JP2002514896A - 組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを用いるｄｎａの筋細胞への送達のための方法 - Google Patents

組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを用いるｄｎａの筋細胞への送達のための方法

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Abstract

(57)【要約】 筋細胞および組織へのDNA分子の送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ビリオンの使用が開示される。本発明は、筋組織への組換えAAVビリオンの直接的インビボ注射（例えば、筋肉内注射）、ならびに処置のために被験体に続いて導入され得る筋細胞のインビトロ形質導入を可能にする。本発明は、送達された遺伝子の一様な高レベル発現、および形質導入された筋細胞からの治療的タンパク質のインビトロ分泌を提供し、その結果全身性送達が達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを用いる DNA の筋細胞への送達のための方法 説明 技術分野 本発明は、一般にDNA送達方法に関する。より詳細には、本発明は、選択したD NAを筋細胞および組織へ送達するための組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ビリオ ンの使用に関する。本方法は、送達DNAの持続的な、高レベル発現を提供する。発明の背景 遺伝子送達は、後天的および遺伝的疾患の処置のための確実な方法である。筋 組織は、それが容易にアクセスし得、高度に分化しそして非分裂であるので、遺 伝子送達標的として示されている。BarrおよびLeiden（1991）Science 254:1507 -1509。これらの特性は、最大の遺伝子移入を達成するための適切な送達ストラ テジーの選択において重要である。 数人の実験者らが、送達された遺伝子によりコードされたタンパク質のその後 の全身性循環を有する遺伝子を筋細胞へ送達する能力を実証している。例えば、 Wolffら、（1990）Scince 247:1465-468;Acsadiら、（1991）Nature 352:815-81 8;BarrおよびLeiden（1991）Science 254:1507-1509;Dhawanら、（1991）Scienc e 254:1509-1512;Wolffら、（1992）Human Mol．Genet．1:363-369;Eyalら、（1 993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4523-4527;Davisら、（1993）Hum．Gene Therapy 4:151-159を参照のこと。 遺伝子は、プラスミドDNAの直接注入により筋肉に送達されている（例えば、W olffら、（1990）Science 247:1465-468;Acsadiら、（1991）Nature 352:815-81 8;BarrおよびLeiden（1991）Science 254:1507-1509により記載される）。しか し、この投与の様式は、一般に維持されるが低レベルの発現を生じる。低いが維 持された発現レベルは、特定の状況（例えば、免疫を提供するため）において効 果的であり得る。 ウイルスベースの系がまた、筋肉への遺伝子送達のために使用されている。例 えば、ヒトアデノウイルスはレセプター媒介性エンドサイトーシスにより細胞に 侵入する２本鎖DNAウイルスである。これらのウイルスは、これらが増殖および 操作に容易であり、そしてこれらがインビボおよびインビトロで広範な宿主範囲 を示すので、遺伝子送達のために良好に適切であると考えられている。アデノウ イルスは、静止標的細胞ならびに複製標的細胞に感染し得、そして宿主ゲノム内 に組込まれるよりむしろ染色体外に存在する。 これらの利点に関わらず、アデノウイルスベクターは、これらを長期遺伝子療 法については非効果的にさせるいくつかの欠点を有する。詳細には、アデノウイ ルスベクターは、ウイルスタンパク質を発現し、これは形質導入細胞の寿命を減 少させ得る免疫応答を惹起し得る。この免疫応答は、体液性および／またはＴ細 胞応答なので、引き続く処置を排除し得る。さらに、成熟筋細胞は、アデノウイ ルスベクターを認識するレセプターを欠失し、これはこのようなベクターを用い るこの細胞型の効果的な形質導入を排除し得る。従って、遺伝子の筋細胞への送 達のためのアデノウイルスベクターを使用する試みは、貧弱および／または一過 的な発現を生じている。例えば、Quantinら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci． USA 89:2581-2584;Acsadiら、（1994）Hum．Mol．Genetics 3:579-584;Acsadiら 、Gene Therapy 1:338-340;Daiら、（1995）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:14 01-1405;Descampsら、（1995）Gene Therapy 2:411-417;Gilgenkrantzら、（199 5）Hum．Gene Therapy 6:1265-1274を参照のこと。 筋芽細胞の外科的移植に基づく遺伝子治療方法がまた試みられている。例えば 、国際公開番号WO 95/13376;Dhawanら、（1991）Science 254:1509-1512;Wolff ら、（1992）Human Mol．Genet．1:363-369;Daiら、（1992）Proc．Natl．Acad ．Sci．UAS 89:10892-10895;Hanamoriら、（1994）Hum．Gene Therapy 5:1349-1 356;Hamamoriら、（1995）J．Clin．Invest．95:1808-1813;BlauおよびSpringer （1995）New Eng．J．Med．333:1204-1207;Leiden，J.M.（1995）New Eng．J．M ed．333:871-872;Mendellら、（1995）New Eng．J．Med．333:832-838;ならびに BlauおよびSpringer（1995）New Eng．J．Med．333:1554-1556を参照のこと。し かし、 このような方法は実質的な組織培養操作および外科的専門技術を必要とし、そし て、せいぜい臨床試験において決定的でない効率を示す。従って、送達遺伝子の 長期発現を生じる、筋肉への遺伝子送達の単純かつ効果的な方法が所望され得る 。 アデノ随伴ウイルス(AAV)由来の組換えベクターは、遺伝子送達のために使用 されている。AAVは、Dependovirus属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルス である。AAVは、生産的感染を生じるために、関連しないヘルパーウイルス（例 えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）との感染を必要と する。ヘルパーウイルスは、AAV複製のほとんどの段階に必要である補助機能を 供給する。このような感染の非存在下では、AAVはそのゲノムの宿主細胞染色体 への挿入により、潜在状態を確立する。引き続くヘルパーウイルスによる感染は 、組込まれたコピーをレスキューし、それは次いで複製して感染性ウイルス子孫 を産生し得る。AAVは、広範な宿主範囲を有し、そして適切なヘルパーウイルス でのこのような細胞の首尾よい感染もまた存在する限り、任意の種由来の細胞に おいて複製し得る。従って、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスで同時感 染したイヌ細胞中で複製する。AAVは、いかなるヒトまたは動物疾患に関連して おらず、そして組込みの際、宿主細胞の生物学特性を変化させないようである。 AAVの総説については、例えば、BernsおよびBohenzky（1987）Advances in Viru s Research（Academic Press，Inc.）32:243-307を参照のこと。 AAVゲノムは、約4681塩基を含む線状の一本鎖DNA分子からなる(BernsおよびBo henzky、前出)。このゲノムは、各末端で、DNA複製起点としておよびウイルスの パッケージングシグナルとしてcisに機能する反転末端反復(ITR)を含む。ゲノム の内部非反復部分は、それぞれAAV repおよびcapとして知られる２つの大きなオ ープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパ ッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。AAVゲノムの詳細な 説明については、例えば、Muzyczka，N.（1992）Current Topics in Microbiol ．and Immunol．158:97-129を参照のこと。 組換えAAV(rAAV)ビリオンの構築は記載されている。例えば、米国特許第5,173 ,414号および同第5,139,941号；国際公開番号WO 92/01070（1992年１月23日公開 ）およびWO 93/03769（1993年３月４日公開）；Lebkowskiら、（1988）Molec． Cell．Biol．8:3988-3996;Vincentら、（1990）Vaccines 90(Cold Spring Harbo r Laboratory Press);Carter，B.J.（1992）Current Opinion in Biothechnolog y 3:533-539;Muzyczka，N.（1992）Current Topics in Michrobiol．and Immuno l．158:97-129;およびKotin，R.M.（1994）Human Gene Therapy 5:793-801。 組換えAAVビリオン産生は、一般にAAVベクタープラスミドを有するプロデュー サー細胞と、AAVベクタープラスミドに欠けている機能を完全にするためのAAVヘ ルパー機能を提供するヘルパー構築物との同時感染を包含する。この様にして、 プロデューサー細胞は、AAV複製およびパッケージングのために必要なAAVタンパ ク質を発現し得る。AAVベクタープラスミドは、AAV複製およびパッケージング機 能を提供するAAV ITRに隣接した、目的のDNAを含む。AAVヘルパー機能は、AAV r epおよび／またはcap領域を含むが、AAV ITRを欠失したAAVヘルパープラスミド を介して提供され得る。従って、ヘルパープラスミドは、それ自身複製もパッケ ージングも不可能である。次いで、プロデューサー細胞は、補助機能を提供する ためにヘルパーウイルスで感染されるか、または必要な補助機能を含むベクター で感染される。ヘルパーウイルスは、AAV repおよびcap領域の転写および翻訳を 指向するヘルパープラスミド上に存在するAAVプロモーターを活性化する。プロ デューサー細胞の引き続く培養の際、目的のDNAを有する組換えAAVビリオンが産 生される。 組換えAAVビリオンは、呼吸器上皮細胞(Flotteら、（1992）Am．J．Respir．C ell Mol．Biol．7:349-356;Flotteら、（1993）J．Biol．Chem．268:3781-3790; Flotteら、（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10613-10617)および中枢神 経系のニューロン(Kaplittら、（1994）Nature Genetics 8:148-154)への向性を 示すことが示されている。これらの細胞型は、高度に分化し、ゆっくりと分裂し ているかまたは有糸分裂後である。Flotteら、（1993）Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 90:10613-10617;Kaplittら、（1994）Nature Genetics 8:148-154。AAVベ クターが非増殖細胞に形質導入する能力(Podsakoffら、（1994）J．Virol．68:5 656-5666;Russellら、（1994）Proc．Natl．Acad．sci．USA 91:8915-8919;Flot teら、（1992）Am．J．Respir．Cell Mol．Biol．11:517-521は、遺伝的に欠損 および非病原性である性状と共に、遺伝子治療ウイルスベクター中にAAVを独特 の位 置に置く。 これらの利点にも関わらず、遺伝子をインビボで筋細胞へ送達するための組換 えAAVビリオンの使用は、本明細書以前には開示されていない。発明の要旨 従って、本発明は、組換えAAV（rAAV）ビリオンが遺伝子の効率的な送達を提 供し、そして種々の筋細胞において治療的タンパク質の産生を維持したという驚 くべきかつ予期しない発見に基づいている。本発明は、タンパク質の治療的レベ ルの全身性送達が達成されるように形質導入された筋細胞からの治療的タンパク 質のインビボ分泌を可能にする。これらの結果は、DNA送達のインビボおよびイ ンビトロ両方の様式で見られる。それゆえに、rAAVビリオンは、筋組織への直接 的にDNAの送達を可能にする。筋細胞における遺伝子を送達および発現する能力 、ならびに形質導入された細胞から産生されたタンパク質の分泌を提供する能力 は、広範な疾患を処置および／または予防するための遺伝子治療アプローチの使 用を可能にする。 さらに、インビボでの筋肉内投与によって、筋細胞にDNAを送達する能力は、 より効率的かつ簡単な遺伝子移入の方法を提供する。 従って、１つの実施態様において、本発明は、選択された遺伝子を筋細胞また は組織に送達するための方法に関する。この方法は以下の工程を含む： （a）AAVベクターを含む組換えAAVビリオンを提供する工程であって、このAAVベ クターは、選択された遺伝子のインビボでの転写および翻訳を指向し得る制御エ レメントに作動可能に連結する選択された遺伝子を含み；そして （b）組換えAAVビリオンを、筋細胞または組織に導入する工程。 特に好ましい実施態様において、選択された遺伝子は、治療的タンパク質（例 えば、エリスロポイエチン（EPO）、またはリソソーム酵素、酸性αガラクトシ ダーゼ（GAA））をコードする。 別の実施態様において、本発明は、AAVベクターを含む組換えAAVビリオンで形 質導入される筋細胞または組織に関し、このAAVベクターは、選択された遺伝子 のインビボでの転写および翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連結す る選択された遺伝子を含む。 なおさらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物被験体において取得また は受け継がれた疾患を処置する方法に関し、その方法は以下を含む：被験体の筋 細胞または組織に、インビボで、治療的有効量の（a）薬学的に受容可能な賦形 剤；および（b）組換えAAVビリオンを含む薬学的組成物を導入する工程。