JP2002511867A - 腸管透過性を増強させるための医薬の製造におけるブロメラインの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ブロメラインは腸管透過性を増強させることができる。従ってインスリンなどのタンパク質や他の高分子生物活性薬物の吸収を増加させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 腸管透過性を増強させるための医薬の製造におけるブロメラインの使用 本出願は消化管透過性の向上に関し、特には腸からの高分子吸収の増大に関す る。 薬学的化合物の経口投与は、好まれる投与経路であることが極めて多い。患者 は、静脈内や筋肉内注射といった他の経路よりむしろ薬剤を経口で服用するのを 好む傾向にあり、こうして患者の協力をより得るための経口投与用の薬の剤型が 一般に承認されている。 しかし、投与される薬剤が高分子であり、このような高分子が一般に腸から容 易に吸収されないような場合には、問題が生じる。その結果、例えばインスリン のような多くの高分子が現在注射により投与されている。これは経口剤をたいへ ん好む患者にとって不評である。 腸管上皮は外部環境と内部宿主環境の間の最も広い界面（2，000，000ｃｍ²以 上）であり、分子を吸収したり分泌したりできる主要な障壁を構成する。腸管上 皮は管腔内容物と上皮の下にある間隙や血管の流体との自由な混合を防止する障 壁として作用する。能動的又は促進的な経細胞メカニズムにより輸送される分子 を除いて、巨大かつ親水性の高分子の吸収はほとんど細胞近傍経路（paracellul lar pathway）（マダラ及びトリエル、1986）のみに限られる。正常な条件下で は、細胞近傍経路を介した分子の輸送はIIXより小さい分子半径を有する分子に 制限される（バッカー及びグルート、1989）。細胞近傍輸送についての主要な障 壁は密着結合又は閉鎖帯であり、それらは各細胞を周囲から包み込みそれをその 隣接細胞と結び付ける上皮細胞の原形質膜上の狭い帯状構造物である（マダラ、 1988）。密着結合には二つの機能が知られている。第１は、塩吸収のようなベク ターの経上皮輸送工程に要求される膜の表面極性の維持を助けることである。第 二は、拡散の障壁として作用する。 過去に、密着結合を緩めることにより細胞近傍輸送を増大させようとする試み が、吸収増強剤により導かれた許容し得ない副作用のために、阻止されたことが ある（リーら、1991;ムラニシ、1990;ホッホマン及びアルトゥールソン、1994; シティ、1992）。一般に、これらの薬剤は二つのクラスに分けられる。第１はカ ルシウムキレート剤であり、第２は界面活性剤である（ホッホマン及びアルトゥ ールソン、1994）。両タイプの薬剤とも分子の吸収を促進する薬剤としての有効 性を制限する性質を有する。カルシウムキレート剤の場合は、Ca²⁺消耗がアクチ ンフィラメントの崩壊、付着接合の崩壊及び細胞接着の減少などの細胞内に広範 囲の変化を引き起こす（シティ、1992）。界面活性剤の場合は、これらの薬剤の 潜在的な溶解作用が腸管上皮の剥脱を引き起こし、その障壁機能を不可逆的に弱 める可能性がある（ホッホマン及びアルトゥールソン、1994）。 今日まで、細胞近傍経路を介する経口薬の送達は、密着結合生理学の理解が限 られているため、また腸管の完全性や機能を不可逆的に弱めることなく密着結合 の透過性を増大させることができる物質がないために、理解できないままであっ た（リーら、1991;ムラニシ、1990；ホッホマン及びアルトゥールソン、1994;シ ティ、1992）。しかし、最近ファサノとその共同研究者ら（1991、1992）は、細 菌コレラ菌（Vibrio cholerae）により産生されるＺｏｔ（閉鎖帯毒）というタ ンパク質を発見した。これは上皮細胞の細胞骨格組織を変えて密着結合を開口さ せる。Ｚｏｔの作用は、アクチンフィラメントの重合とその再配置を行うタンパ ク質キナーゼＣの活性化により媒介され、それによって密着結合と腸管の透過性 を調節する（ファサノら、1995）。