JP2002509736A - 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウス - Google Patents

副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウス

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Abstract

(57)【要約】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）遺伝子ファミリーのメンバーに依存する信号経路は脳及び末梢の器官の両方で、多面的な影響を示す。２つの生化学的にも薬学的にも異なった副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブタイプ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２）について述べられている。これらの特殊なレセプター・サブタイプの発生学的及び生理学的な役割の研究のため、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子の無いマウスの１つの系統をつくった。この遺伝子工学処理された系統のマウスは副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１が視床下部−脳下垂体−副腎軸の成長と機能、及び不安感及び運動活性変化に関連した行動変化の媒介の両方に関与していることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願とのクロス・リファレンス 本出願のクレームは１９９８年３月３０日に出願され、現在は放棄されている
米国暫定出願第６０／０７９，８７４号に基づくものである。
【０００２】 連邦政府資金援助に関する説明 本発明は一部米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌ
ｔｈからの交付金ＤＫ−２６７４１を用いて行われたものである。従って、米連
邦政府は本発明に対して一定の権利を保有している。
【０００３】 本発明は一般的には内分泌学及び神経内分泌学に関するものである。より詳し
くは、本発明は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１と、副腎皮質刺激
ホルモン放出因子レセプター−１レセプターに欠損のある動物に関するものであ
る。
【０００４】 生物の生残はストレスの多い環境に対するホメオスタシスの維持にかかってい
る。ホメオスタシスは嫌悪な刺激の影響に対応するように適合化された適合的応
答を通じて維持される（Ｃｈｒｏｕｓｏｓら、１９９２）。一般的には、こうし
た適応的応答は、注意、奮起、及び攻撃など自己保全に関連した神経経路の刺激
、及び成長、生殖及び摂食などの生長機能を促進する経路の抑制から起きるもの
である（Ｃｈｒｏｕｓｏｓら、１９９２）。哺乳動物においては、副腎皮質刺激
ホルモン放出因子（ＣＲＦ）がストレスに対する内分泌性、神経内分泌性、自律
神経性、及び挙動応答の主要なインテグレーターである（Ｏｗｅｎｓ ＆ Ｎｅ
ｍｅｒｏｆｆ、１９９１； Ｖａｌｅら、１９８１）。ストレス応答の調節失調
は極めて重大な心理学的、生理学的影響をもたらす。実際、副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子システムの慢性的過敏は不安感、神経性食欲不振、及びうつ病など多
くの情緒不全と関係付けられてきている（Ｃｈｒｏｕｓｏｓら、１９９２；Ｏｒ
ｔｈ、１９９２）。
【０００５】 ストレス応答におけるその役割に加えて、副腎皮質刺激ホルモン放出因子は認
識機能にも関与している。副腎皮質刺激ホルモン放出因子は齧歯類における学習
と記憶を促進することが知られており（Ｂｅｔｈａｎら、１９９５，Ｄｉａｍａ
ｎｔ ＆ｄｅ Ｗｉｅｄ、１９９３、Ｋｏｏｂ ＆ Ｂｌｏｏｍ，１９８５、Ｌ
ｉａｎｇ＆ Ｌｅｅ，１９８８）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子系の変化はア
ルツハイマー病やパーキンソン病などいくつかの神経退行性疾患と関係づけられ
る（Ｄｅ Ｓｏｕｚａ，１９９５）。しかしながら、これらのストレスに関連し
た現象及び認識機能を含む副腎皮質刺激ホルモン放出因子依存経路の成長性及び
生理的作用については未だ十分には理解されていない。
【０００６】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子系の多面発現的性質は、最近、副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子族の第２の哺乳動物のメンバーであるウロコルチン（Ｕｒｏｃｏ
ｒｔｉｎ，ＵＣＮ）の発見によってさらにその範囲が広げられた。ラットの中脳
から得られたウロコルチンは副腎皮質刺激ホルモン放出因子とはわずか４５％の
配列の相同性しか有していない。ウロコルチンの正確な役割はまだ知られていな
いが、このペプチドはイン・ビトロとイン・ビボの両方で副腎皮質刺激ホルモン 放出因子の生物学的作用の多くを模倣することができる（Ｓｐｉｎａら、１９９
６； Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、１９９６； Ｖａｕｇｈａｎら、１９９５）が、異
なった能力特性も有している。
【０００７】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子ファミリーメンバーの生物学的作用はセクレチ
ン、血管作用性腸内ポリペプチド及び成長ホルモン放出因子を含む小さなリガン
ドに対するＧタンパク質結合レセプターのサブファミリーに属する特殊は高親和
性膜レセプターへの結合を介して媒介される（Ｓｅｇｒｅ ＆ Ｇｏｌｄｉｎｇ
，１９９３）。２つの異なった副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブ
タイプである、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１及び副腎皮質刺激
ホルモン放出因子レセプター−２はいくつかの種から得られている（Ｇｒｉｏｇ
ｏｒｉａｄｉｓら、１９９６； Ｖａｌｅら、１９９７）。副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子レセプター１及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２は約
７１％のアミノ酸配列相同性を有しており（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９
６； Ｖａｌｅら、１９９７）、そして脳及び周辺組織でのその発現パターンに
薬学的に見て類似した点と異なっている点の両方とがある。成人においては、副
腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１の発現は主に脳幹、小脳、大脳皮質
、及び中央隔膜と脳下垂体に限定されている（Ｃｈａｌｍｅｒｓら、１９９５；
Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４）。
【０００８】 対照的に、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２の方は心臓や骨格筋
、胃腸管、及び精巣上体などを含みいくつかの末梢の器官で発現し、（Ｋｉｓｈ
ｉｍｏｔｏら、１９９５； Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら、１９９５； Ｐｅｒｒｉｎ
ら、１９９５； Ｓｔｅｎｚｅｌら、１９９５）、そして脳内での発現は側隔膜
及び視床下部領域で最も一般的に見られる（Ｃｈａｌｍｅｒｓら、１９９５；
Ｐｅｒｒｉｎら、１９９５）。各レセプター・サブタイプは副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子とウロコルチンの両方と結合することができるが、ウロコルチンは副
腎皮質刺激ホルモン放出因子と比較して副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプタ
ー−２に対して、副腎皮質刺激ホルモン放出因子が示すより約４０倍も高い親和
性を示す（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９５）。これらの結果はウロコルチンが副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２に対する推定上の内因性リガンドであ
る可能性を示唆している。しかしながら、嫌悪刺激に対する種々の適応的応答の
