JP2002513393A

JP2002513393A - ジアミノシクロヘキサン白金（▲ｉｉ▼）錯体のリポソーム配合を介した送達および活性化

Info

Publication number: JP2002513393A
Application number: JP52584098A
Authority: JP
Inventors: プレツ−ソラー，ローマン; アール．コークハー，アブダル
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2002-05-08
Also published as: WO1998024416A1; AU7622598A; AU736688B2; CA2273497A1; EP0956002A1; US7029696B2; US20040161456A1; US20010036470A1; US6696079B2; US5843475A; EP0956002A4

Abstract

(57)【要約】抗腫瘍組成物、ならびに組成物の調製法および哺乳動物における腫瘍の増殖を阻害するためのそれらの使用法が開示される。本発明は、以下の式（Ｉ）を有する白金錯体（ここで、Ｒ₁はジアミノシクロアルキルであり、そしてＲ₂およびＲ₃はそれぞれ以下の式を有し、ここで、Ｒ₄、Ｒ₅、およびＲ₆は、それぞれ独立して１〜約１０個の炭素原子を有する炭化水素部分である）の、以下の式を有する錯体へのリポソーム内変換を利用し得る：R₁-Pt-X₂ (II)ここで、Ｘはハロゲンである。

Description

【発明の詳細な説明】ジアミノシクロヘキサン白金(II)錯体のリポソーム配合を介した送達および活性化発明の背景本発明は、癌の処置のための方法および組成物に関する。特定の腫瘍の処置において有効であることが証明されている薬物の１つにシスプラチン(cis-ジクロロジアミン-白金(II))がある。しかしながら、シスプラチンはある短所を有する。例えば、いくつかの状況におけるその使用は、患者に対するその毒性、特にその腎毒性(nephrotoxicity)により制限される。別の例として、腫瘍は時としてシスプラチンに抵抗して発達する。シスプラチンの短所を克服するための努力として、研究者は効力のある抗腫瘍剤として種々の他の白金錯体を合成し、そして試験してきた。そのような化合物の１つにジクロロ(1,2-ジアミノシクロヘキサン)白金(II)(本特許の明細書中「D ACH-Pt-Cl₂」として示される)がある。しかしながら、この化合物は水に対して非常に低い溶解性しか持たず、そのことがこの化合物の水性溶液での処方および投与を実行不能にしている。さらに、これまで種々の白金錯体がリポソーム中に処方されてきているが、DACH-Pt-Cl₂のリポソーム性処方物は、錯体がほとんどの有機溶媒に不溶であるために開発されていない。この錯体はジメチルホルムアミドには良く溶解するが、この溶媒は非常に高い沸点を有することから、標準的なエバポレーション法を使用するDACH-Pt-Cl₂のリポソーム性処方物の調製は、不可能あるいは実行不能になっている。他の白金ベースの抗腫瘍薬物、例えば、cis-ビス-ネオデカノエート-trans-R, R-1,2-ジアミノシクロヘキサン白金(II)(NDDP)が、抗腫瘍剤として調製されそして試験されてきている。しかしながら、良好な抗腫瘍活性、患者の非腫瘍細胞に対する低い毒性、および望ましい貯蔵特性を有する改良された抗腫瘍薬物処方物に対する必要性が依然として存在する。発明の要旨本発明は、リポソーム性抗腫瘍組成物および哺乳動物における腫瘍の増殖を阻害するための組成物の使用法に関する。本発明はまた、抗腫瘍組成物の調製法にも関わる。本発明は、以下の式(I)を有する白金錯体の、以下の式(11)を有する錯体へのリポソーム内変換を利用し得る： R₁-Pt-X₂ (II) ここで、Ｘはハロゲンである。これにより、今までその水およびほとんどの有機溶媒に対する低い溶解性により実用的ではなかった、錯体(II)のリポソーム性処方物の調製が可能になる。上記の錯体において、Ｒ₁はジアミノシクロアルキルであり、好ましくは約３〜約６個の炭素原子を有する1,2-ジアミノシクロアルキルであり、最も好ましくは1,2-ジアミノシクロヘキサンである。Ｒ₂およびＲ₃はそれぞれ以下の式を有し、ここで、Ｒ₄、Ｒ₅、およびＲ₆は、それぞれ独立して１〜約１０個の炭素原子を有する炭化水素部分であり、好ましくは１〜約６個の炭素原子を有するアルキルであり、最も好ましくは１〜約３個の炭素原子を有するアルキルである。Ｒ₂およびＲ₃は同じであり得るが、必ずしも同じでなくてもよい。同様に、Ｒ₄、Ｒ₅ 、およびＲ₆は同じであり得るが、必ずしも同じでなくてもよい。Ｘは、最も好ましくは塩素である。本発明の一つの局面は、リポソーム中に包括された錯体(II)を含むリポソーム性抗腫瘍処方物である。本発明の特定の実施態様において、リポソームは酸性リン脂質、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールを含有する。理論的な裏付けはないが、リポソーム中に酸性リン脂質が存在することが、錯体(I)の錯体(II)への変換を、促進または加速すると思われる。