Ｚｏｔの作用は可逆的であり、時間と投与量 に依存しており、そしてＺｏｔは結腸透過性ではないので、Ｚｏｔの作用は小腸 に限られる（ファサノ、1991;ウッザウ、1996）。Ｚｏｔは密着結合活性と細胞 近傍経路を調節するので、Ｚｏｔは経口投与した高分子の細胞近傍経路を介する 腸管吸収を増強させるために用いられるであろう。実際、最近の研究では、Zot とインスリン（5733Da）又は免疫グロブリンＧ（140〜160,000Da）との同時投 与によりこれらの分子の吸収が向上することがわかった。経口投与したインスリ ンは血液グルコース濃度の有意な減少を導く10IUほどの低投与量のインスリンで 生物学的に活性である。Ｚｏｔなしに投与したインスリンは血液グルコースレベ ルに影響しなかった。糖尿病のラットでは、経口送達したインスリンは、Zotと 同時投与した場合、血液グルコースレベルの制御において非経口投与したホルモ ンと同様に有効であった（ファサノ及びウッザウ、1997）。組織学的研究により 決定されたときＺｏｔでの治療による小腸の損傷は観察されなかった。 本発明者らはこの度、密着結合活性を調節する他の一つの物質を発見した。本 発明者らはパイナップルの茎由来のブロメラインがＺｏｔ様の様式で生理学的に 作用することを明らかにした。以下に記載する実験において、ブロメラインは腸 管透過性における投与量依存的な増大を引き起こし、それは確かに可逆的である 。従って、ブロメラインは腸管の透過性を増強さるせる方法において有用である 。 腸管の透過性を増強させるこの効果は、腸管からの巨大分子の吸収を増大させ る方法においてブロメラインが有用であることを意味する。 従って、本発明の第一の側面では、腸管からの高分子生物活性薬物の吸収を増 大させる経口投与薬の調製におけるブロメラインの使用が提供される。 本発明はタンパク質及び他の高分子生物活性薬物を経口経路により投与するこ とを可能にするものとして特に有益である。これは患者の協力の可能性を非常に 大きくする。さらなる利点として、ブロメラインは比較的低コストで広く入手可 能なよく知られた物質であり、Ｚｏｔとは異なって、病原性生物由来ではない。 さらに、密着結合に対するブロメラインの作用は可逆性であり、望ましくないい かなる副作用も直ちにかつ容易に治療することができる。最後に、ブロメライン は、期待されるように、栄養流入に対する害作用を有することもなさそうである 。 ブロメラインによる抗生物質、テトラサイクリン及びペニシリンのような小さ い分子の吸収の増大が報告された（ロッツ−ウインター、1989による総説）。作 用メカニズムは未知であったが、ブロメラインは腸管裏張りに対する損傷のよう な非特異的メカニズムにより吸収を増大させるものと考えられた。このようなメ カニズムはブロメラインが薬学的使用のための薬剤として相応しくないことを示 唆していた。さらに、抗生物質は比較的小さい分子であるので、ブロメラインが 抗生物質よりずっと大きい高分子の吸収を増大させるとは予期されなかった。 本発明者らは、驚くべきことに、ブロメラインが損傷を引き起こすことなく腸 管上皮の透過性を可逆的に増大させることを発見した。このようにして、小さい 分子の吸収はもとより、高分子生物活性薬物の吸収をも増大させることが可能と なる。さらに、この効果は可逆性であるので、ブロメラインの毒性は以前に信じ られたものよりずっと低いもののようである。 ブロメラインとはパイナップル科（Bromeliaceae）植物の組織にみられるタン パク質分解酵素の総称である。ブロメラインはパイナップル（アナナス・コモス ス（Ananas comosus））の茎から誘導される様々な部分の混合物である。少なく とも5つのタンパク質分解酵素を含むが、酸性ホスファターゼやペルオキシダー ゼのようなタンパク質非分解酵素も含み、アミラーゼやセルラーゼ活性も含む。 さらに、様々な他の成分、特に有機的に結合したカルシウムも存在する。ブロメ ラインはタウシッグ及びバトキンによる総説がある（J．Ethnopharmacol.，22、 191〜202頁（1988））。