組換え AAVビリオンは、AAVベクターを含み、このAAVベクターは、被験体に存在する場 合、選択された遺伝子の転写および翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能 に連結される選択された遺伝子を含む。 さらに別の実施態様において、本発明は哺乳動物被験体において取得または受 け継がれた疾患を処置する方法に関し、その方法は以下を包含する： （a）組換えAAVビリオンを筋細胞または組織にインビトロで導入し、形質導入さ れた筋細胞を産生する工程。この組換えAAVビリオンは、AAVベクターを含み、こ のAAVベクターは、被験体に存在する場合、選択された遺伝子の転写および翻訳 を指向し得る制御エレメントに作動可能に連結される選択された遺伝子を含み； および （b）被験体に、治療的有効量の組成物を投与し、その組成物は薬学的に受容可 能な賦形剤および工程（a）からの形質導入された筋細胞を含む工程。 さらなる実施態様において、本発明は、治療的有効量のタンパク質を、全身的 に哺乳動物被験体に送達する方法に関し、その方法は、被験体の筋細胞または組 織に薬学的組成物を導入する工程を包含し、その組成物は以下を含む、：（a） 薬学的に受容可能な賦形剤；および（b）組換えAAVビリオン、ここで組換えAAV ビリオンは、AAVベクターを含み、このAAVベクターは、被験体に存在する場合、 選択された遺伝子の転写および翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連 結される選択された遺伝子を含み、ここで導入はインビボで行われる。 別の実施態様において、本発明は、治療的有効量のタンパク質を全身的に哺乳 動物被験体に送達するための方法に関し、その方法は以下の工程を含む： （a）組換えAAVビリオンを筋細胞または組織にインビトロで導入し、形質導入さ れた筋細胞を産生し、ここでこの組換えAAVビリオンは、AAVベクターを含み、こ のAAVベクターは、被験体に存在する場合、選択された遺伝子の転写および翻訳 を指向し得る制御エレメントに作動可能に連結される選択された遺伝子を含む工 程；および （b）被験体に、治療的有効量の薬学的に受容可能な賦形剤および工程（a）から の形質導入された筋細胞を含む組成物を投与する工程。 他の実施態様において、本発明は、遺伝子のインビボでの転写および翻訳を指 向し得る制御エレメントに作動可能に連結されるエリスロポイエチン（EPO）ま たは酸性αガラクトシダーゼ（GAA）のいずれかをコードする遺伝子を含むAAVベ クター、ならびにベクターを含む組換えAAV（rAAV）ビリオンに関する。 本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を参照すれば、当業 者には容易に想到する。図面の簡単な説明 図１は、実施例３、パートAに記載のrAAV-LacZとの形質導入に続く、マウス筋 細胞における、βガラクトシダーゼ発現のインサイチュ組織化学検出を示す。こ の研究において、成体Balb/cマウスの脛骨前筋を、８×109rAAV-LacZで注射した 。動物を、注射後（a）２、（b）４、（c）８、（d）12、（e）24、または（f） 32週間で屠殺した。脛骨前を切除し、そして10mmの切片をβガラクトシダーゼ組 織化学のためのX-galによって染色した。染色した組織資料を、25×で撮影した 。 図２は、実施例３、パートAに記載のrAAV-LacZの注射後２カ月の骨格筋の切片 を示す。脛骨前筋を、βガラクトシダーゼの発現をンサイチュ検出するために処 理し、そして400×の回折干渉対照光学（contrast optics）で撮影した。 図３は、実施例３、パートBに記載のrAAV-LacZでインビトロで形質転換された 、Balb/cマウスの脛骨前筋におけるβガラクトシダーゼの発現を示す。成体Balb /cマウスに、種々の用量のrAAV-LacZを、筋肉内（IM）注射した。βガラクトシ ダーゼ（β-gal）の分析のために注射後２および８週間で、組織を採集した。β -galの発現を、照度計によって検出されるような筋肉ホモジネートから放射され る相対光学単位（relative light units）（RLU）の測定によって分析した。 図４は、実施例４に記載の形質導入された管筋および筋芽細胞からのヒトエリ スロポイエチン（hEPO）の分泌を示す。管筋（分化した細胞）または筋芽細胞（ 活動的に分化している細胞）を、標的細胞につき約105の比で、rAAV-hEPOで形質 導入した。分泌されたhEPOのレベルを、種々の時点での上清について分析した。 形質導入前のhEPOのベースラインレベルは、両方の細胞集団における検出のレベ ル未満であった；各時点での値は、複製値＋／−標準偏差を示す。 図５は、実施例４に記載のrAAV-hEPOで形質導入したC2C12管筋による、ヒトエ リスロポイエチン（hEPO）の分泌を示す。コンフルエントなC2C12筋芽細胞は管 筋に分化され、そして３×108（白ぬきバー）、３×109（斜行平行線のバー）、 または３×1010（黒ぬりバー）rAAV-hEPOで形質導入した。EPOの分泌を、形質導 入後、３、８、および14日で測定した。コントロールrAAV-LacZ管筋は、＜2.5mU /mL EPOを分泌した。棒グラフは、３連の培養で決定される、EPO/ウェル/24時間 の平均産生±平均の標準誤差（SEM）を示す。 図６は、実施例５に記載のrAAV-hEPOで形質導入した原始ヒト管筋による、ヒ トエリスロポイエチン（hEPO）の分泌を示す。コンフルエントなヒト筋芽細胞を 、還元血清培地中（reduced-serum media）で14日間の培養より管筋に分化し、 次いで３×108（白ぬきバー）、３×109（斜行平行線のバー）、または３×1010 （黒ぬりバー）rAAV-hEPOで形質導入した。EPOの分泌を、形質導入後、３、８、 および14日で測定した。rAAV-LacZで形質導入したコントロール管筋は、＜2.5mU /mL EPOを分泌した。棒グラフは、３連の培養で決定される、EPO/ウェル/24時間 の平均産生±平均の標準誤差（SEM）を示す。 図７は、rAAV-hEPOで筋肉内注射後のBalb/cマウスにおける、EPO分泌の時間経 過を示す。成体Balb/cマウスを、０日目に、１×1010（▼）、３×1010（▲）、 １×1011（■）、または３×1011（●）精製rAAV-LacZで筋肉内で注射し、そし て注射後種々の時点で測定した血清EPOレベルを示す。報告される値は、平均（n ＝４）±SEMを示す。 図８は、実施例８、パートAに記載のrAAV-hGAAでインビトロで形質導入したヒ ト骨格筋における酸性αグルコシダーゼ（GAA）の高レベル発現を示す。この研 究において、分化したヒト筋芽細胞を２×105のMOIでrAAV-hGAAビリオンに曝露 した。細胞を、示された時点で回収し、そしてGAA活性を、酵素学的アッセイに よって測定した。形質導入されていないコントロール細胞（白ぬきバー）および rAAV-LacZで形質導入された細胞（斜行平行線のバー）は、GAAの有意な発現を示 さなかったが、一方、rAAV-hGAAで形質導入された細胞（黒ぬりバー）は、高レ ベルのGAA活性を示した。棒グラフは、３連の培養で決定された平均GAA活性±SE Mを示す。 図９は、実施例８、パートBに記載の、rAAV-hGAAでインビボで形質導入したBa lb/cマウス脛骨前筋における酸性αグルコシダーゼの発現を示す。成体Balb/cマ ウスを、４×1010rAAV-hGAA（黒ぬりバー）または同用量のrAAV-LacZ（白ぬきバ ー）で筋肉内注射（IM）した。注射後種々の時点で、筋組織を採取し、酵素学的 アッセイによってGAA活性を分析した。棒グラフは、５匹の動物（週１および４ ）または４匹の動物（週10）において決定された平均GAA活性±SEMを示す。発明の詳細な説明 本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内のウイルス学、 微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来の方法を使用する。このよ うな技法は、文献に十分に説明される。例えば、SambrooklらMolecular Cloning :A Laboratory Manual(最新版)；DNA Cloning:A Practical Approach，第Iおよ びII巻（D．Glover編）；Oligonucleotide Synthesis(N．Gait編，最新版)；Nuc leic Acid Hybridization(B．HamesおよびS．Higgins編，最新版)；Transcripti on and Translation(B．HamesおよびS．Higgins編，最新版)；CRC Handbook of Parvoviruses，第IおよびII巻(P．Tijssen編)；Fundamental Virology，第2版， 第IおよびII巻（B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編）を参照のこと。 本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」 、および「the」は、内容が明確に他を指示しない限り、複数の表示を含む。Ａ．定義 本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義 されることが意図される。 用語「遺伝子送達」または「遺伝子移入」は、標的細胞（例えば、筋細胞）に 外来DNAを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、遺伝 子の一過性または長期的発現を生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝 性疾患の処置への独特のアプローチを提供する。多くの系が、哺乳動物細胞への 遺伝子移入について開発されている。例えば、米国特許第5,399,346号を参照の こと。 用語「治療的タンパク質」は、問題の被験体から欠損しているまたは消失して いるゆえ、被験体において疾患状態または障害を生じるタンパク質か、あるいは 、抗ウイルス、抗細菌または抗腫瘍機能のような、問題の被験体に利益を与える タンパク質をいう。治療的タンパク質はまた、内分泌機能、免疫学的機能および 代謝的機能のような広範な生物学的機能の任意の一つを改変するタンパク質であ り得る。代表的治療的タンパク質は、以下により詳細に説明される。 「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色 体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝エレメントを意味し、これは 適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子 配列を移入し得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒク ル、ならびにウイルスベクターを包含する。 「AAVベクター」とは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含 むがこれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味 する。AAVベクターは、全体または一部欠失した１つ以上のAAV野生型遺伝子、好 ましくはrepおよび／またはcap遺伝子（以下に記載する）を有し得るが、機能的 な隣接ITR配列（これもまた以下に記載する）を保持し得る。機能的ITR配列は、 AAVビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに必要である。従って 、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングにシスで必要とされる これらの配列（例えば、機能的ITR）を少なくとも含むように、本明細書中で定 義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、配列が 機能的レスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレ オチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。 「組換えウイルス」とは、例えば、粒子への異種核酸構築物の付加または挿入 によって、遺伝的に改変されているウイルスを意味する。 「AAVビリオン」とは、野生型（wt）AAVウイルス粒子（AAVキャプシドタンパ ク質コートと結合した直鎖状の一本鎖AAV核酸ゲノムを含む）を意味する。これ に関して、例えば、相補的センス（「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）の いずれかの一本鎖AAV核酸分子は、任意の１つのAAVビリオンにパッケージされ得 、そして両鎖は等しく感染性である。 「組換えAAVビリオン」または「rAAVビリオン」は、本明細書中では、両側にA AV ITRが隣接している目的のDNA分子をキャプシド化している、AAVタンパク質外 皮から構成される感染性の複製欠損性ウイルスとして定義される。rAAVビリオン は、中に導入したAAVベクター、AAVヘルパー機能、および付属機能を有している 適切なプロデューサー細胞において産生される。このようにして、プロデューサ ー細胞は、AAVベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を組換えビリ オン粒子にパッケージしそれに続く遺伝子送達のために必要なAAVポリペプチド をコードし得るようになる。 用語「トランスフェクション」とは、哺乳動物細胞による外来DNAの取り込み をいうために使用される。外因性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合に、 細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技法が当 該分野で公知である。例えば、Grahamら（1973）Virology，52:456、Sambrookら （1989）Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Labor atories，New York、Davisら（1986）Basic Methods in Molecular Biology，El sevier、およびChuら（1981）Gene 13:197を参照のこと。このような技術は、適 切な細胞内に１つ以上の外因性DNA部分（例えば、プラスミドベクターおよび他 の核酸分子）を導入するために使用され得る。この用語は、遺伝的物質の安定な 取り込みおよび一過性の取り込みの両方をいう。 用語「形質導入」は、インビボまたはインビトロのいずれかでの、組換えAAV ビリオンのような複製欠損性ウイルスベクターを介したDNA分子のレシピエント 細胞への送達を意味する。 「筋細胞」または「組織」は、骨格筋；平滑筋（例えば、消化管、膀胱、およ び血管由来）；ならびに心筋由来の細胞および組織を含むがこれらに限定されな い、筋肉由来の細胞または細胞の群を意味する。