本発明の別の局面は、腫瘍の増殖を阻害する方法である。この方法は、白金錯体が腫瘍の増殖を阻害するために有効な量で存在する、リポソームに包括された錯体(II)を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。本発明の別の局面は、抗腫瘍組成物を調製する方法である。この方法は、リポソーム中に包括された白金錯体(I)を含む組成物のpHを調製し、これによりpHをいくらか酸性にし(好ましくは約２と約6.5との間)、錯体(I)の錯体(II)への変換を行う工程を含む。次いで、得られる組成物が患者に投与され得る。この方法の一つの特定の実施態様において、錯体(I)は、リポソーム内で錯体( II)に変換される。これにより錯体(I)のリポソーム性処方物を製造しそして保存することが可能になり、次いで患者に投与する直前に、錯体(I)のリポソーム性処方物は、単に処方物の酸性溶液を加えることにより、インサイチュで錯体(II) のリポソーム性処方物に変換され得る。必要に応じて、酸性溶液の添加からあらかじめ決められた時間が経過した後、錯体(I)から(II)への変換を停止するために、pHを、好ましくは少なくとも約７に再調整し得る。本発明の幅広い目的は、本質的に生物学的に活性な化学的部分を哺乳動物に送達する方法に関わる。生物学的に活性な部分は、例えば、抗腫瘍剤であり得る。この方法は、(a)生物学的に活性な部分であるプロドラッグの水性処方物を提供する工程(プロドラッグはリポソーム中に包括されており、そしてプロドラッグはさらに酸性pHを有する溶液にさらされることにより生物学的に活性な部分を形成し得る)；(b)pHを酸性レベルに下げる工程、これによりプロドラッグを生物学的に活性な化合物に変換する；および(c)水性処方物を哺乳動物に投与する工程を含む。リポソーム性処方物の哺乳動物への投与は、プロドラッグの変換後に適切に行われ得るが、例えばリポソームの酸性成分(例えば酸性リン脂質)により、変換が投与してから(then)インビボで生じるように、変換前にもまた行われ得る。本発明は、先行技術の白金抗腫瘍処方物および方法に勝る多くの利点(より良い抗腫瘍活性、より大きな可能性、および患者の非癌細胞に対する減少した毒性を含む)を有する。さらに、本発明の組成物は、これまでそのように処方し得なかった白金錯体のリポソーム中の処方および送達を可能にする。図面の簡単な説明図１．NDDP、B10、およびL10の化学構造。図２．リポソーム内安定性における、pt錯体の構造、DMPG含有量、および水性溶液の効果、ならびにNDDP(×)、B10(○)、およびL10(■)の細胞毒性。図２Ａ-- DMPC：DMPG＝７：３、生理食塩水；図２Ｂ--DMPC：DMPG＝７：３、PBS；図２Ｃ- -DMPC：DMPG＝３：７、生理食塩水；図２Ｄ--DMPC：DMPG=３：７、PBS。IC₅₀値は、ｇ／mlにおけるものである。図３．NDDPにおける脂質組成物のリポソーム内安定性における効果。0.9％NaC l水溶液(開始時（starting）ph=7.0)を、リポソームの再構成溶液として使用し、そしてリポソーム調製の６時間後に最終的なpHを確認した。図４．リポソーム性NDDP懸濁液の¹⁹⁵PtNMR。図４Ａ--生理食塩水で再構成し、室温で６時間保存したリポソーム性NDDP懸濁液からCHCl₃で抽出することにより調製したクロロホルム中のサンプル１の¹⁹⁵PtNMR。図４Ｂ--生理食塩水で６時間リポソーム性NDDPを再組成し、２日間水を凍結乾燥し、そして混合物をCH₃OHに再溶解することにより調製したCH₃OH中のサンプル２の¹⁹⁵PtNMR。図４Ｃ--ｔ-ブタノールのエバポレーションおよび混合物のCH₃OH再溶解により調製したCH₃OH中のサンプル３の¹⁹⁵PtNMR。図５．図５Ａ--DMF-d₇中のDACH-Pt-Cl₂の¹H-¹H相関分光。図５Ｂ--DMF-d₇中の DACH-Pt-Cl₂の¹³CNMR。図６．リポソーム性NDDPのNMR追跡実験のためのサンプル調製。図６A--クロロホルム溶液中脂質を有する。図６Ｂ--乾燥粉末中脂質を有する。特定の実施態様の説明シス-ビス-ネオデカノアト-トランス-R,R-1,2-ジアミノシクロヘキサン白金（ II）(NDDP)は、リポソームキャリア中に処方され得る、親油性の白金錯体（Pt- 鉗体）である。NDDPおよび他の白金錯体の製造および使用についての種々の詳細は、米国特許第5,041,581号、同第5,117,022号、同第5,186,940号、同第5,178,8 76号、および同第5,384,127号に開示されている。これらの特許は、本明細書中で参考として援用される。先行する研究は、NDDPが、リポソーム二分子層内での活性化により生物学的活性を発揮するプロドラッグであることを示唆している。異なるリポソーム性Pt- 錯体のリポソーム内分解／活性化の動力学を理解するために、本発明者らは、Pt -錯体の構造、pH、温度、脂質の組成、酸性リン脂質の含有量、リポソームのサイズ、および残存するクロロホルムの存在が、安定性、インビトロ細胞傷害性、ならびに異なるリポソーム性Pt-錯体調製物のインビボ抗腫瘍活性に及ぼす影響を研究した。