それぞれを誘発する特定の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター分子はまだ
明確には確定されていない。
【０００９】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子システムの種々の要素の発生にかかわる役割は
まだ十分には解明されていない。副腎皮質刺激ホルモン放出因子の発現は胚形成
及び新生児段階に一時的に、そして空間的に調節されて行われ、副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子遺伝子をもたないマウスは内分泌不全及び成長不全を示す（Ｍｕ
ｇｌｉａら、１９９５）。加えて、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターは
胚形成１５日後のような初期の段階で異なった領域に存在しており、その発現は
初期の新生児段階中規制される（Ａｖｉｓｈａｉ−Ｅｌｉｎｅｒら、１９９６；
Ｉｎｓｅｌら、１９８８）。しかしながら、複数の副腎皮質刺激ホルモン放出
因子レセプター・サブタイプ及び追加的な副腎皮質刺激ホルモン放出因子関連リ ガンドが存在していることから、それぞれの副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセ
プター・サブタイプによって媒介される生物学的経路については体系的評価が必 要である。
【００１０】 このように、先行技術は成長と副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
レセプターが欠損している動物における副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプタ
ー系、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブタイプの役割の理解にお
いて不十分である。本発明はこの分野におけるこうした長年のニーズと願望を満
たすものである。
【００１１】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター媒介経路の具体的な発生上及び生物
学的役割を解明するために、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損
マウスを胚幹性細胞における相同組換えを介して発生させた。副腎皮質刺激ホル
モン放出因子レセプター−１は副腎の成長とストレスに対する通常の内分泌応答
の両方に対して絶対的に必要であることが認められた。加えて、副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスは不安感応答の減少と運動活性
の概日周期における変化を示した。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−
１欠損マウスはストレスに対する種々の適応的応答及び認識機能に関与する副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブタイプの特徴づけを行うための有益
なモデル・システムを提供する。
【００１２】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子を標的として破壊を行っ
たところ、副腎のコルチコステロイド生産領域の出生後の成長と機能のために十
分なＡＣＴＨ分泌を行わせる上での副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−
１の特異的な発生上の役割が示された。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプタ
ー−１遺伝子の突然変異もストレスに対する内分泌応答及び行動応答を媒介する
上でのこのレセプターの重要な役割を明確に示し、運動活性周期の調節する上で
の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１依存経路の新しい役割を明らか
にした。成長とホメオスタシスの維持の両方における副腎皮質刺激ホルモン放出
因子システムのメンバーの正確な役割を解明するためには副腎皮質刺激ホルモン
放出因子信号経路の他の成分に突然変異を有し、本発明で述べるマウスの系統と
交配させることができる動物をつくることが必要である。
【００１３】 本発明の１つの目的は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１が欠損し
ているトランスジェニックマウスを提供することである。
【００１４】 本発明の１つの実施の形態で、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
が実質的に欠損しているトランスジェニックマウスをつくる方法が提供される。
【００１５】 本発明の別の実施の形態で、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウルコルチン又
は、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１以外のレセプターを介して作
用する関連リガンドのアゴニスト又はアンタゴニストを識別する方法が提供され
る。
【００１６】 本発明の他の、そしてさらなる側面は本発明の現段階での好ましい実施の形態
に関する以下の説明から明らかになるであろう。これらの実施の形態は開示の目
的のために提供されるものである。
【００１７】 添付図面は本発明の上に述べたような特徴、利点、及び目的が一層明らかにな
り、より詳細に理解できるようにここに組み込まれている。これらの図面は明細
書の一部を形成するものである。なお、添付図面は本発明の好ましい実施の形態
を示すものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００１８】 図１は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの発生を示し
ている。図１Ａ：（上段）エクソン４−１３を示す副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１遺伝子のゲノム構造。(中段)相同組換えのために使われるター
ゲッティング構築物。第４の膜横断領域を通じて第１細胞外ドメインの最後の１
２のアミノ酸をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント（エクソン５
−８）が消失し、ＰＧＫ−ネオ・カセットと入れ換えられている。（下段）その 結果としての突然変異遺伝子座。図１Ｂ：ＢａｍＨＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ外部プロ ーブを用いたサザン分析で破壊された副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター
−１対立遺伝子を確認した。このプローブは８．０ｋｂ野生型・バンド及び６．
３ｋｂ突然変異バンドを検出し、それぞれＪ１（親ＥＳ細胞系）、Ｊ１−副腎皮
質刺激ホルモン放出因子レセプター−１＋／−（ＣＲＦＲ１＋／−）（ＥＳクロ
ーンヘテロ接合突然変異体）。図１Ｃ：野生型及び副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１突然変異マウスから集められた腎臓の単層培養体による副腎皮
質刺激ホルモン放出因子刺激ＡＣＴＨ分泌（副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセ
プター−１−／−（ＣＲＦＲ１−／−））。
【００１９】 図２は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異マウスの副腎欠
失を示している。図２Ａ：副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マ
ウスにおける著しく低下した血漿コルチコステロン濃度。雄及び雌の野生型及び
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異マウス（副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子レセプター−１−／−）から午前（６時）と午後（４時）に血液
サンプルを採り、血漿コルチコステロン濃度を調べた（平均値＋ＳＥＭ；Ｐ＜０
．００１）。図２Ｂ：副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異マ
ウスの副腎の著しい萎縮。オス野生型及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ
ター−１−／−マウスを解剖して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。コ