この用語は、インビトロおよび インビボの両方での筋細胞を意味する。従って、例えば、単離された心筋細胞は 、インビボで被験体に存在する筋組織中に存在するような筋細胞であるように、 本発明の目的のために「筋細胞」を構成する。この用語はまた、筋細胞、筋管、 筋芽細胞、心筋細胞および心筋芽細胞のような、分化したか、および未分化の両 方の筋細胞を包含する。 用語「異種」は、遺伝子配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、 通常はともに連結されていない、および／または特定の細胞と通常は関連してい ない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、他の分 子に関連して天然では見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した 核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列に関連 して天然では見出されない配列に隣接したコード配列を含み得た。異種コード配 列の別の例は、コード配列自体が天然で見出されない構築物である（例えば、本 来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常は存在 しない構築物で形質転換した細胞は、本発明の目的のために異種であると考えら れる。対立遺伝子変異または天然に存在する変異事象は、本明細書で使用される ように、異種DNAを生じない。 「DNA」は、二本鎖または一本鎖の形態の、弛緩したかスーパーコイル化した かのいずれかの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミジン、 またはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次および二 次構造のみをいい、どの特定の三次形態へも限定しない。したがって、この用語 は、とりわけ、直鎖状DNA分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、 および染色体中で見出される一本鎖および二本鎖DNAを含む。特定のDNA分子の構 造を議論するにおいて、配列は、本明細書中においては、DNAの非転写鎖（すな わち、mRNAに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向への配列のみ を与える、通常の慣例に従って記載され得る。この用語は、４つの塩基、アデニ ン、グアニン、チミジン、またはシトシンを含む分子、ならびに当該分野で公知 の塩基アナログを含む分子を包含する。 「遺伝子」または「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配 列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボでポ リペプチドに転写され（DNAの場合）そして翻訳される（mRNAの場合）核酸分子 である。遺伝子の境界は、5'（アミノ）末端での開始コドンおよび3'（カルボキ シ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子は、原核生物または真 核生物のmRNAからのcDNA、原核生物または真核生物のDNAからのゲノムDNA配列、 およびさらに合成DNA配列を包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配 列は、通常遺伝子配列の3'側に位置する。 用語「制御エレメント」とは、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、 転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「IRES 」）、エンハンサーなどを集団的にいい、これはレシピエント細胞においてコー ド配列の複製、転写、および翻訳を集団的に提供する。選択されたコード配列が 適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御エ レメントのすべてが必ずしも存在する必要はない。 用語「プロモーター領域」は、通常の意味において、調節配列が、RNAポリメ ラーゼと結合し得、そして下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得る遺 伝子由来であるDNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいうために、本明細書中 で使用される。 「作動可能に連結された」とは、エレメントの配置をいい、ここでこのように 記載された成分はそれらの通常の機能を実行するように配置される。従って、コ ード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現をもたら し得る。制御エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配 列と隣接する必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される 配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモー ター配列は、依然として、コード配列に「作動可能に連結された」と考えられ得 る。 本出願の全体を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対位置を 記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」 、「下流」、「3'」、または「5'」に配置されると記載される場合、これは、当 該分野において慣習的にそのようにいわれる、DNA分子の「センス」鎖または「 コード」鎖における配列の位置であると理解される。 「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間、または２つのポリペプチド部分 間の同一性のパーセントをいう。１つの部分から別の部分までの配列の間の一致 は、当該分野で公知の技法によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報 を整列させること、および容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用する ことによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定され 得る。あるいは、相同性は、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポ リヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の１または複数の一本鎖特異 的ヌクレアーゼでの消化、および消化したフラグメントのサイズ決定によって決 定され得る。上記の方法を使用して決定したときに、少なくとも約80％、好まし くは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約95％のヌクレオチド またはアミノ酸が、分子の規定の長さにわたって整合する場合、２つのDNAまた は２つのポリペプチド配列は互いに「実質的に相同」である。 「哺乳動物被験体」は、ヒト、チンパンジーおよび他のサルの種のような非ヒ ト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜；イヌおよびネ コのようなペット用哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモットのような齧歯 類を含む実験動物；などを含みこれらに限定されない哺乳動物綱の任意のメンバ ーを意味する。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、 成体被験体および新生被験体、ならびに胎生被験体が、雄性または雌性であろう が、網羅されるように意図される。 Ｂ．一般的方法 本発明は、組換えAAVビリオンを用いて、選択された遺伝子の筋細胞への移入 の成功を提供する。この方法は、組換えAAVビリオンの筋組織への直接的なイン ビボ注射（例えば、筋肉内注射による）、ならびに引き続いて処置のために被験 体に導入され得る筋細胞のインビトロでの形質導入を可能にする。本発明はまた 、産生されたタンパク質のインビボでの、形質導入筋細胞からの分泌を提供し、 全身性送達が達成され得る。 筋肉は、遺伝子治療のために所望の標的を提供する。なぜなら、筋細胞は容易 に接近可能で、そして分裂しないからである。しかし、本発明はまた、筋芽細胞 のような、インビトロで形質導入され得、そして続いて被験体に導入され得る、 未分化筋細胞を用いる使用を見出す。 筋肉は、循環器系に対して容易な接近を有するため、インビボで筋細胞および 組織により産生されて分泌されたタンパク質が、全身性送達のために血流に入る 。さらに、保持された、治療レベルの筋肉からのタンパク質分泌が、本発明を用 いてインビボで達成されるため、反復された非経口の送達は、避けられるか、ま たは、治療が１回または数回の注射のみを用いて達成され得るような頻度に低減 される。このように、本発明は、以前の遺伝子送達方法に対して、顕著な利点を 提供する。 目的のDNAを含む本発明の組換えAAVビリオンは、当業者に公知の標準技術を用 いて産生され得る。方法は、通常、（1）AAV発現ベクターをプロデューサー細胞 に導入する工程；（2）AAVヘルパー構築物をプロデューサー細胞に導入する工程 であって、ここでヘルパー構築物が、プロデューサー細胞において発現されてAA Vベクターから欠損しているAAVヘルパー機能を補完し得るAAVコード領域を含む 、工程；（3）１つまたはそれ以上のヘルパーウイルスおよび／または付属機能 ベクターをプロデューサー細胞に導入する工程であって、ここでヘルパーウイル スおよび／または付属機能ベクターが、細胞における効率よい組換えAAV（「rAA V」）ビリオン産生を支持し得る付属機能を提供する、工程；および（4）rAAVビ リオンを産生するようにプロデューサー細胞を培養する工程。AAV発現ベクター 、AAVヘルパー構築物およびヘルパーウイルスまたは付属機能ベクター（単数ま たは複数）は、同時にまたは連続的にのいずれかで、標準トランスフェクション 技術を用いて、プロデューサー細胞に導入され得る。１．AAV発現ベクター AAV発現ベクターは、公知の技術を用いて構築され、少なくとも、転写開始領 域、目的のDNAおよび転写終結領域を含む制御エレメントを、転写の方向に作動 可能に連結された成分として提供する。制御エレメントは、哺乳動物筋細胞にお いて機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む生じた構 築物は、機能的AAV ITR配列に結合（５’および３’）している。 AAV ITR領域のヌクレオチド配列は公知である。AAV-2配列については、例えば 、Kotin，R.M.（1994）Human Gene Therapy 5;793-801；Berns，K.I.「パルボウ イルスおよびそれらの複製」、Fundamental Virology中、第２版（B.N．Fields およびD.M．Knipe編）を参照のこと。本発明のベクター中に使用されるAAV ITR は、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、そして例えば、ヌクレオチド の挿入、欠失、または置換により、改変され得る。さらに、AAV ITRは、AAV-1、 AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むがこれらに限定されない、いく つかのAAV血清型のいずれかに由来し得る。さらに、AAV発現ベクターにおいて選 択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ITRは、それらが意図され たように機能（すなわち、ビリオンのパッケージングを可能にする）している限 り、必ずしも同一であるか、または同一のAAV血清型または単離物に由来してい る必要はない。 AAVベクターにおける使用のための適切なDNA分子は、約５キロベース（kb）未 満のサイズであり、そして、例えば、レシピエント被験体から欠損または消失し ているタンパク質をコードする遺伝子、または所望の生物学的または治療的効果 （例えば、抗細菌、抗ウイルス、または抗腫瘍機能）を有するタンパク質をコー ドする遺伝子を含む。 適切なDNA分子には、内分泌の障害、代謝障害、血液学的障害、心血管系障害 、神経学的障害、筋骨格障害、泌尿器学的障害、肺障害、免疫障害の処置に使用 されるタンパク質をコードするDNA分子が含まれるが、これらに限定されない。 これら障害には、炎症性疾患、自己免疫、慢性および感染性疾患(例えば、エイ ズ)、ガン、高コレステロール血症、インスリン障害(例えば、糖尿病)、成長障 害、種々の血液障害(種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含む)；遺伝子欠損 (例えば、嚢胞性線維症、ゴシェ病、フルラー病、アデノシンデアミナーゼ(ADA) 欠損症)、気腫のような障害が含まれる。 本発明を例示するために、エリスロポエチン(EPO)をコードする遺伝子が使用 され得る。EPOは、骨髄および他の造血組織において始原細胞に作用して赤血球 の生成を刺激する、胎児肝臓および成人腎臓で産生される糖タンパク質ホルモン である。ヒトおよび他の哺乳動物のEPOをコードする遺伝子が、クローニングさ れ、配列決定され、そして発現させられている。この遺伝子は、コード領域にお いて、種間で高度な配列相同性を示す(Wenら(1993)Blood 82:1507-1516)。天然 のヒトEPOをコードする遺伝子の配列、ならびにこれを得る方法は、例えば、米 国特許第4,954,437号および第4,703,008号、ならびにJacobsら(1985)Nature 313 :806-810；Linら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7580；国際公開第WO 85/026 10号；および欧州特許公開第232,034 B1号に記載されている。さらに、天然のネ コ、イヌ、およびブタのEPOをコードする遺伝子の配列は、公知であり、そして 容易に入手可能である(それぞれ、GenBankアクセス番号L10606；L13027；および L10607)。サル(Macaca mulatta)EPOをコードする遺伝子の配列もまた、公知であ り、そして入手可能である(GenBankアクセス番号L10609)。本明細書中で使用さ れる場合、用語「EPO」は、天然で完全長の分泌形態のEPO、ならびにPOの機能もし くは活性を保持する、１または複数のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含むそ のアナログまたは誘導体をいう。