以下の要因は、Pt-錯体のリポソーム内分解／活性化を増強することが見いだされた：1）Pt-錯体のサイズおよび空間的配置、2)酸性pH、3)高温、 4)酸性リン脂質の存在および量、ならびに5)残存クロロホルムの存在。リポソームのサイズは、異なるPt-錯体のリポソーム内での安定性に影響しなかった。薬物分解の程度とインビトロ細胞傷害性との間の関係、ならびに薬物分解の程度とインビボ抗腫瘍効力との間の関係において、良好な逆関数関係が観察された。このことは、特定の活性中間体（単数または複数）のリポソーム内での形成により、これらの錯体の生物学的活性が発揮されることを確実にする。同定され得た唯一の活性中間体は、シス-ビス-ジクロロ-トランス-R,R-1,2-ジアミノシクロヘキサン白金（II）であった。この構造は、¹Ｈ、¹³Ｃ、および¹⁹⁵Pt核磁気共鳴（NMR）スペクトル分析により確認された。本発明者らは、以前に、インビボ投与のための親油性Pt-錯体のリポソーム性処方物を開発し［５、６］、そして、その化学的および生物学的特性を研究した［１、４、７］．使用された好適なPt-錯体の一般的構造は、[DACH-Pt-R₂]であり、ここで、DACHは、トランス-R,R-1,2-ジアミノシクロヘキサンであり、そしてＲは、親油性カルボキシラト基である。Pt-錯体は、リポソームの脂質二分子層のリン脂質分子の間に介在すると考えられている。これらの錯体の最も顕著な特性は、インビトロおよびインビボの両方において、シスプラチンと互いに耐性（cross-resistant）でないことである［１、５］。リーディング処方物であるリポソーム性シス-ビス-ネオデカノアト-DACH-白金（II）(NDDP)は、７：３のモル比のジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）から構成される大きいリポソーム（現在、臨床試験中である）を使用する。興味深いことに、リポソーム性NDDPは、その抗腫瘍活性を発揮するためには、リポソーム調製の直後に、リポソームの内部で、化学的分解／活性プロセスに供されて、活性中間体（単数または複数）になることが必要である［７］。本発明者らは、この化学反応が、脂質二分子層中のDMPGの含有量に依存することを以前に報告しており、そしてこの知見に基づいて、本発明者らは、DMPG-Pt錯体が活性中間体のうちの１つであり得ると仮定した。本発明者らはまた、Pt鉗体の構造が、リポソーム内の薬物安定性に影響を有することを報告した：直鎖状でかつ短いカルボキシラト脱離基を有する化合物は、分枝状または長い直鎖状脱離基を有する化合物に比べて、より安定性でありかつ効力は低い［８］。活性中間体（単数または複数）ならびに分解／活性化プロセスに影響を与える異なる因子の全体的キャラクタリゼーションは、薬学的製品としてのこれらの薬剤のうちの１つを開発するために必須である。この目的のために、本発明者らは、NDDP（高度に分枝した構造）ならびに２つの異性体であるB10（最小に分枝した構造）およびL10（直線状構造）(図１)を選択し、そしてそれらの生物学的活性とそれらのリポソーム内安定性との間の関係を研究した。本発明者らは、pH、温度、脂質の組成、リポソームのサイズ、および残存するクロロホルムの存在が、Pt-鉗体の分解に及ぼす影響について試験し、そして³¹Ｐおよび¹⁹⁵PtのNMRスペクトルを用いた追跡実験により、活性中間体（単数または複数）を同定することを試みた。本発明者らの結果は、これらのPt -錯体の分解／活性化は、懸濁液のpHに大きく依存し、そして、DACH-ジクロロ白金（DACH-Pt-Cl₂）は、同定し得る唯一の中間体であることを示しており、従って、これらのPt-鉗体は、生理食塩水中で懸濁されたリポソーム中に配合された場合に、DACH-Pt-Cl₂のプロドラッグであることを示唆している。材料および方法リポソーム性Pt-錯体の調製。 NDDP、B10、およびL10を、以前に記載した通りに合成し［１、２］、そしてアセトン中で再結晶した。DMPC、DMPG、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ホスファチジル酸（PA）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、およびホスファチジルセリン（PS）を、Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）から購入した。 Pt-錯体を含有する多層小胞を、クロロホルム溶液または乾燥粉末の脂質を用いて、凍結乾燥法により調製した。方法１：脂質[1]のクロロホルム溶液を用いて、脂質を所望のモル比で混合し、そしてクロロホルムをロータリーエバポレーターで除去した。乾燥脂質フィルムに、Pt-錯体のt-ブタノール溶液を添加し、そして40℃で10分間振とうした。次いで溶液をドライアイス-アセトン浴で凍結し、そしてt-ブタノールを一晩凍結乾燥によって除去し、凍結乾燥プレリポソーム(preliposomal)粉末を得た。方法２：乾燥粉末の脂質を用いて、脂質を混合し、そしてt-ブタノール：水(1 0:1/v:v)で溶解した。この溶液に、Pt-錯体のt-ブタノール溶液を添加し、そして残りの手順を上記と同様に行った。