TWI548415B

TWI548415B - 狗圍肛腺瘤之治療方法

Info

Publication number: TWI548415B
Application number: TW103146382A
Authority: TW
Inventors: 陳志毅; 游卓遠; 簡基憲
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2016-09-11
Also published as: TW201622741A

Description

狗圍肛腺瘤之治療方法

本發明係關於一種用以治療狗圍肛腺瘤的新穎方法或組合物。

Pardaxin抗菌胜肽是一種最初分離自一海洋魚類(鰈魚，Pardachirus marmoratus)的抗微生物胜肽(antimicrobial peptide，AMP)；Pardaxin抗菌胜肽已被證實可透化病毒膜、干擾磷酯醯膽鹼與絲胺酸之人工細胞膜、在PC12細胞中刺激鈣吸收、表現離子通道選擇性及發揮抗菌與抗腫瘤的活性[Wu等人，Pardaxin抗菌胜肽，一種魚類抗微生物胜肽，在體外及體內對小鼠纖維肉瘤展現出抗腫瘤活性。Mar Drugs，2012年，第10卷第8期：第1852-1872頁；Huang等人，使用抗微生物胜肽Pardaxin(GE33)以保護帶有皮膚損傷的小鼠對抗耐二甲苯青黴素的金黃色葡萄球菌的感染。Antimicrob Agents Chemother，2014年，第58卷第3期：第1538-1545頁；Pal等人，透過Pardaxin抗菌胜肽，一種透化病膜的魚類毒素，活化水疱性口炎病毒的轉錄。J Virol，1981年，第39卷第2期：第641-645頁；Saberwal與Nagaraj，對應於Pardaxin的疏水性胺基端區域的一種合成胜肽可以干擾磷酯醯膽鹼與絲胺酸之人工細胞膜。Biochim Biophys Acta，1989年，第984卷第3期：第360-364頁；Nikodijevic等人，在PC12細胞中由Pardaxin引發的鈣吸收被鎘阻斷且不為L型鈣通道所調節。J Basic Clin Physiol Pharmacol，1992年，第3卷第4期：第359-370頁；Shai與Oren，細胞溶解素的非鏡像異構物，一類新穎的強效抗菌胜肽。J Biol Chem，1996年，第271卷第13期：第7305-7308頁]。合成的Pardaxin抗菌胜肽以劑量依賴方式抑制HT1080細胞的增殖，且誘導HeLa細胞內的計畫性細胞死亡[Hsu等人，Pardaxin抗菌胜肽誘導之細胞凋亡增進了在HeLa細胞中抗腫瘤活性。Peptides，2011年，第32卷第6期：第1110-1116頁]。蛋白質體分析顯示Pardaxin抗菌胜肽觸發在HeLa細胞中的細胞凋亡訊號傳遞途徑，其係歷經與未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，c-Jum途徑，以及活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)的交互作用。Pardaxin抗菌胜肽在活性氧化物的清除以減緩c-Jun活化上扮演重要的角色；由小干擾型RNA調節的c-Jun基因弱化(knockdown)廢止了Pardaxin抗菌胜肽誘導的凋亡蛋白酶活化與細胞死亡，從而暗示了活性氧化物與c-Jun在Pardaxin誘導的細胞凋亡傳訊中的參與[Huang與Chen，蛋白質體分析顯示Pardaxin抗菌胜肽觸發了在人類子宮頸癌HeLa細胞中細胞凋亡的訊號途徑：未折疊蛋白反應、c-Jun與活性氧化物之間的交互作用。Carcinogenesis，2013年，第34卷第8期：第1833-1842頁]。經Pardaxin抗菌胜肽處理的HT-1080細胞的轉錄體分析顯示編碼c-FOS(一種AP-1轉錄因子)的基因之誘導。經Pardaxin抗菌胜肽處理，鈣的細胞濃度增加，且細胞內鈣訊號的阻隔擾亂了Pardaxin抗菌胜肽誘導的細胞死亡[Ting等人，Pardaxin，一種天然的陽離子抗微生物胜肽，靶向內質網並誘導c-FOS機制。Biomaterials，2014年，第35卷第11期：第3627-3640頁]。Pardaxin抗菌胜肽注射到小鼠腫瘤內的空間顯著地抑制腫瘤的生長[Wu等人，Pardaxin，一種魚類抗微生物胜肽，在體外及體內對小鼠纖維肉瘤展現出抗腫瘤活性。Mar Drugs，2012年，第10卷第8期：第1852-1872頁]。然而，Pardaxin抗菌胜肽的抗腫瘤效果及其中的機制，在非鼠類動物模型中尚未被研究。

