさせる。クラブラ ン酸カリウム水溶液をＩＰＡで希釈し、粉末炭素で処理し、ついで、ＩＰＡまた はアセトンを添加することにより再結晶させる。この状態において共溶媒を用い てもよい。 実施例３ クラブラン酸豊富酢酸エチル試料を下記のごとく調製した。 クラブラン酸粗試料を水に溶解して力価を約１４５０００μｇ／ｍｌとし、硫 酸でｐＨ１.５とした。これを酢酸エチル中に抽出し、ついで、共沸的に蒸留し てクラブラン酸含量２１５７３μｇ／ｍｌ、水分含量０.２％の溶液を得た。１ ００ｍｌの上記溶液に７.５ｍｌのイソプロパノール中２ＮのＫＥＨ溶液を１２ 分かけて添加したところ、沈殿が生じた。生成物であるクラブラン酸カリウムを 単離し、湿ケークをアセトンで洗浄し、ついで、１０ｍｌのメタノールおよび水 の混合物中に溶解した。これに２０分かけて１００ｍｌのイソプロパノール／混 合物を添加したところ、白色のクラブラン酸カリウムが棒状物質および核のある 棒状物質として沈澱した。 生成物重量＝２.０３ｇ 生成物純度＝純粋な遊離酸として８３.０％ 豊富溶媒からの収率＝７８％ 実施例４ クラブラン酸前ブロスの限外濾過、ついで、ＲＯ濃縮によりクラブラン酸粗溶 液を調製した。濃度２０.３％の水性の逆抽出物を、方法２と同様にして調製し た。この溶液１００ｍｌにＩＰＡ（１００ｍｌ）を添加した。得られた油状物質 をセライトのベッドによる濾過により除去した。攪拌しながらＩＰＡ（２０００ ｍｌ）をゆっくりと濾液に添加した。ＩＰＡ添加終了時に酢酸エチル（３００ｍ ｌ）を添加し、得られたスラリーを冷却し、１時間攪拌してから濾過し、生成物 を乾燥させた。 生成物重量＝２１.０ｇ 結晶化状態での収率＝８６.３％ 生成物純度＝純粋な遊離酸として８３.２％ 生成物水分含量＝０.３％

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．中間体アミン塩を形成することによって前精製されていないクラブラン酸 をカリウム塩として直接沈殿させることによる、医薬上許容される品質のクラブ ラン酸カリウムの製造方法であって、ＰＣＴ／ＧＢ９５／００１９１の主題であ るものを除く方法。 ２．医薬上許容される品質のクラブラン酸カリウムが、純粋な遊離酸として少 なくとも８０％の純度を有するものである請求項１記載の方法。 ３．医薬上許容される品質のクラブラン酸カリウムが、純粋な遊離酸として少 なくとも８２％の純度を有するものである請求項２記載の方法。 ４．医薬上許容される品質のクラブラン酸カリウムが、純粋な遊離酸として少 なくとも８３％の純度を有するものである請求項３記載の方法。 ５．クラブラン酸のカリウム塩が有機酸のカリウム塩の添加により形成される ものである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。 ６．発酵プロセスから得られたクラブラン酸の遊離酸を有機溶媒中に抽出する ことによりクラブラン酸が得られる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方 法。 ７．ついで、クラブラン酸が水性媒体中に逆抽出される請求項６記載の方法。 ８．クラブラン酸の力価が１ｍｌあたり１０００００ないし２００００マイク ログラムの範囲である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。 ９．クラブラン酸が全ブロス発酵物より得られるものである請求項１ないし８ のいずれか１項に記載の方法。 １０．全ブロス発酵物が濾過される請求項９記載の方法。 １１．濾過が限外濾過によるものである請求項１０記載の方法。