ルチコステロンがつくりだされる束状帯（ＺＦ）領域の著しい形成不全に注目。
球状帯（ＺＧ）、網状帯（Ｚレセプター）、及び髄質（Ｍ）領域は比較的影響を
受けなかった。図２Ｃ：副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異
マウスにおけるコルチコトロープ形成。野生型及び副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１−／−マウス両方からの脳下垂体を解剖して、抗ＡＣＴＨ抗体
でコルチコトロープの場所を特定した。コルチコトロープの数での違いは認めら
れなかった。（Ａ）下垂体前葉、（Ｉ）下垂体中葉。
【００２０】 図３は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター欠損マウスの視床下部内で副
腎皮質刺激ホルモン放出因子の発現が増大されているが、アルギニン・バソプレ
シンがない状態を示している。野生型及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ
ター−１−／−マウスの視床下部の室傍核（ＰＶＮ）副腎皮質刺激ホルモン放出
因子（図３Ａ）及びアルギニン・バソプレシンの免疫組織化学的位置決定を行っ
たところ、突然変異マウスで副腎皮質刺激ホルモン放出因子発現の増大が認めら
れた。小脳扁桃など脳の他の副腎皮質刺激ホルモン放出因子生産領域内部では発
現の増大は認められなかった（データは示さず）。
【００２１】 図４は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスでのストレス
に対する内分泌応答の低下を示している。両方の性の野生型及び突然変異マウス
共１０分間の身体的拘束を受け、ＡＣＴＨ（図４Ａ）及びコルチコステロン（図
４Ｂの基本及びストレス後のレベルを測定した（平均＋ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５
、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００２２】 図５は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおける不安
感の低下を示している。ダーク−ライトエマージェンスタスクでの副腎皮質刺激
ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの挙動を調べ、比較対象マウスと比
較した。マウスを５分間セッションの開始時に小さな部屋に入れた。図５Ａ：部
屋を出るのに使われた合計時間（秒）（平均＋ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。新し
い環境での野生型及び突然変異マウスの急性運動活性についても調べた。（図５
Ｂ）光サイクル中、５分間以上野生型及び突然変異マウスが入っていた時間の合
計（平均＋ＳＥＭ）。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異マ
ウスは運動活性周期での変化を示した。図５Ｃ：明暗サイクルの明るい時と暗い
時の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異及び野生型マウスの
運動活性（１時間あたりのゾーン進入回数）。図５Ｄ：野生型及び突然変異体マ
ウスの基本運動活性（１２時間でのゾーン進入合計回数）（平均＋ＳＥＭ；＊Ｐ
＜０．０５）。
【００２３】 図６はヘテロ接合副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体雌
マウスから生まれた後代はコルチコステロンでのイン・ウテロ処理で直すことが
できる著しい肺異形成を示した。生後１日目の新生児から得た肺を固定、解剖し
、ヘマトキシレン及びエオシンで染色した。図６Ａ：野生型の肺は薄い肺胞中隔
と通常の気室拡張を示す。図６Ｂ：突然変異体マウスの肺は肺胞崩壊（＊）と肺
胞内出血及びヘモジデリン沈着を伴う反応性気腫を示した。硝子膜は明らかでは
なかった。図６Ｃ：イン・ウテロで母親の飲用水にコルチコステリンを入れたも
ので処理した突然変異体新生児から採った肺。
【００２４】 図７は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおける腎臓
欠失のホルモンによる治療を示している。図７Ａ：生後３日目の野生型及び副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスから回収された腎臓をヘマ
トキシリン及びエオシンで染色したところ生まれてから直後の腎臓の形態に差は
認められなかった。図７Ｂ：生後１０−２１日間ＡＣＴＨ又は希釈剤だけで処理
した副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１−／−マウスから回収した副
腎。ＡＣＴＨで処理した副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異
体マウスから得た副腎の束状帯領域のサイズと厚みが増大していることに注目。
図７Ｃ：副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１−／−マウス又は野生型
マウスから回収されたサンプルでの生後１０日目の血漿ＡＣＴＨ濃度（平均＋Ｓ
ＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０２）。
【００２５】 本発明によれば、この技術分野での公知の通常分子生物学、微生物学、及び遺
伝子組換え技術を用いることができる。こうした記述に関しては文献に十分に述
べられている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （１９８２）； ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ及びII （Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏ
ｖｅｌ編集、１９８５）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）； ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ編集、（１９８５）］； ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
編集 （１９８４）］； “Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．
Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、（１９８６）］； ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃ
ｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］
； Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照。従って、ここで使用され
る限り、以下の用語は以下に説明するような意味を有している。
【００２６】 『ＤＮＡ分子』は単鎖又は二重鎖らせんのいずれかの形態でのデオキシリボ核
酸（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー形態を意味してい
る。この用語はこの分子の一次及び二次構造だけを意味し、いずれの特殊な三次
構造に限定するものではない。従って、この用語はなかんずく線形ＤＮＡ分子（
例えば制限ウラグメント）、ウイルス、プラスミド、及びクロモソームで見出さ
れる二重鎖ＤＮＡを含んでいる。以下の検討では、慣例に従ってＤＮＡの非転写
ストランドに沿った５’−３’方向での配列を示す。
【００２７】 『ベクター』とは他のＤＮＡセグメントが取り付いて、取り付いたセグメント
の複製物をもたらすことができるようなプラスミド、ファージ又はコスミドなど
のレプリコンである。『レプリコン』とはイン・ビボでＤＮＡ複製の独立単位と
して機能する、つまり、それ自体の比較対象で複製を行うことができるいずれか
の遺伝子要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）を示す。『複製の発生
源』とはＤＮＡ合成に関与するこれらのＤＮＡ配列を示す。『発現制御配列』と
は別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、規制するＤＮＡ配列である。コード配
列とは、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、そのｍＲＮＡが
コードされるタンパク質内に翻訳される場合に『作動可能に結合され』、細胞内