それは様々な国でANANASE、ANANASE FORTE、EXTRANASE 、PORTEOLIS、RESOLVIT、ROGORIN、BROMASEやTRAUMANASEといった商標のもとに 入手可能である。 本発明に関して、用語「高分子生物活性薬物」とは、タンパク質、糖タンパク 質、オリゴペプチド又はポリペプチド、例えばDNA又はRNAのようなポリヌクレオ チド、多糖又は11Xより大きい分子半径を有する他の巨大分子といった生物活性 を有するいかなる分子をも指すものである。 その吸収を改善するためにブロメラインと共に経口投与されるであろう高分子 生物活性薬物の具体的な例としては、例えばインスリン、グルカゴン、副甲状腺 ホルモンやそのアンタゴニスト、カルシトニン、バソプレッシン、レニン、プロ ラクチン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、カルチシトロピン（carticitro pin）、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、イン ターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ガンマグロブリン及び第VIII 因子のような血液凝固因子などのタンパク質及びペプチドが挙げられる。 ブロメラインと共に投与されるであろう活性分子の他のカテゴリーは、エステ ラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼやペプチダーゼなどのトランスフェラ ーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、プロテアーゼ、リガーゼやオキシドレダク ターゼ類といった生理学的に活性な酵素類、及びロイペプチン（leupeptin）、 キモスタチン（chymostatin）やペプスタチンなどの酵素阻害剤、及び腫瘍性血 管形成因子、表皮成長因子、神経成長因子やインスリン様成長因子などの成長因 子などである。 さらに、この高分子は抗体又はワクチンであってもよく、タンパク質性ワクチ ン又は弱毒化した生物ですらありうる。 ブロメライン及び高分子生物活性薬物は一緒に投与しても又は別々に投与して もよい。それゆえ本発明のさらなる一側面では、ブロメラインと高分子生物活性 薬物からなる生産物は、この高分子生物活性薬物が治療剤であるような病状の治 療において、同時に、別々に、又は連続して使用するための組み合わせ経口製剤 として提供される。 本発明はまた、ブロメラインと高分子生物活性薬物、及び薬学的に許容され得 る賦形剤又は担体からなる経口投与用薬学的組成物を提供する。 ブロメラインは経口投与に適した剤型であれば、生物活性薬剤と一緒に提供し ても又は別々に提供してもよい。このような剤型としては、シロップ剤、エリキ シル剤、錠剤及びカプセル剤が挙げられ、これらのタイプの製剤の調製はすべて 製剤技術分野の技術者であれば熟知している。 生物活性材料がブロメラインと共に含有される場合には、剤型はエマルジョン 剤、微小エマルジョン剤又はミセル溶液又はリポソーム溶液の形態をとってもよ い。 胃を通過するブロメライン混合物の様々な成分の存続を助けるためには、ブロ メラインを腸溶保護した製剤中に調製することが得策である。ブロメラインの腸 溶被覆錠剤は入手可能（例えば英国ではANANASE FORTEという商標で）である。 他の経口投与可能な剤型としてはシロップ剤、エリキシル剤や同じく腸溶被覆し ていてもよい硬質及び軟質ゼラチンカプセル剤が挙げられる。前記したとおり、 この製剤は生物活性薬剤を含有していてもよく、あるいは生物活性薬剤とは別々 に又は連続して投与されてもよい。 ブロメライン活性は広いpH範囲（pH2〜9）にわたって安定している。従って、 胃の酸性条件からブロメラインを腸溶保護（又は腸溶被覆）する必要がないこと もある。しかし、消化管での酸性プロテアーゼによる消化からブロメラインを保 護するためには必要であろう。従って、ブロメラインは例えば重炭酸塩のような 緩衝剤とともに投与してもよい。 ブロメラインの投与量は通常、Rorer単位、FIP単位、BTU（ブロメライン チ ロシン単位）、CDU（カゼイン消化単位）、GDU（ゼラチン消化単位）又はMCU（ ミルク凝固単位）で測定する。