生理食塩水またはPBSを添加し(Pt-錯体の１ml/mg)、凍結乾燥プレリポソーム( preliposomal)粉末を再構成し、そして懸濁液を10分間手で振とうし、大きなサイズのリポソームを得た。１分間超音波細胞破壊器(ultrasonic cell disrupter )(Laboratory Supplies Co.、New York、NY)を用いて大きなサイズのリポソームの超音波処理で小さなサイズのリポソームを調製した。異なるリポソーム調製物のサイズ分布を、Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370(Nicomp Partic le Sizing Systems、Santa Barbara、CA)を用いて決定した。内部リポソーム安定性リポソーム中に導入された異なるPt-錯体の安定性を、前述[8]に記載のように、時間の関数としてHPLCプロファイルを比較することにより決定した。簡単には、リポソーム懸濁液のアリコートのサンプルを、リポソーム調製後０、２、６および24時間でメタノールを用いて希釈し(７×)、次いで各サンプルをchromega-8ボンドカラム(4.6mm×25cm、８ Tm：ES Industries、NJ)および溶出液として10％水-メタノールを用いてHPLCによりモニターした。流速は１ml/minであり、そして錯体を224nmの波長でUVにより検出した。生物学的活性インビトロ．リポソームPt-錯体のA2780ヒト卵巣ガン細胞に対するインビトロ細胞傷害性を、MTT色素還元アッセイにより評価した。簡単には、A2780細胞を96 ウェルプレートに播種し、一晩付着させ、次いで種々の濃度の薬物に20時間曝露した。PBSで細胞を洗浄した後、新鮮な培地を52時間添加し、そして細胞生存画分をMTTアッセイにより決定した。インビボ．リポソームPt-錯体のインビボ抗腫瘍活性を、腹腔内L1210マウス白血病に対して評価した。18〜20gの体重の６〜８匹のマウスのグループを０日に1 06細胞(0.2ml、i.p.)で接種し、そして処置(25、50、100および150mg/kg)を１日に開始した(0.15〜0.5ml、i.p.)。結果を、処置動物の生存中央値をコントロール動物の生存中央値で割った×100(％ T/C)として表した。活性中間体の同定生理食塩水(0.9％ NaCl)中で再構築されたL-NDDPの反応カスケードにおける活性中間体を特徴づけるために、³¹P NMRと組み合わせて¹⁹⁵Pt NMRスペクトルを用いる追跡実験を行った。サンプルの調製の手順を図６に要約する。サンプル１〜３を、クロロホルム溶液中に購入した脂質DMPCおよびDMPGを用いて調製し、一方サンプル４〜８を乾燥粉末中の脂質を用いて調製した。サンプル１〜３において、クロロホルムを最初にロータベイパーでエバポレートした。脂質フィルムを、溶液中にNDDPを含むt-ブタノールに溶解した。この溶液のアリコートを40℃で６時間保持し、次いで凍結乾燥し、そしてメタノールで抽出した(サンプル３)。残りを直ちに凍結乾燥し、従ってプレリポソーム粉末を生じ、これは生理食塩水を用いて再構築され、リポソーム懸濁液を生成した。リポソーム懸濁液を室温で６時間保持した。次いでPt化合物および脂質をクロロホルムで抽出し(サンプル１)またはサンプルを凍結乾燥して水を除去し、そして粉末をメタノールに溶解した( サンプル２)(図６を参照のこと)。サンプルを40℃で６時間保持した後、溶媒を完全にエバポレートし、そしてメタノール中にそれらを再溶解することによりサンプル４、５および６を調製した。サンプル７および８を１〜２日間の水の凍結乾燥およびメタノール中の再溶解によって調製した。全てのサンプルをHPLCでプレチェックした後、NMRで追跡した。生成物の化学シフトを、¹⁹⁵Pt中のNa₂PtCl₆ および³¹P NMR中のDMPCに関して百万分率で表した。 DACH-Pt-Cl₂特徴づけ NMRサンプルからの黄色沈殿物を収集し、そしてDMF-d₇中に再溶解し、それらを¹Hおよび¹³C NMRを用いて特徴づけた。これらの全てのデータは、DACH-Pt-Cl₂の標品で確認された。結果リポソームPt-錯体の調製 NDDPおよびその２つの異性体、B10およびL10は、DMPC、DMPG、DOPC、DOPG、PA 、PEおよびPSを含む種々の脂質の組み合わせから構成されるリポソームに処方された。リポソームは、未緩衝化0.9％NaCl水溶液(生理食塩水)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を伴うPt-錯体および脂質を含むプレリポソーム粉末を再構築することにより形成された。全てのリポソーム処方物の包括有効性(％EE)は90％より多く、そして使用した脂質組成物、再構築溶液、またはNDDP異性体による効果はあまりなかった。遊離薬物の結晶は、光学顕微鏡による評価によれば、任意のこれらの調製物で24時間以内に観察されなかった。多重膜ベシクルの中央サイズは全ての調製において１〜２Tmであった。多重膜ベシクルの超音波処理により調製された小さなサイズのリポソームの中央値は50〜100nmであった。 Pt-錯体のリポソーム内安定性１）Pt-錯体の空間配置およびリポソーム懸濁液のpHの役割図2A〜Dは、再構築溶液として生理食塩水またはPBS、および7:3および3.7のDM PC:DMPGの比を用いた、リポソームPt-錯体処方物の安定性を示す。