の転写及び翻訳制御配列に『制御される』。
【００２８】 一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写と翻訳を促進するプ
ロモータ配列を含む発現ベクターがホストと組み合わせて用いられる。発現ベク
ターは通常複写の発生源、プロモータ、ターミネータ、及び通常『選択可能マー
カー遺伝子』あるいは『選択可能マーカー』と呼ばれる特殊な遺伝子を含んでい
る。形質変換されたホストはこの技術分野で知られている手段で培養して最適な
細胞成長を達成することができる。
【００２９】 ＤＮＡ『コーディング配列』とは適切な規制配列の制御下に置かれた場合、イ
ン・ビボでポリペプチドに転写、翻訳される二重鎖配列を示す。コーディング表
現配列の境界は５’（アミノ）末端での開始コドンと３’（カルボキシル）末端
の翻訳停止コドンによって決められる。コーディング配列は原核性配列、真核性
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核性（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ
配列、そして合成ＤＮＡ配列なども含む。ポリアデニル信号と転写終了配列は通
常そのコード表現の３’に位置づけられる。『ｃＤＮＡ』はコピーＤＮＡあるい
は相補的ＤＮＡと定義され、ｍＲＮＡ転写からの逆転写反応による生成物である
。『エクソン』とは遺伝子座から転写された発現配列であり、『イントロン』と
はその遺伝子座からの非発現配列である。
【００３０】 転写及び翻訳制御配列はホスト細胞でコードディング配列の発現をもたらすプ
ロモーター、エンハンサー、ポリアデニル信号などのＤＮＡ規制配列である。『
ｃｉｓ要素』とは『コンセンサス配列』又は『モチーフ』とも言われるヌクレオ
チド配列で、特定の遺伝子座の発現を上方規制又は下方規制することができる他
のタンパク質と相互作用する。『信号配列』はコーディング配列と共に含まれる
場合もある。この配列はホストと信号をやり取りしてそのポリペプチドを適切な
細胞位置に向かわせるＮ−末端の信号ペプチドをコードする。信号配列は原核生
物及び真核細胞に天然で存在している種々のタンパク質と組み合わされた形態で
見出される場合がある。
【００３１】 『プロモーター配列』は細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方
向）コーディング表現配列の転写を開始させることができるＤＮＡ規制領域であ
る。本発明の内容を明確に定義する目的から、プロモーター配列は転写開始サイ
トによって３’末端を境界としており、上流（５’方向）に延びて背景を対象と
して検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低の数又は元素を含んでい
る。プロモーター配列内には転写開始サイトと、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関
与しているタンパク質結合領域（コンセンサス配列）が見出されるであろう。真
核性プロモーターは常にではないが、しばしば『ＴＡＴＡボックス』及び『ＣＡ
Ｔ』ボックスを含んでいる。原核性プロモーターは−１０及び−２５コンセンサ
ス配列に加えてシャイン−ダルガノ配列を含んでいる。
【００３２】 『オリゴヌクレオチド』という用語は２つ以上、好ましくは４つ以上のデオキ
シリボヌクレオチドで構成された分子である。その正確なサイズは多くの要素に
依存しており、それらの要素自体はさらにそのオリゴヌクレオチドの最終的な機
能と使用法に依存している。ここで用いられる『プライマー』という用語は、精
製された制限消化物として天然に発生するか合成的につくられるかには関係なく
、核酸ストランドに対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条
件下に置かれた場合、つまり、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤
の存在と適切な温度及びｐＨ条件が満たされた場合に合成開始箇所として機能で
きるオリゴヌクレオチドを指している。プライマーは単鎖であっても二重鎖であ
ってもよいが、誘発剤の存在下で望ましい延長生成物の合成を開始させるのに十
分な長さを有していることが必要である。プライマーの正確な長さは温度、プラ
イマーの供給源、及び使用方法など多くの要素に依存している。例えば、診断的
な応用においては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチド・プライマ
ーは通常１５−２５あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでおりいるが、ヌク
レオチドの数がそれ以下の場合もある。
【００３３】 プライマーは特定の標的ＤＮＡ配列の異なったストランドに『実質的に』相補
的になるように選択される。これはそれらのプライマーが対応するストランドと
交雑するのに十分な程度に相補的でなければならないことを意味している。従っ
て、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映している必要はない。例
えば、非相補的なヌクレオチド・フラグメントはプライマーの５’末端に取り付
いて、そのプライマー配列の残りの部分がそのストランドに対して相補的である
ような場合もある。又、そのプライマー配列がその配列に対して十分な相補性を
有しているか、あるいはそれと交雑して、それによって延長生成物合成のための
テンプレートを形成している場合は、非相補的塩基あるいはより長い配列がプラ
イマー内に分散されている場合もある。
【００３４】 ここで使われている『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』という用語
は特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近くで二重鎖ストランドＤＮＡを切
断する酵素を意味している。
【００３５】 『組換えＤＮＡ技術』とは通常は異なった生物からのＤＮＡをイン・ビトロで
結合させることの結果としての２つの異種ＤＮＡ分子を結合させる技術を指して
いる。遺伝子組換え分子は通常は遺伝子加工での実験でつくりだされる。同様の
用語として『遺伝子スプライシング』、『分子クローニング』、及び『遺伝子工
学』などの用語がある。これらの操作による生成物は『組換え体』、『組換え分
子』あるいは『トランスジーン』などである。
【００３６】 そうしたＤＮＡが細胞の内部に導入された場合に、細胞が外来性又は異種ＤＮ
Ａによって『形質変換』、『トランスフェクト』あるいは『形質導入』されたこ
とになる。形質変換ＤＮＡはその細胞のゲノムに統合（共有結合）される場合も
あるしされない場合もある。原核細胞、例えばイースト菌や哺乳動物細胞などで
は、ＤＮＡはベクターやプラスミドなどエピソーム性要素上に保持されている場
合もある。真核性細胞の場合、安定的に形質変換された細胞は、形質変換ＤＮＡ
がクロモソームに組み込まれていて、染色体の複製を通じて娘細胞によって遺伝
的に継承されるものである。この安定性はその真核細胞がその形質変換ＤＮＡを
含む娘細胞の群で形成された細胞株又はクローンを確立する能力によって示され
る。『クローン』とは１つの細胞又は祖先から細胞分裂によって誘導された細胞
のグループである。『細胞株』とはイン・ビトロで多数の世代にわたって安定し
た成長ができる一次細胞のクローンである。外来ＤＮＡで形質変換された植物や
動物などの生物は『トランスジェニック』と表現される。
【００３７】 ここで用いられている『ホスト』という用語は、原核細胞ばかりでなく、イー
スト菌、植物及び動物細胞などを含む。本発明によるとうもろこし澱粉シンター
ゼをコードする組換えＤＮＡ分子又は遺伝子は、この分野の当業者に公知のいず
れかの技術を用いてホストを形質変換させるために用いることができる。１つの
好ましい実施の形態は原核細胞形質変換のために１つの遺伝子に関するコーディ
ング配列を含むベクターの使用である。原核性ホストは大腸菌、Ｓ．ｔｙｍｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ、セラティア・マルセッセンス、及びバシラス・サブチリスなど
を含んでいる。真核性ホストはピキア・パストリスなどのイースト菌、哺乳動物
細胞及び昆虫細胞、そしてより好ましくはアラビドプシス・タリアナ及びタバッ
カム・ニコチアナなどの植物細胞などである。
【００３８】 ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは約８０％、そして最も好まし
くは少なくとも９０％又は９５％）がそのＤＮＡ配列の定義された長さとかさな
る場合に２つのＤＮＡ配列は『実質的に相同である』とされる。実質的に相同で
ある配列は配列データ・バンクで利用できる標準ソフトウエアを用いて比較する