プロテアーゼ活性の1Rorer単位は、pH7、25℃で 標準カゼイン基質を加水分解して280nmで１分間あたり0.00001の吸光度の増大を 引き起こすような酵素量として定義される。ブロメライン活性の1FIP単位は、 標準的な条件下、1分間あたり、特異的タンパク質沈殿試薬によっては沈殿され ないペプチドの遊離量が、275nmでチロシン1molと同じ吸光度を与える初期速度 で、（FIP制御された）適切な調製物を加水分解する標準調製量に含まれるもの である。BTU、CDU、GDU及びMCUは以下のように文献に定義されている。BTU 1ブロメラインチロシン単位はアッセイ条件の下（例えばpH5、30℃で酸変性した ヘモグロビン基質の消化後）で、１分間あたりチロシン１マイクロモルを遊離す る酵素量のことである。CDU 37℃で１分間消化した後、pH7.0で標準カゼイン基質からチロシン１マイクログ ラムを遊離する酵素量。GDU 45℃、pH4.5で20分間消化した後、標準ゼラチン溶液からアミノ態窒素１ミリグ ラム（10^-3g）を遊離する酵素活性。 1100BTU/g=750CDU/mg=1200GDU/g 正確な投与量は医師や臨床医のコントロールによればよいが、50〜4000GDU/日 の一日投与量、例えば100〜1000GDU/日の一日投与量が、適当であることが分か るであろう。生物活性薬剤が吸収されるのに適する時間に腸管透過性が増大する ように時間を選んでブロメラインが投与されるので、正確な投与のパターンは高 分子生物活性薬物の投与パターンに左右されることになる。 前記したように、本発明の一つの特別な利点は、ブロメラインにより誘導され る腸管透過性増大が容易に逆行することである。このことは患者への抗ブロメラ イン抗体投与によりもたらされるであろう。この抗体は通常IgGイソタイプのも のであり、例えばウサギにブロメラインを注射し、適当な時間が経過した後ウサ ギから抗体を抽出するといった慣用の方法により生成させ得る。 このように、本発明のさらなる側面では、ブロメラインにより誘導され増大し た腸管透過性を逆行させる薬剤の調製における抗ブロメライン抗体の使用が提供 される。 本発明の有効性はこの理論が真実であるか否かに左右されるものではないが、 ブロメラインの作用メカニズムは細胞内シグナル伝達経路の活性の調節能により 媒介されると考えられる。密着結合及び障壁機能の生理学的調節は、アクチン細 胞骨格の集合及び解体を制御する二次メッセンジャー及びシグナル伝達経路によ り影響される。Rho GTPアーゼファミリーの構成員であるチロシンキナーゼ、Ca^{2 +} 、タンパク質キナーゼＣ、アデノシン3'，5'-サイクリックーリン酸（cAMP）及 びホスホリパーゼＣはアクチン細胞骨格構成の制御において鍵となるプレーヤー であるようである（アンダーソン及びバンイタリエ、1995;タポン及びホール、1 997）。先に、本発明者らはブロメラインが細胞内の二次メッセンジャーである 、cAMP、cGMP及びCa²⁺の効果を防止することを示した（ミノットら、1997）。ミ ノット及びエングベルダ（1996）は、ブロメラインが前記したRho GTPアーゼフ ァミリーの構成員でありアクチン細胞骨格の構成を制御する鍵分子の仲間である Rac及びCdc42により活性化されるMAPキナーゼ経路の活性化を防止することも示 した。 本発明を以下の実施例及び図面を参照してより詳しく記載する。 図１は、ウサギ回腸Iscに対するブロメラインの効果を示す。ブロメライン（ ）（:15g/ml）、PBS（N）、又は特異的抗ブロメライン抗体と共に前インキュ ベーションしたブロメライン（◆）を、ゼロ時点で粘膜溶液及び漿膜溶液に添加 した。バーを付した印はn=9の組織対の平均±SEをあらわす。Pはペアt検定によ り決定された有意性をあらわす。 図２は、ウサギ回腸Ｒ_tに対するブロメラインの効果を示す。（Ａ）Ｒ_tに対す るブロメラインの投与量の効果。バーを付したカラムはブロメライン添加後60分 のn=4の組織対のＲ_t±ＳＥにおける平均変化をあらわす。