以前に観察された[1]ように、Pt-錯体の脱離基の分枝配置および脂質二重層中のDMPGの含量は、Pt11-錯体のより高い分解速度に相関した。結果として、直線状脱離基L10を有する錯体は、非常に安定であるが、高度に分枝したNDDPはむしろ不安定であり、そして最小限に分枝したB10は中間の安定性を有した。再構築溶液としてPBCを使用することにより、生理食塩水と比較して、Pt-錯体が顕著により高い安定性を示した。例えば、リポソーム調製の６時間後、生理食塩水中のインタクトなNDDP の割合対PBS中のインタクトなNDDPの割合は、43.7％対82.1％であり、一方、B10 についての割合は、それぞれ85.0％対95.9％であり、そしてL10についての割合は、それぞれ93.1％対100％であった。生理食塩水中のリポソーム懸濁液のpHは、Pt-錯体に依存して7.0から3.8〜6.2に低下し、一方、PBSは、全ての場合において、溶液のpHを約6.0〜7.0に維持した。これらの結果は、以下のことを示す：１）酸性pHはPt-錯体のリポソーム内分解を促進する、および２）良好な中性緩衝液系はPt-錯体のリポソーム内分解を低減するかまたは停止し得る。これらの結果を確認するために、本発明者らは、強酸性(pH=3.0)または強塩基性(pH=8.0) 生理食塩水溶液中のPt-錯体のリポソーム内安定性を試験した。これらの強酸性または強塩基性生理食塩水溶液は、0.1N HClまたはNaOH水溶液をpH7.0の生理食塩水に添加することにより調製した。pH3.0の生理食塩水は、全てのPt-錯体の分解速度を増加させ、一方、pH8.0の生理食塩水は、リポソーム調製の24時間後でさえ、有意なPt-錯体の分解を誘導しなかった。比較的多量のDMPG(DMPC:DMPG=3: 7)を用いる全ての処方物は、DMPGが酸性リン脂質であるので、リポソーム懸濁液のpHと良好に相関して、Pt-錯体のより高い分解速度を示した。２）温度の役割 Pt-錯体のリポソーム内安定性は、40℃で調べ、そして室温で得られた結果と比較した。Pt-錯体の分解は、温度依存性であり、分解速度は、試験したpt-錯体に依存して、40℃では25℃でよりも約30〜70％高かった。３）脂質組成物の役割モル比7:3でDMPC:PA、PS:DMPG、およびDMPC:PE、ならびにモル比1:0、7:3、3: 7、および0:1でDOPC:DOPGを用いるNDDPのリポソーム処方物が調製され、そして再構築溶液として生理食塩水を用いて試験された（図３）。リン脂質の酸性度(P A>PG>PS)および相対DOPG含量(DOPC:DOPG 0:1>3:7>73>1:0)は、NDDPのリポソーム内分解を促進し、そしてPt-錯体の分解と酸性pHとの間の良好な相関が再度観察された。同一の結論が、DMPC:DMPGモル比(7:3)は同じであるが、NDDP:合計脂質比(1:5 、1:10、1:15、および1:30)は異なり、それゆえ異なるDMPG含量を用いるリポソーム中のNDDPでの研究において得られた。1:5または1:10の比を用いると、初期N DDPの85％は24時間で存在し；対照的に、1:15または1.30の比を用いると、NDDP の分解が促進され、24時間で初期NDDPのわずか25％のみが残り、従って、これは、分解の程度と脂質二重層内のDMPGの絶対量との間の相関を示唆する。４）リポソームサイズの役割リポソームサイズは、NDDPのリポソーム内安定性に影響を与えなかった；多重膜ベシクルの最初の懸濁液の超音波処理は、使用した脂質組成物に関わらず、ND DPの安定性を顕著に変化させなかった。インビトロ細胞毒性とリポソーム内安定性との間の相関本発明者らは、MTTアッセイを用いて、A2780細胞に対する異なるリポソームPt -錯体処方物のインビトロ細胞毒性を研究し、そしてその結果をPt-錯体のリポソーム内安定性と相関させた。結果を図2A〜Dに示す。IC₅₀値は、薬物安定性とかなり良好に相関した；Pt-錯体がより安定になるにつれて、より毒性が低くなるかまたはIC₅₀がより高くなる。６時間で最初のPt-錯体の約20％、50％、および9 0％が残っていたとき、IC₅₀は、それぞれ約３〜５、７〜10、および20〜50g/ml であった。これらの結果は、Pt-錯体のリポソーム内分解が、その細胞毒性効果を発揮するために必要であり、それゆえ、リポソーム内活性化工程であることを示す。 NDDPの活性中間体の同定分解生成物に対応する新しいピークは、NDDPのために開発されたHPLC法により観察されない。なぜなら、それらはリン脂質と共に溶出するか、またはそれらは UV吸光度を有しないかのいずれかであるから。脂質ピークから新しいピークを分離する試みは、いままで成功していなかった。リポソームNDDPの反応カスケードのトラックを保持するために、本発明者らは、NDDPの分解／活性化生成物を特徴付けるための、他の研究者[2,3,9-11]によって使用されるNMRトラッキング法を適用することを試みた。１）クロロホルム溶液中の脂質を用いて調製された処方物（図６Ａのサンプル１、２、および３）。