大多數的圍肛腺腫大係良性增生形式(腺瘤)的局部增生；另一方面，其對應形式(腺癌)則罕見[Park等人，在犬中以環孢素處理併發良性前列腺增生的圍肛腺瘤。Can Vet J，2010年，第51卷第11期：第1279-1282頁]。多數的腺瘤可以環孢素、去勢以及手術移除腫瘤有效治療[Park等人，在犬中以環孢素處理併發良性前列腺增生的圍肛腺瘤。Can Vet J期刊，2010年，第51卷第11期：第1279-1282頁；Javanbakht等人，在混種梗(terrier)犬中環肛腺瘤的整體評估。Asian Pac J Trop Biomed，2013年，第3卷第7期：第580-583頁]。當飼主拒絕去勢時，雌激素治療是圍肛腺瘤的另一個選項。然而，雌激素可能具有嚴重的副作用，如骨髓抑制與再生不良性貧血(anaplastic anemia)。

意外地發現Pardaxin抗菌胜肽對於狗圍肛腺瘤的治療有效。據此，本發明提供一種治療狗圍肛腺瘤的新藥物。

本發明提供一種用於製造供治療狗圍肛腺瘤之藥物的組合物之用途，其中該組合物包含Pardaxin抗菌胜肽與醫藥上可接受的載體。

前文之概述，以及以下之本發明的詳細描述，在與附圖一起閱讀時將會有較佳的理解。為了說明本發明之目的，在圖中顯現的具體實施例是目前較佳的。然而，應當被理解的是本發明不限於這些具體實施例。

在圖中：圖1顯示以Pardaxin抗菌胜肽治療期間腫瘤體積的改變。圖1(a)顯示5種進行監測20天的乳腺腫瘤(1號、2號與5號狗)。圖1(b)顯示1種進行監測20天的纖維肉瘤(3號狗)。圖1(c)顯示2種進行監測28天的鱗狀細胞癌(4號狗)。圖1(d)顯示3種進行監測28天的惡性肥大細胞腫瘤(9號與11號狗)。圖1(e)顯示一種進行監測28天的肉瘤腫瘤(12號狗)。腫瘤特徵的描述與Pardaxin抗菌胜肽治療方案如表1與表2所示。投予Pardaxin抗菌胜肽的第一天被標示為第一天。每隻狗的每個腫瘤都注射不同濃度的Pardaxin抗菌胜肽，並以不同顏色作圖顯示結果。顯示腫瘤個體的腫瘤體積(cm³)。

圖2顯示以Pardaxin抗菌胜肽治療期間腫瘤體積的改變。對4種圍肛腺瘤(6號、13號與14號狗)進行監測28天。施用Pardaxin抗菌胜肽的第一天被標示為第一天。每隻狗的每個腫瘤都注射不同濃度的Pardaxin抗菌胜肽，並以不同顏色作圖顯示結果。顯示腫瘤個體的腫瘤體積(cm³)。腫瘤特徵的描述與Pardaxin抗菌胜肽治療方案如表1與表2所示。

圖3顯示以Pardaxin抗菌胜肽治療期間腫瘤體積的改變。對2種組織細胞瘤腫瘤(7號與10號狗)進行監測28天。在以Pardaxin抗菌胜肽治療28天之後以手術切除10號狗的組織細胞腫瘤體顯示囊內有膿，沒有實質的腫瘤體。每天於腫瘤內投予Pardaxin抗菌胜肽28天後，腫瘤塊為中空並帶有廣泛的壞死區域。

圖4顯示以pardaxin抗菌胜肽治療後在指定期間中巨噬細胞發炎性蛋白-1(macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)、介白素-1β(IL-1β)，以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的血清分泌變化(第0天：處理前)。狗編號係指在表1與表2中描述的狗。