Ｐ値はＡＮＯＶＡによ り決定された有意性をあらわす。（Ｂ）抗ブロメライン抗体を用いたブロメライ ンの中和及びブロメラインの除去の、Rtに対する効果。ブロメライン（ ）（:1 5g/ml）、PBS（N）、又は特異的抗ブロメライン抗体と共に30分間前インキュベ ーションしたブロメライン（◆）を、ゼロ時点で粘膜溶液及び漿膜溶液に添加し た。バーを付した印はn=4の組織対の平均±SEをあらわす。Ｐ値はペアt検定によ り決定された有意性をあらわす。実施例 材料及び方法 試薬類 。 ¹⁴Ｃで標識した、グルコース、ロイシン、リシン、グルタミン酸、グ リシン−フェニルアラニン及び³Ｈで標識したイヌリンをアマシャム（イタリア 国、ミラノ）より購入した。タンパク質分解活性はブロメラインチロシン単位（ BTU）で測定した。IBTUはpH7.0で標準カゼイン基質を37℃で１分間消化した後チ ロシン1マイクロモルを遊離する酵素量である。粗ブロメライン抽出物（タンパ ク質分解活性、1877BTU/g¹）はマイルズ・サイエンティフィック（インディアナ 州、エルクハート）から得た。ユッシングチャンバー実験 。実験は過去の記載（フィールドら、1971）にファサ ノら（1991）に記載された修飾を用いて行った。研究はユニバーシティ・オブ・ メリーランド，ボルチモアのインスティチューショナル・アニマル・ケア・アン ド・ユース・コミティーにより承認された。雄ニュージーランド種白色ウサギ（ 2〜3kg）はチャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリーズ（マサチュー セッツ州、ウィルミントン）から得た。動物を子宮頚部脱臼により屠殺し、遠位 回腸の15cm片をすばやく切除し、腸間膜境界に沿って切開した。回腸を濯いで管 腔内容物をきれいにし、平滑切開法により粘膜層及び漿膜層を剥ぎ取った。一 体の動物から調製した粘膜部分を開口部1.12cm²のルサイト・ユッシング・チャ ンバー（ワールド・プリシジョン・インストルーメンツ、Sarasota、FL）に載せ た。組織の各表面を絶えずNaCl（53mM）、KCl（5mM）、Na₂SO₄（30.5mM）、マン ニトール（30.5mM）、Na₂HPO₄（1.69mM）、NaH₂PO₄（0.3mM）、CaCl₂（1.25mM） 、MgCl₂（1.1mM）及びNaHCO₃（25mM）を含有する新たに調製したリンガー液に浸 した（表面あたり10ml）。浸した溶液を一定温度循環ポンプに接続したウォータ ージャケット容器を用いて37℃に維持し、95％O₂/5％CO₂を通気した。次に、ポ テンシャル差（組織の粘膜側と漿膜側の間の電圧差、PD）を開放回路条件下で測 定した。100:Ａの電流通過により生じる電圧上昇を用いて、短回路電流（PDをゼ ロにするために必要な電流量）及びオームの法則（Ｉ_sc=PD/Ｒ_t）による組織抵 抗（Ｒ_t）を計算した（フィールドら、1971）。組織を載せる前に、流体抵抗を 測定し、計算に取り込んだ。組織を載せた後と実験の前に、I_scを約10分間隔で 、安定した状態に達するまで測定した。各動物から得た組織の4又は8部分を同時 に載せ、各実験に用いた。実験に先立ち組織の微小孔を試験するために、0.01M グルコース及び0.01Mマンニトール、希釈したリンガー液を漿膜側及び粘膜側に それぞれ添加した。Na−グルコース共輸送を反映するＩ_scの増大が示されるとき は、漿膜に添加したグルコースは粘膜表面の孔を通って拡散されるので、組織を 廃棄した。実験はすべて、類似の抵抗を示す組織について行った（±10％）。回腸のＩ_sc及びＲ_tに対するブロメラインの効果 。組織が安定な状態に達した時 、リン酸緩衝化食塩水（0.1M、pH7.4、PBS）中に希釈したブロメライン（15μg/ ml）又は対照としてのPBS単独を、載せた組織の粘膜及び漿膜の両表面に添加し た。次に、Ｉ_sc、PD及びＲ_tにおける変動を2時間、5〜10分ごとに記録した。ブロメライン活性の中和 。ユッシングチャンバー実験において、ブロメラインに 対して形成させた抗体（免疫グロブリン[Ig]G）をＩ_scに対するブロメラインの 阻害効果を遮断するために用いた。