か、あるいは、例えば、その特定の系のために決められた厳しい条件に基づいて
サザン交雑実験を行うことで識別することができる。適切な交雑条件を決めるこ
とは当業者の知る範囲である。例えば、Ｍａｎｉｔｉａｓら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ及びII； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎなど参照。
【００３９】 ＤＮＡ構成物の『異種』領域とは自然においてより大型の分子と結合した形態
では見出されないより大型のＤＮＡ分子の識別可能なセグメントのことである。
従って、その異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常そ
の供給源となっている生物のゲノム内で哺乳動物のゲノムＤＮＡで側鎖しないＤ
ＮＡによって側鎖されている。他の例で、コーディング配列はそのコード自体が
自然では見出されない構成物（例えば、そのゲノム性コーディング配列がイント
ロンを含んでいるｃＤＮＡ、あるいは自然の遺伝子とは異なったコドンを有する
合成配列）である。対立遺伝子の変差あるいは自然に発生する突然変異イベント
はここに述べているようなＤＮＡの異種領域は発生させない。
【００４０】 標準的なノーザン・ブロット・アッセイを、この技術分野の当業者に知られて
いる通常のノーザン交雑技術に従って、植物又はその他の形質変換組織の細胞又
は組織におけるｍＲＮＡの相対的量を確認するために用いることができる。又、
この技術分野の当業者に知られている従来のサザン交雑技術に従って、形質変換
系における遺伝子の存在及びそれらのコピー数を確認するために標準的なサザン
・ブロット・アッセイを用いることができる。ノーザン・ブロット及びサザン・
ブロットの両方とも、例えば放射性物質でラベルしたｃＤＮＡなどの交雑プロー
ブ、あるいは連続するヌクレオチドの長さが少なくとも２０（好ましくは少なく
とも３０、より好ましくは５０、そして最も好ましくは少なくとも１００）であ
るＤＮＡ配列のフラグメントである。ＤＮＡ交雑プローブは当業者に公知の多く
の異なった方法のいずれをもちいてでもラベルすることができる。
【００４１】 こうした研究で最も一般的に用いられるラベルは放射性元素、酵素、紫外線を
照射されると蛍光を発する化学物質などである。多数の蛍光性物質が知られてお
り、ラベルとして用いることができる。これらには、例えば、フルオレセイン、
ローダミン、オーラミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー及びルシファー・
イエローなどがある。特殊な検出用物質はヤギでつくられ、イソチオシアネート
を介してフルオロセインに接合された抗ウサギ抗体である。タンパク質は放射性
元素や酵素でもラベルすることができる。こうした放射性元素は現在利用できる
いずれのカウント技術ででも検出することができる。好ましい放射性同位元素は 3 Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125 I、131I、及び186Ｒｅから選択できる。
【００４２】 酵素ラベルも同様に有益で、現在利用されている比色、分光、蛍光分光、電流
測定、あるいはガス量測定方法のいずれかで検出することができる。酵素はカル
ボジイミル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応に
よって選択された粒子に接合される。この手順で用いることができる多くの酵素
が知られており、これらを用いることができる。好ましいものは、ペロキシダー
ゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、グルコース・オキシダーゼ＋ペロキシダーゼ、及びアルカリ性
ホスファターゼである。他のラベル用物質及び方法の開示に関しては、米国特許
Ｎｏ．３，６５４，０９０、３，８５０，７５２及び４，０１６，０４３を参照
されたい。
【００４３】 本発明は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１に欠損のあるトランス
ジェニックマウスに関連している。この欠損は不安感が低下し、コントロールマ
ウスと比較してストレスに対する内分泌応答が減少し、運動活性周期が違ってい
るマウスをもたらす。このマウスはその後別の系統のマウスと交配して子孫マウ
スをつくることができる。
【００４４】 本発明は副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウルコルチン、又は副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子レセプター−１以外のレセプターを通じて作用する関連リガンド
のアゴニスト又はアンタゴニストを確認できる方法にも関係している。本発明は
テスト化合物あるいは偽薬を副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損
マウスに投与するステップと、不安感、ストレスに対する内分泌応答、又はマウ
スの運動活性周期に対する影響を調べるステップを含んでいる。不安感レベル、
内分泌応答、又は運動活性周期の変化は副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウロコ
ルチン、又は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１以外のレセプターを
通じで作用する関連リガンドのアゴニスト又はアンタゴニストの存在を示してい
る。これらその他のレセプターは副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２
、又は新しい副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターを含んでいる。
【００４５】 本発明は又副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１が実質的に欠損して
いるトランスジェニックマウスをつくりだす方法にも関連している。この方法は
マウス・副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子から誘導された副
腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１形質変換遺伝子を胚性幹細胞に導入
することによる陽性ＥＳ細胞をつくりだすステップを含んでいる。このトランス
ジーンは副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子のエクソン５から
エクソン８の代わりに選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含んでおり、そ
こで、上記選択可能なマーカーでの選択下で生残し、成長するＥＳ細胞は陽性Ｅ
Ｓ細胞であり、トランスジェニックマウスは陽性ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤
胞内に導入することによってつくられる。これらのトランスジェニックマウスは
交配させて、そのトランスジーンがヘテロ接合であるトランスジェニックマウス
をつくりだすことができる。
【００４６】 本発明はコルチコステロン又は副腎皮質刺激ホルモンのアナノーグ又はアゴニ
ストである化合物を選別する方法にも関連している。この方法は、両方とも副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１が欠損しているヘテロ接合雌マウス及
びヘテロ接合雄マウスとの間の交配を行うステップと、その化合物を受胎後の雌
マウスに投与するステップと、その雌マウスから生まれた子孫マウスの肺の組織
状況を調べるステップとを含んでいる。ディスプレジア、肺胞虚脱及び肺胞内出
血を伴う反応性気腫、及びヘモジデリン沈着がないことはコルチコステロン又は
副腎皮質刺激ホルモンのアナローグ又はアンタゴニストの存在を示している。
【００４７】 本発明は又致死性の呼吸不全症候群を有している疑いのある胎児に対してイン
・ウテロで薬学的に受け入れ可能な量のコルチコステロンを投与するステップを
含む胎児の胎児呼吸不全症候群を緩和する方法にも関連している。
【００４８】 以下の実施例は本発明の開示の目的のために提供されるものであって、いかな
る意味でも本発明の限定を意味するものではない。
【００４９】 実施例１ ベクター構成物、ＥＳ細胞培養体の向標的操作とヌル突然変異の確認 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子座に対応するクローンさ
れたゲノムＤＮＡをマウス細胞株１２９ゲノムＤＮＡライブラリから分離した。
ターゲッティング構成物を発生させ、４番目の膜横断領域を通じて第１の細胞外