除非另有定義，本文所用之所有的技術與科學術語與本發明所屬技術領域中具通常知識者所通常理解者具有相同的意義。

如本文所用，除非上下文明確指示，否則單數形式「一」、「一個」、「該」包含複數對象。因此，例如，提及「一樣本」包括複數個這樣的樣本以及本領域具通常知識者所知的等同物。

如本文所用，「Pardaxin抗菌胜肽」乙詞意指一Pardaxin胜肽或其衍生物、片段或變異體。Pardaxin抗菌胜肽的一較佳例子意指一以甘胺酸(glycine，G)開始並以谷胺酸(glutamic acid，E)結束的具有33個胺基酸的胜肽，如Oren與Shai所述[Eur J Biochem，1996年，第237卷：第303-10頁，或美國專利號6,172,038]，其具有如下之胺基酸序列：Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-Gly-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln-Glu(SEQ ID NO：1)。Pardaxin抗菌胜肽的例子包括但不限於所有顯示於美國專利號6,172,038的Pardaxin胜肽、其衍生物、片段或變異體。

如本文所用之「其功能性衍生物、片段或變異體」乙詞意指該胜肽的一衍生物、片段或變異體，其維持相同或相似活性，且展現相同或相似特性。

如本文所用，「狗圍肛腺瘤」乙詞意指肝樣腺體的腫瘤之類型，發生於圍肛區域，包皮邊，以及偶爾發現於其他地方[Cotchin，家畜中腫瘤的一些病因方面，Annals of The Royal College of Surgeons of England， 1966年，第38卷第2期：第92頁]。

如本文所用，「狗圍肛腺瘤」乙詞意指良性形式的腫瘤，即圍肛腺瘤，以及惡性形式的腫瘤，即圍肛腺癌。

如本文所用，「狗圍肛腺瘤」乙詞包括但不限於良性形式的狗圍肛腺腫瘤，即圍肛腺瘤。

在實施例1中基於下列發現，已證實Pardaxin抗菌胜肽是對狗圍肛腺瘤的傳統治療的一種潛在的補充治療：(i)Pardaxin抗菌胜肽每日劑量，範圍每隻狗自1至40毫克間，在帶有腫瘤的狗體內，不會引起明顯的與藥物相關的毒性或異常血液生化參數；(ii)Pardaxin抗菌胜肽治療不會顯著地影響血液學特性、免疫相關的蛋白質分泌，或生化參數(圖4與未出示的數據)；(iii)所有圍肛腺瘤中都觀察到腫瘤生長的減少。

於另一方面，本發明提供一種用於製造供治療狗圍肛腺瘤之藥物的組合物之用途，其中該組合物包含Pardaxin抗菌胜肽，與醫藥上可接受的載體。

在本發明中，該醫藥組合物可使用任何標準的技術或本領域具通常知識者已知之通常使用的方法來配製。

如本文所用，「治療有效量」乙詞意指一藥物或藥劑的量，與未接受此一量的對應個體相比，導致在一疾病、失調症或副作用的治療或癒合的效果，或一疾病或失調症的發展速度的減緩。該術語之範圍內亦包括有效提高正常生理機能之量。

針對治療上的應用，該胜肽或其功能變體的治療有效量可配製為一用於投予的醫藥組合物。據此，本發明進一步提供一種包含治療有效量的該胜肽或其功能衍生物、片段或變體的醫藥組合物，與一或多種醫藥上可接受的載體一起。

如本文所用，「一醫藥上可接受的載體」乙詞意指一載體、稀釋劑，或賦形劑，在與該配方的其他成分相容且不會對施用該醫藥組合物的個體有害的意義上，其係為醫藥上可接受的。本領域通常已知或所用之任何載體、稀釋劑或賦形劑皆可被用於本發明中，視該醫藥製劑之要求而定。

根據本發明，該醫藥組合物可適用於以任何適當途徑之投予，包括但不限於局部、直腸、鼻、陰道、口服或腸胃外途徑。在本發明之一特定之具體實施例中，該醫藥組合物係配製用於腫瘤內投予。這樣的製劑可以藥學領域已知的任何方法製備。本發明之一具體實施例為一注射劑形式的醫藥組合物。