この点について、EPOレセプターに結合し、そ してこれを活性化する多くの小さなペプチドが同定されている(Wrihtonら(1996) Science 273:458-463；Livnahら(1996)Science 273:464-471)。EPOをコードする かまたは同一の機能を有するそのアナログもしくは誘導体をコードする遺伝子を 含む、本明細書中に記載される組換えAAVビリオンは、欠陥のある赤血球生成に よって特徴付けられる血液疾患の処置(例えば、貧血の処置)において特に有用で ある。EPOの産生に起因する赤血球産生の増大は、適切な指標によって(例えば、 処置の前後のへマトクリット測定値を比較すること、赤血球数、ヘモグロビン濃 度、または網状赤血球数の増加を測定することによって)容易に決定され得る。 上記のように、EPO遺伝子にはAAV ITRが隣接する。 あるいは、リソゾーム酵素である酸αグルコシダーゼ(GAA)をコードするヌク レオチド配列が使用され得る。GAAは、リソゾームのグリコーゲンのα-1,4およ びα-1,6結合を切断して、単糖を遊離するように機能する。ヒトGAAをコードす る遺伝子の配列ならびにこれを得る方法は、以前に記載されている(GenBankアク セス番号M34424およびY00839；Martiniukら(1990)DNA Cell Biol．9:85-94；Mar tiniukら(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9641-9644；Hoefslootら(1988)Eur. Mol.Biol.Organ．7:1697-1704)。従って、本明細書中に記載される組換えAAV ビリオンは、GAAをコードするかまたはGAA活性を有するそのアナログもしくは誘 導体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。 選択されたヌクレオチド配列(例えば、EPOまたは目的の別の遺伝子)は、被験 体においてインビボでその転写または発現を指向する制御エレメントに作動可能 に連結される。このような制御エレメントは、選択された配列と通常関連する制 御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が用いられ得る。有用な異種制御配 列には、一般的に、哺乳動物もしくはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来 する制御配列が含まれる。例としては、SV40早期プロモーター；マウス乳ガンウ イルスLTRプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)；単純 ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター；サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター (例えば、CMV即時初期型プロモーター領域(CMVIE))；ラウス肉腫ウイルス(RSV) プロモーター；合成プロモーター；ハイブリッドプロモーター；などが挙げられ るが、これらに限定されない。さらに、非ウイルス遺伝子(例えば、マウスメタ ロチオネイン遺伝子)由来の配列もまた、本明細書中の使用を見出す。このよう なプロモーター配列は、例えば、Stratagene(San Diego，CA)から市販されてい る。 本発明の目的のためには、制御エレメント(例えば、筋肉特異的および誘導性 プロモーター、エンハンサーなど)は、特に有用である。このような制御エレメ ントには、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー(例えば、myoD遺伝子ファ ミリー(Weintraubら(1991)Science 251:761-766))由来の制御エレメント；筋細 胞特異的エンハンサー結合因子MEF-2(CserjesiおよびOlson（1991）Mol.Cell Bi ol．11:4854-4862)；ヒト骨格筋アクチン遺伝子(Muscatら(1987)Mol.Cell Biol.7 :4089-4099)および心筋アクチン遺伝子に由来する制御エレメント；筋クレアチ ンキナーゼ配列エレメント(Johnsonら(1989)Mol.Cell Biol．9:3393-3399)およ びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー(mCK)エレメント；骨格筋速収縮(fast -twitch)トロポニンＣ遺伝子、遅収縮(slow-twitch)心筋トロポニンＣ遺伝子、 および遅収縮トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント；低酸素血症誘導核 因子(Semenzaら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5680-5684；Semenzaら、J.Bi ol.Chem．269:23757-23763)；ステロイド誘導エレメントおよびプロモーター （例えば、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)(MaderおよびWhite（1993） Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607))；RU486誘導のための融合コンセンサス エレメント；テトラサイクリン調節遺伝子発現を提供するエレメント(Dhawanら （1995）Somat.Cell.Mol.Genet．21:233-240；Shockettら(1995)Proc.Natl.Acad .Sci.USA 92:6522-6526)；および誘導可能、合成ヒト化プロモーター(Riveraら( 1996)Nature Med．2:1028-1032)が挙げられるが、これらに限定されない。 これらの調節エレメントおよび他の調節エレメントは、以下の実施例において 記載される、インビボでの静止状態の筋生理機能を模倣するインビトロ筋芽細胞 モデルを使用して、可能性のあるインビボ効力について試験され得る。 AAV ITRに結合された目的のDNA分子を有するAAV発現ベクターは、選択された 配列を、そこから主要なAAVオープンリーディングフレーム(「ORF」)が切り取られ ているAAVゲノム中に直接挿入することにより構築され得る。複製およびパッケ ージング機能を可能にするに十分な部分のITRが残される限り、AAVゲノムの他の 部分もまた欠失させ得る。このような構築物は、当該分野において周知の技術を 使用して設計され得る。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号 ；国際公開第WO 92/01070号(1992年１月23日公開)および同第WO 93/03769(1993 年３月４日公開)；Lebkowskiら(1988)Molec.Cell.Biol．8:3988-3996；Vincent ら(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter,B.J.（1 992）Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Curren t Topics in Microbiol．and Immunol．158:97-129；Kotin,R.M.(1994)Human Ge ne Therapy 5:793-801；ShellingおよびSmith(1994)Gene Therapy 1:165-169； ならびにZhouら(1994)J.Exp.Med．179:1867-1875を参照のこと。 あるいは、AAV ITRは、ウイルスゲノムまたはこれを含むAAVベクターから切り 取られ、そして標準的な連結技術(例えば、Sambrookら(前出)に記載の連結技術) を使用して、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の5'および3'に融合 され得る。例えば、連結は、20mM Tris-Cl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM DTT、33 μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl、および40μM ATP、０℃の0.01〜0.02(Weiss)単 位のT4 DNAリガーゼ(「粘着末端」連結用)、または１mM ATP、14℃の0.3〜0.6(Wei ss)単位のT4 DNAリガーゼ(「平滑末端」連結用)のいずれかにおいて達成され得る 。 分子間「粘着末端」連結は、通常、30〜100μg/mlの総DNA濃度(５〜100nMの終点総 濃度)にて実行される。ITRを含むAAVベクターは、例えば、米国特許第5,139,941 号に記載されている。特に、アメリカンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」) から、アクセス番号53222、53223、53224、53225、および53226の下で入手可能 ないくつかのAAVベクターがこの特許明細書に記載されている。 さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に 配置されたAAV ITR配列を含むように合成的に産生され得る。哺乳動物筋細胞に おけるキメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンが使用され得る。完全な キメラ配列が、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから組 み立てられる。例えば、Edge，Nature（1981）292:756；Nambairら、Science（1 984）223:1299；Jayら、J．Biol．Chem．（1984）259:6311を参照のこと。 rAAVビリオンを産生するため、AAV発現ベクターが、トランスフェクションの ような公知の技術を用いて適切なプロデューサー細胞に導入される。多くのトラ ンスフェクション技法が当該分野で一般的に公知である。例えば、Grahamら（19 73）Virology，52:456、Sambrookら（1989）Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York、Davisら（1986）Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier、およびChuら（1981）Gene 13:197を 参照のこと。特に適切なトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム共沈殿 （Grahamら（1973）Virol．52:456-467）、培養した細胞中への直接マイクロイ ンジェクション（Capecchi，M.R．（1980）Cell 22:479-488）、エレクトロポレ ーション（Shigekawaら（1988）BioTechniques 6:742-751）、リポソーム媒介遺 伝子移入（Manninoら（1988）BioTechniques 6:682-690）、脂質媒介形質導入（ Felgnerら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417）、および高速度 マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達（Kleinら（1987）Nature 327:70 -73）を包含する。 本発明の目的のために、rAAVビリオンを産生するために適切なプロデューサー 細胞は微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含み、それは、異種 DNA分子のレシピエントとして使用され得るか、または使用されている。この用 語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。このように、本明細書中 に使用される「プロデューサー細胞」は、通常、外因性DNA配列によってトラン スフェクトされた細胞をいう。安定なヒト細胞株293（例えば、アメリカンタイ プカルチャーコレクションから受託番号ATCC CRL1573で容易に入手可能）に由来 する細胞が本発明の実施において好ましい。特に、ヒト細胞株293は、アデノウ イルス５型のDNAフラグメントで形質転換したヒト胚腎細胞株であり（Grahamら 、（1977）J．Gen．Virol．36:59）、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現 する（Aielloら（1979）Virology 94:460）。293細胞株は、容易にトランスフェ クトされ、そしてrAAVビリオンを産生するための特に便利なプラットフォームを 提供する。 ２．AAV ヘルパー機能 上記のAAV発現ベクターを含むプロデューサー細胞は、AAV ITRに隣接するヌク レオチド配列を複製しそしてキャプシド形成してrAAVビリオンを産生するために 、AAVヘルパー機能を提供し得るようにならなければならない。AAVヘルパー機能 は、通常、その代わりに、生産的AAV複製のためにトランスで機能するAAV遺伝子 産物を提供するために発現され得る、AAV由来コード配列である。AAVヘルパー機 能は、AAV発現ベクターに欠損している必要なAAV機能を相補するために本明細書 中で使用される。このように、AAVヘルパー機能は、１つまたは両方の主要なAAV ORF、つまりrepおよびcapコード領域、またはその機能的ホモログを含む。 「AAV repコード領域」は、複製タンパク質Rep 78、Rep 68、Rep 52、およびR ep 40をコードするAAVゲノムの当該分野で認識された領域を意味する。これらの Rep発現産物は、認識、DNA複製のAAV起点の結合およびニッキング、DNAヘリカー ゼ活性、ならびにAAV（または、他の異種の）プロモーターからの転写の調節を 含む多くの機能を有することが示されてきた。Rep発現産物は、AAVゲノムを複製 するのに集団的に必要である。AAV repコード領域の記載については、例えば、M uzyczka，N.（1992）Current Topics in Microbiol．and Immunol．158:97-129; およびKotin，R.M.（1994）Human Gene Therapy 5:793-801を参照のこと。AAV r epコード領域の適切なホモログは、AAV-2 DNA複製を媒介することも知られてい るヒトヘルペスウイルス６（HHV-6）rep遺伝子（Thomsonら、（1994）Virology 2 04 :304-311）を含む。 「AAV capコード領域」は、キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3、ある いはそれらの機能的ホモログをコードするAAVゲノムの当該分野で認識された領 域を意味する。これらのcap発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングする のに集団的に必要とされるキャプシドタンパク質である。AAV capコード領域の 記載については、例えば、Muzyczka，N．