ウサギに4週間おきにブロメライン60：gを３ 回皮下注射した。全ての免疫化について、ブロメラインをフロイント不完全アジ ュバントで乳化した。動物を最後の免疫化の２週間後に瀉血した。IgG分画を 、製造者に指示された通りにタンパク質ＡセファロースCL-4B（ファルマシア） を用いるタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより調製した。ユッ シングチャンバーでのウサギ回腸の処置に先立ち、抗ブロメラインIgGをPBSで1: 100希釈し、等容量のブロメラインと共に30分間、37℃で前インキュベートした 。対照チャンバーを抗体単独と共にインキュベートした。流入実験 。流入実験は過去の記載（グアンダリーニら、1988）に従って行った。 雄ニュージーランド種白色ウサギ（2〜3kg）を子宮頚部脱臼により屠殺した。遠 位回腸の25cm片を切除し、腸間膜境界に沿って切開し、冷リンガー液で濯いで腸 管内容物を除去した。腸管の２つの10cm片をルサイト流入チャンバーにすばやく 載せ、この時4つの粘膜側隣接部分（表面積0.28cm²）を30分間、37℃で前インキ ュベーション溶液に曝し、95％O₂/5％CO₂を通気した。前インキュベーション溶 液はグルコース流入を観察する研究用には1mg/ml、アミノ酸及びジペプチドの流 入を観察する研究用には15μg/mlのブロメラインを含んでいた。対照の組織はリ ンガー液単独と共にインキュベートした。前インキュベーション溶液を細胞外空 間のマーカーとして¹⁴C標識栄養素及び³Hイヌリンを含むリンガー液と置き換え た時点で研究を開始した。この溶液におけるインキュベーションは45〜50秒間で あり、標識を含む溶液をすばやく除去し、冷0.3Mマンニトールを添加することに より停止しした。次に、曝した組織各片を切開し、ろ紙上に穏やかにブロットし 、10％トリクロロ酢酸中でホモジナイズし、微粒物を沈殿させるために遠心分離 した。上澄みの一部をHpb Beckmanシンチレーション液（イタリア国、ミラノ） を用いて、Beckman LS 7500Beta計測器で放射活性を検定した。計算は過去の記 載（ルブノら、1971）により行った。データ解析 。各実験につき、ブロメライン処理した組織から得たデータをその対 のPBS対照と比較した。ペアt検定（スチューデントt検定、二元配置）を用いて Ｉ_sc、Ｒ_t及びPD応答の平均の間の差及び栄養素の取り込みの差を比較した。複 数処理の平均をPBS対照と比較する場合は、分散分析（ANOVA）を用いた。Ｉ_sc値 及びＲ_t値を示す数値データは平均±標準誤差として表される。PDの変化はＩ_{s sc} の変化に従ったので、Ｉ_scの変化のみを示す。結果 Ｉ_sc及びＲ_tに対するブロメラインの効果 。ユッシングチャンバーに載せたウサ ギ回腸は、粘膜及び漿膜の両表面をブロメライン（15:g/ml）で処理した。ブロ メライン添加は一時的なI_sc増大を引き起こし、添加30分後にはほぼベースライ ン値に戻った（図1）。I_sc応答はブロメラインを抗ブロメラインIgGと共に前イ ンキュベートすると、阻止することができた。Ｉ_scに対するブロメライン効果を 中和する抗体の能力は、Ｉ_scの一時的な増大が粗ブロメライン抽出物中に存在し たであろうNa⁺と栄養素の共輸送の結果ではなかったことを示唆するものであろ う。 ブロメライン添加は投与量に依存してＲt減少をも引き起こした（図2A）。こ のＲ_t減少は容易に回復させることができ、ブロメラインを除去すれば、Ｒt値は ベースライン値まで増大した（図2B）。対照の組織、又はブロメライン及び抗ブ ロメラインIgGとインキュベートした組織では、Ｒ_t変化観察されなかった。グルコース及びアミノ酸の腸管流入 。ブロメラインのタンパク質分解活性により 小腸損傷の可能性があるので、本発明者らは栄養素流入に対するその効果を調べ た（インキュベーション培地から粘膜細胞中への栄養素の一定方向の流入の初期 速度）。ブロメラインの存在下及び非存在下におけるグルコース、グルタミン酸 、リシン、ロイシン及びジペプチド、グリシン−フェニルアラニンの流入を試験 した。 