本發明現將參照以下之具體實施例更為具體地描述，實施例的提供為示範而非限制之目的。

實施例

材料與方法

在實施例中所用狗隻的特徵

狗患者的族群調查與腫瘤類型如表1所列。共有14隻狗用於本研究的劑量遞增部分。病患族群由不同品種的狗所組成：混種(n=7)、德國牧羊犬(n=1)、黃金獵犬(n=1)、馬爾濟斯犬(n=1)、約克夏梗犬(n=1)、美國比特鬥牛梗犬(n=1)、西施犬(n=1)，以及哈士奇犬(n=1)。本研究中包含之腫瘤類型如下：乳腺腫瘤(n=9)、纖維瘤(n=1)、鱗狀細胞癌(n=2)、圍肛腺瘤(n=4)、組織細胞瘤(n=2)、惡性肥大細胞瘤(n=3)，以及肉瘤(n=1)。

臨床試驗資格

所有的動物均按照國立屏東科技大學動物照顧與使用委員會所批准的實驗室指南進行研究。出現在國立屏東科技大學動物醫院帶有組織學上-、細胞學上-，或形態學上確診為腫瘤性疾病的狗為研究的候選者。在實驗進行之前獲得自每隻狗飼主的書面通知同意書。向帶有乳腺腫瘤、圍肛腺瘤、肉瘤，或其他實質固態瘤的狗的飼主們提出手術、化療或其他標準療法作為選擇。常規治療已經失敗的狗、飼主希望嘗試以Pardaxin抗菌胜肽治療的狗，以及飼主拒絕標準療法的狗有資格報名進入本研究。

試劑

合成Pardaxin抗菌胜肽(H-GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGGQE-OH)且由GL生物化學(上海，中國)純化至>95%的等級。合成的胜肽以無菌去離子水或PBS緩衝液溶解以供實驗使用。

實施例之參數與Pardaxin胜肽之投予

共14隻帶有自發性腫瘤的私有狗隻參與Pardaxin抗菌胜肽的安全性與生物活性的開放性評估的實施例。每天進行臨床毒性與腫瘤反應的評估。在研究期間，狗住在國立屏東科技大學動物醫院內。狗的品種、性別、年齡，以及腫瘤類型的詳細資訊提供於表1內。因為本研究包含不同品種的狗，體重變化範圍為3~35公斤，其平均值為17.78公斤。以Pardaxin抗菌胜肽治療的狗每7天接受常規的血液生化參數檢驗，以評估血液與生化毒性。以起始劑量為1mg/天、2mg/天、4mg/天、5mg/天、10mg/天、20mg/天，或40mg/天，將Pardaxin抗菌胜肽(0.5ml至4ml)注射到腫瘤內的位置。編號1號、4號、5號與9號的狗病患在腫瘤表面注射二個位置。腫瘤上畫上圓圈，且分成四個象限。Pardaxin抗菌胜肽被注射到第四象限內。編號12號的狗在腫瘤表面區域注射四個位置。編號2號、3號、6號、7號、8號、10號、11號、13號、與14號的狗在腫瘤表面的一個位置上注射Pardaxin抗菌胜肽。在治療期間每天以游標卡尺測量腫瘤尺寸(在三個維度中)。投予Pardaxin抗菌胜肽前的第一天定義為第0天，且治療持續至第7、12、19或28天。編號14號的狗的二個腫瘤定義為A與B；對A的注射持續38天而對B的注射持續31天。治療期的持續視用於不同狗或腫瘤類型的治療方法而定(如表2所示)。在胜肽劑量與腫瘤表面積之間的關係被定義為mg/cm²。面積的計算為腫瘤的寬度與腫瘤區域長度的乘積。

血液採集與處理

於治療期間的第1、7、14、21與28天，自靜脈中採集血液樣本；樣本被置於EDTA試管內且以3000 x g離心10分鐘。然後收集血漿以進行生化參數的分析(數據未顯示)。以ELISA偵測免疫相關的蛋白質(TNF-α、 IL-1β以及MIP-1α)。自國立屏東科技大學動物照護與倫理委員會獲准倫理許可。