サンプル１の（生理食塩水、クロロホルム抽出、図４Ａ）およびサンプル２（生理食塩水、凍結乾燥、図４Ｂ）の¹⁹⁵Pt NMRによって、NDDPピークは1750ppmで検出され、そしてDACH-Pt-Cl₂に対応する新しいピークは1950ppmで検出された。反応時間を延長し、pHを下げ、温度を上げ、そしてリポソーム中のDMPGの量を増大させることで、NDDPの分解／活性化を増強し、¹⁹⁵0ppmでのピークの強度を増大させた。しかし、³¹P NMRにより、DMPC（２ppm）およびDMPG（３ppm）に対応するピークを除いては新しいピークは観察されず、このことは、¹⁹⁵Pt NMRにより示される新しい生成物はDMPG-組込Pt-複合体ではないことを示す。これらのスペクトルの結果は、サンプル３からの結果と類似しており（図６Ａ、t-ブタノール、凍結乾燥、図４Ｃ）、この場合、リポソームNDDPは生理食塩水に曝露されず、従ってCHCl₃の存在はまたDACH-Pt-Cl₂を形成するための塩化物のドナーとして作用し得ることを示す。黄色がかったNMRサンプルを４℃で一晩保存した後、黄色結晶がゆっくりと沈澱した。沈殿物を濾過し、乾燥し、そして化合物の構造はDACH-Pt-Cl₂であることが、¹Ｈ，COSY（図５Ａ）、¹³Ｃ（図５Ｂ）、および¹⁹⁵Pt NMRによって立証された。もともとのリポソームNDDP懸濁液を室温で放置した後、黄色沈殿物をまた２〜３週間観察した。DMPCのみで構成されるリポソーム中のNDDPは、新しいピークを¹⁹⁵Ptまたは³¹P NMRのいずれによっても与えなかった。これは、DMPGの非存在下でその完全に保存された安定性と相関する。２）乾燥粉末中の脂質を使用して調製された処方物（サンプル４、５、６、７、および８）。本発明者らは、NDDPの分解時での残渣のCHCl₃の存在の影響を排除するために、クロロホルム溶液の代わりに、乾燥粉末中の脂質を用いて調製された処方物での同じトラッキング実験を行った（図６）。脂質およびNDDPを含有するサンプル４および５（溶媒t-ブタノール＋それぞれ、水およびメタノール）において、反応は起こらなかった。一方、サンプル６（脂質およびNDDPのクロロホルム溶液）は、¹⁹⁵Pt NMRによりDACH-Pt-Cl₂の存在を示した。これらのサンプルによる結果（40℃で６時間インキュベートし、クロロホルムの存在を確認した）は、NDDPの DACH-Pt-Cl₂への分解を誘発し得る。サンプル７を、室温で６時間の、pH6.5〜7. 0の生理食塩水中のプレリポソームNDDP粉末の再構成によって調製した。顕著な分解（＜５％）は観察されなかった。一方、pH3.0〜4.0の酸性生理食塩水中で再構成される場合（サンプル８）、NDDPの60％〜95％分解（¹⁹⁵Pt NMRおよびHPLC によって測定されるようなDACH-Pt-Cl₂を生成する）は、10分間起こった（表１）。表１乾燥粉末として脂質で調製されたNDDPのリポソーム内安定性に対する生理食塩水の種々のpH値の影響 Pt-複合体安定性とインビボ抗腫瘍活性との間の関係１．残渣のクロロホルムを含む調製物これらの研究は、クロロホルム中に溶解した脂質を用いて、リポソームPt-複合体の懸濁液で行った。L1210白血病に対するインビボ抗腫瘍活性研究において、薬物安定性と抗腫瘍効力との間に逆の関係が観察された（表２）。DMPC：DMPG 比は、すべての調製物に関して７：３であった。生理食塩水およびPBSの開始pH 値は、7.0であった。腫瘍を０日目に腹腔内で接種し、続いて薬物を１日目に腹腔内注入した。表２ L 1210白血病に対するリポソームPt複合体のインビボ抗腫瘍活性リポソームNDDPの最適な用量は、生理食塩水中50mg/kgであり、そしてPBS中10 0mg/kgであった（それぞれ、％T/C=211および200）。リポソームB10およびL10について、最適な用量は、生理食塩水中100mg（％T/C＝228および178）であったが、両方の薬物がPBS中で再構成された場合、顕著な抗腫瘍活性は観察されなかった。従って、ほとんどの強力なリポソームPt-複合体調製物はPt-複合体の最も低い安定性を有する調製物であった。しかし、すべての処方物は、最適な用量で投与される場合、類似の抗腫瘍活性を有した。２．残渣のクロロホルムを含有しない調製物これらの研究は、乾燥脂質で調製されたリポソームPt-複合体の懸濁液でなされた。NDDP安定性と抗腫瘍活性との間の関係を、インビボL 1210白血病モデルを用いて再度研究した。表３は、異なるpHの生理食塩水溶液で再構成され、そして再構成後に異なる時点において投与された、処方物による結果を示す。（値は２つの別個の実験の平均である。）表３ L 1210白血病に対するリポソームNDDPの抗腫瘍活性 pH3.0、5.0、および7.0の生理食塩水で再構成したリポソームNDDPの最適な用量は、それぞれ25mg/kg、50mg/kg、および100mg/kgであった。従って、pHが低くなるほど、増大させたリポソーム内薬物の分解／活性化との良好な相関関係での調製物の効力はより高くなる。最適用量にて得られた％T/Cはそれぞれ、214、27 1、および271であった。薬物投与の時間の遅れは、増大した薬物活性化と時間との間の良好な相関関係で、処方物の抗腫瘍活性を増大させる。