およびKotin，R.M.（上記）を参照のこ と。 AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターのトランスフェクションの前、または同 時のいずれかで、細胞をAAVヘルパー構築物でトランスフェクトすることにより プロデューサー細胞に導入される。このように、AAVヘルパー構築物は、生産的A AV感染のために必要な欠損AAV機能を相補するために、AAV repおよび／またはca p遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用される。AAVヘルパー構 築物は、AAV ITRを欠損しており、そして、自身を複製もパッケージすることを もし得ない。 これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイ ルスまたはビリオンの形態であり得る。RepおよびCapの両方の発現産物をコード する、一般に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45のような多くのAAVヘ ルパー構築物が記載されている。例えば、Samulskiら（1989）J．Virol．63:382 2-3828；およびMcCartyら（1991）J．Virol．65:2936-2945を参照のこと。Repお よび／またはCap発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。 例えば、米国特許第5,139,941号を参照のこと。 AAV発現ベクターおよびAAVヘルパー構築物の両方が、１つ以上の任意の選択マ ーカーを含むように構築され得る。適切なマーカーには、選択マーカーを含む核 酸構築物でトランスフェクトされている細胞が適切な選択培地中で増殖される場 合、それらの細胞に抗生物質耐性もしくは感受性を与えるか、色を与えるか、ま たは抗原特徴を変化させる遺伝子が挙げられる。本発明の実施に有用ないくつか の選択マーカー遺伝子は、G418（Sigma，St．Louis，MOから入手可能）に対する 耐性を与えることによって哺乳動物細胞での選択を可能にするハイグロマイシン Ｂ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）をコードす る）を含む。他の適切なマーカーは当業者に公知である。 ３．付属機能 プロデューサー細胞はまた、rAAVビリオンを産生するために、非AAV由来の機 能すなわち「付属機能」を提供し得るようにならなければならない。付属機能は 、AAVがその複製を依存する、非AAV由来のウイルスおよび／または細胞機能であ る。このように、付属機能は、少なくとも、AAV遺伝子転写、時期特異的なAAV m RNAスプライシング、AAV DNA複製、Cap発現産物の合成、およびAAVキャプシド組 立ての活性化に関連するものを含む、AAV複製に必要なそれらの非AAVタンパク質 およびRNAを含む。ウイルスベースの付属機能は、公知のヘルパーウイルスのい ずれかに由来し得る。 特に、付属機能は、当業者に公知である方法を使用してプロデューサー細胞に 導入され得、次いで発現され得る。一般に、付属機能は、関連のないヘルパーウ イルスでのプロデューサー細胞の感染によって提供される。アデノウイルス；単 純ヘルペスウイルス１型および２型のようなヘルペスウイルス；ならびにワクシ ニアウイルスを含む、多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。非ウイルス 付属機能も、任意の種々の公知の薬剤のいずれかを使用した細胞同調化により提 供される付属機能のように本発明における使用を見出す。例えば、Bullerら（19 81）J．Virol．40:241-247；McPhersonら（1985）Virology 147:217-222；Schle hoferら（1986）Virology 152:110-117を参照のこと。 あるいは、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供され得る。付属機能 ベクターは、１つ以上の付属機能を提供するヌクレオチド配列を含む。付属機能 ベクターは、細胞中の効率的なAAVビリオン産生を支持するために、適切なプロ デューサー細胞に導入され得る。付属機能ベクターは、プラスミド、ファージ、 トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。付属ベクターはまた、適切 な制御エレメントおよび酵素と会合する場合、プロデューサー細胞において転写 され得るか、または発現されて付属機能を提供し得る、１つ以上の線状化DNAま たはRNAフラグメントの形態であり得る。 付属機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムのような天然源 から得られ得るか、または、当該分野で公知の組換え方法または合成方法を使用 して構築され得る。この意味で、アデノウイルス由来付属機能は、広範に研究さ れており、付属機能に関連する多数のアデノウイルス遺伝子が、同定され、そし て部分的に特徴づけられている。例えばCarter，B.J.（1990）「アデノ随伴ウイ ルスヘルパー機能」CRC Handbook of Parvoviruses、第一巻（P．Tijssen編）； およびMuzyczka，N.（1992）Curr．Topics．Microbiol．and Immunol．158:97-1 29を参照のこと。特に、初期アデノウイルス遺伝子領域E1a、Ea2、E4、VAI RNA および、潜在的に、E1bは、付属プロセスに参加していると考えられる。Janikら 、（1981）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1925-1929。ヘルペスウイルス由来 付属機能が記載されている。例えば、Youngら(1979)Prog．Med．Virol．25:113 を参照のこと。ワクシニアウイルス由来付属機能もまた、記載されている。例え ば、Carter，B.J．(1990)、上記、Schlehoferら、（1986）Virology 152:110-11 7を参照のこと。 プロデューサー細胞のヘルパーウイルスでの感染、またはプロデューサー細胞 の付属機能ベクターでのトランスフェクションの結果として、AAV Repおよび／ またはCapタンパク質を産生するためにAAVヘルパー構築物をトランス活性化する 付属機能が発現される。Rep発現産物は、AAV発現ベクターから組換えDNA（目的 のDNAを含む）を切り出す。Repタンパク質はまた、AAVゲノムを２倍にするため に作用する。発現したCapタンパク質はキャプシド中に組み立てられ、そして組 換えAAVゲノムはキャプシド中にパッケージされる。従って、生産的AAV複製が起 こり、そしてDNAはrAAVビリオンにパッケージされる。 組換えAAV複製の後、rAAVビリオンは、CsCl勾配のような種々の従来の精製方 法を使用してプロデューサー細胞から精製され得る。さらに、感染が付属機能を 発現するために用いられる場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用 して不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、例えば、20分以上、約60℃ の温度まで加熱することによって不活性化され得る。この処理はヘルパー細胞の みを効率的に不活性化する。なぜなら、AAVは非常に熱安定であるが、一方ヘル パーアデノウイルスは熱不安定であるからである。 得られたrAAVビリオンは、次いで、DNA送達のために、例えば遺伝子治療適用 に、トランスジェニック動物の生産に、ワクチン接種、特に種々の筋細胞タイプ への遺伝子送達のために容易に使用され得る。 ４．インビトロ、およびインビボでのrAAVビリオン送達 通常、rAAVビリオンは、インビボまたはインビトロ形質導入技術のいずれかを 用いて筋細胞に導入される。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエ ント筋細胞は、被験体から取り出され、rAAVビリオンで形質導入され、そして、 被験体に再度導入される。あるいは、それらの細胞が、不適切な免疫応答を被験 体において起こさない場合、同系のまたは異系の筋細胞が使用され得る。 形質導入細胞の被験体への送達および導入のための適切な方法が記載されてい る。例えば、細胞は、例えば、適切な培地中で組換えAAVビリオンを筋細胞と組 み合わせ、そしてサザンブロットおよび／またはPCRのような従来の技術を用い て目的のDNAを有するそれらの細胞をスクリーニングすることによるか、または 選択可能なマーカーを使用することにより、インビトロで形質導入され得る。次 いで、形質導入細胞は、以下に十分に記載される、薬学的組成物に処方され得、 そして組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射、あるいは、例えば カテーテルを使用した平滑筋および心筋への注射によるような種々の技術により 被験体に導入され得る。 インビボ送達については、rAAVビリオンが、薬学的組成物に処方され、そして 、通常、例えば、骨格筋または心筋への直接的な筋肉内注射により非経口的に投 与される。 薬学的組成物は、目的のタンパク質の治療的な有効量（すなわち、問題の疾患 状態の徴候を低減するかまたは改善するのに充分な量、あるいは所望の利益を与 えるのに充分な量）を産生するために充分な遺伝物質を含む。薬学的組成物はま た、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、それ自身が組成物 を受け取る個体に毒性である抗体の産生を誘導せず、そして過度な毒性なく投与 され得る、任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に受容可能な賦形剤は、水、生理的 食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体を含むがこれらに限定さ れない。薬学的に受容可能な塩は、ここでは、例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸 塩、硫酸塩などのような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩 、安息香酸塩などのような有機酸塩を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩 衝物質などのような補助物質は、このようなビヒクルに存在し得る。薬学的に受 容可能な賦形剤の完全な議論は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack P ub．Co.，N.J．1991)で入手可能である。 適切な用量は、とりわけ、処置される哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト霊 長類または他の哺乳動物）、処置される披験体の年齢および一般条件、処置を受 ける状態の重篤度、問題の特定の治療タンパク質、その投与方法に依存する。適 切な有効量は、容易に当業者により決定され得る。 このように、「治療的な有効量」は、比較的広範であり、これらは、臨床試験 を通して決定され得る。例えば、インビボ注射、すなわち、骨格筋または心筋へ の直接的な注射については、治療的な有効用量は、rAAVビリオンの約106〜1015 のオーダーであり、より好ましくは、108〜1014rAAVビリオンである。インビト ロ形質導入については、筋細胞に送達されるrAAVビリオンの有効量は、rAAVビリ オンの108〜1013のオーダーである。薬学的組成物における形質導入細胞の量は 、約104〜1010の筋細胞であり、より好ましくは105〜108の筋細胞である。形質 導入細胞が血管平滑筋に導入され得る場合、より低い用量が適切であり得る。他 の有効な用量は、用量応答曲線を確立するルーチンの試験を通して当業者により 容易に確立され得る。 投与処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。 さらに、被験体は、適切なだけの多くの用量で投与され得る。当業者は、容易に 適切な用量回数を決定し得る。Ｃ．実験 以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、 例示目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいかなるようにも限定す ることを意図されない。 使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力が なされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん容認されるべきで である。 材料と方法 ベクター構築物 Ａ．p1909adhlacZの構築。 プラスミドp1909adhlacZを、以下の実施例においてヘルパー構築物として使用 し、そしてプラスミドpWadhlacZから構築した。プラスミドpWadhlacZを、プラス ミドpUC119(GeneBank参照名：U07649，GeneBank受託番号：U07649)をAflIIIおよ びBspHIで部分的に消化し、クレノウ酵素で平滑末端改変し、次いで連結するこ とによって構築し、細菌起点およびamp遺伝子のみ（ポリリンカーおよびF1起点 を除去した）を含む環状1732bpプラスミドを形成した。平滑化され、そして連結 されたAflIIIおよびBspHI接合部は、独特のNspI部位を形成する。1732bpプラス ミドをNspIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端改変し、そしてpUC119ポリリン カーから得られた20bp HinDIII-HinCIIフラグメント（クレノウ酵素で平滑末端 改変した）を、このプラスミドの平滑化NspI部位に連結した。平滑化ポリリンカ ー由来のHinDIIIを再生し、次いで細菌複製起点に隣接して配置した。次いで、 得られたプラスミドを独特のPstI/Sse8387I部位で切断し、そして配列：5'-GGCA GCTGCCTGCA-3'（配列番号１）を有するSse8387I-PvuII-Sse8387Iオリゴヌクレオ チドをそこに連結した。残っている独特のBspHI部位を切断し、クレノウ酵素で 平滑末端改変し、そして配列：5'-GAAGGCGCGCCTTC-3'（配列番号２）を有するAs cIリンカーオリゴヌクレオチドをそこに連結し、BspHI部位を排除した。得られ たプラスミドをpWeeと呼んだ。 pWadhlacZ構築物を作製するために、CMVlacZ発現カセット（以下のエレメント ：CMVプロモーター、hGH第１イントロン、adhlacZフラグメント、およびSV40初 期ポリアデニル化部位を含み、AAV ITRによって5'および3'を隣接されるヌクレ オチド配列を含む）を、CMVプロモーターがpWeeの細菌amp遺伝子の近位に配置さ れるように複数の工程を用いてpWeeの独特のPvuII部位に挿入した。 