JP2002513419A - 抗癌および抗寄生体特性を有するヒドロキサム酸化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：ＨＯＮＨ−［リンカー］−Ｘ¹Ｒ¹Ｒ²または（Ｉｃ）：Ｒ¹Ｒ²Ｘ¹−［リンカー］−Ｘ¹Ｒ¹Ｒ²のヒドロキサメートまたはヒドロキサム酸化合物、またはそれらの薬学上許容される塩、エステルまたは誘導体を提供する：式中、Ｘ¹は−Ｃ＝Ｏ；−ＣＯＲ¹；−ＣＦ₂；−ＣＮＨ₂；−ＣＮＲ¹；−ＳＯ₂−；−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−；−Ｃ＝Ｓ；−ＣＳＲ¹；−Ｃ−ＣＯＲ¹；−Ｃ−ＣＯＮＲ¹Ｒ²または−Ｃ−ＣＨ₂ＯＨから選択される極性基である；Ｒ¹およびＲ²は同一であるか、または異なり、各々はＨ；ＯＨ；ＮＨ₂；ＮＨＯＨ；置換もしくは非置換の、分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、アルキルオキシまたはアリールアルキルオキシ；置換もしくは非置換のアリール、アリールオキシまたはピリジノ；置換もしくは非置換のアリールアミノ、ピペリジノ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、ピリジンアミノ、９−プリン−６−アミン、およびチアゾールアミノから成る群より独立して選択される；あるいはＲ¹またはＲ²は非存在である；そしてリンカーは５〜９個の原子の主鎖を有する基であり、１、２または３つのアミノ酸を含むことができる。これらの化合物は、正常細胞に影響を与えないで、種々のヒト腫瘍細胞の型の成長を選択的に抑制する能力を有する。本発明の化合物は、また、原生動物の寄生体の成長を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗癌および抗寄生体特性を有するヒドロキサム酸化合物 本発明は、抗腫瘍および抗寄生体活性を有する化合物に関する。これらの化合 物は、正常の細胞のタイプを殺さないで、腫瘍細胞に対して選択的細胞障害性を 有し、そして単独で、または他の抗癌剤と組合わせて使用することができる。特 に、本発明は、腫瘍細胞に対して選択的細胞障害性を有する、窒素含有化合物、 構造的に関係する化合物、およびそれらの誘導体に関する。本発明の化合物は、 特徴的にヒストンの脱アセチル化を阻害し、遺伝子の発現を変更する。本発明は 、また、本発明の化合物を利用する、癌、過形成または形成異常の症状、例えば 、乾癬、白斑症、および日光性角化症、および寄生体の感染の治療する、医薬組 成物および／または獣医薬組成物、および方法に関する。特に、本発明は、特に 活性な化合物を同定する方法、および本発明の化合物を使用する治療から利益を 受ける可能性を有する患者を同定する方法を提供する。 発明の背景 癌は現代社会における罹患および死亡の主要な原因の１つである。癌に対する 化学療法は、伝統的に、正常細胞ならびに腫瘍細胞を無差別に殺す、細胞障害剤 、例えば、抗代謝薬剤またはＤＮＡターゲッティング薬剤の使用を包含する。し たがって、これらの薬剤は、通常投与量制限的である、重大な副作用を引き起こ す。大部分のこのような薬剤は、また、充実腫瘍に対して無効であるか、あるい は有効性に劣る。こうして、これらの問題を克服するために、別の作用のメカニ ズムをベースとする、新しい抗腫瘍剤が必要とされる 。 癌は成長および形態をコントロールする、通常の細胞のメカニズムを侵害する １連の遺伝的変化から生ずる。遺伝的突然変異または喪失は、細胞の形質転換お よび癌に関係づけられてきている（Ｒｕｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９７６）。 腫瘍細胞のより選択的ターゲッティングを可能とする、１つの別の方法は、遺伝 子の発現の変化により、癌細胞を非増殖性表現型に変換させることである。この ように、腫瘍形成的に形質転換された細胞を形態学的に非増殖性の細胞に逆転す る研究は、まだ完全には理解されていない細胞周期の面に対して価値ある手掛か りを提供することができる。腫瘍細胞を分化させることが知られている多数の化 合物、例えば、ブチレート（１）、レチノン酸（２）、およびＮ，Ｎ’−ヘキサ メチレン−ビス−アセトアミド（ＨＭＢＡ；３）（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、 １９８９）は臨床試験を実施されたが、低い効力、選択性、可逆的分化または耐 性の欠如という問題に悩まされてきている。 例えば、ＨＭＢＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多数のタイプの新 形成細胞系統（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８）および上皮細胞系統（Ａ ｎｄｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．、１９８８）および胚細胞（Ｅｇｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）において分化を誘導することが報告された。それは骨髄形成 異常症候群および急性骨髄芽球性白血病における寛解を誘導した（Ｂｒｅｓｌｏ ｗ、ｅｔ ａｌ．、１９９１）が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて脱アセチル化による 急速な分解に悩まされ、そして副作用、例えば、血小板減少症、神経毒性および アシドーシスを引き起こす（Ｍａｒｋｓ、ｅｔ ａｌ．、１９９４）。 ネズミ赤白血症の細胞において、ＨＭＢＡはＧ１において阻止を誘導し、タン パク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の細胞質ゾルから膜へのトランスロケーションを促 進し、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃおよびｐ５３タンパク質のレベルを減少させ、そ してｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡを増加させる。低リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質ｐ ＲＢの一時的増加が治療後２４時間に見出され、次いで次の２〜３日間において 高リン酸化形態ｐｐＲＢの産生が増大した（Ｒｃｈｏｎ、ｅｔ ａｌ．、１９９ ２；Ｋｉｙｏｋａｗａ，，ｅｔ ａｌ．、１９９４）。構造的に関係するが、い っそう効力のある分化剤の最近報告されたグループは、ネズミ赤白血症の細胞系 統、ヒト前骨髄球細胞（ＨＬ−６０）、およびヒト結腸癌細胞における分化を誘 導する（Ｂｒｅｓｌｏｗ、ｅｔ ａｌ．、１９９１）。 これらの研究者らは、末端の分化を誘導することができる化合物の１ファミリ ーを報告した（国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９２／０８４５４、Ｎｏ．ＷＯ ９３／０７１４８として公開された；Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／０６５５４、Ｎ ｏ．ＷＯ９５／３１９７７として公開された）。これらの化合物は（これらのい くつかはヒドロキサメートである）は一般式Ｒ₁ＣＯ（ＣＨ₂）_nＣＯＲ₂を有 し、式中、ｎは４〜８であり、そしてＲ₁およびＲ₂は同一であるか、または異な ることができ、そして広範な種類の置換基により表される。 アゼラインビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ；４）およびその類似体のいくつか はＨＭＢＡよりも１００倍までより高い活性を有する。 好ましい化合物はＡＢＨＡ（４）である。これらの化合物は新形成細胞の末端 の分化を誘導し、これによりこれらの細胞の増殖を阻害すると記載されているが 、活性は化合物と細胞と延長した、好ましくは少なくとも４〜５日間の、接触を 必要とする。ネズミ赤白血症の細胞および急性前骨髄球細胞に対する活性は、そ れぞれ、１〜２，５０００μＭ（８０の化合物が試験され、１つは不活性であっ た）、および１〜２０μＭ（１６の化合物が試験された）の範囲において観察さ れた。ＡＢＨＡを包含する、これらの化合物のいずれかが、正常細胞と区別され る、腫瘍細胞に対して選択的毒性を発揮するという開示または示唆は存在しない 。先行技術において、これらの化合物が寄生体に対して活性を有するという示唆 は存在しない。 これらの化合物のあるものは、哺乳動物細胞を培養において処理したとき、ヒ ストンＨ４の過アセチル化を誘導することを我々発見した。この出願の優先権主 張日に引き続いて、これは独立に確証された（Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．、１ ９９８）。ヒストンのデアセチラーゼインヒビターのトリコスタチン（ＴＳＡ） は、非形質転 換線維芽細胞と比較してＳＶ４０形質転換されたマウス線維芽細胞の短期増殖に 対する適度のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択性（Ｂｅｐｐｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第 ４，６９０，９１８号、１９８６年１月２４日発行、表３参照）に基づいて、腫 瘍選択的因子として報告された（Ｂｅｐｐｕ ｅｔ ａｌ．、上掲）。これはヒ トの癌の治療に対する概念の満足すべき証明ではない。なぜなら、 （ａ）ヒト細胞は使用されるおらず、 （ｂ）ＳＶ４０形質転換された細胞は腫瘍細胞ではなく、そして一般に動物に おいて腫瘍を形成せず、 （ｃ）ヒト線維芽細胞のＳＶ４０形質転換は、腫瘍細胞に対する選択性を一般 的に欠如するために、臨床的価値をもたない、アルキル化剤に対する選択性をし ばしば生成であることがあり、そして （ｄ）連続的薬剤暴露の３日間の観察期間は、ＳＶ４０形質転換細胞の増殖が 不可逆的に阻害されることを示すために不十分であった、 からである。 さらに、この出願において、ＴＳＡは培養においてあるヒト腫瘍細胞に対して 選択的に毒性であるが、培養された細胞により代謝され、そしてｉｎ ｖｉｖｏ においてヒト腫瘍細胞に対して不活性であることを我々は示した。また、マラリ アの治療に提案された環状ペプチドであるＨＣ−トキシン（Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａ ｔｔｒａｙ ｅｔ ａｌ．、１９９６）は、ＴＳＡに類似する性質を有する、す なわち、それはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍選択的であるが、高い投与量で使 用したときでさえ、培養された細胞により不活性化され、抗腫瘍活性を欠如する ことを我々は示した。 メラノサイトおよび黒色腫細胞は、顔料合成に関係するある範囲の分化マーカ ー、例えば、チロシナーゼ、ＨＭＢ−４５、メラニン およびチロシナーゼ関係プロテイン−１（ＴＲＰ−１）を発現する（Ｔａｋａｈ ａｓｈｉおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９９０；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．、１９９ ４）。これらのマーカーに対するアゼライン酸、ＨＭＢＡおよび９炭素の誘導体 ＡＢＨＡの作用を比較する間、Ｂｒｅｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９１）の研 究に比較して、メラノサイト細胞における主要な分化経路である、色素沈着に関 する分化因子として、事実ＡＢＨＡは劣った活性を有し、そして事実ＡＢＨＡは ある面において脱分化因子として作用できることを、我々は今回見出した。また 、驚くべきことには、ＡＢＨＡは、形質転換された細胞に対して細胞障害性であ るが、正常細胞に対して細胞障害性ではないことにおいて異常であると同時に、 シグナルのトランスダクションに関係するある種の遺伝子の転写を活性化するこ とを我々は見出した。 今回、我々は、薬物耐性黒色腫細胞系統およびリンパ系新形成を包含する、７ つの異なるヒト充実腫瘍にわたって誘導された細胞系統に対して選択的に毒性で ある化合物の１ファミリーを同定した。典型的には、これらの化合物はマトリッ クス金属プロテアーゼに対して阻害活性をもたない。本発明の特に好ましい化合 物は、ヌードマウスにおける薬物耐性黒色腫細胞系統の異種移植片に対してｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性であることが示された。本発明の化合物は、黒色腫、卵 巣癌、および現在利用可能な療法に対する応答が低い、ある範囲の新形成に対し て活性であることは特に顕著である。また、本発明の化合物は、重複鞭毛虫類（ Ｇｉａｒｄｉａ）およびマラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の薬物耐性系 統を包含する、寄生体生物に対して活性であることを我々は証明した。 発明の要約 本発明は、正常のヒト細胞の成長に影響を与えないで、種々のヒト腫瘍細胞の 型の成長を選択的に妨害する能力を有する化合物に関する。特に、本発明は、窒 素含有化合物、構造的に関係する化合物、およびそれらの誘導体に関する。１つ の好ましい態様において、化合物はヒドロキサメートまたはビスヒドロキサメー ト化合物またはそれらの誘導体である。他の好ましい態様において、化合物は環 状ペプチドである。本発明の化合物は、細胞培養物およびｉｎ ｖｉｖｏの動物 モデルの双方においてヒト腫瘍細胞に対して選択的に細胞障害性である。この明 細書の目的に対して、表現「腫瘍細胞に対して選択的に細胞障害性」は、匹敵す る条件下に本発明の化合物に暴露されたとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細 胞の増殖が不可逆的に阻害されるが、正常細胞はなお増殖することができること を意味する。 第１の面において、本発明は、治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明 の化合物を投与する工程を含んでなる、癌を治療する方法を提供し、前記化合物 は正常細胞に比較して新形成細胞に対して選択的細胞障害性を有しかつ新形成細 胞における分化を誘導する最小の能力を有するか、あるいは前記能力をもたない 。 好ましくは、化合物はヒドロキサメート、ヒスヒドロキサメート、またはそれ らの誘導体、および環状ペプチドから成る群より選択される。 典型的には、化合物は、また、ヒストンの脱アセチル化を抑制する能力を有す る。 好ましくは、化合物は、また、Ｓｐｈ１含有プロモーターおよび／またはメタ ロチオネインＩａプロモーターの亜鉛誘導活性を増強する能力を有する。 好ましくは、化合物は低いレベルの全長のＲｂＡｐ４８を発現す る細胞に対して選択的に毒性である。 より好ましくは、化合物はＡＢＨＡではない。 典型的には、本発明の化合物は、ヒト黒色腫細胞における分化の古典的マーカ ーの発現に対して作用をもたないか、あるいはそれをダウンレギュレートする。 例えば、ＴＲＰ１はダウンレギュレートされるが、ＨＭＢ−４５およびチロシナ ーゼは有意に影響を受けない。 明らかに理解されるように、本発明の方法は１または２以上の他の抗癌療法、 例えば、化学療法または放射線療法と組合わせて使用することができる。特に、 本発明の方法は１または２以上の抗増殖剤、例えば、シトシンアラビノシド、５ −フルオロウラシル、メトトレキセート、クロロデオキアデノシン、エトポシド 、タキソール（パクリタクセル）、およびその他と組合わせて使用することがで きることが考えられる。他の治療剤を本発明の化合物と同時に、予防的にまたは 本発明の化合物の後に投与することができる。 本発明の化合物は、白血病およびリンパ腫を包含する、すべての型の癌に有効 ことが考えられるが、これらの化合物は充実腫瘍、例えば、黒色腫および他の皮 膚癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、結腸癌お よびその他の治療において特に有利であると考えられる。 同様に、本発明の方法はヒト癌の治療のために考えられるが、また、獣医学的 治療に適用可能である。したがって、哺乳動物はヒトであることができるか、あ るいは家畜、コンパニオン哺乳動物または動物園の哺乳動物であることができ、 畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ネコ、イヌ、および大型のネコ科の動物を包 含するが、これらに限定されない。 好ましくは、化合物は少なくとも１つの型の腫瘍に対して選択的 に毒性である、すなわち、化合物は腫瘍細胞に対して毒性または抗増殖性である が、正常細胞に対して毒性または抗増殖性ではない。 本発明のすべての化合物は、下記の活性の１または２以上を有する： ａ）下記のヒト腫瘍細胞系統の少なくとも１つの細胞培養における成長の阻害 ：黒色腫ＭＭ４１８ｃ１、頸ＨｅＬａ、黒色腫Ａ２０５８、卵巣ＪＡＭ、および リンパ腫Ｍｕｔｕ； ｂ）形質転換されたケラチノサイト（ＨａＣａｔ）およびメラノサイト（Ｍｅ ｌ−ＳＶ）の細胞培養における成長の阻害； ｃ）異種移植されたヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞（例えば、黒色腫ＭＭ ９６Ｌ）のｉｎ ｖｉｖｏの成長の阻害； ｄ）ヒストンの過アセチル化の程度により測定して、ヒストンのデアセチラー ゼの阻害； ｅ）正常のヒト細胞に比較してヒト腫瘍細胞によるタンパク質の発現の差の誘 導； ｆ）正常細胞を殺さないで（ａ）における腫瘍細胞の選択的殺し； ｇ）Ｇ１／Ｓ期におけるいくつかの感受性腫瘍細胞の細胞周期の進行のブロッ キング； ｈ）腫瘍細胞におけるアポプトーシスの誘導；および ｉ）腫瘍細胞ではなく、正常細胞におけるＤＮＡ合成の阻害。 