領域の最後の１２個のアミノ酸をコードする副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセ
プター−１遺伝子のエクソン５−８をＰＧＫ−ネオ・カセットと置換する（図１
）。その結果できるプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで線形化して、先行技術（Ｌｅ
ｅら、１９９２）に述べられている方法で胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポー
ションした。０．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８内で７−９日間選択を行った後、ネオ
マイシン抵抗性クローンを個別に選択して、各クローンから取り出した細胞の５
０％を９６ウェル・プレートで増殖させて凍結保存し、残りの５０％を２４ウェ
ル・プレートで培養してＤＮＡ分離に用いた。
【００５０】 ターゲッティング構成物（図１Ａ）に５’交雑した外部ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩゲノム性フラグメントを用いたサザン分析によって破壊された副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１対立遺伝子の存在を示すためにコロニーのス
クリーニングを行った。相同組換え遺伝子の存在を示唆する６．３ｋｂエコ・レ
セプター−Iを含んでいるＥＳ細胞クローンは８３個に１個の頻度で得られた。 陽性ＥＳクローンから得られた細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤細胞及び先行技術（Ｌ
ｅｅら、１９９２）に述べられている手順で発生させられたキメラ性マウスに注
入した。突然変異体対立遺伝子の生殖系列伝達をアグーチ・コート・カラーを示
しているＦ１グループの子どもマウスのテイルＤＮＡのサザン分析によって判定
した（図１Ｂ）。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝内に消失部
分も、エクソン６及び８（消失領域）に相補的なプライマーを用いてホモ接合体
突然変異体マウス及び野生型マウスから得られた小脳レセプター−ＮＡのレセプ
ター−Ｔ−ＰＣレセプター分析によって確認された。すべての反応に関してＧＡ
ＰＤＨ ｍＲＮＡをポジティブ・コントロールとして増幅させた。
【００５１】 マウス全脳下垂体細胞の１次培養体を用いて副腎皮質刺激ホルモン放出因子レ
セプター−１遺伝子における消失について確認したところヌル突然変異であった
。要約的に言うと、生後８−１０週間の雌マウス突然変異体およびコントロール
マウス（一つのグループからだいたい１０マウス）から全脳下垂体を集め、先行
技術に述べられている方法で分散させた（Ｖａｌｅら、１９８３）。その後細胞
は２パーセントのＦＢＳで補われた完全培地（ｂＰＪ）で洗浄され、ポリ−ｄ−
リジン（２０μｇ／ｍｌ）で予めコートされた４８ウェルコスタープレートで単
分子層（１．２×１０5細胞／ウェル／０．５ｍｌ）で培養される。３日間の回 復の後、細胞は０．１パーセントのＢＳＡを含むｂＰＪ媒体で２時間均衡化され
、新しい媒体の０−１００ｎＭ副腎皮質刺激ホルモン放出因子で一時間処理され
る。媒体は収集されＡＣＴＨ分泌は放射免疫測定キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定される。
【００５２】 実施例２ 組織学、免疫組織化学的インシトウハイブリッド形成分析 組織学的分析のために、突然変異体および野生型のマウス(特に指定がない限 り生後８−１０週間)は４パーセントのパラホルムアルデヒドで処理し、解剖（ 肺、副腎など）して、４℃で２４時間ポスト固定した。その後細胞組織をパラフ
ィンに埋め込こみ、７ミリの深さで切片化して、評価に先立ってヘマトキシリン
およびエオシンで染色した。脳内での副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ＡＶＰお
よびウロコルチンの位置と、脳下垂体内のＡＣＴＨの位置を免疫組織化学的につ
きとめるために、実験動物を４パーセントのパラホルムアルデヒドで処理し、細
胞組織は３０ミリの厚さで切片化した。副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ＡＶＰ
（Ｃｈａｎら、１９９３）アルコルチン（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９５）及びＡ
ＣＴＨ（Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４）の免疫組織化学的位置決定が行われた。イ
ンシトウでハイブリッド形成分析を行うためにマウスに麻酔をかけ、サリンで処
理し、その後０．１Ｍホウ酸塩緩衝液に４パーセント・パラホルムアルデヒドと
溶かした溶液で処理した。これらの細胞組織を１０パーセント・サッカロースを
含む固定剤内で４℃の温度で一昼夜保存した。凍結切片（厚さ３０ミリ）はレセ
プターマイクロトームでカットし、使用時まで不凍液（０．０５Ｍ ＮａＰＯ4 内に３０パーセントのポリエチレン・グリコール、２０パーセントのグリコール
を溶かしたもの）の中で保存した。交雑及び洗浄を先行技術（Ｐｏｔｔｅｒら、
１９９４）で述べられている手順に従って行った。その場で副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子ｍＲＮＡの位置決定を行うために、35Ｓでラベルしたアンチセンスお
よびセンスｃＲＮＡプローブをラットの副腎皮質刺激ホルモン放出因子ｃＤＮＡ
テンプレート（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ大学のＤｒ，Ｋｅｌｌｙ Ｍａｙｏか
ら提供）から合成した。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２に関して
は、33ＰでラベルしたアンチセンスおよびセンスｃＲＮＡプローブを８０ｂｐの
５非翻訳領域および９２６ｂｐのコーディング配列を含むおよそ１ｋｂのマウス
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２ｃＤＮＡ（Ｐｅｒｒｉｎら、１９
９５）から合成した。
【００５３】 実施例３ 血液採取およびホルモン分析 全ホルモン分析のため、動物(特に指定がない限りおよそ生後８−１０週間)は
、布で覆ったケージの中に一昼夜別々に収容されたあと、レトロオルバイタルア
イブリーディングによる血液の採取を行った。ケージを最初を混乱状態にさせて
から４５秒以内に血液サンプルを採取し、ＥＤＴＡを含むチューブ内の氷上保存
した。血漿サンプルは分析に先立って２０℃で保存された。混乱が与えられない
状態でのコルチコステロン濃度を確認するため、血液サンプルは雄および雌の突
然変異体と野生型マウス（それぞれｎ＝１４）から午前６時に採取した。サンプ
ルは突然変異体及びコントロールマウスの雄と雌（それぞれ，ｎ＝６，６，５お
よび６）から午後の４時にも採取した。ストレスに対する内分泌応答を調べるた
め、血液サンプルは副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター１突然変異体およ
び野生型マウスの雄と雌(各グループ、ｎ＝６)から午前８時に採取した。その後
、供試動物は直ちに短時間身体拘束ストレス（底を取り外した５０ｍｌ円錐形チ
ューブ内での１０分間の拘束）にかけられた。そして二回目の血液サンプル採取
を行い、その後直ちに動物を致死させた。出生直後の循環ＡＣＴＨ濃度を判定す
るために、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損（ｎ＝５）および
野生型マウス（ｎ＝７）から出生後１０日目に血漿サンプルを採取した。ラット
ＡＣＴＨ（１−３９）を標準として用いるヒトＡＣＴＨ２−サイト免疫放射定量
測定器（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓ
ｔｒａｎｏ，ＣＡ）によって、ＡＣＴＨの血漿濃度を判定した。コルチコステロ
ンの血漿濃度はラット／マウス125Ｉコルチコステロン放射免疫測定キット（Ｉ ＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）を用いて判定した
。
【００５４】 実施例４ 行動分析 不安を発生させる環境における副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
欠損マウスの挙動応答をダーク−ライトエマージェンスタスクを用いてテストし
、コントロールマウス(各グループの雄マウス、ｎ＝６)の反応と比較した。行動
実験に用いられるマウスは全て単独で収納された。実験は深さ１２ｃｍ、直径８