より詳細には、CMVlacZ発現力七ットはプラスミドpsub201CMVに由来し、これ を以下のように構築した。制限酵素部位：NotI-MluI-SnaBI-AgeI-BstBI-BssHII- NcoI-HpaI-BspEI-PmlI-RsrlI-NotIをコードし、そして以下のヌクレオチド配列 ：5'-GCGGCCGCACGCGTACGTACCGGTTCGAAGCGCGCACGGCCGACCATGGTTAACTCCGGACACGTGC GGACCGCGGCCGC-3'（配列番号３）を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そして pUC119の平滑末端改変KasI-EarI部位（部分的）にクローニングして、2757bpベ クターフラグメントを得た。CMV即時初期プロモーターをコードするヌクレオチ ド配列を含む653bp SpeI-SacIIフラグメントを、2757bpベクターフラグメントの SnaBI部位にクローニングした。さらに、以下のプライマー：5'-AAAATTCGAACCTG GGGAGAAACCAGAG-3'（配列番号４）および3'-aaaattcgaacaggtaagcgcccctTTG-5' （配列番号５）を用いて得られたhGH第１イントロンをコードするヌクレオチド 配列を含む、269bpのPCR生成BstBI-BstBIフラグメントを、2757bpベクターフラ グメントのBstBI部位にクローニングし、そしてpCMV-βプラスミド(CLONETECH) 由来のSV40初期ポリアデニル化部位を含む135bpのHpaI-BamHI（平滑末端改変） フラグメントを、このベクターフラグメントのHpaI部位にクローニングした。次 いで、得られた構築物をNotIで切断して、第１のCMV発現カセットを得た。 プラスミドpW1909adhlacZを以下のように構築した。AAV repおよびcapコード 領域を含む4723bpのSpeI-EcoRVフラグメントを、プラスミドpGN1909(ATCC受託番 号69871)から得た。pGN1909プラスミドは、repコード領域に対して（野生型AAV ゲノムにおいて）その通常の位置から下流であるように構築物において配置され たAAV p5プロモーター領域と共に、AAV repおよびcap遺伝子を有する高効率AAV ヘルパープラスミドである。4723bpフラグメントを平滑末端改変し、そしてAscI リンカーをその平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントを、pWadhl acZの独特のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物において細菌複製 起点の近位に配置されるように配向した。 プラスミドpW1909adhlacZは、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター(CM VIE)の転写制御下の細菌β-ガラクトシダーゼ(β-gal)遺伝子を含む。 Ｂ．pW1909EPOの構築 プラスミドpW1909adhlacZを、adhlacZ遺伝子をヒトEPO cDNA(Wenら、（1993） Blood 5:1507-1516)の718塩基対PpuMI-NcoIフラグメントで置換し、そして2181b p ClaI-EcoRI lacZスペーサーフラグメント（非コード）をベクターのPmlI部位に クローニングすることにより、ヒトエリスロポエチン(EPO)を発現するように改 変した。 Ｃ．pAAV-GAAの構築 ヒトリソソーム酵素、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)コード領域を含むプラスミ ドを以下のように構築した。開始コドンから207bs下流で開始するヒトGAAのコー ド配列を含む3.2KB cDNAクローン(GenBank受託番号：M34424およびY00839；Mart iniukら、（1990）DNA Cell Biol．9:85-94)を、Bluescript KS(Stratagene)のE coRI部位にクローニングした。さらなる5'配列を、テンプレートとして逆転写ポ リ-A mRNA（正常ヒト線維芽細胞から得られた）を用いてポリメラーゼ連鎖反応( PCR)を使用して作製した。5'プライマーを、KpnI制限部位および公表された配列 (Martiniukら、（1986）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:9641-9644;Hoefsloot ら、（1988）Eur．Mol．Biol．Organ.7:1697-1704)のbp-3〜12を有して構築した 。3'プライマーを、塩基対1001〜1018から合成した。KpnIおよび776位の独特の 内部StuI部位を使用して、PCR産物を部分的cDNAに連結して、完全長GAAコードプ ラスミドを形成した。完全長cDNAを独特のSphI制限部位で切断し、そして発現ベ クターp1.1cにクローニングして、CMV-IEプロモーターの転写制御下のGAAコード 領域を有するpAAV-GAA構築物を得た。 p1.1c発現ベクターを以下のように構築した。pUC119をKasIおよびEarIで部分 的に消化し、そしてアンピシリン耐性遺伝子、coli 1複製起点、およびM13複製 起点を含む2713bpベクターフラグメントを単離し、平滑末端改変し、そして制限 酵素部位NotI-MluI-SnaBI-AgeI-SfuI-BssHII-EagI-NcoI-PmeI-BspEI-PmlI-RsrII -NotIをコードし、そして以下のヌクレオチド配列： 5'-GCGGCCGCACGCGTTGTTAACAACCGGTTCGAAGCGCGCAGCGGCCGACCATGGGTTTAAACTCCGGAC CACGTGCGGACCGAGCGGCCGC-3'（配列番号６）を有する合成DNAポリリンカーに連結 した。連結を、ポリリンカーのMluI末端をプラスミドのKasI側に連結するように 行った。CMV即時初期プロモーターをコードする653bp SpeI-SacIIフラグメント 、hGH第１イントロン（以下のプライマー：5'-AAAATTCGAACAGGTAAGCGCCCCTTTG-3 ' （配列番号７）および3'-AAAATTCGAACCTGGGGAGAAACCAGAG-5'（配列番号８）を用 いて得られた）をコードする269bpのPCR生成SfuI-SfuI生成フラグメント、pBlue script II SK-由来の183bp BssHII-BssHIIポリリンカーフラグメント、およびpC MV-β(Stratagene)由来のSV40初期ポリアデニル化部位を含む135bp HpaI-BamHI （平滑化）フラグメントを、上記のプラスミドの、SnaBI、SfuI、BssHII、およ びPmeI部位のそれぞれにクローニングした。イントロンおよびポリアデニル化部 位に対するポリリンカーの方向は、イントロン-ポリリンカー(5'SacI-3'KpnI)- ポリアデニル化部位であった。ポリリンカーをさらに、88bp SacI-XhoIポリリン カーフラグメントを除去し、そしてそれを、以下のヌクレオチド配列： 5'-GAGCTCAATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCACTGTGTTGGATATCCAA CACACTGGTAGGGATAACAGGGTAATCTCGAG-3'（配列番号９）を有する、制限酵素部位S acI-ClaI-EcoRI-SmaI-BamHI-XbaI-SalI-PstI-BstXI-EcoRV-BstXI-オルメガヌク レアーゼ(olmeganuclease)-HinDIII-XhoIをコードする以下の合成SacI〜XhoIフ ラグメントと置換することにより改変した。ウイルスおよび細胞株 アメリカンタイプカルチャーコレクション、ATCC、カタログ番号VR846から入 手可能なアデノウイルス２型(Ad2)を、ベクターをキャプシドで包むためのヘル パーウイルスとして使用した・ そのゲノムに安定に組み込まれたアデノウイルスElaおよびElb遺伝子を有する 、ヒト293細胞株（Grahamら、（1977）J．Gen．Virol．36:59-72、受託番号CRL1 573のもとでATCCから入手可能）を、4.5g/Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児 血清(FBS;Hyclone，Logan，Utah)、２mMグルタミン、ならびに50単位/mLペニシ リンおよび50μg/mLストレプトマイシンを含む完全ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM;Bio-Whittaker，Walkersville，MD)中で培養した。 ATCC、カタログ番号CRL1772から入手可能なC2C12マウス筋芽細胞株を、20％ウ シ胎児血清(FCS)、１％ニワトリ胚抽出物、および５μg/mLゲンタマイシンを有 するDMEM中で培養した。 胎児ヒト骨格筋芽細胞(Clonetics)を、20％FCSおよび５μg/mLゲンタマイシ ンを含むHams F-12ヒト増殖培地中で培養した。 上記の細胞株を、５％CO2中で37℃にてインキュベートし、そして日常的に試 験し、そしてマイコプラズマ混入がないことを調べた。組換えAAVウイルスの産生 組換えAAVビリオンを、以下のようにヒト293細胞において産生した。サブコン フルエントな293細胞を、標準的なリン酸カルシウム沈澱(Wiglerら、（1979）Pr oc．Natl．Acad．Sci USA 76:1373-1376)により、AAVベクター/ヘルパープラス ミド構築物（pW1909adhLacZまたはpW1909EPO）のうちの１つを用いて；またはpA AV-GAAおよびpW1909ヘルパープラスミドを用いて、同時トランスフェクトした。 ６時間後、トランスフェクトした細胞を、２の多重感染度(MOI)で新鮮な培地中 でAd2に感染させ、そして採取する前に５％CO2中37℃にて70時間インキュベート した。ペレット化細胞を、凍結-解凍の３サイクルにより、Tris緩衝液(10mM Tri s、150mM NaCl、pH8.0)中で溶解した。溶解物から、12,000×gでの遠心分離によ り細胞破片を除去し、そして粗細胞溶解物を、等密度遠心分離のために塩化セシ ウムクッション上に重層した。組換えAAVビリオン（rAAV-LacZ、rAAV-hEPO、ま たはrAAV-hGAAビリオン）を、約1.38g/mLの平均密度を有する画分を単離するこ とにより、得られた勾配から抽出し、50mM Hepes(pH7.4)および150mM NaClを含 むHepes緩衝化生理食塩水(HBS)に再懸濁した。次いで、調製物を、Ad2を不活化 するために56℃で約１時間加熱した。ドットブロットハイブリダイゼーションによるrAAVのアッセイ 組換えAAVビリオンをDNase I消化し、プロテイナーゼK処理し、フェノール-ク ロロホルム抽出し、そして酢酸ナトリウム-グリコーゲン(それぞれ、最終濃度＝ 0.3M酢酸ナトリウムおよび160μg/mL)を用いてDNA沈澱した。DNAサンプルを10分 間変性し（200μLの２×アルカリ溶液（0.8M NaOH、20mM EDTA）をDNAサンプル に添加した）、次いでドットブロット装置中の適切なウェルに添加し、そしてウ ェルが空になるまで吸引することにより、湿ったZeta Probeメンブレン(Biorad) 上にブロットした。次いで、400μLの１×アルカリ溶液を添加し；５分後、 ウェルを吸引により空にした。メンブレンを、２×SSC(Sambrookら、前出)で１ 分間リンスし、流し、濾紙上で風乾し、次いで80℃で30分間真空中で焼いた。次 いで、メンブレンを、10mLのハイブリダイゼーション緩衝液（７％SDS、0.25Mリ ン酸ナトリウム、pH7.2、１mM EDTA）を用いて65℃で30分間プレハイブリダイズ した。緩衝液を10mLの新鮮な溶液で置換し、新たに煮沸したプローブを添加し、 そして65℃で一晩ハイブリダイズした。メンブレンを、65℃で20分間、25mLのウ ォッシュ１緩衝液(５％SDS、40mMリン酸ナトリウム、pH7.2、１mM EDTA)で２回 洗浄し、そしてウォッシュ２緩衝液(１％SDS、40mMリン酸ナトリウム、pH7.2、 １mM EDTA)で２回洗浄した。メンブレンをプラスチックフィルムでラップし、Ｘ 線撮影フィルムに曝露し、そして適切なドットを、シンチレーションカウンティ ングにより放射能を測定するためにメンブレンから切り出し、そして標準との比 較により定量した。rAAVビリオンの力価は、日常的に、約1013ゲノム/mLの範囲 内であった。混入ヘルパーアデノウイルスのためのアッセイ 混入感染性アデノウイルスを以下のようにアッセイした。精製rAAVビリオンス トック由来のサンプルを、50％コンフルエントの293細胞（１×105細胞/ウェル で12ウェルディッシュ中で培養した）に添加し、そして培養物を、30日間または 培養物がアデノウイルス感染により100％の細胞変性効果(CPE)を示すまで継代し た（例えば、培養物を、３日毎に１〜５に分けた）。培養物を、CPEについて毎 日調べ、そして各実験培養物が100％のCPEを示した日を書き留めた。アデノウイ ルス２型の既知量の範囲（０〜１×107プラーク形成単位(pfu)/培養）で感染し た参照293細胞培養物もまた調製し、そして同じ方法で処理した。次いで、標準 曲線を、参照培養物から得られたデータから調製した（ここで、アデノウイルス pfu数を、100％CPEの田こ対してプロットした）。次いで、各実験培養物におけ る感染性アデノウイルス２型の力価を、標準曲線から決定することにより容易に 得た。このアッセイの検出限界は100pfu/mLであった。ドットブロットハイブリ ダイゼーションにより分析された野生型AAV混入の存在は、組換えビリオン濃度 より約７対数低かった。筋芽細胞の分化 C2C12筋芽細胞を、活発に分裂している間または分化した細胞培養物としての いずれかで形質導入した。分化を、サブコンフルエントな筋芽細胞を、筋芽細胞 融合および分化筋管の形成を誘導するための形質導入前に４日間隔で、マウス分 化培地（２％ウマ血清および標準的濃度のグルタミンおよびペニシリン-ストレ プトマイシンを含むDMEM）に置くことにより誘導した。 胎児ヒト骨格筋芽細胞を、ヒト分化培地（10％ウマ血清および５μg/mLゲンタ マイシンを含むDMEM）中で分化させた。分化の確認を顕微鏡分析により行って、 培養中の多核筋管の存在を決定した。 実施例１ 最終的に分化した成体ラット心筋細胞におけるrAAV-LacZの発現 組換えAAVビリオンの最終的に分化した成体心筋細胞を形質導入する能力を、 インビトロで立証した。心筋細胞を、成体ラット心臓のコラゲナーゼを用いた冠 潅流により採取した（Fischer 344，Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN ）。心筋細胞をラミニンでコートしたガラスカバースリップ上で増殖させ、そし てrAAV-LacZビリオンに４時間曝した。72時間後、細胞をβガラクトシダーゼ活 性について染色した。AAV発現を二核細胞の青色染色により検出した。