典型的には、化合物は： ａ）ヒト腫瘍細胞を殺すために有効な投与量において、正常のヒト細胞、例え ば、メラノサイト、新生児包皮線維芽細胞（ＮＦＦ）、または末梢血リンパ球を 殺さない； ｂ）１μＭに等しいか、あるいはそれより低いＫｉにおいて、組織の維持およ びタンパク質の調節のために重要であることが知られ ている金属プロテイナーゼを有意に阻害しない； ｃ）動物モデルにおける毒性の明白な徴候を示さない； ｄ）Ｇ₂／Ｍ期におけるいくつかの薬剤感受性腫瘍細胞の細胞周期をブロック しない。 ＡＢＨＡを包含する、本発明の化合物は、形質転換されたケラチノサイトの殺 しにおいて有効である。 したがって、第２の面において、本発明は、治療を必要とする被検体に、有効 投与量の上に定義した化合物またはＡＢＨＡを投与する工程からなる、過形成ま たは形成異常の症状を治療する方法を提供する。 好ましくは、この症状はケラチンの過形成、例えば、乾癬、白斑症、または日 光性角化症である。 第３の面において、本発明は、一般式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ：（式中、 Ｘ¹は−Ｃ＝Ｏ；−ＣＯＲ¹；−ＣＦ₂；−ＣＮＨ₂；−ＣＮＲ¹；−ＳＯ₂−；− Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−；−Ｃ−Ｓ；−ＣＳＲ¹；−Ｃ−ＣＯＲ¹；−Ｃ−ＣＯＮＲ¹ Ｒ²または−Ｃ−ＣＨ₂ＯＨから選択される極性基であるか、あるいはＲ¹または Ｒ²は存在せず、 Ｒ¹およびＲ²は同一であるか、または異なり、各々はＨ；ＯＨ；ＮＨ₂；ＮＨ ＯＨ；置換もしくは非置換の、分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル 、アルキルアミノ、アルキルオキシまたはアリールアルキルオキシ；置換もしく は非置換のアリール、アリールオキシまたはピリジノ；置換もしくは非置換のア リールアミノ、ピペリジノ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、ピリジン アミノ、９−プリン−６−アミン、およびチアゾールアミノから成る群より独立 して選択され、そして リンカーは５〜９個の原子の主鎖を有する基であり、これは１、２または３つ のアミノ酸からなることができる） のヒドロキサメートまたはヒドロキサム酸化合物、またはそれらの薬学上許容さ れる塩、エステルまたは誘導体を提供する。 式Ｉｃにおいて、２つのＸ¹基は列挙された基から独立して選択される。 こうして、１つの態様において、化合物は下記式１１を有する：式中、 Ｒ³はＲ¹およびＲ²について上に定義した通りであり、そして Ｒ⁴およびＲ⁵ は同一であるか、または異なり、各々はＨ、アルキル、アリールまたは普通また は非普通のアミノ酸の側鎖から独立して選択される。 この明細書の目的に対して、「普通の」アミノ酸はグリシン、ロイシン、イソ ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、 アスパラギン酸塩、アスパラギン、グル タミン酸塩、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニル、リジン、プロ リン、セリン、スレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択されるＬ−アミ ノ酸である。 「非普通の」アミノ酸は、下記のものを包含するが、これらに限定されない： Ｄ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳 香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン以外の）、オ ルト−、メタ−またはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロ イシン、γ−グルタミン酸、アミノ酪酸およびα，α−二置換アミノ酸。 他の態様において、リンカーは２つのアミノ酸からなり、そして化合物は下記 式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂを有する：式中、 Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の各々は上に定義した通りであり、そして Ｙは−ＣＨ＝ ＣＨ₂−ＣＯ；−Ｃ（アルキル）＝Ｃ（Ｈまたはアルキル）₂；−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＯ； −ＣＨ（アルキル）−ＣＨ（アルキル）−ＣＯ；−ＮＲ⁶ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ；−Ｎ Ｒ⁶Ｃ（アルキル）−Ｃ（Ｈまたはアルキル）−ＣＯ−；または−ＮＲ⁶−Ｃ₆Ｈ₄ −ＣＯであり、ここでＲ⁶はＲ¹及びＲ²について上に定義した通りであり、そし てアルキルは直鎖状もしくは分枝鎖状の脂肪族基で ある。 第３の態様において、リンカーは１つのアミノ酸を含んでなり、そして化合物 は下記式ＩＶａまたはＩＶｂを有する： 式中、 Ｙは上に定義した通りである、 式中、 Ｙ’は−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＯ；−（ＣＨ₂）_n、ここでｎは１〜６の整数である ；−（ＣＨ₂）₃；−（ＣＨ₂）₄；−（ＣＨ₂）₂ＣＯ−；−（ＣＨ₂）₃−ＣＯ；Ｃ₆ Ｈ₄；Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ＝ＣＨ₂；−ＣＨ＝ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄；−ＣＨ（アルキル）−Ｃ Ｈ（アルキル）；−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＯ；−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ＝ＣＨ−ＯＨ；−ＣＨ＝ＣＨ −Ｃ₆Ｈ₄−ＣＯ；または−ＣＨ（アルキル）−ＣＨ（アルキル）ＣＯである。 双方の式ＩＶａおよびＩＶｂにおいて、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は上に定義した通 りである。 他の態様においてリンカーは１、２または３つの二重結合を有し、そして化合 物は下記式Ｖａ、Ｖｂ、Ｖｃ、Ｖｄ、Ｖｅ、ＶｆまたはＶｇを有する： 式中、 Ｒ¹およびＲ²は同一であるか、または異なり、そして上に定義した通りであり 、 ｎおよびｍの各々は独立して１〜６の整数であり、そして Ｃ₆Ｈ₄基は芳香族環であり、前記環はオルト位、メタ位またはパラ位において ＮＯ₂、ＮＨ₂、ＮＭｅ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＳＯ₂ＮＨ₂、Ｍｅおよびアルキルから選択 される置換基で置換されていてもよい。 好ましくは、Ｒ¹およびＲ²の各々は独立してＨ、アルキルまたはアリールであ る。 別の態様において、極性基Ｘ¹は下記式ＶＩの環状テトラペプチドの一部分を 形成する： 例えば、 式中、 Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の各々は同一であるか、または異なり、そ して上に定義した通りであるか、あるいはチオプロリン、ヒドロキシプロリン、 ピペコリン酸またはデカヒドロイソキノリンであることができ、 Ｘ¹およびＹは上に定義した通りであるか、あるいはＹは（ＣＨ₂）₅ＣＯＭｅ 、（ＣＨ₂）₄ＣＯＭｅ、（ＣＨ₂）₅ＣＯ−アルキル、（ＣＨ₂）₅ＣＯ−アリール 、（ＣＨ₂）₅ＣＯ−ＮＲ³Ｒ⁶であることができ、ここでＲ³およびＲ⁶は同一であ るか、または異なり、そして上に定義した通りである。 好ましくは、Ｒ³およびＲ⁶の各々はＨ、アルキル、アリール、（ＣＨ₂）₅ＣＨ Ｏ、 およびＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂−ＣＯＭｅから成る群より選択され、そ して４つのアミノ酸の各々は脂肪族アルキル基でＮ−アルキル化されていてもよ い。 ＊でマークする位置における立体化学的立体配置はＲまたはＳ（ＬまたはＤ） であることができる。 他の別の態様において、極性基Ｘ¹は環状ペンタペプチドの一部分を形成し、 そして化合物は下記式ＶＩＩＩを有する： 式中、 Ｘ¹およびＹは前の態様について定義した通りであり、そして他の置換基は上 に定義した通りである。 なお他の態様において、本発明の化合物は環状分子、例えば、キノリン、イソ キノリン、テトラヒドロキノリン、またはデカヒドロ キノリンであるか、あるいは下記の化合物から成る群より選択される化合物であ る： および 式中、 ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル；ＮＯ；ＳＯ；ＣＯ；Ｃ−Ｒ⁷であり、 Ｘ²はＯ、ＯＨ、アルデヒド、ケトン、ＣＦ₃；ＮＯ₂；ＮＯ；ＳＨ；Ｓ；ＮＨ ；ＮＨ₂；ＣＯ₂Ｈ；ＣＯＮＨ₂；ＣＯ₂（アルキル）；ＣＯＮＨ（アルキル）；ま たは他の極性基であり、 Ｒ⁷は１または２以上の置換基、例えば、Ｈ；ＯＨ；ＯＭｅ；ＮＯ₂；Ｃｌ；Ｂ ｒ；Ｆ；（Ｍｅ）₂Ｎ；ＣＮ；ＮＨ₂；ＮＨ（アルキル）；Ｎ（アルキル）₂；Ｓ Ｏ₃Ｈ；ＳＯ₂ＮＨ₂；アルキルＣＦ₃；Ｏ（アルキル）；ＳＨ；Ｓ（アルキル）お よびその他であり、そしてここで アルケン結合として描写される各結合は選択的に単結合であることができ、そ して円形でマークされる各単結合は選択的に二重結合であることができる。 第４の面において、本発明は、本発明の一般式の化合物、またはその薬学上許 容される塩、エステルまたは誘導体と、薬学上または獣医学上許容される担体と を含んでなる組成物を提供する。 ＷＯ９３／０７１４８およびＷＯ９５／３１９７７の明細書には、それらの中 に開示された化合物の末端の分化を誘導しかつ新形成細胞の増殖を阻害する能力 が記載されている。過形成または形成異常の症状における活性、免疫学的活性の モジュレーション、または原生動物の寄生体に対する活性の開示または示唆は存 在しない。結局、明らかに理解されるように、本発明の下記の面は、本発明の新 規な化合物に加えて、ＷＯ９３／０７１４８およびＷＯ９５／３１９７７に開示 されている化合物の使用を包含する。これらの化合物は、本明細書において「Ａ ＢＨＡおよび関係する化合物」と呼ばれる。 我々は、また、驚くべきことには、本発明の化合物、およびＡＢＨＡは、０． １〜１５０μｇ／ｍｌの投与量において、原生動物の寄生体、例えば、ギアルデ ィア・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）およびプラスモ ディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいての成長を阻害することを見出し た。 したがって、第５の面において、治療を必要とする被検体に、有効投与量の本 発明の１または２以上の化合物、ＡＢＨＡまたは関係する化合物を投与する工程 を含んでなる、原生動物の寄生体の感染を治療する方法を提供する。 本発明のこの面は、種々の原生動物の寄生体による感染の治療に適用可能であ る。このような原生動物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：重 複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプ トスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス類（Ｔｒｉ ｃｈｏｍｏｎａｓ）、根鞭毛虫類（Ｈｉｓｔｏｍａｏｎａｓ）、マラリア病原虫 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、睡眠病 病原虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、ピロプラズマ類（Ｂａｂｅｓｉａ）、異毛 類（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、有鞭毛アメーバ類（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、寄 生性アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）および球虫類（Ｅｉｍｅｒｉａ）、住血吸 虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｍａｎｉａｓｉｓ）、他の腸内寄生体、およびその他。これ らの寄生体の多くは深刻な公共の健康又は獣医学的問題を供し、特に発展途上国 で顕著であり、現状の治療法は不満足たるものである。 好ましくは、寄生体は、重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、特にギアルディア ・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、マラリア病原虫（ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、特にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、またはトリコモナス類（Ｔｒｉｃｈｏｍ ｏｎａｓ）、特にトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇ ｉｎａｌｉｓ）である。 好ましくは、化合物は、本明細書において定義するＡＡＨＡ、ＭＷ２７９６、 ＭＷ２９９６、またはＡＢＨＡである。より好ましく化合物はＭＷ２７９６であ る。 本発明の化合物の選択的細胞障害性は、網膜芽細胞腫結合性タンパク質ＲｂＡ ｐ４８の低いまたは異常な発現により促進されることを我々はを示した。 したがって、第６の面において、本発明は、癌の試料中の全長のＲｂＡｐ４８ の異常なレベルまたは非存在を検出する工程を含んでなる、本発明の方法の治療 が特に可能である癌を同定する方法を提 供する。適当には、これは、生検を介するか、あるいは腫瘍の外科的切除時にお いて得られた、腫瘍の組織学的切片を、ＲｂＡｐ４８に対して向けられた抗体を 使用して、免疫組織学的に分析するすることによって達成することができる。抗 体を任意の適当な検出可能なマーカーで標識化することができ、そして蛍光性ま たは放射性マーカーは好ましい。蛍光性マーカーは特に好ましい。適当な方法は 当業者によく知られている。 本発明の化合物は、適当な経路により投与することができ、このような経路は 下記のものを包含するが、これらに限定されない：非経口的注射、例えば、静脈 内、皮下、筋肉内および腫瘍内の注射、経口投与、経皮および局所投与。一般に 、経口、経皮または局所投与は好ましい。ヒドロキサメートおよび関係する化合 物の一般的化学的性質に基づいて、本発明の目的に対して有用な、少なくとも１ つのいくつかの化合物は経口的に生物学的利用可能であることが期待され、そし てこれが正しいことを我々は証明した。経口的生物学的利用能を改良することが できる、構造的変更はこの分野において知られている；例えば、Ｂｅｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９９６、参照。 投与の量および経路は、治療すべき癌または原生動物の寄生体の感染の特質、 投与されてきた他の治療、あるいは、また、使用すべき他の治療、および被検体 の健康状態に依存し、そして所属の医師または獣医師の判断によるであろう。適 当な投与量の範囲は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１回で、または分割 されて投与されることが考えられる。例えば、３回の別々の投与／日を使用する ことができる。あるいは、ポンプを介する連続的注入を使用することができる。 広範な種類の適当な担体および処方剤はこの分野において知られており、そして 、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ ｌｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン、に記載されてい る。 処方物は使用すべき投与量および経路に依存するであろう、そして日常的手探 り法の事柄である。 第７の面において、本発明は、ＲｂＡｐ４８をコードする核酸配列またはＳｐ ｈ１を含有する配列に対して相補的である核酸配列を治療すべき被検体に投与す る工程を含んでなる、本発明の化合物で、癌または寄生体の感染の治療の選択性 を増強させる方法を提供する。好ましくは、相補的配列を腫瘍細胞または寄生体 にターゲットさせる。 第８の面において、本発明は、腫瘍を患う被検体に、本発明の化合物を投与し て、ＭＨＣクラスＩの分子を発現する腫瘍細胞の比率を増加させる工程を含んで なる、免疫系により認識される腫瘍細胞の比率を増加させる方法を提供する。こ れは本発明の化合物、またはＡＢＨＡおよび関係する化合物を使用して、癌、あ るいは免疫系または免疫調節分子の増強が要求される他の症状を有する患者の免 疫応答をモジュレートすることである。 