在帶有腫瘤的狗活體內Pardaxin抗菌胜肽的抗腫瘤功效

每天以下列公式計算腫瘤尺寸：體積=長度x寬度的平方x 0.5

[Ting等人，以pardaxin抗菌胜肽，一種天然的陽離子抗微生物胜肽，靶向內質網並誘導c-FOS機制。Biomaterials，2014年，第35卷第11期：第3627-3640頁；Javanbakht等人，在混種梗犬中環肛腺瘤的整體評估。Asian Pac J Trop Biomed期刊，2013年，第3卷第7期：第580-583頁]。

投予的第一天設定為第一天。

實施例1 帶有腫瘤的狗內之藥物投予以及抗腫瘤活性

每天對帶有各種腫瘤類型的狗病患以腫瘤內注射給予Pardaxin抗菌胜肽，劑量範圍自0.010mg/cm²至16.666mg/cm²(表2)。編號1號、2號、5號以及8號的狗患者帶有乳腺腫瘤；而在Pardaxin抗菌胜肽治療期間編號2號的狗的腫瘤體積減少，其他乳腺腫瘤的生長則無實質上的影響(圖1a，表2)。在Pardaxin抗菌胜肽治療期間結束時，在編號3號的狗中的纖維瘤的體積減少(圖1b，表2)。編號4號的狗病患帶有二個鱗狀細胞癌；在Pardaxin抗菌胜肽治療前後，其中一個腫瘤(B)的體積無差異，而第二個腫瘤(A)的體積則減少(圖1c，表2)。編號9號與11號的狗病患具有惡性肥大細胞瘤；在治療期間結束時，在編號9號的狗內的其中一個腫瘤(B)的體積減小，而在編號9號的狗內的第二個腫瘤(A)以及在編號11號的狗內的腫瘤的體積則不受影響(圖1d，表2)。在編號12號的狗內的肉瘤的體積也未受Pardaxin 抗菌胜肽治療的影響(圖1e，表2)。

在Pardaxin抗菌胜肽治療前，編號6號的狗病患，一8歲大，完好的混種公狗，被觀察到在肛門周圍帶有皮內結節(3.960cm²)。在Pardaxin抗菌胜肽治療的第28天後，該圍肛腺瘤已經消失(圖2)。體檢時，圍肛區域的病變被發現具潰瘍。該圍肛腺瘤被纖維囊與基質所包圍。該狗接受每日單一腫瘤內注射10mg/ml Pardaxin抗菌胜肽(2ml/天；Pardaxin抗菌胜肽溶於PBS內)。在第19天時，觀察到圍肛腺瘤體積顯著減少，且該腺瘤團塊最終爆裂。Pardaxin抗菌胜肽治療的最後一天為第28天。持續觀察該傷口，在第121天時該傷口被發現完全地癒合。因此，Pardaxin抗菌胜肽治療使圍肛腺瘤的腫瘤組織完全的消退。然而，Pardaxin抗菌胜肽治療引起快速的腺瘤細胞溶解，在第一次腫瘤內注射的28天後，其表現為一可見的壞死腺瘤。

編號13號與14號的狗病患接受每日單一腫瘤內注射10mg/ml Pardaxin抗菌胜肽(0.5ml/天)。在編號13號的狗內，Pardaxin抗菌胜肽治療導致圍肛腺瘤生長的顯著減少，其體積自1.276cm²(處理前)減少至0.000cm²(處理後)(表2)。在治療期間，在編號13號的狗內未觀察到明顯的壞死腺瘤區域。編號14號的狗病患帶有二個圍肛腺瘤。該二圍肛腺瘤顯現出體積之減少；第一個腫瘤自2.030cm²(處理前)減少至0.000cm²(處理後38天)，而第二個腫瘤則自3.000cm²(處理前)減少至0.000cm²(處理後31天)(表2)。

編號7號與10號的狗病患帶有組織細胞瘤，其實質上不受Pardaxin抗菌胜肽治療的影響(圖3，表2)。編號10號的狗，2歲大美國比特鬥、牛梗犬，在左頸處呈現一組織細胞瘤(4.400cm²)。該狗接受每日單一腫瘤內注射10mg/ml溶於PBS內的Pardaxin抗菌胜肽(2ml/天)。在第19天時，觀察到腫瘤體積的顯著增加，且觸碰時感覺到該腫瘤的團塊非常柔軟。Pardaxin抗菌胜肽治療在第28天時停止。接著，該腫瘤表面呈現一小區域的發紺。在Pardaxin抗菌胜肽治療的第28天後以手術切除該團塊，顯示在囊中有膿且不具有顯著的腫瘤團塊。該團塊為中空，帶有廣泛的壞死區域。