これらの 研究は、rAAVビリオンの最終的に分化した細胞を形質導入する能力を示した。イ ンビトロでの形質導入効率は、１細胞あたり104ゲノムの感染多重度（MOI）にお いて成体細胞の30％であった。 実施例２ インビボでのrAAV-LacZ発現の安定性 成体Fischerラットを使用して、インビボでのトランスジーンの発現を分析し た。漸増用量のrAAV-LacZビリオンを、剣状突起下（subxyphoid）開胸術アプロ ーチまたは側方開胸術アプローチのいずれかを使用して心臓の左心室尖中に注入 した。より詳細には、実験動物をメトフォン（Metofane）で麻酔し、続いて剣状 突起下で切開して心臓の横隔膜表面を露呈させた。心臓の先端への注入を、ガラ スマイクロピペットを用いて行なった。組換えビリオンを、標準の生理食塩水で 希釈し、そして20〜50μlの容量で注入した。 注入後の異なる時間において、心臓を採取し、そしてβガラクトシダーゼ産生 についておよび浸潤単核細胞の存在について試験した。5-ブロモ-4-クロロ-3-イ ンドリルβ-D-ガラクトシダーゼ組織化学決定のために、凍結切片（６μm）を0. 5％グルタルアルデヒドで固定し、そして記載のようにβガラクトシダーゼ活性 について染色した（Sanesら(1986)「Use of Recombinant Retrovirus to Study Post-Implantation Cell Lineage in Mouse Embyros,」EMBO J 5:3133-3142）。 パラフィン切片（５μm）を、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。切片を浸 潤単核細胞について調べた。 上記の組織化学研究は、各試験時点の注入領域において、50％を超える心筋細 胞の形質導入を、示した。さらに、分析を行った間に炎症細胞浸潤は見られなか った。βガラクトシダーゼ染色により、遺伝子移入後少なくとも２ヶ月間心筋細 胞において持続されることが観察された。 実施例３ rAAV-LacZ ビリオンを用いるマウス骨格筋のインビボ形質導入 組換えAAV-LacZビリオンをマウスの筋組織に注入し、そして形質導入をβ-gal 活性により評価した。詳細には、インビボ形質導入を、組換えAAVビリオンを健 常な６〜８週齢のBalb/cマウスの骨格筋（Jackson Laboratories，Bar Harbor， ME、Simonsen Laboratories，Gilroy，CAまたはHarlan Laboratories）に、メト フォン（Pitman-Moore，Mundelein，IL）またはケタミン−キシラジン麻酔下で 、筋肉内（IM）注入することにより行った。脛骨前方筋（tibialis anterior mu scle）のそれぞれの中間部分を、１cmの切開により露呈させた。脛骨の前側への 注入を、Hamiltonシリンジに結合したマイクロキャピラリーチューブを使用して 行い、以下の処方物を深さ２mmで投与した：リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）単 独（ネガティブコントロール）；またはrAAV-LacZビリオンまたはpW1909adhlacZ プラスミドのいずれかを含むPBS。 脛骨前方筋、前肢筋、心臓、脳および肝臓の組織サンプルを、βガラクトシダ ーゼ発現の分析のために得た。各動物由来の脛骨前方筋を横断的（cross-sectio nal）βガラクトシダーゼ分析のためにプロセスし、そして全βガラクトシダー ゼを他の筋肉の粗ホモジネートから化学ルミネセンスアッセイを使用して決定し た。 βガラクトシダーゼの組織化学的検出のために、筋肉サンプルを、ドライアイ スで冷却したイソペンタン中で素早く凍結し、続いて連続的に横断切断し（10μ m）、そして先に記載の方法（Sanesら(1986)EMBO J 5:3133-3142）に従ってプロ セスした。βガラクトシダーゼを発現する脛骨前方の横断面を、以下のように決 定した：核耐性レッド（Vector Labs）による対比染色後、X-gal染色した組織を デジタル撮影し、そして横断面の蓄積された映像をNIHイメージソフトウェアー を使用して決定した。 GALACTO-LIGHTTM(Tropix，Bedford，MA)化学ルミネセンスレポーターアッセイ キットを使用して、全脛骨前方筋中の全βガラクトシダーゼ活性を検出した。標 準曲線を、非形質導入筋肉ホモジネート中に再懸濁した既知量の精製βガラクト シダーゼ（Sigma，St.Louis，MO）により用意した。βガラクトシダーゼ活性は 以下のいずれかとして表される：ナノグラムのβガラクトシダーゼ（全筋肉につ いて標準化されている）−バックグラウンドの活性；またはルミノメーターによ り定量される相対的な光の単位（RLU）に換算して。前肢筋、心筋、脳組織およ び肝臓サンプルを同じ様式でアッセイした。 Ａ．βガラクトシダーゼ発現のタイムコース 左脛骨前方筋および右脛骨前方筋への１回の筋肉内注入（直視下）を利用して 、PBSビヒクル中の８×109のrAAV-LacZを送達した。４匹の動物にPBSのみを注入 した。動物を注入後２、４、８、12、24および32週で屠殺し、そして上記のよう に脛骨前方筋を取り出し、そして細菌性βガラクトシダーゼの存在について分析 した（各グループについてn=5）。 LacZ遺伝子移入の効率を横断的組織染色および化学ルミネセンスアッセイによ り評価した。図１および以下の表１から明らかなように、遺伝子発現は少なくと も32週間持続した。さらに、組換えウイルスの注入の２週後、18％の筋肉横断面 がβガラクトシダーゼを発現した。一方、32週目において、24％の筋肉横断面が βガラクトシダーゼを発現した。ネガティブコントロールの脛骨前方筋（PBSの みを注入した動物から得た）は、全くバックグラウンド染色を示さなかった。筋 肉βガラクトシダーゼ活性をまた、反対側に注入した筋肉においても決定した。 この研究はまた、横断的線維分析（表１）と一致して、少なくとも32週間の持続 発現を示した。さらに、観察されたβガラクトシダーゼは、最小の炎症細胞浸潤 とともに持続した。これらのデータは、rAAV-LacZビリオンの筋肉への投与が、 少なくとも８ヶ月間のトランスジーンの安定な発現をもたらすことを示す。 組織学的試験において、ポジティブ染色が形質導入筋線維の細胞質を満たし、 そして筋肉の広範な近接する部分を通じて観察された。連続横断切片は、青色染 色が筋線維の長さの隅々に及んだことを示した。回折干渉対照顕微鏡は、ポジテ ィブに染色した筋線維とネガティブに染色した筋線維との間の明確な図（図２） を示し、これは、組換えビリオン送達が、筋外膜封鎖（epimyseal）または骨内 膜封鎖（perimyseal）結合組織のような構造的な障壁により制限されることを示 唆した。脳、心臓、肝臓および前肢筋から調製されたホモジネートは、ネガティ ブコントロール動物のバックグラウンド活性と比較した場合、全くβガラクトシ ダーゼ活性を示さなかった。 左脛骨前方筋および右脛骨前方筋に８×109のrAAV-lacZを注入した。１組の注入 した筋肉の１つのメンバーをβガラクトシダーゼ発現のためにプロセスした（n= 5±標準偏差）。他の筋肉をβガラクトシダーゼの組織化学検出およびβガラク トシダーゼを発現する脛骨前方の横断面の決定のためにプロセスした。平均横断 面±標準偏差を示す。Ｂ．用量応答アッセイ インビボでのrAAV-LacZの効果的な用量範囲を決定するために、組換えビリオ ンを６〜８週齢のBalb/cマウスの脛骨前方筋に注入し、そして形質導入をGLACTO -LIGHTTM相対光単位（RLU）により測定されるβガラクトシダーゼ活性により評 価した。図３から明らかなように、注入後２週間で、観察されたRLUは、約0.2× 107RLU/筋肉（８×108のrAAV-LacZを注入）から約1.1×109RLU/筋肉（3.6×1011 のrAAV-LacZを注入）までの範囲であった。 RLUで測定されるβガラクトシダーゼの発現レベルは、横断的分析におけるβ ガラクトシダーゼポジティブ筋線維のパーセンテージに対応する。例えば、0.2 ×107RLUは、約１％のβガラクトシダーゼポジティブ筋線維に対応し、そして1. 1×109RLUは、約60％のβガラクトシダーゼポジティブ筋線維に対応する。Ｃ．βガラクトシダーゼ発現効率の比較 rAAV-LacZビリオンまたは同じLacZ発現カセット（pW1909adhlacZ）を含むプラ スミドDNAのいずれかを使用するマウスのインビボ形質導入により得られるβガ ラクトシダーゼ発現効率の比較を以下のように行った。８×109のrAAV-LacZまた は100μgのpW1909adhlacZのいずれかを、６〜８週齢のBalb/cマウスの脛骨前方 筋に注入した。注入の２週後、βガラクトシダーゼ活性を、上記のように、GALA CTO-LIGHTTM化学ルミネセンスレポーターアッセイキットを使用して評価した。 組換えビリオンの投与は、1441ngのβガラクトシダーゼ/筋肉をもたらした（n=5 ）。一方、100μgのプラスミドDNAの投与（代表的なインビボプラスミドDNA投与 (Whalenら(1995)Hum．Gene Ther．4:151-159)）は、12ngのβガラクトシダーゼ/ 筋肉をもたらした（n=4）。pW1909adhlacZプラスミドDNAのこの投与量は、2.2× 1013の一本鎖ゲノムに等しく、これは、組換えビリオンによる遺伝子送達が、当 モル量のベクターDNAの送達よりも実質的に効率的であったことを示す。 実施例４ マウス筋管および筋芽細胞のインビトロ形質導入 分化した培養筋細胞が組換えAAVビリオン形質導入のための適切な標的である かどうかを決定するために、およびこのような細胞の形質導入遺伝子を発現する 能力を評価するために、以下の研究を行った。マウスC2C12細胞を選択した。な ぜなら、これらの細胞は、哺乳動物の筋形成のためのモデルとして広く研究され （Blauら(1993)Trends Genet．9:269-274）、そして血清を減少した培地におけ る増殖により分化が誘導され得るからである。 本研究において、C2C12筋芽細胞（分裂細胞）を、細胞培養プレート中に２×1 04細胞/cm2で播種し、コンフルエントになるまで増殖培地（GM）で維持し、分配 し、次いで、GMで培養するかまたはマウスDMで５日間培養する。分化を、融合し た筋芽細胞（分化したC2C12細胞）を表す多核筋管の存在を顕微鏡で観察するこ とにより確認した。 C2C12筋管および筋芽細胞を、OptiMEM(Gibco BRL)中105のMOIの精製rAAV-hEPO ビリオンとの培養で形質導入した。筋管培養物において、DMをビリオン吸着後に 添加した。形質導入細胞の培養培地を、形質導入の３、８および14日後、上清を 回収する24時間前に変更した。hEPOの分泌を、製造業者の推奨に従い、ヒトエリ スロポエチンQuantikine IVDキット（R and D Systems，Minneapolis，MNより入 手可能）を使用して、ELISAにより評価した。 本研究の結果は、hEPOが形質導入した筋管および筋芽細胞の両方から分泌され ることを示す。hEPO分泌のレベルは、筋管において、形質導入後の最初の７日間 にわたって増大した（図４）。図５から明らかなように、hEPO分泌の用量依存的 増大がまた、形質導入C2C12筋管において観察された。筋管の形質導入の８日後 、hEPOレベルは、>3400mU/mlで最大となった。これらのデータは、rAAV-hEPOで の筋管および筋芽細胞の両方の形質導入が、形質導入細胞によるhEPOの分泌をも たらすこと、および短い期間の筋管培養で、hEPOが合成されそして用量依存的な 様式で分泌されることを示す。 実施例５ rAAV-hEPO ビリオンを使用するヒト筋管のインビトロ形質導入 分化した初代ヒト筋細胞がrAAV-hEPOでの形質導入後にhEPOを発現し得るかど うかを決定するために、以下の研究を行なった。初代ヒト胎児骨格筋芽細胞を細 胞培養プレート中に２×104細胞/cm2の密度で播種し、適切な増殖培地中でコン フルエンスまで増殖させ、次いでヒトDM中で14日間培養した。分化を多核細胞に ついての顕微鏡試験により確認した。インビトロ形質導入を、精製rAAV-hEPOビ リオンをOptiMEM培地（Gibco BRL）中で培養した筋管に添加することにより行な った。DMをビリオン吸着後の培養物に添加した。コントロール培養物をrAAV-Lac Zで形質導入した。 培養培地を、形質導入の３、８および14日後、上清を回収する24時間前に変更 した。分泌したEPOレベルを、上記実施例４に記載のようにELISAによりアッセイ した。 図６から明らかなように、形質導入ヒト筋管は、hEPOを培養物中に用量依存様 式で分泌した。検出可能なEPO活性は、コントロール培養物において全く測定さ れなかった。EPOの分泌は、形質導入後の14日の間増大した。これらのデータは 、 組換えAAVビリオンにより形質導入された初代ヒト筋管が、エリスロポエチンを 発現および分泌し得ることを示す。 実施例６ rAAV-hEPO の筋肉内投与によるインビボでのヒトエリスロポエチンの全身送達 hEPOをコードする組換えAAVビリオンを、インビボで、健常な成体Balb/cマウ スに投与して、全身レベルのhEPOが産生され得るかどうか、および生物学的応答 が得られ得るかどうかを決定した。投与後の種々の時点において、血液を麻酔下 の眼窩静脈叢から得た。血清hEPOレベルを上記のELISAにより決定した。赤血球 の計数を血球計により行い、血球容量を血液をマイクロキャピラリーチューブで 遠心分離することにより決定し、そしてヘモグロビン濃度を、製造業者の仕様書 に従ってシアンメトヘモグロビンアッセイ（DMA，Arlington，TX）により分析し 、分光光度計で570nmで分析される標準物（Stanbio Laboratory，San Antonio， TX）と比較した。網状赤血球を、新規のメチレンブルー染色によるかまたはチア kinson，Mountain View，CA）により分析した；これらの方法のいずれかにより 得られたデータの結果は同様であった。 最初の実験は、高レベルのhEPOおよび上昇した血球容量が、6.5×1011のrAAV- hEPOをIM注入したマウスにおいて100日間を超えて維持されたことを示した。次 いで、成体雌Balb/cマウスに、３×109から３×1011粒子までの範囲の投与量でr AAV-hEPOの１回投与を用いて、両後肢にIM注入した。コントロール動物にrAAV-L acZを注入した。得られた血清hEPOレベルを分析し、そして以下の表IIに記載し た。明らかなように、良く特徴付けられた用量応答が、注入の20、41、62および 83日後に得られた。 rAAV-hEPOを受容する動物によるhEPO分泌のタイムコースを図７に示す。明ら かなように、hEPOの血清レベルは、注入後６〜８週において時間とともにプラト ーまで増大した。 分泌されたhEPOの生物学的活性は、実験動物における血球容量の上昇によりモ ニターされ得る。循環hEPOレベル対血球容量の比較を図IIに示す。比較は、血球 容量が時間および増大する組換えビリオン用量とともに増大したことを示す。さ らに、血球容量の安定な上昇が、40週までの間、rAAV-hEPOを注入した実験動物 のグループにおいて観察された。