明らかに理解されるように、本発明は、化合物それ自体および癌を治療する医 薬組成物それ自体に関するかぎり、アゼラインビスヒドロキサム酸またはＷＯ９ ５／３１９７７またはＷＯ９３／０７１４８に開示されている化合物を包含しな い。 この明細書の目的に対して、明らかに理解されるように、語「を含んでなる」 は「を包含するが、これらに限定されない」意味を有し、そして「からなる」は 対応する意味を有する。 図面の簡単な説明 第１Ａ図は、黒色腫細胞（Ａ、Ｂ）またはＨｅＬａ細胞（Ｅ、Ｆ）において誘 導されるが、正常のメラノサイト（Ｃ、Ｄ）、または新生児包皮線維芽細胞（Ｎ ＦＦ、Ｇ、Ｈ）において誘導されない、増強された形態を示す。インヒビター： アゼラインビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）、１００μＭ。 第１Ｂ図は、１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで２４時間処理し、メタノール中で 固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２４８で染色した、細胞におけるアポプトーシス （プログラムされた細胞の死）を示す。アポプトーシス細胞はフラグメント化し た核を有する。左のパネル、未処理細胞、右のパネル、処理された細胞。Ａ、Ｂ ：ＭＭ９６Ｌ細胞。Ｃ，Ｄ：ＨｅＬａ、Ｅ、Ｆ：ＭＭ２２９細胞。Ｇ、Ｈ：ヒト 新生児包皮繊維芽細胞（ＮＦＦ）。 第２図は、フロー・サイトメトリーのプロフィルを示し、細胞の増殖をブロッ クする本発明の化合物の能力を図解する。腫瘍細胞（ＭＭ９６ＬおよびＨｅＬａ ）は感受性であるが、正常細胞（ＮＦＦ、Ｄ２９）は耐性である。ＴＳＡ：トリ コスタチンＡ；Ｍｋ−４：アゼライン−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（ ＡＡＨＡ）と同一；ＨＵ：ヒドロキシ尿素。ＡＢＨＡおよびＡＡＨＡの投与量は μｇ／ｍｌである；ＴＳＡの投与量はｎｇ／ｍｌである；数は投与量を示す；例 えば、ＡＢＨＡ ３＝３μｇ／ｍｌのＡＢＨＡ；水平軸：ＤＮＡの含量。 第３図は、ＡＢＨＡによる腫瘍細胞の選択的阻害を図解する。 パネルＡは、メラノサイト（●）、新生児包皮線維芽細胞（■）、ＨａＣａｔ 形質転換ケラチノサイト（△）、Ｍｅｌ−ＳＶメラノサイト（▲）およびＭＭ４ １８ｃ１黒色腫（○）に対する応答を示す。 パネルＢは、腫瘍細胞系統ＨｅＬａ頸（□）、Ａ２０５８黒色腫 （○）、ＭＭ９６Ｌ黒色腫（●）およびＪＡＭ卵巣癌（△）についての結果を示 す。各点は平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。 第４図は、ＡＢＨＡ（１３μｇ／ｍｌ）またはヘキサメチレンビスアセトアミ ド（ＨＭＢＡ：１，０００μｇ／ｍｌ）で１２時間または３日間処理した細胞に おける過リン酸化網膜芽細胞腫（ＲＢ）の低下を示す。ｐｐＲＢは過リン酸化Ｒ Ｂ（１１５ｋＤａ）を表す；ｐＲＢは低リン酸化ＲＢ（１０５ｋＤａ）を表す。 第５Ａ図は、１００μＭのＺｎＳＯ４₄の存在におけるヒツジメタロチオネイ ンＩａプロモーターのモジュレーションについてのＡＢＨＡの投与量応答を示す （□ ＭＭ９６−Ｇａ１；○ ＨｅＬａ−Ｇａ１）。各点は平均±標準偏差（ｎ ＝３）を表す。 第５Ｂ図は、ルシフェラーゼ遺伝子を推進する種々のプロモーター構築物を使 用し、発光によりルシフェラーゼ活性を測定した、ＡＢＨＡまたはＡＡＨＡで処 理後２４時間における、ＨｅＬａ細胞における転写の誘導を示す。ＳｐｈＩ列は 完全な活性化に必須な配列として同定される。Ｏｃｔ：ＳＶ４０エンハンサー領 域から誘導され、ｐＧＬ２リポーター構築物の中に挿入された、オクタマー配列 ；ＳｐｈＩ：ＳｐｈＩ配列；ＳｐｈＩＩ：ＳｐｈＩＩ配列；ｗｔ：野生型；ｄｐ ｍ２、ｄｐｍ７およびｄｐｍ８：ボールドフェース型で識別される突然変異を含 有する同様な配列。 第５Ｃ図は、ＳｐｈＩ活性が試験したすべてのヒストン脱アセチル化インヒビ ターにより誘導されるが、それが腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、を発現する 細胞においてのみであることを示す。 第６Ａ図、第６Ｂ図および第６Ｃ図は、４ｍｇ／日のＡＢＨＡ、５ｍｇ／日の ＡＡＨＡ、８ｍｇ／日のＳＢＨＡ、２５μｇ／日のＴＳＡまたは２５μｇ／日の ＨＣ−トキシンで処理された、ヌードマウスにおける異種移植されたＭＭ９６Ｌ ヒト黒色腫の増殖を示す。 ●＝ＡＢＨＡ、ＡＡＨＡまたはＳＢＨＡで処理された；△＝ＴＳＡまたはＨＣ− トキシンで処理された；□＝未処理対照（ｎ＝７／グループ）。 第７Ａ図は、１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで処理された（ａ）および処理され ない（ｂ）黒色腫細胞系統ＭＭ９６Ｌの細胞抽出物を比較する、二次元のポリア クリルアミドゲルの電気泳動の結果を示す。小さい黒色の矢印は、薬剤処理のた めに減少したタンパク質を示す；小さい白色の矢印は、薬剤処理のために獲得さ れたタンパク質を示す。 第７Ｂ図は、対照および処理された細胞から分離されたタンパク質の２つの一 次元のＰＡＧＥゲルを示す。ボールドフェースの矢印は、感受性細胞においてＡ ＢＨＡ（１００μｇ／ｍｌ、２４時間）またはＵＢＶ（２４０ジュール／ｍ²の 放射線、２４時間）により特異的に誘導されるタンパク質を示す。使用した細胞 は、ＭＭ９６ＬおよびＡ２０５８黒色腫細胞系統、ＭＥＬ／ＳＶ４０ ＳＶ４０ 形質転換メラノサイトおよびＮＦＦ細胞であった。＊はＦＣＳに由来するＢＳＡ の位置を示し、その存在はゲルのこの領域を不明瞭にする。Ｍ：分子量マーカー ；Ｃ：対照。 第７Ｃ図は、Ｋｕ８６に対するＯＶ９Ｄ１抗体と反応した、ＭＭ９６Ｌ細胞の ウェスタンブロットを示す。このタンパク質（８６ｋＤａ）のレベルは細胞質ゾ ル（Ｃ）においてアップレギュレートし、そしてＡＢＨＡ処理（１００μｇ／ｍ ｌ、２４時間）により核（Ｎ）において消耗される。 第８図は、薬作用発生団のモデルを示し、ここで活性（灰色）および不活性（ 白色）の化合物の構造がオーバーレイされている。 第９Ａ図は２４時間の１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡによるＭＭ９６Ｌ細胞の処 理（レーンＣ：対照；レーンＡ：ＡＢＨＡ処理）また は５ｍＭの酪酸ナトリウムを使用するＨｅＬａ細胞の処理（レーンＣ：対照；レ ーンＢ：処理）の間のヒストンＨ４のアセチル化を示す；Ｈ：ヒストン混合物。 ポリアクリルアミドゲルで分離された酸可溶性物質のタンパク質の染色により、 バンドは可視化された。 第９Ｂ図は、また、２４時間の、今回は１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡを使用す るＭＭ９６Ｌの処理、および１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡを使用するＮＦＦ細胞 の処理の間のヒストンＨ４のアセチル化を示す。ポリアクリルアミドゲルで分離 された酸可溶性物質のタンパク質の染色により、バンドは可視化された。「−」 ＝ＡＢＨＡの非存在；「＋」＝ＡＢＨＡの存在；Ｈ２Ａ、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ２Ｂは 他のヒストンである； 第９Ｃ図は、ＭＭ９６Ｌ細胞（上のパネル）およびＮＦＦ（下のパネル）にお ける、ＡＢＨＡを使用する処理の間のヒストンＨ４のアセチル化の時間経過のレ ーザーデンシトメトリーの跡を示す。Ｈ２Ａ、Ｈ１、Ｈ３およびＨ２Ｂは他のヒ ストンである；４、３、２、１および０は結合したアセチル基の数を表す；例え ば、４＝テトラ−アセチルヒストンＨ４。 第９Ｄ図は、培地からＡＢＨＡを除去した後、アシル化ヒストンＨ４の低下速 度を示す。細胞は１０μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで２４時間前以て処理されていた。 第１０Ａ図は、ウェスタンブロッティングにより明らかにされた、ＲｂＡｐ４ ８抗体と反応性である細胞ライゼイト中のタンパク質のレベルおよび相対的大き さを示す。感受性細胞系統（例えば、ＭＭ９６Ｌ、ＨｅＬａ）は、耐性細胞系統 ＭＭ２２９、ＮＦＦ、メラノサイトおよびＡ２０５８と比較したとき、低いレベ ルの全長のタンパク質を有した。 第１０Ｂ図は、感受性細胞（ＨｅＬａ）と耐性細胞（ＮＦＦまた はＡ２０５８）との間のハイブリッドが、感受性親系統のそれに類似するＲｂＡ ｐ４８タンパク質のパターンを表現する傾向があることを示す；すなわち、親耐 性系統から期待されたよりも、より少ない全長のタンパク質（４８ｋＤａ）が存 在する。Ａ／Ｈ ｍｐ２、Ａ／Ｈ Ｂ５はＡ２０５８／ＨｅＬａハイブリッドで ある。Ｎ／Ｈ ｍｐはＮＦＦ／ＨｅＬａハイブリッドである。 第１１Ａ図および第１１Ｂ図は、ＡＢＨＡと比較した、培養した細胞の存在に おける１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡ（Ａ）およびＨＣ−トキシン（Ｂ）の不安定性 を示す。ＭＭ９６Ｌ細胞に対する２４、４８および７２時間の暴露を使用して、 ＨＣ−トキシン（パネルＢ）の不活性化の投与量応答を実施し、培地単独中の７ ２時間のインキュベーションと比較した。薬剤をマイクロタイタープレート中で ５０，０００のＭＭ９６Ｌ細胞／ウェルとインキュベートし、そして種々の時間 において、２４時間の処理のために５０００のＭＭ９６Ｌ細胞を含有する他のプ レートに培地を移し、次いで細胞の生存の決定のために、さらに５日間インキュ ベートした。 発明の詳細な説明 下記の一般的方法および実施例、および図面のみを参照して、本発明を詳細に 説明する。 略号 ＡＡＨＡ アゼライン−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（Ｍｋ−４） ＡＢＨＡ アゼラインビスヒドロキサム酸 ＤＭＥＭ ダルベッコ変性イーグル培地 ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＨＭＢＡ ヘキサメチレンビスアセトアミド ＭＳＭＳ 質量分析 ＮＦＦ 新生児包皮線維芽細胞 ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 ＰＢＳ リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３ ｐＲＢ 網膜芽細胞腫タンパク質 ＰＫＣ ホスホキナーゼＣ ＰＶＤＦ ポリビニルジフルオライド膜 ＲｂＡｐ４８ ｐＲＢ結合性タンパク質 ＳＢＨＡ スベリンビスヒドロキサム酸 ＳｐｈＩ シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）エンハンサー領域から誘導さ れた８ｂｐのヌクレオチド配列 ＴＰＡ １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート ＴＲＰ−１ チロシナーゼ関係プロテイン−１ ＴＳＡ トリコスタチンＡ 細胞の培養 ヒト黒色腫細胞系統ＭＭ９６Ｅ、ＭＭ９６Ｌ（ＭＭ９６のサブクローン）、Ｍ Ｍ４１８ｃ１およびＭＭ４１８ｃ５、ヒト頸腫瘍細胞系統ＨｅＬａおよび卵巣腫 瘍細胞系統ＪＡＭ（ＭｃＥｗａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４）および自発的に形質転換されたケラチノサイト系統ＨａＣａ ｔの由来は前に記載された。ＮＦＦはヒト新生児包皮線維芽細胞である。包皮か らの正常のヒトメラノサイトを、１００μｇ／ｍｌの１２−Ｏ−テトラデカノイ ルホルボール１３−アセテートおよび６μｇ／ｍｌのコレラトキシン中で培養し た。ＳＶ４０−アデノウイルス５ハイブリッドウイルスでメラノサイトを感染さ せた後に得られた、永久分裂能化ヒトメラノサイトのｍｅｌ−ＳＶ系統は、Ｐ． Ｇａｌｌｍｏ ｒｅ教授（Ｂｉｒｍｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）から提供された。前に記降されてい るように、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したロスウェル・パーク・メモリ アル・インスチチュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地中で、３７℃において培養物を増殖させた。 ２４ウェルのプレート（直径１６ｍｍのウェル）の中に播種し、薬剤で２４時 間処理し、３倍加時間の間（ＮＦＦ、メラノサイトおよびＭＭ４１８について６ 日間；他の細胞系統について３日間）インキュベートした、２５，０００の細胞 の数の増加の血球計の計数を実施することによって、細胞の生存率を決定した。 また、ＭＴＳ／ＰＭＳ法によるか、あるいはＨ₃−チミジンの組込み（これは 同様な結果を与える）（Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９９７）により、細 胞数を測定する。クロロフェノールレッドガラクトシド（ＣＰＲＧ）基質を使用 するガラクトシダーゼの作用についてのアッセイをマイクロタイタープレート中 で実施し、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して読むことができる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。 後述する機能的試験において、処理した細胞を対照と細胞数またはタンパク質 含量に基づいて比較した。タンパク質含量は、ビキンコン酸試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を添加してマイクロタイタープレート中で三重反 復実験し、５７０ｎｍにおける吸収の増加を測定することによって、測定した。 標準として、ウシ血清アルブミンを使用した。 アゼラインビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）の合成 ジメチルホルムアミド（２５ｍｌ）中のアゼライン酸（ノナンジオン酸；１． ０ｇ；５．３ｍＭ）の溶液に、トリエチルアミン（２．６８ｇ；３．７ｍｌ；２ ６．５ｍＭ）、ヒドロキシルアミン塩酸 塩（０．７７ｇ；１１ｍＭ）およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（６．２ｇ；１ ４ｍＭ）を添加し、反応混合物を窒素雰囲気下に室温において１２時間撹拌した 。次いで混合物を水（１００ｍｌ）で希釈し、凍結乾燥して、粗生成物を濃厚な シロップとして得た。この物質をアセトニトリル（４ｍｌ）と水（１６ｍｌ）と の混合物中に再溶解し、濾過し、ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓデルタパックＣ１８、 １５ｍｍ、４０×１００ｍｍ、流速２０ｍｌ／分、溶離液２０％アセトニトリル ／８０％水／０．１％トリフルオロ酢酸）のクロマトグラフィーにかけた。精製 された物質を凍結乾燥して白色粉末（０．９２ｇ；８０％）が得られ、¹Ｈ Ｎ ＭＲ分光分析およびエレクトロスプレー質量分析によると、これは以前に報告さ れたものと同一であった（Ｂｒｅｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。 チロシナーゼ活性および色素沈着抗原 記載されているように（ＴａｋａｈａｓｉおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９９０） Ｌ−ドーパの酸化により、チロシナーゼ（ドーパオキシダーゼ）活性を測定した 。ＴＲＰ−１に対するＢ８Ｇ３マウスモノクローナル抗体上清またはＨＭＢ−４ ５マウス抗体（１／２５０に希釈した）を使用し、次いでアルカリ性ホスファタ ーゼ結合抗マウス抗体を使用して、イムノブロットを実施し、ＩｍａｇｅＱｕａ ｎｔソフトウェアを使用するモレキュラー・ダイナミック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ）レーザーデンシトメーターにより定量した。 ルシフェラーゼトランスフェクタントを使用する転写調節の分析 リポータープラスミドで安定にトランスフェクトされたＭＭ９６Ｌ細胞および ＨｅＬａ細胞のクローンを使用して、プロモーター活 性に対するＡＢＨＡの作用を決定した。ＴＲＰ−１構築物の構築は記載された（ Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー 構築物をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手した。ｐ５３応答因子を含有する リポーターの構築のために、強いパリンドロームｐ５３認識部位を含有する二重 らせんオリゴヌクレオチド（Ｆｕｎｋ ｅｔ ａｌ．、１９９２）を平滑末端の フラグメント（５’ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴ ＣＴＣＣ）として、エンハンサー−プローブベクターｐＧＬ２−プロモーター（ Ｐｒｏｍｅｇａ）の平滑Ｅｃ１ １３６ＩＩ部位の中にクローニングした。イン サートの双方の鎖の読みを可能とするプロモーターを使用して、自動化ＤＮＡ配 列決定（ＴａｙｌｏｒおよびＤｕｎｎ、１９９４）により、単一の挿入されたオ リゴヌクレオチドを含有するプラスミドの構造を確認した。上記応答因子の各々 をルシフェラーゼリポーター遺伝子にカップリングさせた。Ｎｅｏ耐性プラスミ ドと共トランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのゲネチシンで選択した後、安定 にトランスフェクトされた細胞のクローンを取り上げた。