しかし、抗腫瘍活性は、活性化プロセスの間にリポソーム内で形成される活性化Pt-種の計算量とは完全には相関しなかった。例えば、pH7.0での100mg/kgは、pH5.0で50mg/kgのような類似の％T/C値を提供するが、pH7.0（10mg/kg）で10％のNDDPのみ、およびpH5.0（35mg/kg）で約70％のNDDPは、これらの条件下で活性Pt-種に形質転換する。さらに、インビボ活性化はそれ故、これらの矛盾を説明するために起こならければならない。考察本発明者らの結果は、酸性リン脂質を含むリポソームで包括され、塩素のドナーとしての塩化ナトリウムまたは残留クロロホルムが存在する場合、NDDPおよびその異性体がDACH-Pt-Cl₂のプロドラッグであることを示す。NDDPのDACH-Pt-Cl₂ への変換率（rate）は、リポソーム懸濁液のpHに直接関係する。実施された研究は、DMPGおよび他の酸性リン脂質が、リポソーム膜内に酸性環境を与えることによって、反応を促進（enhance）することを示す。本発明者らが前に仮定したように、NDDPの活性中間体の一つとしてのDACH-Pt-DMPG複合体を形成するNDDPとDM PGとの間の直接反応を支持する証拠は、生じ得ず、DACH-Pt水性種（aquated spe cies）の形成もない。 DACH-Pt-Cl₂は、Pt-複合体のDACHファミリーの主要化合物である。しかし、水への溶解性に欠けるために、これは開発されなかった。本発明者らは、リポソーム包括用のこの化合物を最初に考えたが、これはほとんどの有機溶媒に不溶であるので、これはリポソーム処方用の不適切な薬剤であることを決定した。DACH-P t-Cl₂は、ジメチルホルムアミド（DMF）にのみ良好な溶解性を有する。DMFは非常に高い沸点を有し、従って、標準エバポレーション方法を用いてリポソームを調製するのに使用され得ず、そしてDMFは、凍結乾燥法に使用されるどんな有機溶媒にも不溶である。本発明者らの研究は、DACH-Pt-Cl₂は、記載の条件下リポソーム膜内で生成され得ること、および薬剤が、漏れ出ることなしに、リポソーム領域に残り、少なくとも２４時間で結晶化することを示す。対照的に、DACH-P t-Cl₂は、NDDPからHClの添加により形成された場合、素早く沈澱する。これらの結果は、化合物が包括前駆体からインサイチュで合成され、かつリポソームがその自発的な沈澱を防ぐ、リポソーム処方物の第１の例を構成する。結果は、この非常に興味のある化合物のために非常に必要とされる送達システムの開発のための手段を提供するので、奨励されるものである。強力なストラテジーは、NDDPの80%を越えるDACH-Pt-Cl₂への速い変換を誘導するために、酸性の生理食塩水溶液をまず使用し、続いて所定時間後、緩衝溶液を添加し、pHを7.0より高くし、反応を停止することによる２段階の再構成手順を使用することである。本発明によるリポソームは、天然のまたは合成のリン脂質を含む種々の両親媒性物質から調製され得る。多くの適切なリン脂質が当該分野で周知である。本発明のリポソームは、多層または単層であり得、不特定の層構造を有し得る。このようなリポソームを含む薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、ならびに他の薬学的に受容可能なアジュバントを含み得る。本発明のリポソーム組成物は、哺乳類の、特にヒトの腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用され得る。本発明の組成物は、種々のヒト悪性腫瘍、特に任意の白金感受性癌（卵巣、精巣、肺、頭部および頚部、食道、ならびに膀胱の、腫瘍、肉肺、リンパ腫、および中皮腫を含む）の処置に有用であるべきである。本発明の組成物を使用する方法は、哺乳類に腫瘍増殖を阻害するのに有効な量の組成物を投与する工程を含む。投与する工程は、適切に、非経口的であり得、および静脈内、動脈内、筋内、リンパ系内、腹腔内、皮下、胸膜内、もしくはくも膜下腔内注射により、または局所的適用もしくは経口投与による。このような投与は、腫瘍退行または消失が達成されるまで、好ましくは、時間を決めたスケジュールで繰り返され、他の形式の腫瘍治療（例えば、外科手術、または異なる薬剤を用いる化学療法）と組み合わせて使用され得る。本発明による組成物の投与量は、好ましくは、それが投与される哺乳類被験体の体重の約100〜750mg/kgの間である。本発明の特定の実施態様の以上の説明は、本発明のあらゆる可能な実施態様の完全なリストであることを意図しない。当業者は、本明細書に記載の特定の実施態様に修飾がなされ得ること、それが本発明の範囲内であることを理解する。参考文献以下の参考文献は、例示的な手順または他の詳細を本明細書中に記載の範囲に補充する程度まで、本明細書中で参考として特に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．リポソーム中に包括された以下の式を有する白金錯体を含む、リポソーム性抗腫瘍組成物であって： R₁-Pt-X₂ ここで、Ｒ₁がジアミノシクロアルキルであり、かつＸがハロゲンである、組成物。２．Ｒ₁が約３〜約６個の炭素原子を有する、請求項１に記載の組成物。３．