流入研究では、グルコース及びアミノ酸の流入に対する干渉はなく、このこと から栄養素取り込みにとって重要な栄養素担体に対する害作用はないことが示さ れた（表１参照）。 グルコース（K_t）の腸管粘膜に対する親和性及びグルコースの粘膜細胞内への 最大流入（V_max）（ルビノら、1971）はブロメラインによる影響を受けなかった （表1）。ブロメライン処理した組織と処理していない組織の間の差が有意でな いとしても、ブロメライン処理した組織では栄養素の流入が増大する傾向がある ことは注目に値する。ブロメライン（15:g/ml）で処理した組織の電子顕微鏡及 び組織学的検査では、組織の損傷の証拠はみられなかった（Munott、1993）。考察 腸管上皮のブロメライン処理は投与量依存的に腸管透過性を増大させ、これはブ ロメラインを除去すると回復した。原形質膜の抵抗は比較的高いので、経上皮抵 抗の変動は細胞間空間を通る組織透過性の修飾を反映する（マダラ、1989）。密 着結合は細胞近傍経路の主な障壁であるので、ブロメラインが密着結合を修飾し ている可能性がある。この効果は興味のあるところであり、Ｚｏｔによる経上皮 透過性の増大が細胞間密着結合構造の修飾と一致するというＺｏｔ様活性（ファ サノら、1991）を連想させる。Ｚｏｔ及びブロメラインの効果の経時的変化も同 様である。 本発明者らは、ブロメラインがウサギ回腸において一時的なＩ_sc増大を引き起 こすこと、そしてこの増大が特異的抗体を用いて中和することが可能であること を特記した。組織のＩ_sc及びＲ_tに対するブロメラインの効果はCa²⁺により調節 されるであろう。タプシガルギン（thapsigargin）、カルシウムイオノホア及び カルバコール（carbachol）のような薬剤は組織Ｉ_scの一時的な増大を引き起こ し、20〜30分後にはベースライン値に戻る（ダームサタホーン及びパンドール、 1986;トレイノール−カプランら、1994）。組織透過性の増大はCa−アゴニスト 作用とも関連する。Ca²⁺細胞内濃度の増大は細胞骨格のアクチンフィラメントの 再配置及び密着結合の再集合を介する腸管透過性の増大を生じる（アンダーソン 及びバンイタリエ、1995）。ブロメラインの効果はMAPキナーゼに対する効果に より発揮されることもあろう。先に、ミノット及びエングベルダ（1996）はブロ メラインがチロシンリン酸化及びMAPキナーゼ活性の調節を阻害することを示し た。MAPキナーゼは、細胞骨格の配置を制御する鍵分子の仲間であるRho GTPアー ゼファミリーの構成員により活性化される。従って、ブロメラインはMAPキナー ゼ経路に対する効果を介して及び/又はCa²⁺シグナル伝達経路を活性化すること により密着結合活性を調節する可能性がある。 ブロメラインは栄養素流入に対する害作用を示さなかった。これはこの物質の 使用が安全であることを示唆する。実際、ブロメラインは抗炎症剤としての使用 及びIII度熱傷組織切除のための使用といった適用のもと多年にわたり臨床に用 いられてきた（タウシッグ及びバトキン、1988）。 密着結合活性に関連したブロメラインの細胞内シグナル伝達経路制御能及びそ の腸管透過性増大能は、ブロメラインが高分子の吸収を増大させる有用な薬剤で あることを示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 38/28 Ａ６１Ｋ 37/54 38/43 37/26 38/44 37/24 38/45 37/36 38/52 37/32 38/53 37/28 38/55 37/66 Ｈ 39/395 37/465 37/52 37/58 37/60 Ａ６１Ｐ 43/00 37/50 １１１ 37/34 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 トレイシー リーハン ミノット 英国、エスダブリュー７ ２エイゼット ロンドン、エキシビション ロード、デパ ートメント オブ バイオケミストリー、 インペリアル カレッジ オブ サイエン ス、テクノロジー アンド メディシン (72)発明者 アレッシオ ファサノ アメリカ合衆国、メリーランド州 21201 ―1595、ボルチモア、サウス グリーン ストリート 22番地、ユニバーシティ オ ブ メリーランド，ボルチモア、ペディア トリック ガストロエンテロロジー アン ド ニュートリション