コントロール動物は検出不能なレベルのhEPOを 保有した（<2.5mU/mL、アッセイの検出の下限）。 これらの結果は、hEPOの持続およびその安定な高レベルの分泌が、血球容量の 対応する上昇とともにrAAV-hEPOの１回のIM投与の後に確立されることを示す。 さらに、rAAV-hEPO（３×1011の一本鎖ゲノム）をIM注入した動物およびpW190 9EPOプラスミド（100μgのDNA中の1.4×1013の二本鎖ゲノム）をIM注入した動物 によるhEPO発現の比較は、組換えビリオンが有意なより高いレベルのEPO発現を 生じたことを示す。表IIに記載されるように、注入の20日後、組換えビリオン注 入動物は445±98mU/mLの血清レベルを有したが、プラスミド注入動物は８±10mU /mLのレベルを有した。注入の41日後、組換えビリオン処置動物におけるレベル は725±112mU/mLまで上昇したが、プラスミド処置動物におけるレベルは検出レ ベル未満に低下した。rAAV-hEPOを受容する動物は、注入の20日後に、100倍少な い取り込みゲノムで約60倍を超える循環hEPOを、すなわち１ゲノムあたりで約60 00倍を超える分泌を示した。注入の41日後、この差異はさらに大きくなった。な ぜなら、プラスミド発現は検出レベル未満であったからである。 実施例７ IM またはIV経路によって投与されたrAAV-hEPOからのhEPO分泌の比較 IMおよびIV投与経路から生じるhEPOの循環レベルの比較を分析して、どの遺伝 子送達方法が全身性hEPOのより高いレベルを生じるかを決定した。Balb/cマウス に、上記のIM経路か、または尾の側脈を介した50μLの総容量のPBS中での静脈内 （IV）のいずれかを用いて、３×1011rAAV-hEPOを注射した。血清hEPOレベルをE LISAによって上記の方法を用いて測定した。 表IIに示すように、IV投与から生じるhEPOレベルは、IM経路でビリオンを受け た群よりも有意に低かった。特に、注射後の20日目で、IM経路は、445±98mU/mL のhEPOのレベルを生じた。一方、IV経路は、７±3.0mU/mLを生じた。注射後41日 目で、IM経路で観察されたEPOレベルは、IVでの13±2.0mU/mLに比較して725±11 2mU/mL、すなわち約60倍より有効であった。これらのデータは、注射のIM経路が hEPOのより高い全身性のレベルを生じたことを実証し、このことは、筋肉中の間 質送達が、組換えAAVビリオンによる改善された形質導入を生じることを示唆す る。 実施例８ rAAV-GGA ビリオンを用いる筋細胞のインビトロおよびインビボ形質導入 乳児の心筋症は、遺伝性代謝疾患に頻繁に起因する。一つのこのような代謝疾 患であるII型糖原病（ポーンプ病）は、リソソーム酵素、酸性αグルコシダーゼ （GAA）の欠損によって引き起こされる遺伝性心筋症である。GAAは、リソソーム のグリコーゲンのα-1,4およびα-1,6連結を切断し、単糖類を放出するように機 能する。酵素活性の欠失は、横紋筋におけるリソソームグリコーゲンの蓄積を生 じ、そしてリソソームの破裂、収縮器管破壊、およびグリコーゲン浸潤によって 特徴づけられる。現在、利用可能な効果的な処置はない。 従って、以下の研究は、本発明の組換えAAVビリオンが形質導入した筋細胞に おいてGAAの長期発現を得るために用いられ得るか否かを決定するために行われ た。Ａ．rAAV-hGAAビリオンでのヒト骨格筋細胞のインビトロ形質導入 ヒト骨格筋筋芽細胞を、細胞培養プレート中に２×104細胞/cm2の密度で播種 し、適切な増殖培地中でコンフルエンスまで増殖させ、次いで、ヒトDM中で14日 間培養した。顕微鏡による検査によって多核細胞について分化を確認した。イン ビトロ形質導入を、２×105のMOIで精製rAAV-hGAAビリオンをOptiMEM培地（Gibc o BRL）中の培養筋管に添加することによって行った。DMをビリオン吸着後に培 養物に添加した。形質導入されたコントロール培養物を、同一のMOIで筋管をrAA V-LacZで形質導入することによって樹立し、そしてネガティブコントロールを非 形質導入筋管を培養することにより樹立した。 培養培地を、形質導入後の３、８、および14日目で上清を回収する24時間前に 替えた。hGAA発現を酵素アッセイによって測定した。詳細には、細胞単層を、0. 02％エチレンジアミンテトラ酢酸を含有するPuckの生理食塩水Ａ中の0.05％トリ プシンで回収した。増殖培地でトリプシンをクエンチした後、細胞を遠心分離し 、細胞ペレットをPBSで洗浄し、そして蒸留水中で再懸濁した。３回の凍結-解凍 サイクルの後、サンプルを10,000×gでミクロ遠心分離した。上清中のタンパク 質を、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準としてBicinchoninic酸法（Pierce）を 用いて測定した。GAA活性を、以前に記載された方法(Galjaardら(1973)）Clin． Chim．Acta．49:361-375;Galjaard，H．（1973）Pediatr．Res．7:56)の改変に より、グリコーゲンアナログである4-メチルウンベリフェリル-α-D-グルコシド の切断を用いて測定した。アッセイは125μLの水中に30μgのタンパク質を含ん でいた。200mMの酢酸ナトリウム（pH4.3）および750nM 4-メチルウンベリフェリ ル-α-D-グルコシド（ジメチルスルホキシド中の200mMのストック溶液から）の ２容量を、添加し、そしてこのサンプルを37℃で１時間インキュベートした。反 応を625μLの炭酸ナトリウム（pH10.7）で止めた。一旦切断され、そしてアルカ リ化されると、4-メチルウンベリフェリルは蛍光を発する。365nmでの励起およ び448nmでの発光を用いて、蛍光分光光度計で測定を行った。アッセイ測定を、4 -メチルウンベリフェロン（Sigma，St.Louis，MO）標準に対して比較した。ゼロ タンパク質およびゼロ時間ブランクを用いた。 観察されたGAA活性を、ヒト筋管のインビトロ形質導入が、高レベルのGAA発現 を形質導入後の８日および14日目に生じることを示す図８において報告する。 Ｂ．rAAV-GAAビリオンを用いる骨格筋のインビボ形質導入 ヒトGAAをコードする組換えAAVビリオンを成体Balb/cマウスにインビボで投与 し、全身のGAAレベルが形質導入された細胞によって生成され得るか否かを決定 した。筋組織を、投与後の種々の時点で単離し、そして酵素アッセイを用いてGA A活性についてプロセスした。 この研究において、Balb/cマウスの脛骨前方筋を外科的に露出させ、そして左 および右の筋肉への（直視下での）単回筋肉内注射を用いて以下の処方物を投与 した：リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）単独（ネガティブコントロール）；また は２×1010のrAAV-hGAAまたはrAAV-LacZ（合計４×1010ビリオン/動物）のいず れかを含有するPBS。 脛骨前方筋の組織サンプルを、形質導入後の１、４、および10週目に得た。組 織サンプルを、水中でホモジナイゼーション、続いて凍結-解凍の３サイクルに よって調製した。凍結-解凍溶解物を、ミクロ遠心分離し、そして得られた上清 をGAA活性について上記のようにアッセイした。この研究の結果を図９に示す。 理解され得るように、形質導入されたマウス筋細胞でのGAAの安定な発現を、10 週間観察した。このことは、本発明の組換えAAVビリオンが、形質導入された細 胞における機能的リソソームタンパク質の効率的な発現を確立し得、従って、糖 原病の処置のための治療的アプローチを提供することを示した。 従って、遺伝子を筋細胞に移送するための新規の方法が記載された。本発明の 好ましい実施態様は、ある程度詳細に記載されたが、明らかな改変が添付の請求 の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ 得ることが理解される。本発明の実施において有用な株の寄託 以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託は、アメリカンタイプカルチャーコ レクション、12301 Parklawn Drive，Rockville，Marylandにブダペスト条約の 規定のもとになされた。示された受託番号は、首尾良い生存性試験の後に割り当 てられ、必要な料金が支払われた。上記培養物へのアクセスは、連邦法施行規則 第37卷1.14および合衆国法典第35巻122のもと、権利を与えられた委員によって 決定されたものに対して特許出願が属している間入手可能である。上記培養物の 公への入手可能性に対する全ての制限は、出願に基づいた特許の付与の際に変更 不能に除去される。さらに、指定された寄託物は、寄託の日から30年の期間、ま たは寄託の最後の要求後５年間；あるいは、米国特許の実施可能な期間の、いず れかより長い期間、維持される。培養物が生存可能でなくなり、または不注意に も破壊された場合は、またはプラスミドを含む株の場合では、そのプラスミドを 損失した場合、同一の分類学上の記載の生存培養物で補充される。 この寄託は、当業者の便宜としてのみ提供され、そして寄託が要求されるとい う許可ではない。寄託された物質を作製、使用、または販売するためにはライセ ンスが必要とされ得、そしてそのようなライセンスはこれによっては付与されな い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 37/24 38/46 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ケスラー，ポール ディー. アメリカ合衆国 メリーランド 21204, ボルチモア，エレンハム アベニュー 7907 (72)発明者 バイルン，バリー ジェイ. アメリカ合衆国 メリーランド 21212, ボルチモア，チャムレイ ロード 814 (72)発明者 カルツマン，ギャリー ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク，キャンベル レーン 24

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．選択された遺伝子を平滑筋細胞または平滑筋組織に送達するのに有用な組成 物を産生するための方法であって、該方法は以下の工程： （a）インビボ転写およびその翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連 結した選択された遺伝子を有する組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを 含むAAVビリオンを提供する工程；および （b）組換えAAVビリオンを、薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせる工程、 を包含する、方法。 ２．前記選択された遺伝子が、治療的タンパク質をコード化する点で特徴づけら れる、請求項１に記載の方法。 ３．前記制御エレメントが、筋肉特異的プロモーター配列を含む点で特徴づけら れる、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記制御エレメントが、誘導性プロモーター配列を含む点で特徴づけられる 、請求項１または２に記載の方法。 ５．組換えAAVビリオンで形質導入された平滑筋細胞であって、該ビリオンが、 選択した遺伝子のインビボ転写および翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可 能に連結される該選択された遺伝子を有するAAVベクターを含む、平滑筋細胞。 ６．前記選択された遺伝子が、治療的タンパク質をコードする点で特徴づけられ る、請求項５に記載の形質導入された筋細胞。 ７．前記制御エレメントが、筋肉特異的プロモーター配列を含む点で特徴づけら れる、請求項５または６に記載の形質導入された筋細胞。 ８．前記制御エレメントが、誘導性プロモーター配列を含む点で特徴づけられる 、請求項５または６に記載の形質導入された筋細胞。 ９．哺乳動物平滑筋細胞を形質導入するための方法であって、該方法は以下の工 程： （a）選択された遺伝子のインビボ転写および翻訳を指向し得る制御エレメント に作動可能に連結した該選択された遺伝子を有するAAVベクターを含む組換えAAV ビリオンを提供する工程；および （b）形質導入された筋細胞を産生するために、適切な平滑筋細胞に組換えAAVビ リオンを導入する工程、 を包含する、方法。 １０．筋細胞または筋組織に、酸性αグルコシダーゼをコードする遺伝子を送達 するのに有用な組成物を産生するための方法であって、該方法は以下： （a）インビボ転写およびその翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連 結した該遺伝子を有するAAVベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ビ リオンを提供する工程；および （b）該組換えAAVビリオンを、薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせる工程 、を包含する、方法。 １１．前記制御エレメントが、筋肉特異的プロモーター配列を含む点で特徴づけ られる、請求項１０に記載の方法。 １２．前記制御エレメントが、誘導性プロモーター配列を含む点で特徴づけられ る、請求項１０に記載の方法。 １３．前記組成物が、選択された遺伝子を骨格筋由来の筋細胞または組織に送達 するのに有用である点で特徴づけられる、請求項１０に記載の方法。 １４．前記筋細胞が、骨格筋芽細胞または骨格筋細胞である点で特徴づけられる 、請求項１３に記載の方法。 １５．前記組成物が、選択された遺伝子を平滑筋由来の筋細胞または組織に送達 するのに有用である点で特徴づけられる、請求項１０に記載の方法。 １６．前記組成物が、選択された遺伝子を心筋由来の筋細胞または組織に送達す るのに有用である点で特徴づけられる、請求項１０に記載の方法。 １７．前記筋細胞が、心筋芽細胞である点で特徴づけられる、請求項１６に記載 の方法。 １８．組換えAAVビリオンで形質導入された筋細胞であって、該ビリオンが、イ ンビトロ転写およびその翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連結する 酸性αグルコシダーゼをコードする遺伝子を有するAAVベクターを含む、筋細胞 。 １９．哺乳動物筋細胞を形質導入する方法であって、： （a）インビボ転写およびその翻訳を指向し得る制御エレメントに作動可能に連 結した酸性αグルコシダーゼをコードする遺伝子を有するAAVベクターを含む組 換えAAVビリオンを提供する工程；および （b）形質導入された筋細胞を産生するために、適可な筋細胞に組換えAAVビリオ ンを導入する工程、 を包含する、方法。 ２０．前記筋細胞が、骨格筋由来である点で特徴づけられる、請求項１９に記載 の方法。 ２１．前記筋細胞が、平滑筋由来である点で特徴づけられる、請求項１９に記載 の方法。 ２２．前記筋細胞が、心筋由来である点で特徴づけられる、請求項１９に記載の 方法。
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