透明な、細胞培養等級 の底を有する、黒色のマイクロタイタープレートの中に、細胞を５０，０００／ ウェルで播種し、薬剤と６または２４時間インキュベートした。次いで培地を２ ０μｌのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルシフェラーゼアッセイ試薬と置換し、直 ちにパッカード・トップ・プレート（Ｐａｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｐｌａｔｅ）計器 を使用して発光計数をｉｎ ｓｉｔｕで実施した。 化学的設計および合成 よく確立された有機化学溶液および固相技術を使用して、化合物を合成した。 チロン（Ｃｈｉｒｏｎ）から入手した、コンビ−ケム・マルチピン（Ｃｏｍｂｉ −ｃｈｅｍ ｍｕｌｔｉｐｉｎｓ）を使 用して、組合わせのライブラリーを構築した。シリカゲルのカラムクロマトグラ フィーによるか、あるいはアセトニトリル−水の溶離液を使用する逆相高性能液 体クロマトグラフィーにより、精製を実施した。質量分析およびＮＭＲ分光学に より、化合物を特性決定した。 マトリックス金属プロテアーゼ 慣用法、例えば、マトリックス金属プロテアーゼのストロメリシン（ＭＭＰ− ３：ＥＣ３．４．２４．１７）、ヒト好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８：ＥＣ３ ．４．２４．３４）についてのアッセイ、およびＴＮＦ−アルファコンバーター ゼのインヒビターを使用して、１連の金属プロテアーゼに対して化合物をバッチ でスクリーニングした。適当なアッセイは、Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ（ １９９３）およびＭｃＧｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載されてい る。 ヒストンの過アセチル化 核タンパク質の酸抽出、引き続くＰＡＧＥまたはＴｒｉｔｏｎ／尿素ゲル、お よびクーマッシーブルー染色を使用するゲルの染色により、ヒストンの過アセチ ル化を測定した。また、フロー・サイトメトリーを使用する、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２４８へのＤＮＡのアクセス可能性により間接的に、そしてＰＡＧＥにより 直接的に、過アセチル化を測定することができる。ウェスタンブロッティングに よるか、あるいは発表された配列からの逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応により、 ヒストンデアセチラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼのレベルを測定する 。Ｂｒｎ−２アンチセンス配列について実施されたように（Ｔｈｏｍｐｏｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５）、発現ベクターの構築のためにｃＤＮＡを使用する 。 黒色腫の異種移植片 黒色腫ＭＭ９６Ｌ、ＨｅＬａおよび卵巣癌細胞系統ＪＡＭの異種移植片を、以 前に記載されたように（Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９９１）、ヌードマ ウスにおいて増殖させた。腫瘍を確立するために１週後、生理食塩水中の薬剤処 理を見出された毒性レベルよりちょうど低い濃度において３匹のマウスの腹腔内 に１回／日で与え、次いでより低い、いっそう有効な投与量で各グループのすべ ての６匹のマウスに与えた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する初期の実験において 、ＡＢＨＡについて一般的毒性は見出されなかった。腫瘍の大きさを毎週測定し 、腫瘍が直径１ｃｍに到達したとき、動物を安楽死させた。処理したマウスにお いて腫瘍が発生した場合、腫瘍細胞を培養の中に単離し戻して、耐性が発生した かどうかを決定した。 レセプターの同定 ａ）２Ｄ ＰＡＧＥ 通常の培地中で１０μｇ／ｍｌの被験化合物存在または非存在において、細胞 を２４時間成長させた。次いで細胞（１０⁶）を収集し、冷い生理食塩水で洗浄 し、溶解した。細胞膜を遠心により除去し、タンパク質抽出液を固定化ｐＨ勾配 （ＩＰＧ）ゲル上に負荷して等電点電気泳動させた。電気泳動は通常２５０，０ ００／時を必要とする。次いでＩＰＧゲルをポリアクリルアミドゲル（４％〜１ ５％）中で分離し、銀染色した。変更法において、タンパク質抽出液をまず１０ ｍｇ／１の放射能標識化分化因子と混合し、実験の終わりにおいてオートラジオ グラフィーにより見た。特定のタンパク質をアクリルアミドゲルから直接的に抽 出するか、あるいはＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットすることができる。調製 用２Ｄ ＰＡＧＥ技術を使用して、複合混合物の中の５０ｍｇまでのタンパク質 を負荷することができる。発現レベルに依存して、これは「セント リコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓ）」を使用する分子量分配によるか、あるいはサ イズ排除クロマトグラフィーによる、タンパク質の部分的精製（負荷の前に）を 必要とすることがある。より大きい規模の細胞培養（１０⁹までの細胞）を必要 とすることもある。すべての研究において使用したプロトコールは、オーストラ リアン・プロテオーム・アナリシス・ファッシリティー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ＡＰＡＦ）、マ ックアリー大学（Ｍａｃｑｕａｒｉｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において使用さ れるプロトコールに類似する。 ｂ）バイアコアー（Ｂｉａｃｏｒｅ^TM）分析 標準的固相ペプチドカップリングを使用する１系列のグリシン残基により、適 当に機能化された分化因子をＣＭ−５チップの表面に結合させる。次いで細胞ラ イゼイトを分画して粒状物質を除去し、固定化された分化因子の上に通過させる 。次いで固定化された物質を緩衝化生理食塩水で洗浄し、脱着させる（通常、ｐ Ｈまたはイオン強度の変化による）。脱着された物質を収集し、ゲル上に展開さ せて、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験におけるどのバンドが結合性であるかを同定する。３ ０ｎｇまでのタンパク質が単一のバイアコアー実験から収集されるが、これは相 互作用の強さおよびレセプターの数に依存する。分析のために十分なタンパク質 を得るために、アフィニティーカラムを調製することが必要であることがある。 ｃ）アフィニティークロマトグラフィー 化合物を固体の支持体のトレシル・セファローズ（Ｔｒｅｓｙｌ Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）または同様な支持体に結合させる。０．５％のトリトン−Ｘ１００中 で調製した細胞ライゼイト（１０⁸またはそれ多い細胞）を低い塩の緩衝液の中 に希釈し、セファローズに結合したタンパク質から非結合物質を洗浄除去した後 、ＮａＣｌ（ ２Ｍまで）のバッチで溶離し、最後に電気溶出する。画分をＰＡＧＥゲル上に展 開させ、タンパク質を銀で検出する。大規模調製からの関係するバンドをＰＶＤ Ｆ膜に移し、タンパク質のＮ末端をＭＳＭＳおよびトリプシン消化により配列決 定する。 薬理学的プロフィル ＰＡＬＬＡＳ ｐＫａｌｃおよびＰｒｏｌｏｇＰプログラム（Ｃｏｍｐｕｄｒ ｕｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｔｄ、ハンガリー）を使用して、ＬｏｇＰ値を予 測し、そしてＨＰＬＣ溶離速度および既知のＬｏｇＰの対照化合物を使用する標 準的検量線を使用して測定する。 細胞吸収の実験 ＨｅＬａ細胞、ヒト繊維芽細胞または他の所望の被験細胞を１０⁶細胞／ウェ ルで播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変性イーグル 培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において成長させる。２０時間後、培地を取出し、 細胞を５ｍｌの培地（ＦＣＳを含まない）で２回洗浄し、そして適当なアイソト ープで標識化した被検化合物を種々の濃度（０．０５〜１ｍＭ）において細胞に 添加する。細胞をさらに２０時間成長させ、氷冷ＤＭＥＭで２回洗浄し、液体シ ンチレーションカウンターで計数する。 実施例１ 形態学および細胞の生存 ＡＢＨＡの処理の１２時間以内に、細胞は特徴ある形態学的変化を発現した。 色素沈着系統、ＭＭ４１８ｃ５、およびメラミン欠乏性黒色腫系統ＭＭ９６Ｅは 、スピンドル形から長い突起をもつ著しく細長い細胞に変更した。ＨｅＬａの形 態は立方形からいっそう細長い、スピンドル形の変化し、多数の細胞は明確な突 起を有する。これは第１Ａ図に示されている。 対照的に、形質転換された腎細胞系統２９３は、平坦化したコロ ニーの代わりに、細胞の大きい凝集物を形成した。数日に処理後、細胞は増殖を 停止したが、より高い投与量を使用するまで（１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡ）明 白な毒性の徴候は存在しなかった。アポプトーシスの細胞が、第１Ｂ図に示すよ うに、検出され、これらの細胞は耐性細胞（ＮＦＦ、ＭＭ２２９）においてより も感受性細胞の型（ＭＭ９６Ｌ、ＨｅＬａ）においていっそう多数のである傾向 があった。これを表１に要約する。 黒色腫細胞はＨｅＬａ細胞よりもかなりいっそう感受性であり、そして黒色腫 細胞のより高い比率がＧ１において停止するようになった。これは第２図に図解 されており、この図面は感受性細胞（ＭＭ９６Ｌ、ＨｅＬａ）および耐性細胞（ ＮＦＦ、２２９）のサイクリングに対するヒドロキサメートＡＢＨＡおよびＡＡ ＨＡの作用を示す。細胞をＧ１においてブロックすることができることを示すた めに、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）を含め、そして比較のためにトリコスタチンＡ（ ＴＳＡ）を含めた。ヒドロキサメート処理（２４時間 ）で感受性細胞はＧ１において多少の停止を示したが、耐性細胞はＧ２において 蓄積した。Ｓ期は分析しなかった。薬剤処理後における³Ｈ−チミジンを使用す る標識化により、これらの結果は独立に確証された。結果はＭＭ９６Ｌ細胞にお いてＤＮＡ合成のわずかの阻害（対照の５２％）を示し、これに対してＮＦＦに おける阻害は非常に大きかった（対照の３．７％）。対照的に、非選択的薬剤の ブチレートは、それぞれ、１０％および２％のレベルを与えた。 細胞の長い期間および短い期間の双方の処理は、増殖の阻害において、ＡＢＨ ＡがＨＭＢＡまたはアゼライン酸よりも１００倍より大きい効力を有すること明 らかにした。２４時間の処理は６日間よりも約１０倍低い有効性を有したが、ｉ ｎ ｖｉｖｏにおいて予測される制限された暴露期間ために、２４時間の処理を さらに調査した。２４時間の処理後の３倍加時間の間の細胞の増殖に基づいて比 較して、ＡＢＨＡは繊維芽細胞およびメラノサイトに比べて腫瘍細胞系統に対し て高度に感受性であることが見出された。 これらの結果を表３に要約する。また、ＨｅＬａを使用して選択率をまた観測 し、これは試験した最も耐性の腫瘍系統であったが、正常細胞よりも感受性であ った。我々の結果が示すように、ＡＢＨＡおよびＡＡＨＡはｉｎ ｖｉｔｒｏの 分化因子としてＨＭＢＡよりも１００倍効力がある。ＡＢＨＡはＨＭＢＡよりも 効力があるばかりでなく、かつまた正常細胞（メラノサイト、繊維芽細胞；３７ ％、＞３００μｇ／ｍｌ）と比較して、５つのヒト腫瘍細胞に対して、ならびに ＳＶ４０形質転換メラノサイト（３７％の生存率、３０〜１００μｇ／ｍｌ）に 対して選択的に毒性であることを我々は見出した。この選択率は既知の細胞障害 性ヒドロキサメート（Ｂｒｏｗｎ、１９９５）およびＨＭＢＡの作用と対照的で あり、ＨＭＢＡは腫瘍細胞および正常細胞の双方に対して＞１０００μｇ／ｍｌ において３７％の生存率を示す。ＡＢＨＡは、１ｍＭの濃度においてさえ、繊維 芽細胞およびメラノサイトに対して毒性をほとんど示さない。 非常により大きい数の細胞の型から得られた結果を表２に要約する。これらは 、ＡＢＨＡに対して多少の耐性を示した、いくつかの黒色腫細胞系統（Ａ２０５ ８、ＭＭ２２９）を除外して、上記において観察された傾向を確証する。また、 ＴＳＡはＡＢＨＡよりも小さい範囲の細胞系統に対する選択的であることに注意 すべきである；しかしながら、ＡＡＨＡはＡＢＨＡに類似する選択率を示すが、 わずかにより大きい効力を有する。 ＡＢＨＡおよびＡＡＨＡは比較的低い効力を有するが、主要な発見は、メラノ サイトおよび繊維芽細胞のような正常細胞の成長に影響を与えないで、黒色腫、 卵巣および頸の腫瘍細胞、およびある範囲の他の腫瘍細胞の型の殺しにおける、 これらの化合物の選択率である。これは新規な結果である。腫瘍細胞および１ま たはそれ以上の細胞のターゲットに対する、この選択率についての基準を下記に おいて詳しく説明する。実施例２ 色素沈着マーカーおよびｐＲＢの発現 ＭＭ９６ＥおよびＭＭ４１８ｃ５において、７２時間の処理後、メラニン合成 における主要な酵素であるチロシナーゼの活性をアッセイした。７２時間までに 、活性は最小に到達した。結果を表３に要約する。 双方の細胞系統において、高いレベルのＡＢＨＡはチロシナーゼ活性の顕著な 阻害を引き起こした。等毒性濃度のＨＭＢＡは有効性が低かった。ウェスタンブ ロットにより測定した、メラノソームの抗原ＴＲＰ−１およびＨＭＢ−４５の発 現はＡＢＨＡおよびＨＭＢＡにより大きく減少し、ＨＭＢＡは色素沈着したＭＭ ４１８ｃ５細胞においてＡＢＨＡよりも有効であった。ほぼ等毒性投与量のアゼ ライン酸は、ほとんど無効であった。 １００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡでＭＭ４１８黒色腫細胞を２４時間処理すると、 フロー・サイトメトリーにより測定して、ＭＨＣクラスＩの分子を発現する細胞 の比率は９３％から９８％に増加することが見出された。ＭＨＣクラスＩの分子 はＢ７抗体により認識される分子であった。これが示唆するように、本発明の化 合物は免疫系により認識される腫瘍細胞の比率の増加において有効であろう。 第４図に示すように、ＡＢＨＡ処理の最初の１２時間の間に、過リン酸化され たｐＲＢ（ｐｐＲＢ）のレベルは影響を受けなかったが、少量のｐＲＢ（低リン 酸化）を検出できた。ＭＭ９６Ｌの延長した処理後、ｐｐＲＢは低下されたが、 ｐＲＢはＡＢＨＡ処理された細胞およびＨＭＢＡ処理された細胞の双方において 残留した。ｐｐＲＢの低下は、ＭＭ９６Ｌ細胞におけるよりも、それほど顕著で はなかった。 実施例３ ＲＮＡおよびタンパク質の合成のＡＢＨＡ誘導分化 ＨｅＬａ細胞において、ＡＢＨＡ誘導分化に関連するＲＮＡおよびタンパク質 の要件を研究した。５×１０⁴細胞をマイクロタイタープレート中で１０および １００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで２４時間処理した。１０μｇ／ｍｌのシクロヘキ シイミドまたは２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを０、５、１０、１８および ２４時間に添加した。次いで細胞をエタノール中の５％酢酸で固定した。各ウェ ル中の樹枝状細胞を、細胞の形状に基づいて、マニュアルで、あるいは倒立顕微 鏡上の像により計数した。 いずれかのインヒビターの存在下に、ＡＢＨＡに対して応答して形成した樹枝 状細胞の数は８０％減少した。したがって、ＡＢＨＡ誘導分化はＲＮＡおよびタ ンパク質の双方の合成に依存し、ＡＢＨＡは細胞の機能のインヒビターとしての み作用ばかりでなく、かつまた分化に関係する遺伝子の転写を誘導することが示 唆される。実施例４ リポーター遺伝子のにより測定されたＡＢＨＡ誘導転写の変化 ある範囲のリポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞のクローン を使用して、細胞周期のコントロールに関係する特異的遺伝子のプロモーターに 対する分化因子の作用を直接的に試験した。いくつかの場合において、感受性Ｍ Ｍ９６Ｌ細胞および比較的耐性のＨｅＬａ細胞においてＡＢＨＡの転写作用をま た比較した。 結果を表４に示す。 結果は第２細胞のクローンを使用して確証された。２４時間のＡＢＨＡ処理は ｃ−ｆｏｓおよびＳＶ４０プロモーターの活性を増加させたが、等毒性レベルの ＨＭＢＡおよびアゼライン酸は低い作用を有するか、あるいは阻害性であった。 試験したすべての化合物は、６時間または２４時間の処理後、ＴＲＰ−１プロモ ーターを阻害した。 ある場合において、感受性ＭＭ９６Ｌ細胞は、ＨｅＬａ細胞と比較して、ＡＢ ＨＡに対して異なる応答を与えた。ＭＭ９６Ｌは２４時間の処理においてｐ５３ 活性化の阻害を示した。ＡＢＨＡを使用する６時間の処理後、ｃ−Ｆｏｓプロモ ーターの活性はＨｅＬａにおいて強く阻害されたが、ＭＭ９６Ｌにおいて阻害さ れなかった。 実施例５ 転写活性に対する作用 ａ）メタロチオネインプロモーター ヒツジメタロチオネインＩａプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼを含有 するｐ２９４ＭｅｔＭ３を使用するエレクトロポレーション、引き続くヒグロマ イシンで安定にトランスフェクトされたクローンの選択（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ ．、１９９４）により、ＭＭ９６Ｌ細胞およびＨｅＬａ細胞をトランスフェクし た。リポーターのアッセイのために、細胞をマイクロタイタープレートにおいて 播種し（５×１０⁴／ウェル）、次の日に処理した。培地を取出し、本質的に前 に記載されたように（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、基質としてクロロ フェノールレッドガラクトシドを使用して、ＥＬＩＳＡリーダーにより５７０ｎ ｍにおいて、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 ＭＭ９６Ｌ細胞の６つの安定にトランスフェクトされた、混合クローン（ＭＭ ９６Ｌ−ｇａ１）におけるメタロチオネインプロモーターの亜鉛誘導活性はＡＢ ＨＡに対して高度に感受性であり、１μ ｇ／ｍｌの薬剤で５時間処理した後、増強が検出された。結果を第５Ａ図に示す 。６つの混合ＨｅＬａ−ｇａ１クローンの投与量応答は逆の応答を示し、１０μ ｇ／ｍｌのＡＢＨＡにおいて対照の４０％に阻害された。一時的にトランスフェ クトされた細胞を使用したとき、同様な傾向が見出された。９６Ｌ−ｇａ１細胞 を１０μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで２４時間処理し、洗浄し、次いで亜鉛で５時間誘 導したとき、また、活性が増加し（１８１±１３％）、亜鉛の細胞の中への輸送 によりＡＢＨＡは作用していないことが示された。ＰＫＣインヒビターのカルホ スチンＣ（０．５μｇ／ｍｌ）またはビスインドリルマレイミド（１μｇ／ｍｌ ）に対する暴露により、亜鉛活性のＡＢＨＡ増強は阻害されなかった。 ｂ）ＳｐｈＩ含有プロモーター ＳＶ４０および哺乳動物の遺伝子プロモーターの一部分を形成するモチーフに 関連して、ＡＢＨＡおよびＡＡＨＡによる遺伝子活性化のいっそう劇的な例が見 出された。ある範囲の異なるプロモーター構築物は、第５Ｂ図に図解するように 、この活性化にＳｐｈＩ配列（ＡＡＧ ＣＡＴ ＧＣ）が要求されることを示し た。活性化は試験したすべてのヒストンデアセチラーゼインヒビターを使用して 起こったが、第５Ｃ図に図解するように、腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、を 過度に発現する細胞においてのみ観測された。この発見は、このような薬剤によ り活性化される哺乳動物の遺伝子の範囲を同定することに関係する。 ｃ）ＤＮＡのメチル化 これらの化合物は、また、ＤＮＡのメチル化を阻害し、こうして感受性または 耐性の細胞における遺伝子の発現を調節する、補助的メカニズムを提供する。Ａ ４／４細胞系統は２９３細胞の誘導体であり、これは表２に示すＡＢＨＡおよび ＡＡＨＡに対して感受性で あることが示された。ＤＮＡメチル化によりサイレント化されたリポータープラ スミドで、Ａ４／４細胞をトランスフェクトした。脱メチル化剤（５−アザシチ ジン；Ｂｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９２）を使用する処理は細胞分裂後の娘 鎖のＤＮＡ再メチル化を阻害し、これによりβ−ガラクトシダーゼとして検出さ れた、リポーター活性の回収を可能とする。Ａ４／４細胞を４０時間処理すると 、表５に要約するように、リポーター活性は実質的に増加した。 実施例６ 異種移植された黒色腫のｉｎ ｖｉｖｏ増殖の阻害 黒色腫細胞系統ＭＭ９６Ｌの異種移植片を、ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ ）マウスにおいて確立させた。４ｍｇ／日の投与量の本発明の化合物で、マウス の１つのグループを腹腔内注射により処理した。化合物の制限された供給のため に、投与量は５／７日／週でのみ投与することができた。第６図に示すように、 対照の未処理マウスに比較して黒色腫の増殖はＡＢＨＡ、ＡＡＨＡおよびＳＢＨ Ａを使用する処理により有意に阻害された。これは特に注目に値する。なぜなら 、黒色腫細胞系統ＭＭ９６Ｌは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの双方 において、慣用の抗腫瘍剤による処理に対して耐性であるからである。事実、我 々が知るかぎりにおいて 、これらはこの細胞系統の増殖を阻害することが証明された最初の化合物である 。対照的に、ＴＳＡおよびＨＣ−トキシンは、使用した投与量がＡＢＨＡの同等 の投与量よりも５〜１０倍より高かったが、不活性であった。 第４０日になお生存してる小さい腫瘍から培養した細胞は化合物に対してまだ 感受性であり、より高い投与量を使用できることを示した。投与した投与量はよ く許容され、そして明白な毒性の徴候は検出されなかった。ＡＢＨＡは検出可能 な置換基をもたず、そしてヒドロキサメートはｉｎ ｖｉｖｏにおける代謝に対 して非常に安定である。これは実施例９においてさらに論考される。 実施例７ リポーターのマッピングおよび薬剤構造の最適化 我々のグループ内で、および他のグループ（ＬｏｆａｓおよびＪｏｈｎｓｓｏ ｎ、１９９０）により、多数のヒドロキサメート化合物が合成されてきている。 リポーターの遺伝地図作製するために、我々は化合物の２つの極性末端の間の距 離の要件を検査すること集中した。こうして、炭素鎖の長さを変化させ、剛性ス ペーサー、例えば、５におけるように芳香族環およびシンナミル基で置換する。 Ｒ₁またはＲ₂はＨ、アルキル、およびその他である。 Ｒ₃はＮＯ₂、ハロゲン、ＮＨ₂、ＯＨ、およびその他である。 活性化合物（灰色）および不活性化合物（白色）の構造のオーバーレイは、第 ８図に描写されており、これらの２つのクラスについてアクセス可能な三次元の 空間の大きい差を示す。各場合において 、１つのヒドロキサメート部分は緊密に重ねられているが、この分子の残部は自 由に動く。活性化合物は第２ヒドロキサメート（またはカルボニル）と密接な配 列で緊密なクラスターを形成し、そして主鎖は緊密にパックされている。対照的 に、不活性な系列は第２ヒドロキサメート（またはカルボニル）ジオメトリーの 異なる配列を形成する。この地図の主要な特徴は化合物の２つの末端の相対的位 置であり、これの末端は活性化合物および不活性化合物について異なる位置にあ る。 この薬作用発生団の初期の開発以来、有意な主鎖の分岐または置換は基本的構 造の中に組込まれてきた。２つの末端の結合ジオメトリーを維持するが、それら の大きさおよび置換のパターンが変化する、１系列の化合物を合成して、レセプ ターの結合のための空間的要件を定めてきた。 ペプチドをベースとする化合物および炭化水素をベースとする化合物の双方を 合成することによって、この目的は達成された。 ペプチドをベースとするモノヒドロキサメートライブラリー Ｒ₁＝Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ₃；Ｃｌ；Ｂｒ；ＮＯ₂；Ｎｍｅ₂；およびその他。 Ｒ₂およびＲ₂はＤまたはＬ−アミノ酸の側鎖である。 非ペプチドをベースとするモノヒドロキサメートライブラリー Ｒ₁＝Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ₃；Ｃｌ；Ｂｒ；ＮＯ₂；Ｎｍｅ₂；およびその他。 Ｒ₂およびＲ₂はＤまたはＬ−アミノ酸の側鎖である。 Ｒ₂およびＲ₂はＤまたはＬ−アミノ酸の側鎖である。 ペプチドをベースとするビスヒドロキサメートライブラリー活性であることが 見出された好ましいは、次の通りである：ＡＡＨＡ（優先権の出願において前に Ｍｋ−４と表示された）ＳＢＨＡ ＨＯＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₆−ＣＯ−ＮＨＯＨ ＭＷ２７９６ ＭＷ２９９６ ペプチドをベースとする化合物は１つ、２つまたは３つのアミド結合をリンカ ー内に取込み、剛性の平面の拘束として作用し、ならびにインヒビターの主鎖に 沿った水素結合の相互作用をプロービン グする。これらの拘束に加えて、アミノ酸側鎖（ＤまたはＬ）の付加はレセプタ ー内の立体的ならびに疎水性の水素結合および電荷−電荷の相互作用をプロービ ングする。 実施例９ 二次元電気泳動 予備的結果は、前述したようにして得られた、二次元ゲル電気泳動のパターン の比較を使用してサブトラクション地図を発生させて、本発明の化合物で処理さ れた細胞の中に存在するが、未処理細胞の中に存在しないタンパク質を同定でき ることを示した。正常のＮＦＦ細胞のサブトラクション地図を使用して、定性的 差が確証された。処理および未処理のＭＭ９６Ｌ細胞の二次元電気泳動のパター ンの比較は、第７Ａ図および第７Ｂ図に示されている。多数の細胞系統からの試 料を、ＡＢＨＡで１６時間処理した後、細胞質ゾルのタンパク質から抽出した。 抽出物を一次元ゲル上で電気泳動させ（第７Ｃ図）、次いでＭＭ９６Ｌライゼイ トの試料（対照（Ａ）および１００μｇ／ｍｌのＡＢＨＡで処理した（Ｂ））を ｐＨ３〜１０の等電点電気泳動ゲル上の二次元電気泳動にかけ、次いで８〜１８ ％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の二次元電気泳動にかけた。増加または新 しいパターンを充実矢印で示し、そして低下を白色矢印で示す。 観測されたタンパク質抽出の変化はバンドを同定するために十分に大きく、耐 性細胞との比較により、一次元タンパク質ゲル上において、感受性細胞に関係づ けられる。これは第７Ｃ図において図解されている。我々がウェスタンブロット により自己抗原Ｋｕ８６として同定した１つの候補は、感受性細胞において高度 に発現され、そして、第７Ｄ図に示すように、ＡＢＨＡ処理によりさらに増加さ れる。細胞質の抽出物から、または細胞質の膜および核からの２５μｌの細胞ラ イゼイトを各レーンに負荷した。ウェスタンの転移後 、細胞をＫｕ８６ペプチドと反応するモノクローナル抗体ＯＶ９ＤＩと反応させ た。 これはアプローチは、上に示したペプチドのライブラリーのために１６００程 度に多い化合物を発生することができる。最初に、２０〜３０の化合物を合成し てレセプターの空間をプロービングした。多数のピンをベースとする組合わせの 化学的アプローチにおいて標準的固相ペプチド合成のプロトコールを使用して、 これらのフォーカスされたライブラリーを調製する。これらのライブラリーを使 用して得られた初期の結果に基づいて、それ以上の化合物を引き続いて作って相 互作用および薬理学的プロフィルを最適化する。 実施例９ 炭化水素のライブラリー 溶液有機合成と組合わせ非ペプチド合成との組合わせ（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ ｅ ｔ ａｌ．、１９９６）を使用して、炭化水素のライブラリーを調製することが できる。 芳香族化合物（例えば、実施例６における５）は、それらのペプチドの対応化 合物よりも剛性の主鎖を有する。芳香族環上の置換基は追加の立体的拘束を付与 する。ペプチドの系列において、いくつかの主鎖の再編成は好ましくない立体的 相互作用を軽減するが、これは一般に置換された芳香族化合物に当てはまらない 。結局、これらの芳香族化合物はいっそう正確であるが、また、活性のための立 体的要件のいっそう制限された描写を提供する。１系列の１２５までの化合物（ ３位置、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃の各々における５つの置換基）を第１の場合において製 造した。これらの化合物を普通の溶液化学により製造し、分光学的に特性決定し た。 ２つのヒドロキサム酸基の要件をまた研究した。最近の報告（Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９６）において、モノヒドロキサメート６（その構造は前に 示された）は、細胞の分化の誘導におい てＡＢＨＡと同様に有効であることが報告された。我々はこの化合物を正常細胞 を超えた腫瘍細胞に対する選択性について試験した。我々の初期の結果は、６が ＡＢＨＡと同様にＧ１のＳ期への移行を阻害することを示した。６がヒト細胞に ついてＡＢＨＡに匹敵する選択的細胞障害性を示す場合において、前述のそれら に類似する、１つのヒドロキサメートが変化する、１系列の２０〜３０の化合物 を下記において説明するように検査した。 ６およびＡＢＨＡに構造的に類似する、３つの化合物のクラスは、実施例６に 記載する理由で、この薬剤の誘導を最適化することにおいて重要であることがあ る。これらはモノヒドロキサメートバチマスタット７をベースとする（Ｂｒｉｔ ｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。モノヒドロキサメートバチマスタット ７は、ＡＢＨＡと比較したとき、正常細胞よりも腫瘍細胞に対して選択的ではな い。 これらのフォーカスされた組合わせライブラリーを使用して、分化因子の次の 世代の顕著な特徴を同定し、そして選択性を犠牲にしないで１０〜１０００倍の 活性の増加が得られた。これらの研究からの情報を組合わせると、効力のある、 選択的な分化因子を開発することができ、後述するように、これらの分化因子を 改良された生物学的利用について洗練させ、細胞ライゼイトから１またはそれ以 上のターゲットタンパク質を抽出するために使用することができる。 実施例１０ 選択性の評価 ａ）細胞障害性 実施例１において使用した細胞系統のパネルを使用して、広い範囲の薬剤のス クリーニングを実施した。他の正常細胞（好中球；好酸球；マクロファージ；Ｂ リンパ球）、形質転換された細胞系統および他の癌細胞系統（結腸および乳房の 腫瘍細胞）を、適当ならば、それ以上の評価のために使用する。これらの追加の データにより、各化合物についての細胞障害性の詳細な選択性のプロフィルを解 明することができる。ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニングのための候補の選択の指 針として、実施例１における結果と同様な結果を使用する。 ｂ）金属プロテアーゼの阻害 マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、細胞外マトリックスの主要な 成分を分解するＺｎ／Ｃａ酵素の１ファミリーである。最も悪性の腫瘍は高い濃 度のＭＭＰｓを産生する。ＭＭＰｓの過度の発現および活性化は、金属プロテア ーゼ（ＴＩＭＰｓ）の組織のインヒビターにより自然に阻害されるが、組織の分 解を生ずる不均衡を引き起こす。ＭＭＰｓは悪性腫瘍の増殖および拡大において 重要であると広く考えられており、そして、また、慢性疾患、例えば、関節炎お よび多発性硬化症に関連づけられてきた（Ｂｅｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９ ９６）。７および８のような化合物は非選択性の広いスペクトルのＭＭＰインヒ ビターであるが、モデルにおける転移、血管形成および腫瘍の進行の広がりまた は増殖を防止または減少させることが見出された（Ｂｅｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ ．、１９９６）。ヒト卵巣癌腫のネズミ異種移植モデルにおける腹 膜腔の中に形成する悪性腹水に対して、７の腹腔内投与は有効であった。しかし ながら、これらの化合物は多数の金属酵素を阻害し、少なくともいくつかの正常 細胞ならびにある種の腫瘍細胞に対して細胞障害性である。 本発明の化合物は、７およびより有望な８のようなヒドロキサメートの既知の 抗腫瘍特性を有するので、金属プロテアーゼアッセイにおいて試験する。 本発明のいかなる化合物についても、ＭＭＰ活性の有意な阻害は観察されなか った。 ｃ）ヒストンの過アセチル化の阻害 真核ゲノムの基本的単位はヌクレオソームであり、ヌクレオソームはヒストン オクタマーの回りに巻かれたＤＮＡから構成されている。ヒストンはＬｙｓ残基 のε−アミノ基上で可逆的にアセチル化される。アセチル化されたヒストンとＤ ＮＡとの間の相互作用は遺伝子工学にとって重大であると考えられる（Ｗｏｌｆ ｆｅ、１９９６）ので、ヒストンのアセチル化の調節は転写に影響を与えること を期待することができる。 最近の遺伝的、生化学的および免疫学的証拠が示唆するように、転写された遺 伝子を含むヒストンは非転写領域からのヒストンよりもいっそう高度にアセチル 化される（Ｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。ヒストンデアセチラー ゼのインヒビターはヒスト ンのアセチル化レベルを増加するであろう。ミリモルの範囲の濃度において、弱 い分化因子、ブチレート（１）は、ヒストンのアセチル化を阻害することが知ら れており（Ｋｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９９３）、過アセチル化されたヒス トンの細胞内蓄積を誘導する。分化および細胞周期の停止は多分ヒストンの過ア セチル化のためであろう。 前述するように、ＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞を使用して、ヒストンの過アセチル化 を検査した。結果は第９図に図解されており、そして第９Ａ図は細胞を１００μ ｇ／ｍｌの投与量のＡＢＨＡに２４時間暴露した後、ヒストンＨ４のアセチル化 が増加することを示す。これはヒストンデアセチラーゼの阻害から生ずると我々 は考える。 時間経過（第９Ｂ図）が示すように、アセチル化は処理の２時間以内に増加し 、次いで、薬剤を除去した場合、次の２４時間にわたって減衰する（第９Ｃ図） 。