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 腸管からの高分子生物活性薬物の吸収を増大させるための経口投与可能な 薬剤の調製におけるブロメラインの使用。 ２． 高分子生物活性薬物がそれに対する治療剤であるような病状の治療におけ る同時、別々又は連続使用のための組み合わせ経口製剤としてのブロメライン及 び該高分子生物活性薬物を含んで成る生産物であって、該高分子生物活性薬物が 、 インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン及びそのアンタゴニスト、カ ルシトニン、バソプレッシン、レニン、プロラクチン、成長ホルモン、甲状腺刺 激ホルモン、カルチシトロピン(carticitropin)、濾胞刺激ホルモン、黄体形成 ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターフェロン、組織プラスミノーゲン 活性化因子、ガンマグロブリン及び第VIII因子などの血液凝固因子、並びにエス テラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼなどのトランスフェラーゼ、ヒドロ ラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ及びオキシドリダクターゼから選択される生理 学的に活性な酵素、並びにロイペプチン、キモスタチン及びペプスタチンなどの 酵素阻害剤並びに腫瘍性血管形成因子、表皮成長因子、神経成長因子及びインス リン様成長因子などの成長因子、並びに抗体、 から選択されるものである生産物。 ３． 高分子生物活性薬物及び薬学的に許容され得る賦形剤又は担体と共にブロ メラインを含んで成る経口投与用の薬学的組成物であって、該高分子生物活性薬 物が インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン及びそのアンタゴニスト、カ ルシトニン、バソプレッシン、レニン、プロラクチン、成長ホルモン、甲状腺刺 激ホルモン、カルチシトロピン(carticitropin)、濾胞刺激ホルモン、黄体形成 ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターフェロン、組織プラスミノーゲン 活性化因子、ガンマグロブリン及び第VIII因子などの血液凝固因子、並びにエス テラーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼなどのトランスフェラーゼ、ヒドロ ラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ及びオキシドリダクターゼから選択される生理 学的に活性な酵素、並びにロイペプチン、キモスタチン及びペプスタチンなどの 酵素阻害剤並びに腫瘍性血管形成因子、表皮成長因子、神経成長因子及びインス リン様成長因子などの成長因子、並びに抗体、 から選択されるものである組成物。 ４． 腸溶被覆されている、請求項２記載の生産物又は請求項３記載の組成物。 ５． シロップ剤、エリキシル剤、又は硬質もしくは軟質のゼラチンカプセルで ある請求項２記載の生産物又は請求項３記載の組成物。 ６． ブロメラインの毎日投与量が５０〜４０００ＧＤＵ／日である、請求項１ 記載の使用又は請求項２〜請求項５いずれか１項に記載の生産物又は組成物。 ７． ブロメラインの毎日投与量が１００〜１０００ＧＤＵ／日である請求項６ 記載の使用、生産物又は組成物。 ８． 該高分子生物活性薬物がインスリンである請求項７記載の使用、生産物又 は組成物。 ９． ブロメラインによって誘導される腸管透過性の増大を元に戻すための薬剤 の調製における抗ブロメライン抗体の使用。