ｃｍの不透明なチャンバーを含む白色オープン・フィールド(５０×５０ｃｍ)内
で行われた（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８９）。このチャンバーは開口した端
がコーナーに面した状態でオープン・フィールドの中央に配置された。オープン
・フィールドはその中央に向けられたランプ（床上で１２０ルクス）によって照
らされた。実験は一定の背景白色ノイズ（８０ｄｂ）のある部屋で行われた。実
験に先立ってマウスを実験室に一時間慣らさせた。行動実験は、マウスを小チャ
ンバーの中に入れて、慣れない実験環境に導入することによって行われた。５分
間の実験期間中の行動をビデオカメラによって記録した。チャンバーを出るまで
の待ち時間―四つ足がオープン・フィールドに付いている時間と定義、チャンバ
ーの外で過ごした時間の合計、脱出の回数、各脱出の度にオープン・フィールド
内で過ごした時間がビデオ記録から定量された。
【００５５】 運動活性は光電セル・ビーム（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の取り付けられたフレーム（２５．５×４７
ｃｍ）内に配置された大型Ｐｌｅｘｉｇｉａｓケージ（４２×２２×２０ｃｍ）
内で計測した。水平移動フレームは４×８配列のビームで構成される。運動活性
の実験は一定の背景白色ノイズ（８０ｄＢ；Ｘｕら、１９９４）のある部屋で、
上に述べたのと同じ照明条件下で行われた。マウスは実験開始一時間前に実験室
に入れられた。光ビーム中断パターンが分析され、時間の経過に伴うゾーン進入
回数を測定した。ゾーンへの進入は８つの等サイズ正方形（２×４マトリックス
、１１×１０，５ｃｍ／ゾーン）の１つ内への移動と定義された。この計測は１
つのビームの反復される中断より、むしろ水平移動をより正確に反映するために
用いられた。
【００５６】 実験サイクルの明期の間にテストされたこの新しい環境下での運動応答を、不
安実験における運動活性のコントロールとして用いた。運動応答を１８０分間に
わたって記録し、その最初の５分間をダーク−ライトエマージェンスタスクの５
分間との比較、評価した。２ヵ月後、食物と水を与えつつ、運動活性を４８時間
にわたって記録した。基礎的運動活性は活動ケージに１２時間馴化期間に続く２
４時間の間とみなされた。運動応答は各段階で記録され、実験サイクルの明期段
階に比べての暗期の活動増加の割合を計測した。
【００５７】 スチューデントｔ−検定を用いてこれら２つのグループの運動活性スコアを比
較し、さらに、個体間因子としてのグループ（野生型及び突然変異体動物）及び
個体内因子としての運動活性の時間経過に関する反復測定の因数分析（ＡＮＯＶ
Ａ）によって行った。ダーク−ライトエマージェンスタスクにおけるグループ同
士の比較はマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定を用いて行
なった。
【００５８】 実施例５ 肺異形成のイン・ウテロでのコルチコステロイドによる治療 ホモ接合型副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１マウスの雄と雌を交
配させて、交尾プラグの存在によって交尾が確認された(胚発生日０とする)。胚
発生日１２から出産後１４日目までの妊娠したマウスを飲料水内に含ませた２５
μｇ／ｍｌのコルチコステロン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を与え
、新生児の生存評価のために用いた。コルチコステロンで処理された突然変異体
マウス、処理されなかった突然変異体マウス、及びまったく処理されなかったコ
ントロールマウスから出生後１日目に肺を取り出して、上述の手順で組織分析を
行った。
【００５９】 実施例６ 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの副腎欠失のホルモ
ンに よる治療 上述のコルチコステロン治療方法を用いて、出生された突然変異体の子マウス
を副腎の成熟に対するＡＣＴＨ置換の影響を調べた。出生後１０日目から２１日
目まで、希釈剤（０．１Ｍリン酸塩緩衝液、０．１％仔ウシ血清アルブミン、０
．０１％アスコルビン酸、ｐＨ７．３）にＡＣＴＨを溶かしたものか又は希釈剤
のみを、ラットの体重１ｇあたり１０ｎｇの割合で皮下注射した。その後ＡＣＴ
Ｈで処理突然変異体マウス（ｎ＝４）及び希釈剤だけで処理された突然変異体（
ｎ＝３）から副腎を取り出して、上述の手順で処理した。
【００６０】 実施例７ 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの発生 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスを発生させるために
、第1の細胞外領域から４番目の膜横断領域までの最後の１２個のアミノ酸をコ ードする副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子の部分がネオマイ
シン抵抗性遺伝子カセットと置換されたターゲッティングベクターを構成した（
図１Ａ）。その結果として得られた破壊した副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセ
プター−１ ｍＲＮＡは細胞膜に組み込まれないレセプタータンパク質となり、
従って、機能しないことが予想された。スクリーニングされた５００のネオマイ
シン抵抗性コロニーのうちの６つは外部ブローブを用いて行ったサザン分析で陽
性と示された(図１Ｂ)。標的とされたＥＳ細胞株の内の２つから得られた細胞を
Ｃ５７ＢＬ／６肺盤胞に注入してキメラ・ファウンダ・マウスが発生させ、分裂
した対立遺伝子の生殖腺伝達が得られた。一般に、ヘテロ接合動物の交配から生
まれるホモ接合体突然変異体マウスは正常に発育し、生殖能力があった。しかし
ながら、雄の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスに
おいて１５パーセントの死亡率が確認された。死亡は主に生後３−１２週間の間
に起きたが、雌の副腎皮質刺激ホルモン放出因子マウスレセプター−1欠損マウ ス及びコントロールマウスにおいてはそうした傾向は認められなかった。ホモ接
合突然変異体動物の小脳から得られたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣレセプター分析で、
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子内に消失部分があることが
確認された（データは示さず）。
【００６１】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子がヌル・レベルの突然変
異を起こしたかどうか確認するために、野生型及び突然変異体マウスから得られ
た培養脳下垂体細胞を０から１００ｎＭの副腎皮質刺激ホルモン放出因子で１時
間処理し、培養体内のＡＣＴＨレベルを計測した。野生型マウスの脳下垂体細胞
を副腎皮質刺激ホルモン放出因子処理したところ、ＡＣＴＨ分泌においてその用
量に依存した増加が認められた（図１Ｃ）。これと対照的に、０−１００ｎＭの
副腎皮質刺激ホルモン放出因子で副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
欠損脳下垂体細胞を処理したところ、ＡＣＴＨ分泌の増大は認められなかった（
図１Ｃ）。このように、ターゲッティング突然変異は機能性レセプタータンパク
質をつくりださない破壊された副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺
伝子がつくりだされた。
【００６２】 実施例８ 明確な副腎欠失を示す副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウ
ス 副腎皮質刺激ホルモン放出因子依存経路は視床下部−脳下垂体−副腎（ＨＰＡ
）軸の調整及びストレスに対する多くの中枢反応において重要な役割を果たすこ
とが知られている（Ｏｗｅｎｓ及びＮｅｍｅｒｏｆｆ，１９９１）。突然変異体
動物におけるＨＰＡ軸の機能の初期評価として、血漿サンプルを雄／雌野生型マ
ウス及び突然変異体マウスから午前６時と午後４時に採取した。副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子レセプター−１突然変異体(雄及び雌)は野生型のマウスに比べて
血漿コルチコステロン濃度が非常に低かった。特に午後に発生する循環コルチコ
ステロンの特徴的な増加は突然変異体マウスには認められなかった（図２Ａ）。
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスから得られた副腎の組
織分析は観察された内分泌不全の解剖学的根拠を示した。突然変異体動物は副腎
中のコルチコステロン生成に関与している領域である束状帯の著しい萎縮を示し