反復した実験において、表６に示すように、ヒドロキサメート感受性および耐 性の細胞の間において主要な差は見出されなかった。 実施例１１ ヒドロキサメート感受性細胞における全長のＲｂＡｐ４８の低い 発現 細胞ライゼイトのウェスタンブロットにおいて、ヒドロキサメート感受性細胞 は、第１０Ａ図に示すように、タンパク質ＲｂＡｐ４８と表示する網膜芽細胞腫 タンパク質に結合できる低分子量の形態のタンパク質を発現し、および／または 、表７に示すように、低いレベルの全長のＲｂＡｐ４８を発現することが示され た。 種々の異なる腫瘍細胞を試験した。感受性との関連性は感受性細胞と耐性細胞 との間の細胞のハイブリッドにおいて確証された。細胞のハイブリッドは、感受 性の相手のＲｂＡｐ４８パターンを発現 し（第１０Ｂ図）、そしてＡＢＨＡによる殺しに対して感受性であった。したが って、ヒドロキサメート感受性がヒト腫瘍細胞における優性の陰性表現型である ことを我々は示した。 実施例１２ ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性 実施例５に記載するｉｎ ｖｉｖｏプロトコールを使用して、ヌードマウスに おけるヒト黒色腫細胞系統（ＭＭ９６Ｌ）、卵巣癌細胞系統（ＪＡＭ）、子宮頸 癌（ＨｅＬａ）、およびＣ５７マウスにおけるＢ１６マウス黒色腫の異種移植に 対する異なる投与量の本発明の化合物の効能を試験した。ＡＢＨＡよりもすぐれ た活性のｉｎ ｖｉｖｏプロフィルを有する化合物を同定するために、非常にい っそう効力がありかつ選択性であることが期待される誘導体の比較的評価に、こ れらの初期の実験の結果が使用されてきた。０〜４のＬｏｇＰｓ（オクタノール 溶解度／水溶解度）、および多分代謝および毒性に基づいて、どの化合物が試験 するために適当であるかについて、多少の選択を実施する。詳細な投与量応答曲 線が最も有望な化合物について得られた。また、最も活性な化合物を、既知の抗 腫瘍因子を使用する組合わせ療法において、相乗性および交差結果について試験 した。 ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴＳＡおよびＨＣ−トキシンの活性の欠如は、培養し た細胞とインキュベートしたとき、それらの殺し作用の不活性化と相関すること を我々は示した。これは第１１図に図解されている。肝臓および腎臓の代謝はこ こで使用する培養した細胞のそれよりもさらにいっそう活性であることが期待さ れるので、これらの薬剤はより高い投与量においてさえｉｎ ｖｉｖｏで有効で ありそうにない。この発見と対照的に、ＡＢＨＡにより例示される、本発明の方 法において有用な化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて安定である（第１１図） と同時にｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性で ある（第６図）。 実施例１３ 薬理学的プロフィルの最適化 ａ）細胞の吸収 化合物が療法的効果を示すためには、化合物は細胞膜を貫通することが必要で ある。分配係数（ＬｏｇＰ＝オクタノール溶解率％／水溶解率％）はコンピュー ターのソフトウェアを使用して設計期の間に予測される。次いでＬｏｇＰ値を逆 相ＨＰＬＣにより実験的に測定する。一般に、化合物は０〜４のＬｏｇＰ値を有 するか、あるいは吸収（例えば、アミンポンプ、およびその他による）を促進す ることが知られている置換基を有することが望ましい。 ｂ）生物学的利用率 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて十分に効力がありかつ選択的であることが見出され 、そしてマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍剤として有望性を示す化合物を 、動物における生物学的利用能について評価する。単一の投与量の薬剤（１０ｍ ｇ／ｋｇ）を平行実験において静脈内および経口的に２００〜２５０ｇのＳＤラ ットに投与する。血清をサンプリングし、次いでパラメーターｔ１／２、Ｔｍａ ｘ、Ｃｍａｘ、Ｆ％を計算する。非常に有望な候補について、同様な方法に従い 、それ以上の試験をイヌにおいて実施する。 実施例１４ 非ペプチドインヒビターＡＡＨＡの合成 アゼライン酸（２０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）を含有する５００ｍｌの丸底フラス コに、２５ｍｌの塩化チオニルを添加した。空気冷却器を勘合させ、混合物を３ ０分間還流させ、次いで過剰の塩化チオニルを真空除去すると、二酸塩化物の残 留物が得られた。 上で製造した二酸塩化物を含有する５００ｍｌの丸底フラスコに 、アニリン（１０．６５ｍｌ、１１７ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１２ ．８５ｍｌ、１１７ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（１００ｍｌ）を含有する 溶液を滴下した。添加が完結した後、混合物を室温において２０分間撹拌した。 次いでジクロロメタンを真空除去し、残留物を２００ｍｌの５％水酸化ナトリウ ム中に取り、３×１００ｍｌのアリコートの酢酸エチルで抽出した。塩基性層を 除去し、６ＭのＨＣｌで酸性化し、３×１００ｍｌのアリコートの酢酸エチルで 抽出した。酢酸エチル抽出液を一緒にし、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮すると、 アニリドが得られた。粗生成物１．９３ｇ（６．９％）をそれ以上精製しないで 次の工程において使用した。ＮＭＲおよび質量分析は所望の生成物と一致した： 乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）中に溶解したアニリドを含有する５０ｍｌの丸底フラ スコに、Ｎ−メチルモルホリン（０．０９２ｍｌ、０．８５ｍｍｏｌ）およびイ ソブチルクロロホルメート（０．１１０ｍｌ、０．８５ｍｌ）を添加した。混合 物を１０分間撹拌し、次いでヒドロキシルアミン塩酸塩（５８．２ｍｇ、０．８ ５ｍｍｏｌ）、エタノール（１０ｍｌ）および５％水酸化ナトリウム（０．９４ ｍｌ）を添加した。さらに１０分後、ＴＨＦを真空除去し、残留物を１００ｍｌ の１ＭのＨＣｌ中に取り、３×３０ｍｌのアリコートのジクロロメタンで抽出し た。有機抽出液を一緒にし、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮すると、１３０ｍｇの 粗製物質が得られ、これを逆相ＨＰＬＣにより精製すると、１５ｍｇ（７．１％ ）の所望のヒドロキサム酸が得られた： 実施例１５ ペプチド類似体（Ａ）の合成 ジクロロメタン（２０ｍｌ）中のＢｏｃ−フェニルアラリン（１ｇ、３．７７ ｍｍｏｌ）およびグリシンエチルエステル塩酸塩（１．１６ｇ、８．２９ｍｍｏ ｌ）撹拌した溶液に、ベンゾトリアゾル−１−イルオキシートリス（ジメチルア ミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）（１．８４ｇ、４． １７ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＮ−メチルモルホリン（０．７９６ｍｌ、８． ２９ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後、混合物を１００ｍｌの分液漏斗に添加し 、３×３０ｍｌの１ＭのＨＣｌおよび３×３０ｍｌの飽和重亜硫酸ナトリウム溶 液で抽出した。有機層をシリカゲルのプラグに通過させ、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し 、濃縮すると、保護されたジペプチド９１０ｍｇ（８１．３％）が得られ、これ をそれ以上精製しないで次の工程において使用した。ＮＭＲおよび質量分析は所 望の生成物と一致した： ＤＭＦ（３ｍｌ）中の上で製造したジペプチド（４３３ｍｇ、１．５１ｍｍｏ ｌ）およびｐ−クロロ安息香酸（５２１ｍｇ、３．３３ｍｍｏｌ）の撹拌した溶 液に、ＢＯＰ（１．４７ｇ、３．３３ｍｍｏｌ））を添加し、次いでＮ−メチル モルホリン（０．７２５ｍ１、７．５５ｍｍｏｌ）を添加した。６０分後、ＤＭ Ｆを真空除去 し、残留物をジクロロメタン（４０ｍｌ）中に溶解し、３×３０ｍｌの１ＭのＨ Ｃｌおよび３×３０ｍｌの飽和重亜硫酸ナトリウム溶液で抽出した。有機層をシ リカゲルのプラグに通過させ、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮すると、アシル化さ れたジプチド５７４ｍｇ（９７％）が得られ、これをそれ以上精製しないで次の 工程において使用した。ＮＭＲスペクトル分析により、所望の生成物の存在が確 証された。 上で製造した保護されたジペプチド（５３０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を、室 温においてジオキサン／ＨＣｌとともに３０分間撹拌した。次いでジオキサン／ ＨＣｌを真空除去し、粗製の、脱保護されたジペプチドそれ以上精製しないで次 の工程において使用した。ＮＭＲスペクトルにより、成功した脱保護が確証され た： ＤＭＦ（３ｍｌ）中の上で製造した脱保護されたジペプチド（４３３ｍｇ、１ ．５１ｍｍｏｌ）およびｐ−クロロ安息香酸（５２１ｍｇ、３．３３ｍｍｏｌ） の撹拌した溶液に、ＢＯＰ（１．４７ｇ、３．３３ｍｍｏｌ））を添加し、次い でＮ−メチルモルホリン（０．７２５ｍｌ、７．５５ｍｍｏｌ）を添加した。６ ０分後、ＤＭＦを真空除去し、残留物をジクロロメタン（４０ｍｌ）中に溶解し 、３×３０ｍ１の１ＭのＨＣｌおよび３×３０ｍｌの飽和重亜硫酸ナトリウム溶 液で抽出した。有機層をシリカゲルのプラグに通過させ、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し 、濃縮すると、アシル化されたジプチド５７４ｍｇ（９７％）が得られ、これを それ以上精製しないで次の 工程において使用した。ＮＭＲおよび質量分析は所望の生成物と一致した。 上で製造したアシル化されたジペプチド（５７４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を 、水酸化リチウム（１２５ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を含有する５０％ＴＨＦ／ 水の溶液とともに３０分間撹拌した。次いでＴＨＦを真空除去し、水（４０ｍｌ ）を残留物に添加した。濃ＨＣｌで酸性化した後、白色沈澱を濾過し、乾燥し、 それ以上精製しないで次の工程において使用した。ＮＭＲスペクトルにより、遊 離酸の存在が確証された： Ｎ−メチルモルホリン（０．１１３ｍ１、１．０３ｍｍｏｌ）およびイソブチ ルクロロホルメート（０．１３３ｍｌ、１．０３ｍｌ）を含有する乾燥したＴＨ Ｆ５ｍｌ中に、上で製造した酸（３３７ｍｇ、０．９３４ｍｍｏｌ）を溶解した 。次いで、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１３０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、ＴＨ Ｆ（５ｍｌ）および５％水酸化ナトリウム（１．５ｍｌ）を含有する溶液をワン ショットで添加し、生ずる反応混合物をさらに１５分間撹拌した。次いでＴＨＦ を真空除去し、水（２０ｍｌ）を残留物に添加した。 １ＭのＨＣｌで酸性化した後、白色沈澱を濾過し、フラッシュクロマトグラフィ ー（２０％ジクロロメタン／酢酸エチル）にかけると、所望のペプチド類似体Ａ が得られた。この生成物の構造および純度はＮＭＲおよび質量分析により確証さ れた。 実施例１６ 抗寄生体活性 ３つの異なる型の単細胞寄生体に対する本発明の化合物の活性を検査した。選 択した微生物はギアルディア・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａ ｌｉｓ）［また、ギアルディア・ラムイア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ） として知られている］、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）およびプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）であった。 種々の濃度の薬剤の存在および非存在において、１０％ＦＣＳを補充したＴＹ Ｉ／Ｓ培地中で、ギアルディア・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎ ａｌｉｓ）微生物を成長させた。重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）系統の１つで あるＷＢＩＢ−Ｍ３はメトロニダゾール耐性系統であり、３６μＭのメトロニダ ゾールを含有する培地中で維持した。培養物を数日間維持したとき、生きている 寄生体が存在しない、薬剤の最低濃度として、最小致死量（ＭＬＣ）をアッセイ した。結果を表８に示す。 上記表から明らかなように、ＡＢＨＡは重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）のす べての系統およびトリコモナス類（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）に対して有効であ り、ＭＬＣは野生型系統についてよりもメトロニダゾール耐性系統についてなお いっそう低い。試験した本発明の他の化合物のうちで、ＡＡＨＡはＡＢＨＡのそ れと同一の大きさのＭＬＣを有したが、ＭＷ２９９６についてより高かった。し かしながら、ＭＷ２７９６は非常により低かった。それ以上の比較として使用し たＴＳＡは、特に低いＭＬＣを有した。 重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験するため に、１５μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．３中の１０⁵のトロフォゾイトの投与量を使用 して、３日齢の哺乳するマウスにギアルディア・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）系統１０６を注射した。注射後第７日および第８日に 、２５０μｇのＡＢＨＡまたはＳＢＨＡ、および２６５μｇのメトロニダゾール を使用して、マウスに薬剤を与えた。対照について第９日に、被験マウスについ て第１０日に、ギアルディアを収獲した。ギアルディアが感染したマウスの小腸 を切除し、縦方向にストリッピングし、氷冷ＰＢＳの中に３０分間保持し、激し く撹拌し、次いで血球計で寄生体を計数した。表９に示すように、ＡＢＨＡおよ びＳＢＨＡの双方は腸内のギアルディア寄生体の殺しにおいて有効であった。投 与量および処置の養生法は多分最適でなかったという事実にかんがみて、これら の薬剤はこれらの寄生体に対する療法において慣用されているメトロニダゾール より優れていた。 マラリアの最も苛酷な形態の原因となる生物である、プラスモディウム・ファ ルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対するｉｎ ｖ ｉｔｒｏ活性を評価するために、マラリアのトロフォゾイトの連続希釈物を赤血 球中で薬剤の存在および非存在下におよび³Ｈ−ハイポキサンチンの存在下に３ ７℃において４８時間成長させた。実験の１つのグループにおいて、ピリメタミ ンを使用する慣用の療法に対して耐性の寄生体を使用した。次いで赤血球を収集 し、寄生体の成長の阻害百分率を³Ｈ−ハイポキサンチンの取込みの程度から計 算した。結果を表１０に示す。値は、未処理対照と比較したとき、寄生体の５０ ％を殺すために要求される薬剤の量を表す。 マラリア寄生体もまた本発明の化合物に対して高度に感受性であることが明ら かである。再び、慣用の抗マラリア因子に対して耐性の系統は本発明の化合物に 対して感受性であることを理解することができる。細胞培養において安定な薬剤 を使用する最良の結果は、ＳＢＨＡを使用して見られた。比較としてまた使用し たＴＳＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｎｇ／ｍｌの範囲において有効であったが 、抗腫瘍研究において見出されたように、それはｉｎ ｖｉｖｏにおいて不活性 であることが期待されるであろう。 ｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験するために、表１０において最良の結果を与える本 発明の化合物であるＳＢＨＡを、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓ ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）による感染に対してマウスを保護する能 力について試験した。マウスに鍔、トロフォゾイトおよびシゾントの混合物（２ ００μｌのＰＢＳ中の１０⁶）を腹腔内注射し、次いで２時間後、別の群に０． ５ｍｌのＰＢＳ中の４ｍｇのＳＢＨＡまたは０．２ｍｇのクロロキンまたはＰＢ Ｓ単独（対照）を与えた。第２組の群に、感染後４８時間に、同一の投与量のＳ ＢＨＡを与えた。すべての群において、処置を１日２回１２時間の間隔で３日間 続け、対照マウスを安楽死しなくてはならなくなったとき、第１０日に寄生体血 症のスコアを付けた。結果を表１１に示す。これらが明瞭に示すように、ＳＢＨ Ａは、感染後２時間または４８時間のいずれにおいても、非常に効力がある慣用 の抗マラリア剤であるクロロキンの効能に匹敵する効能を有した。 