Ｒ₁が1,2-ジアミノシクロヘキサンである、請求項１に記載の組成物。４．Ｘが塩素である、請求項１に記載の組成物。５．前記リポソームが酸性リン脂質を含む、請求項１に記載の組成物。６．前記リポソームがジミリストイルホスファチジルグリセロールを含む、請求項１に記載の組成物。７．前記白金錯体が前記リポソームの二重層の間に介在している、請求項１に記載の組成物。８．リポソームの二重層の間に介在した以下の式を有する白金錯体を含む、リポソーム性抗腫瘍組成物であって： DACH-Pt-Cl₂ ここで、DACHはジアミノシクロヘキサンであり；そして、ここで該リポソームがさらにジミリストイルホスファチジルグリセロールを含む、組成物。９．腫瘍の増殖を阻害する方法であって：哺乳動物に、腫瘍の増殖を阻害するのに有効な量の、リポソーム中に包括された以下の式を有する白金錯体を含む組成物を投与する工程を包含し： R₁-Pt-X₂ ここで、Ｒ₁がジアミノシクロアルキルであり、Ｘがハロゲンである、方法。１０．Ｒ₁が約３〜約６個の炭素原子を有する、請求項９に記載の方法。１１．Ｒ₁が1,2-ジアミノシクロヘキサンである、請求項９に記載の方法。１２．Ｘが塩素である、請求項９に記載の方法。１３．前記リポソームが酸性リン脂質を含む、請求項９に記載の方法。１４．前記リポソームがジミリストイルホスファチジルグリセロールを含む、請求項９に記載の方法。１５．前記鉗体が前記リポソームの二重層の間に介在している、請求項９に記載の方法。１６．腫瘍の増殖を阻害する方法であって：哺乳動物に、腫瘍の増殖を阻害するのに有効な量の、リポソームの二重層の間に挿入された以下の式を有する白金錯体を含む組成物を投与する工程を包含し： DACH-Pt-Cl₂ ここで、DACHはジアミノシクロヘキサンであり、そしてここで該リポソームがジミリストイルホスファチジルグリセロールをさらに含む、方法。１７．抗腫瘍組成物を調製する方法であって：リポソーム中に包括された以下の式(I)を有する白金錯体を含む組成物のpHを調整する工程であって、ここで、Ｒ₁がジアミノシクロアルキルであり、そしてＲ₂およびＲ₃がそれぞれ以下の式を有し、ここで、Ｒ₄、Ｒ₅、およびＲ₆は、それぞれ独立して１〜約１０個の炭素原子を有する炭化水素部分であり、それにより該錯体(I)を以下の式(II)を有する錯体に変換する工程を包含し、 R₁-Pt-X₂ (II) ここで、Ｒ₁がジアミノシクロアルキルであり、Ｘがハロゲンである、方法。１８．前記pHが約２と約6.5との間に調整される、請求項１７に記載の方法。１９．Ｒ₄、Ｒ₅、およびＲ₆が、それぞれ独立して１〜約６個の炭素原子を有するアルキルである、請求項１７に記載の方法。２０．Ｒ₄、Ｒ₅、およびＲ₆が、それぞれ独立して１〜約３個の炭素原子を有するアルキルである、請求項１７に記載の方法。２１．前記錯体(I)が、前記リポソーム内で前記錯体(II)に変換される、請求項１７に記載の方法。２２．前記pHが、前記リポソームを酸性溶液と接触させることにより調整される、請求項１７に記載の方法。２３．前記pHが、前記リポソーム中に酸性リン脂質を含有することにより調整される、請求項１７に記載の方法。２４．前記リポソームがジミリストイルホスファチジルグリセロールを含む、請求項１７に記載の方法。２５．Ｒ₂およびＲ₃がネオデカノアトである、請求項１７に記載の方法。２６．Ｒ₁が約３〜約６個の炭素原子を有する、請求項１７に記載の方法。２７．Ｒ₁が1,2-ジアミノシクロヘキサンである、請求項１７に記載の方法。２８．Ｘが塩素である、請求項１７に記載の方法。２９．前記錯体(I)が前記リポソームの二重層の間に介在している、請求項１７に記載の方法。３０．前記錯体(II)が前記リポソームの二重層の間に介在している、請求項１７に記載の方法。３１．前記錯体(I)が、cis-ビス-ネオデカノアト-trans−R,R-1,2-ジアミノシクロヘキサン白金(II)である、請求項１７に記載の方法。３２．所定の時間の後に、続いて前記pHを約７に再調整する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。３３．抗腫瘍組成物を調製する方法であって：リポソーム中に包括されたcis-ビス-ネオデカノアト-trans-R,R-1,2-ジアミノシクロヘキサン白金(II)を含む前記組成物のpHを７より低いレベルに調整し、それにより該白金錯体をジクロロジアミン白金(II)に変換する工程、および所定の時間の後に、該pHを少なくとも約７に調整する工程、を包含する、方法。３４．本質的に生物学的に活性な化学的部分を哺乳動物の内部へ送達する方法であって、以下の工程を包含する、方法：生物学的に活性な部分のプロドラッグの水性処方物を提供する工程であって、該プロドラッグはリポソーム中に包括されており、該プロドラッグは酸性pHを有する溶液に曝露されることにより生物学的に活性な部分をさらに形成し得る、工程；該pHを酸性レベルに下げる工程であって、これにより該プロドラッグを生物学的に活性な化合物に変換する工程；および該水性処方物を哺乳乳動物に投与する工程。３５．前記生物学的に活性な部分が抗腫瘍剤である、請求項３４に記載の方法。３６．前記pHが、前記リポソーム中に酸性リン脂質を含むことにより下げられる、請求項３４に記載の方法。