從該實施例中的血液樣本的生化分析可知，其遵循在生理條件下以Pardaxin抗菌胜肽治療狗係有利於在腫瘤位置上逐漸內化的Pardaxin抗菌胜肽的局部釋放；關鍵在於，緩慢的內化作用與細胞內釋放增強藥物的生物活性。這些特性導致治療反應的改善，同時避免過度的毒性。任何抗微生物胜肽在一腫瘤內空間的系統性釋放遠比使用有機化合物的傷害更小。事實上，在嚙齒類與狗內的臨床前毒理學研究已經顯示出對抗微生物胜肽的高耐受性。例如，此處測量的生化參數(數據未顯示)在治療前後顯示不明顯的差異。在狗內，pardaxin抗菌胜肽不會顯著地影響任何測量的生化參數，包括血球容積比(packed cell volume，P.C.V)、紅血球細胞數、血紅蛋白、平均細胞體積(mean cell volume，MCV)、平均細胞血紅蛋白含量(mean cell hemoglobin，MCH)、平均微粒血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、白血球數、淋巴細胞數、單核細胞數、血小板數、血漿、血纖維蛋白原、總蛋白、T-膽紅素、AST、ALT、白蛋白、膽固醇、三酸甘油酯、肌酐、血脲氮(blood urea nitrogen，BUN)，或尿酸；這表明其高耐受性，以及對狗正常組織少/無毒性。血液的酵素學分析以及生化概覽被廣泛用作動物健康的功能狀態的指標。在肝臟酵素活性(AST、ALT，以及T-膽紅素)中的變化意味著肝功能障礙。肝臟酵素及/或某些化學物質(膽紅素與肌酐)的增高通常指向在肝臟中的細胞發炎或損傷。由於這些肝臟指標並未受到pardaxin抗菌胜肽的影響/減少，因此其顯現出測試的劑量的治療不會誘發氧化反應壓力或肝毒性。

在此一實施例中確認，Pardaxin抗菌胜肽可被考慮作為取代雌激素以治療狗內圍肛腺瘤的可能候選者，以避免例如骨髓抑制以及由在該治療中通常使用的雌激素所造成的致命性的再生不良性貧血等副作用。在狗中以Pardaxin抗菌胜肽治療(抗微生物胜肽治療)提供具體而言為當無法進行閹割與手術移除腫瘤時的優勢。

總結，Pardaxin抗菌胜肽治療在帶有腫瘤的狗上不具有可見的副作用或是整體毒性。另一項結論是，Pardaxin抗菌胜肽在帶有腫瘤的狗內顯示出抗腫瘤活性，其係具體而言對圍肛腺瘤有效，其導致腫瘤縮小與消減。與Pardaxin抗菌胜肽先前在小鼠中異體腫瘤內的抗腫瘤功能的結果以及臨床前全部方面的結果一起，本實施例之展示進一步支持Pardaxin抗菌胜肽作為獸醫用藥的未來臨床發展，以及將來可能適合人類實體腫瘤臨床前試驗的支持。

所提供之描述與申請專利範圍應被了解為示範之目的而非以任何方法限制本發明之範圍。

Claims

一種用於製造供治療狗圍肛腺瘤之藥物的組合物之用途，其中該組合物包含Pardaxin抗菌胜肽，與醫藥上可接受的載體。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥組合物減少圍肛腺瘤的腫瘤生長且不帶有可見的副作用或整體毒性。
如申請專利範圍第1項之用途，其中Pardaxin抗菌胜肽係一具有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的胜肽。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該「狗」乙詞係指犬屬，其包括但不限於狗。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該「狗圍肛腺瘤」乙詞包括良性形式的狗圍肛腺瘤，即圍肛腺瘤，以及惡性形式的狗圍肛腺瘤，即圍肛腺癌。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該「狗圍肛腺瘤」乙詞包括但不限於該良性形式的狗圍肛腺瘤，其係圍肛腺瘤。