論考 ＡＢＨＡは、ＨＭＢＡよりも、ヒト黒色腫に対してかなりいっそう効力がある 。しかしながら、正常細胞と比較して腫瘍細胞に対す る高度の選択率はさらに驚くべきことである。この差は単に細胞周期の速度にお ける差から生じなかった。 広い範囲の腫瘍細胞の型はＡＢＨＡおよびＡＡＨＡに対して感受性であり、組 織特異的である分化メカニズムがこれらの因子の主要なターゲットではないであ ろうことを示す。活性は形質転換されたケラチノサイト（Ｃｏｌｏ １６および ＨＡＣａｔ）に対して証明されたので、本発明は高増殖性ケラチノサイト、例え ば、乾癬および日光性角化症およびその他を包含する症状の治療に適用可能であ る。 さらに、ＡＢＨＡ感受性腫瘍系統ＭＭ９６Ｌは、ある種の遺伝子、特にメタロ チオネインおよびＳｐｈＩの転写活性化において、耐性系統との主要な差を示し た。 第１図に示すように、樹枝状の形態の増強はＡＢＨＡにより分化の誘導につい て見出された唯一の証拠であった。黒色腫細胞について、これはそれらの神経堤 由来に関係づけることができる。色素沈着経路において、ＴＲＰ−１およびＨＭ Ｂ−４５タンパク質の低下およびチロシナーゼ活性の減少はＡＢＨＡが分化因子 として作用することを示した。これが少なくとも一部分において転写レベルで起 こるということは、ＴＲＰ−１リポーター活性の低下および、ＨＭＢＡの前の研 究（Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｖｉｊａｙａｓａｒａｄｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９５；Ｖｉｊａｙａｓａｒａｄｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１） において、ＴＲＰ−１メッセージおよびタンパク質の低下により示唆された。Ｓ Ｖ４０プロモーター／エンハンサーはＴＰＡに対して応答し、こうしてこの構築 物中のＡＰ−１部位はＡＢＨＡにより影響を受けることがある。これらのプロモ ーターおよびＨＩＶ−ＬＴＲ配列中の応答因子の変動性（Ｅｄｗａｒｄｓ、１９ ９４）は、感受性細胞における活性化に 対する特異性の欠如とともに、ＡＢＨＡが、細胞の感受性に関連しない、多数の 作用を発揮できることを示す。 本発明の化合物のいくつかの主要なターゲットは同定された。ある範囲の可能 性を考慮することが必要である。ヒドロキサム酸は亜鉛および他の金属イオンを キレート化する能力を有するが、マトリックス金属プロテアーゼはこれらの化合 物により阻害されない。さらに、メタロチオネインプロモーターの応答は培地か らの亜鉛の吸収の促進から生じなかった。なぜなら、亜鉛誘導前のＡＢＨＡを使 用する処理もまた有効であったからである。黒色腫細胞におけるＡＢＨＡによる メタロチオネインリポーターの活性化は、非常に低い効力の分化因子であるブチ レートについて示唆されるように（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、１９９２）、ｃ−ｆ ｏｓを包含するある範囲の遺伝子の転写を増強するが、ＴＲＰ−１およびｐ５３ により活性化された遺伝子を表示する、クロマチン構造の変化から生ずることが ある。ＤＮＡの脱メチル化はある種の細胞においてメタロチオネインプロモータ ー活性を増強する（Ｂｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９２）が、この研究におい てＡＢＨＡに対する急速な転写応答および５−アザシチジンに対するこの応答の 不感受性により排除された。メタロチオネインプロモーターの応答はＨｅＬａお よび黒色腫細胞の間の生存率の差を平行させ、そして、細胞の増殖の選択的阻害 に必ずしも関係しないが、本発明の化合物によりターゲットされる分子の型の同 定を促進することがある。このプロモーターはＳｐ−１結合部位に類似するＧＣ に富んだモチーフを含有する；したがって、このようなシグナルのトランスダク ション経路における１またはそれ以上のステップは黒色腫細胞において異常であ ることがある。メタロチオネインそれ自体は、金属イオンのホメオスタシス（Ｈ ａｍｅｒ、１９８６）およびＰＫＣの調節（ＯｕおよびＥｂａｄｉ 、１９９２）を包含する、細胞のシグナリングにおいていくつかの役割を演じ、 多分細胞周期の調節の変更に導く。 ＨＭＢＡで処理したネズミ赤白血病細胞において見出されたように（Ｋｉｙｏ ｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、ＡＢＨＡは１２時間処理した黒色腫細胞 においてｐＲＢの小さい増加を誘導した。より重要なことには、ＭＭ９６Ｌ細胞 において観察されたＧ１ブロックと一致して、ｐＲＢは後の時間に持続したが、 ｐｐＲＢレベルが増加したネズミ赤白血病細胞（Ｋｉｙｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ ．、１９９４）と対照的に、ｐｐＲＢは減少した。シクリン依存性キナーゼイン ヒビターｐ２１（ＷＡＦ−１）活性はｐＲＢ低リン酸化に関係づけられ、そして ｐ５３依存的および独立的経路により誘導され、これらの経路は黒色腫および他 の形質転換された細胞において異常であることがある（Ｖｉｄａｌ ｅｔ ａｌ ．、１９９５）。他の型の遺伝子の活性化は、処理の結果に間接的に影響を及ぼ すことがある。免疫応答は癌に対する防御の重要な面であると考えられ、我々は ＭＨＣクラスＩの分子の発現の増強を見出し、その増加は、わずかであるが、腫 瘍細胞の完全な排除を促進することがある。 観察された有益な効果について提案されたいかなるメカニズムによっても拘束 されたくないが、本発明の化合物はヒストンの脱アセチル化を阻害し、これによ り、ＤＮＡと相互作用して遺伝子の発現を促進または阻害しかつＤＮＡ転写をモ ジュレートすることができる、アセチル化ヒストンのレベルを増大することを我 々は見出した。ＷＯ９３／０７１４８およびＷＯ９５／３１９７７の開示と対照 的に、ＡＢＨＡを包含する、本発明において有用な化合物は、腫瘍形成細胞の分 化を誘導する最小の能力を有する。 本発明の化合物のすべては、それらが１または２以上のヒストン デアセチラーゼに対して高い親和性を有することができるようにするが、それら を細胞透過性としかつアセチル化／脱アセチル化反応に対して抵抗性とする、種 々の形態において、アセチル化されたリジン（ＲＮＨＣ（ＣＯＲ’）−（ＣＨ₂ ）₄−ＮＨ−ＣＯＣＨ₃）の構造的模倣物であると思われる。特に、ＳｐｈＩ様プ ロモーター誘導遺伝子の転写はこれらの化合物により劇的に活性化されることを 我々は見出した。このような変化は細胞の殺しに必要することがあるが、選択性 のためには不必要である。選択性に関すると、腫瘍細胞に対する選択的細胞障害 性は、タンパク質ＲｂＡｐ４８の低いか、あるいは異常な発現により促進され、 そして正常細胞を保護する細胞周期のチェックポイントの欠如により促進されう ることを我々は示した。これが示唆するように、本発明の化合物はある種の既知 の抗増殖薬剤と組み合わせて使用して、後者の薬剤の腫瘍選択性を増強すること ができる。また、本発明の化合物はｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍に対する免疫応 答を増強するエフェクター分子、例えば、主要な組織適合性複合体の抗原、およ びウイルス関係腫瘍におけるウイルス抗原の発現を誘導することを我々は示唆し 、そしてＩＬ−２を使用する同時の治療はＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（ １９９６）が報告したヒストン脱アセチル化インヒビターによるＩＬ−２発現の ダウンレギュレーションを克服し、こうしてこれらの化合物のｉｎ ｖｉｖｏ抗 癌活性を増強することを我々は示唆する。 黒色腫ＭＭ９６Ｌ細胞の異種移植片は４ｍｇ／日のＡＢＨＡ、ＡＡＨＡまたは ＳＢＨＡの毎日の治療により有意に阻害され、これらはこの細胞系統に対して有 意な活性を示す種類のうちの最初の薬剤である。これは比較的高い投与量である が、他の分化因子、例えば、ブチレートは同様なレベルにおいて鎌状赤血球貧血 の子供を治療 するために臨床的に安全に使用されてきている。転移から確立されたＭＭ９６Ｌ 細胞は突然変異の表現型を有し、現在のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ の抗癌剤に対して耐性であり、新しい抗癌剤を試験するための、厳格ななお多分 実際的なモデルを表す。ＡＢＨＡによる処理に生き残る、小さいマウス腫瘍から 培養した細胞は、この薬剤に対してなお感受性であった。これが示唆するように 、毒性または副作用の明白な徴候は存在しなかったので、より高い投与量のＡＢ ＨＡを与えることさえできるであろう。ＡＡＨＡは、水性リン酸塩緩衝生理食塩 水中で低い溶解度を有するので、ＤＭＳＯ中の溶液として投与され、水酸化アル ミニウムＳＢＨＡはなおより高い溶解度を有した。この研究において最初に検出 されたＴＳＡの代謝は、この薬剤に対するＮＦＦ細胞の耐性を説明しないようで ある。なぜなら、薬剤への暴露は２４時間に制限されたからである。したがって 、ＴＳＡはｉｎ ｖｉｔｒｏのヒストンデアセチラーゼの効力のある特異的イン ヒビターとして広く使用されているが、有用なｉｎ ｖｉｖｏの活性を得るため に、代謝的に安定なインヒビターを必要とすることがある。 ヒストンＨ４のアセチル化は、以前にＴＳＡについて示されたように、ＡＢＨ ＡおよびＡＡＨＡにより、多分ヒストンデアセチラーゼ活性の阻害により、誘導 されることが見出された。これは遺伝子の発現を深遠に変更することを期待する ことができ、そして細胞の毒性が起こるために必要な条件であろう。しかしなが ら、無傷の、感受性および耐性の細胞におけるアセチル化速度および脱アセチル 化速度の現在の比較は、本発明の化合物の毒性を識別するために必要であろう。 他のヒストンの修飾が選択性に関係することがあるか、あるいは薬剤ターゲット の他の型が原因となることがある。 我々は、個々の細胞および感受性細胞と耐性との間のハイブリッ ドの双方において、ＲｂＡｐ４８をＡＢＨＡに対する耐性に密接に関係するタン パク質として同定した。哺乳動物細胞におけるＲｂＡｐ４８の通常の役割はまだ 定められてきていない。酵母におけるＲｂＡｐ４８対応物は、多分ＰＫＡの阻害 を介して、Ｒａｓ−ｃＡＭＰ経路を阻害する。ＲｂＡｐ４８は、また、ＤＮＡ（ ＭＡＲ領域）へのクロマチンのスカホールドまたはマトリックス結合に関係し、 隣接因子から遺伝子を遮断することができるであろう。ヒストンデアセチラーゼ インヒビターのトラポキシンはＲｂＡｐ４８に結合するので、ＲｂＡｐ４８は本 発明の化合物の候補のターゲットである。感受性細胞において、全長のＲｂＡｐ ４８のレベルの減少および／またはトランケートまたは変更した形態との競合は 野生型ＲｂＡｐ４８の機能の喪失に導き、結局、多分ヒストンの過アセチル化と 組み合わせて、サイクリング細胞の生活能力を危うくするであろう。対照的に、 細胞周期の研究およびＤＮＡ合成の選択性阻害により示されるように、薬剤が除 去されるまで、正常細胞をＧ２／Ｍにおいて検査し、次いで正常細胞は周期にお いて安全に存続することができる。これらの発見は、ＡＢＨＡ、ＡＡＨＡ、ＳＢ ＨＡおよびそれらの誘導体を化学療法の組合わせにおいて使用して、特に骨髄お よび消化管における、正常の増殖する細胞を保護することによって、周期特異的 薬剤、例えば、シトシン、アラビノシド、５−フルオロウラシル、メトトレキセ ート、クロロデオキシアデノシン、エトポシド、タキソール（パクリタクセル） 、およびその他を包含する、代謝拮抗物質に対する特異性を提供することを正当 化する。アポプトーシスおよび細胞分裂それ自体の調節は、究極的ヒストンの過 アセチル化から生ずる、ヌクレオソーム構造および電荷の変化に対して高度に感 受性であり、そして変更したＲｂＡｐ４８から発生するクロマチン構造の推定的 変更に対して高度に感受性であることが ある。同一の考察をまた寄生体に適用することができる。 全体的に、我々の結果が示唆するように、大きく増加した効力に加えて、本発 明の化合物は分化因子について先行技術において報告されたよりも、いっそう特 異的な領域の細胞ターゲットを有し、形質転換された細胞および癌細胞に対する 特異性を生ずる。さらに、メタロチオネインおよびＳｐｈＩ転写の活性化、Ｇ２ ／Ｍのブロッキングの低下および全長のＲｂＡｐ４８の発現の減少の我々の同定 は、癌の治療および予後において利用できる、この選択性のマーカーを提供した 。 本発明の化合物により誘導された新形成細胞および形成異常細胞における接触 阻害の低下および細胞形態の変化が示すように、細胞表面の現象、例えば、接着 性分子は、また、それらの選択性作用においてある役割を演ずることができる。 従来知られている抗癌剤よりすぐれた本発明の化合物の利点は、次の通りであ る： １．正常細胞に比較してヒトの形質転換された細胞および癌細胞に対する、異常 に高い選択性。 ２．抗腫瘍活性を有するが、非選択的サイトトキシンである他のモノヒドロキサ メート（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９４）と異なり、形質転換された細胞お よび癌細胞を阻害する濃度における、正常細胞の成長の阻害の欠如。 ３．癌細胞による耐性が発生した場合であっても、ほんのわずかである；少なく とも１０サイクルの処理後において、ヒト黒色腫細胞は本発明の化合物に対して なお感受性である。大部分の他の抗癌薬剤を使用する我々の実験において、薬剤 耐性は数回の処理後に発生する。 ４．他のヒストンデアセチラーゼインヒビターと対照的に、培養さ れた細胞により不活性形態への急速な代謝は存在しない。 ５．よく認識されているマウス異種移植モデルにおけるヒト腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏ活性。 ６．６週間の毎日の高い投与量の投与後においてさえ、マウスにおいて明らかな 副作用は存在しない。 ７．容易に修飾して他の誘導体を得ることができる化学的構造。 ８．抗腫瘍の免疫応答を増強できる分子のアップレギュレーション。 ９．作用のメカニズムは現在の薬剤よりも分子レベルにおいていっそう特異的で あり、そして細胞周期のチェックポイントの喪失を腫瘍細胞において特定的に利 用することができる。 寄生体の治療における現在の薬剤よりすぐれた本発明の化合物の利点は、次の 通りである： １．上に詳細に説明したように、正常のヒト細胞に対する毒性の欠如、その結果 得られる、治療上のより高い安全率。 ２．現在の薬剤に対して耐性となった、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を包含する、寄生体に対する活性 。 ３．ｉｎ ｖｉｖｏ活性により確証された、ｉｎ ｖｉｖｏの安定性。 ４．光毒性の副作用の証拠の非存在。 当業者にとって明らかなように、本発明を解明および理解を目的として多少詳 細に説明したが、この明細書に開示されている本発明概念の範囲から逸脱しない で種々の変更および変化が可能である。 本明細書に引用された参考文献を次のページに列挙し、そしてこれらは引用す ることによって本明細書の一部とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/47 Ａ６１Ｋ 31/47 31/472 31/472 38/00 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 17/16 17/16 31/04 31/04 33/02 33/02 35/00 35/00 Ｃ０７Ｃ 259/06 Ｃ０７Ｃ 259/06 259/10 259/10 275/44 275/44 Ｃ０７Ｄ 215/02 Ｃ０７Ｄ 215/02 217/24 217/24 311/22 311/22 311/58 311/58 333/34 333/34 335/06 335/06 Ｃ０７Ｋ 5/08 Ｃ０７Ｋ 5/08 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．治療を必要とする哺乳動物に、有効量の窒素含有化合物、構造的にそれに 関係する化合物、またはそれらの誘導体を投与する工程を含んでなり、前記化合 物は正常細胞に比較して新形成細胞に対して選択的細胞障害性を有しかつ新形成 細胞における分化を誘導する最小の能力を有するか、あるいは前記能力をもたず 、そして前記化合物は、下記の活性： ａ）下記のヒト腫瘍細胞系統の少なくとも１つの細胞培養における成長の阻害 ：黒色腫ＭＭ４１８ｃ１、頸ＨｅＬａ、黒色腫Ａ２０５８、卵巣ＪＡＭ、および リンパ腫Ｍｕｔｕ； ｂ）形質転換されたケラチノサイトおよびメラノサイト（Ｍｅｌ−ＳＶ）の細 胞培養における成長の阻害； ｃ）異種移植されたヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のｉｎｖｉｖｏの成長 の阻害； ｄ）ヒストンの過アセチル化の程度により測定して、ヒストンのデアセチラー ゼの阻害； ｅ）正常のヒト細胞に比較してヒト腫瘍細胞によるタンパク質の発現の差の誘 導； ｆ）正常細胞を殺さないで（ａ）における腫瘍細胞の選択的殺し； ｇ）Ｇ１／Ｓ期におけるいくつかの感受性腫瘍細胞の細胞周期の進行のブロッ キング； ｈ）腫瘍細胞におけるアポプトーシスの誘導；および ｉ）腫瘍細胞ではなく、正常細胞におけるＤＮＡ合成の阻害； の１または２以上をさらに有する、 癌を治療する方法。 ２．前記化合物がモノヒドロキサメートまたはビスヒドロキサメート化合物ま たはその誘導体である、請求項１に記載の方法。 ３．前記化合物が環状ペプチドである、請求項１に記載の方法。 ４．前記化合物がヒストンの脱アセチル化を阻害する能力を有する、請求項１ 〜３のいずれか一項に記載の方法。 ５．前記化合物がメタロチオネインＩａプロモーターの亜鉛誘導活性、および ／またはＳｐｈＩ含有プロモーターの活性を増強する能力を有する、請求項１〜 ３のいずれか一項に記載の方法。 ６．前記化合物が低いレベルの全長のＲｂＡｐ４８を発現する細胞に対して選 択的に毒性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７．前記癌が、白血病、リンパ腫、皮膚癌、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌 、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、または結腸癌である、請求項１〜６のい ずれか一項に記載の方法。 ８．前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９．前記化合物がアゼラインビスヒドロキサム酸ではない、請求項１〜８のい ずれか一項に記載の方法。 １０． 一般式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ： （式中、 Ｘ¹は−Ｃ＝Ｏ；−ＣＯＲ¹；−ＣＦ₂；−ＣＮＨ₂；−ＣＮＲ¹；−ＳＯ₂−；− Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−；−Ｃ＝Ｓ；−ＣＳＲ¹；−Ｃ−ＣＯＲ¹；−Ｃ−ＣＯＮＲ¹ Ｒ²または−Ｃ−ＣＨ₂ＯＨから選択される極性基であるか、あるいはＲ¹または Ｒ²は存在せず、 Ｒ¹およびＲ²は同一であるか、または異なり、各々はＨ；ＯＨ；ＮＨ²；ＮＨ ＯＨ；置換もしくは非置換の、分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル 、アルキルアミノ、アルキルオキシまたはアリールアルキルオキシ；置換もしく は非置換のアリール、アリールオキシまたはピリジノ；置換もしくは非置換のア リールアミノ、ピペリジノ、シクロアルキル、シクロアルキルアミノ、ピリジン アミノ、９−プリン−６−アミン、およびチアゾールアミノから成る群より独立 して選択され、そして リンカーは５〜９個の原子の主鎖を有する基である） のヒドロキサメートまたはヒドロキサム酸または誘導体化合物、またはそれらの 薬学上許容される塩、エステルまたは誘導体であって、前記化合物はアゼライン ビスヒドロキサム酸または国際特許公開Ｎｏ．ＷＯ９５／３１９７７またはＮｏ ．ＷＯ９３／０７４１８に開示されている化合物ではないことを条件とする化合 物。 １１．リンカーが１、２または３つのアミノ酸を含んでなる、請求項１０に記 載の化合物。 １２．前記化合物が下記式ＩＩを有する、請求項１１に記載の化合物： （式中、 Ｒ³はＨ；ＯＨ；ＮＨ₂；ＮＨＯＨ；置換もしくは非置換の、分枝鎖状もしくは 直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、アルキルオキシまたはアリー ルアルキルオキシ；置換もしくは非置換のアリール、アリールオキシまたはピリ ジノ；置換もしくは非置換のアリールアミノ、ピペリジノ、シクロアルキル、シ クロアルキルアミノ、ピリジンアミノ、９−プリン−６−アミン、およびチアゾ ールアミノから成る群より選択され、そして Ｒ⁴およびＲ⁵は同一であるか、または異なり、各々はＨ、アルキル、アリール または普通または非普通のアミノ酸の側鎖から独立して選択される）。 １３．前記リンカーが２つのアミノ酸からなり、そして前記化合物が下記式Ｉ ＩＩａまたはＩＩＩｂを有する、請求項１０または請求項１１に記載の化合物：（式中、 Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の各々は請求項１２において定義した通りであり、そして Ｙは−ＣＨ−ＣＨ₂−ＣＯ；−Ｃ（アルキル）＝Ｃ（Ｈまたはアルキル）₂；−Ｃ₆ Ｈ₄−ＣＯ；−ＣＨ（アルキル）−ＣＨ（アルキル）−ＣＯ；−ＮＲ⁶ＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＯ；−ＮＲ⁶Ｃ（アルキル）−Ｃ（Ｈまたはアルキル）−ＣＯ−；または−Ｎ Ｒ⁶−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＯであり、ここでＲ⁶はＲ³について上に定義した通りであり、 そしてアルキルは直鎖状もしくは分枝鎖状の脂肪族基である）。 １４．前記リンカーが１つのアミノ酸を含んでなり、そして前記化合物が下記 式ＩＶａまたはＩＶｂを有する、請求項１０または請求項１１に記載の化合物： （式中、 Ｙは請求項１３において定義した通りであり、そして Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は請求項１２において定義した通りである； 式中、 Ｙ’は−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＯ；−（ＣＨ₂）_n、ここでｎは１〜６の整数である ；−（ＣＨ₂）₃；−（ＣＨ₂）₄；−（ＣＨ₂）₂ＣＯ−；−（ＣＨ₂）₃−ＣＯ；Ｃ₆ Ｈ₄；Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ＝Ｃ Ｈ₂；−ＣＨ＝ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄；−ＣＨ（アルキル）−ＣＨ（アルキル）；−Ｃ₆ Ｈ₄−ＣＯ；−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ＝ＣＨ−ＯＨ；−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＯ；また は−ＣＨ（アルキル）−ＣＨ（アルキル）ＣＯであり、そして Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は請求項１２において定義した通りである）。 １５．前記リンカーが１、２または３つの二重結合を有し、そして前記化合物 が下記式Ｖａ、Ｖｂ、Ｖｃ、Ｖｄ、Ｖｅ、ＶｆまたはＶｇを有する、請求項１０ に記載の化合物： （式中、 Ｒ¹およびＲ³は同一であるか、または異なり、そして請求項１０において定義 した通りであり、 ｎおよびｍの各々は独立して１〜６の整数であり、そして Ｃ₆Ｈ₄基は芳香族環であり、前記環はオルト位、メタ位またはパラ位において ＮＯ₂、ＮＨ₂、ＮＭｅ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＳＯ₂ＮＨ₂、Ｍｅおよびアルキルから選択 される置換基で置換されていてもよい）。 １６．Ｒ¹およびＲ²の各々が独立してＨ、アルキルまたはアリールである、請 求項１４に記載の化合物。 １７．前記極性基Ｘ¹が下記式ＶＩの環状テトラペプチドの一部分を形成する 、請求項１０に記載の化合物： （式中、 Ｒ⁴、Ｘ¹およびＹは、それぞれ、請求項９および１０において定義した通りで あるか、あるいはＹは（ＣＨ₂）₅ＣＯＭｅ、（ＣＨ₂）₄ＣＯＭｅ、（ＣＨ₂）₅Ｃ Ｏ−アルキル、（ＣＨ₂）₅ＣＯ−アリール、（ＣＨ₂）₅ＣＯ−ＮＲ³Ｒ⁶であるこ とができ、ここでＲ³およびＲ⁶は同一であるか、または異なり、そしてＲ⁶は請 求項１３において定義した通りである）。 １８．下記式ＶＩＩを有する、請求項１７に記載の化合物： （式中、 Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の各々は同一であるか、または異なり、そして請求項１２ において定義した通りであるか、あるいはチオプロリン、ヒドロキシプロリン、 ピペコリン酸またはデカヒドロイソキノリンであることができ、そして ＊でマークする位置における立体化学的立体配置はＲまたはＳ（ＬまたはＤ） であることができる）。 １９．Ｒ³およびＲ⁶の各々がＨ、アルキル、アリール、（ＣＨ₂）₅ＣＨＯ、 およびＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂−ＣＯＭｅから成る群より 選択され、そして４つのアミノ酸の各々は脂肪族アルキル基でＮ−アルキル化さ れていてもよい、請求項１７記載の化合物。 ２０．極性基Ｘ¹が環状ペンタペプチドの一部分を形成し、そして前記化合物 が下記式ＶＩＩＩを有する、請求項１０に記載の化合物： シクロ［ＣＸ¹−ＣＨＹ−ＮＨ］（ＣＯＣＨＲ⁴ＮＨ）₄］ （式中、 Ｘ¹およびＹは、それぞれ、請求項１０および１２において定義した通りであ る）。 ２１．キノリン、イソキノリン、テトラヒドロキノリンおよびデカヒドロキノ リンから成る群より選択される環状分子である、請求項１０に記載の化合物。 ２１．下記の化合物から成る群より選択される、請求項１０に記載の化合物： および （式中、 ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル；ＮＯ；ＳＯ；ＣＯ；Ｃ−Ｒ⁷であり、 Ｘ²はＯ、ＯＨ、アルデヒド、ケトン、ＣＦ₃；ＮＯ₂；ＮＯ； ＳＨ；Ｓ；ＮＨ；ＮＨ₂；ＣＯ₂Ｈ；ＣＯＮＨ₂；ＣＯ₂（アルキル）またはＣＯＮ Ｈ（アルキル）であり、 Ｒ⁷はＨ；ＯＨ；ＯＭｅ；ＮＯ₂；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｆ；（Ｍｅ）₂Ｎ；ＣＮ；ＮＨ₂ ；ＮＨ（アルキル）；Ｎ（アルキル）₂；ＳＯ₃Ｈ；ＳＯ₂ＮＨ₂；アルキルＣＦ₃ ；Ｏ（アルキル）；ＳＨおよびＳ（アルキル）から成る群より選択される１また は２以上の置換基であり、そしてここで アルケン結合として描写される各結合は選択的に単結合であることができ、そ して円形でマークされる各単結合は選択的に二重結合であることができる）。 ２３．正常細胞に比較して新形成細胞に対して選択的細胞障害性を有しかつ新 形成細胞における分化を誘導する最小の能力を有するか、あるいは前記能力をも たなず、そして下記の活性： ａ）ヒストンの脱アセチル化を阻害する能力、 ｂ）メタロチオネインＩａプロモーターの亜鉛誘導活性を増強する能力、 ｃ）ＳｐｈＩプロモーターの活性を増強する能力、 ｄ）低いレベルの全長のＲｂＡｐ４８を有する細胞に対して選択的に毒性であ る能力、 を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。 ２４．２またはそれ以上の型の腫瘍細胞に対して選択的に毒性である、請求項 １０〜２３のいずれか一項に記載の化合物。 ２５．請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許 容される塩と、薬学上または獣医学上許容される担体とを含んでなる組成物。 ２６．治療を必要とする被検体に、有効量の請求項１０〜２４のいずれか一項 に記載の化合物を投与する工程を含んでなる、癌を治 療する方法。 ２７．治療を必要とする被検体に、有効投与量の請求項１０〜２４のいずれか 一項に記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書において定義される関係す る化合物を投与する工程を含んでなる、原生動物の寄生体の感染を治療する方法 。 ２８．寄生体が、重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム（ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス類（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ）、根鞭毛虫類（Ｈｉｓｔｏｍａｏｎａｓ）、マラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｕｍ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、睡眠病病原虫（Ｔｒｙｐ ａｎｏｓｏｍａ）、ピロプラズマ類（Ｂａｂｅｓｉａ）、異毛類（Ｂａｌａｎｔ ｉｄｉｕｍ）、有鞭毛アメーバ類（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、寄生性アメーバ（Ｅ ｎｔａｍｏｅｂａ）および球虫類（Ｅｉｍｅｒｉａ）から成る群より選択される 属のメンバーである、請求項２７に記載の方法。 ２９．寄生体が重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、トリコモナス類（Ｔｒｉｃ ｈｏｍｏｎａｓ）またはマラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の属のメンバ ーである、請求項２８に記載の方法。 ３０．寄生体がギアルディア・ヅオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎ ａｌｉｓ）またはプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項２９に記載の方法。 ３１．治療を必要とする被検体に、有効投与量の請求項８〜２４のいずれか一 項に記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書において定義される関係する 化合物を投与する工程を含んでなる、ケラチンの過形成または形成異常の症状を 治療する方法。 ３２．前記症状が乾癬、白斑症、または日光性角化症である、請 求項３０に記載の方法。 ３３．癌の試料中の全長のＲｂＡｐ４８の異常なレベルまたは非存在を検出す る工程を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法による治療が特 に可能である癌を同定する方法。 ３４．生検を介するか、あるいは腫瘍の外科的切除時において得られた、腫瘍 の組織学的切片を、ＲｂＡｐ４８に対して向けられた抗体を使用して、免疫組織 学的に分析する工程を含んでなる、請求項３３に記載の方法。 ３５．ＲｂＡｐ４８をコードする核酸配列またはＳｐｈＩを含有する配列に対 して相補的である核酸配列を治療すべき被検体に投与する工程を含んでなる、請 求項１０〜２４のいずれか一項に記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書 において定義される関係する化合物で、癌または寄生体の感染の治療の選択性を 増強させる方法。 ３６．前記相補的配列を腫瘍細胞または寄生体にターゲットさせる、請求項３ ５に記載の方法。 ３７．腫瘍の療法に悩まされる被検体に、請求項１０〜２４のいずれか一項に 記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書において定義される関係する化合 物を投与して、ＭＨＣクラスＩの分子を発現する腫瘍細胞の比率を増加させる工 程を含んでなる、免疫系により認識される腫瘍細胞の比率を増加させる方法。 ３８．癌の治療における請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の化合物の使 用。 ３９．原生動物の感染の治療における、請求項１０〜２４のいずれか一項に記 載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書において定義される関係する化合物 の使用。 ４０．原生動物の感染が寄生体により引き起こされ、前記寄生体 が重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐ ｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス類（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、根鞭毛虫類（ Ｈｉｓｔｏｍａｏｎａｓ）、マラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トキソ プラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、睡眠病病原虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ） 、ピロプラズマ類（Ｂａｂｅｓｉａ）、異毛類（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、有 鞭毛アメーバ類（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、寄生性アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ）および球虫類（Ｅｉｍｅｒｉａ）から成る群より選択される属のメンバーであ る、請求項３９に記載の使用。 ４１．寄生体が重複鞭毛虫類（Ｇｉａｒｄｉａ）、トリコモナス類（Ｔｒｉｃ ｈｏｍｏｎａｓ）またはマラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の属のメンバ ーである、請求項３９に記載の使用。 ４２．原生動物の感染の治療のための薬剤の製造における、請求項１０〜２４ のいずれか一項に記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書において定義さ れる関係する化合物の使用。 ４３．過形成または形成異常の症状の治療のための薬剤の製造における、請求 項１０〜２４のいずれか一項に記載の化合物、またはＡＢＨＡまたは本明細書に おいて定義される関係する化合物の使用。 ４４．前記症状が乾癬、白斑症、または日光性角化症である、請求項４３に記 載の使用。