た(図２Ｂ)。対照的に、突然変異体マウスの副腎の球状帯、網状帯及び髄質は正
常に見えた。さらに、突然変異体マウスの副腎の球状帯領域で生成されるアルド
ステロンの血漿濃度は野生型のものと同じであった（データは示さず）。従って
、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおける副腎欠失は
副腎のコルチコステロン生成領域に特有な現象のようである。
【００６３】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子はイン・ビボで副腎皮質刺激ホルモン増殖を刺
激することができ（脳下垂体のＣＴＨ生産細胞、Ｇｅｒｔｚら、１９８７）、脳
下垂体ＡＣＴＨは副腎のコルチコステロン生成領域のトロフィックとしての役割
を果たす（Ｉｄｅｌｍａｎら、１９７０）。従って、副腎皮質刺激ホルモン発生
における欠陥があるかどうかを確定するために、突然変異体マウスからの副腎の
細胞構成及び全体的形態を調査した。突然変異体マウスから得られた脳下垂体の
組織学的、免疫細胞化学的分析によって、観察可能な解剖学的欠陥(データ示さ ず)は存在しないこと、及び副腎皮質刺激ホルモンプスの通常の補体が存在する ことが明らかになった（図２Ｃ)。イン・ビトロでの基礎ＡＣＴＨ分泌(図１Ｃ) 及び突然変異体マウスから得られた分散脳下垂体細胞のＡＣＴＨ含量は野生型マ
ウスのものと同じであった。さらに、午前（図４Ｂ参照）と午後の突然変異体マ
ウスの血液循環におけるＡＣＴＨ濃度はコントロールマウスのものと変わらなか
った。隔壁、海馬及び小脳扁桃などを含む副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ ター−１欠損マウスの脳内のいろいろな部分のニッスル染色切片も何ら解剖学上
の明確な欠陥を示さなかった。
【００６４】 実施例９ 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの視床下部の室傍核
における副腎皮質刺激ホルモン放出因子発現の増大 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１は脳下垂体内及び副腎皮質刺激
ホルモン放出因子のいろいろな生物学的作用の多くの媒介に関与する脳の諸領域
内で発現される優越副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターのサブタイプであ
る（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９６）。突然変異体動物におけるコルコト
ロピン放出因子レセプター−１依存経路の喪失は副腎皮質刺激ホルモン放出因子
系の他の構成要素の位置、あるいは発現レベルの変化によって補償されることも
ある。従って、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの脳及
び脳下垂体内の副腎皮質刺激ホルモン放出因子システムの他の重要な構成物の発
現における変化の特性を示すために免疫組織化学及びインシトウハイブリッド形
成分析が行われた。免疫組織化学分析の結果、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レ
セプター−１欠損マウスの視床下部の室傍核（ＰＶＮ）内の副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子の発現が野生型(図３Ａ)のものと比較して著しく増加していることが
明らかとなった。副腎皮質刺激ホルモン放出因子ｍＲＮＡ発現の増加は突然変異
体マウスのＰＶＮと野生型のものとを比較して増大が認められた。
【００６５】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子を総合する室傍核内の同じニューロンから主に
発生されるアルギニン・バソプレシン（ＡＶＰ）もコルチコトロプ機能の重要な
調整因子である。副腎皮質刺激ホルモン放出因子とは対照的に、突然変異体マウ
スの室傍核内ではＡＶＰ発現には変化は見られなかった(図３Ｂ)。副腎皮質刺激
ホルモン放出因子を生成する脳の他の領域では突然変異体マウス内の副腎皮質刺
激ホルモン放出因子発現はコントロールマウスのものと変わらなかった。従って
、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１の欠損は特に突然変異体マウス
の傍室核内で副腎皮質刺激ホルモン放出因子表現の増大につながる。突然変異体
マウスの脳あるいは脳下垂体内では副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−
２発現の空間配置あるいはレベルに変化が見られなかった。同様に、突然変異体
マウスの中脳内のウルコルチンの中心の発現もコントロールマウスのそれと同じ
だった。
【００６６】 実施例１０ ストレスに対して減少した内分泌レセプター反応を示す副腎皮質刺激ホルモン
放出因子レセプター−１欠損マウス ストレスに対するホルモン反応は、視床下部の室傍核によって増加した副腎皮
質刺激ホルモン放出因子分泌物が視床下部脳下垂体門脈系に流入するし、それに
よって脳下垂体コルチコトロプスによってＡＣＴＨ分泌物が増加し、それに伴っ て副腎によるコルチコステロイド分泌が増大することによって引き起こされる（
Ｏｗｅｎｓ ＆ Ｎｅｍｅｒｏｆｆ，１９９１）。副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター１欠損マウスにおいて脳下垂体及び副腎のストレスに対する反応に
問題があるかどうかを確認するために、午前８時に１０分間、野生型及び突然変
異体雄／雌マウスに身体拘束ストレスをかけた。ストレスをかける前とかけた直
後に採取したサンプルからコルチコステロン及びＡＣＴＨの血漿濃度を計測した
。拘束後、雄／雌のコントロールマウスにＡＣＴＨ及びコルチコステロンの著し
い増加応答がみられた（それぞれ図４Ａ及び図４Ｂ）。これと対照的に、拘束ス
トレスをくわえても、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウス
における循環ＡＣＴＨ(図４Ａ)には計測可能な増加はみられず、その結果として のコルチコステロンの増加も野生型のものと比べたら著しく少なかった(図４Ｂ)
。これらの結果は、ストレスに対する内分泌応答が副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１欠損マウスにおいては大きく調製されることを示している。
【００６７】 実施例１１ 不安感の低下を示す副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体
マウス 不安感を示す適応性変化はストレス応答の主要な構成要素であり、ストレスに
対する挙動応答の媒介において副腎皮質刺激ホルモン放出因子が重要な役割を果
たしていることが示されている（Ｋｏｏｂら、１９９４）。従って、副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスのストレスに対する挙動応答の評
価が行われた。不安を感じさせる環境に対する副腎皮質刺激ホルモン放出因子レ
セプター−１欠損マウスの挙動応答がダーク−ライトエマージェンスタスクを用
いて検査され、コントロールマウスと比較された。突然変異体マウスは、野生型
マウスと比較して、あまり待たずに小チャンバーを抜け出てオープン・フィール
ドに入る傾向があり(嫌悪環境)、そのオープン・フィールドでの滞在時間も有意
に長かった（Ｐ＜０．０５；図５Ａ）。脱出のたびにオープン・フィールドで過
ごした時間も野生種のものと比較して有意に長かった（３．８±３．２秒に対し
て、１９．９±７．５３；Ｐ＜０．０５）。
【００６８】 不安感を与える刺激に対する副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突
然変 異体マウスの感度の低下が新奇性に対する挙動応答の違いによって起きたのでは
ないことを確認するため、ダーク−ライトエマージェンスタスクと同じ照明条件
下で新しい環境に対する運動活性が計測された。ダーク−ライトエマージェンス
プロトコールの持続時間の最初の５分間(図５Ｂ)と３時間のテスト期間全体での
両グループのゾーンへの総進入回数に相違はなかった。従って、突然変異体マウ
スのダーク−ライトエマージェンスタスク中のチャンバー出入りの増加傾向は目
新しさに対する反応性の違いによるものではなかった。
【００６９】 実施例１２ 活動活性変化を示す副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウス 副腎皮質刺激ホルモン放出因子発現（Ｍｏｌｄｏｗ及びＦｉｓｃｈｍａｎ，１
９８４；Ｏｗｅｎｓら、１９９０）及び運動活性を含む複数の挙動応答の両方の
概日周期がはっきりと確定された。しかし、行動の周期変化の変調における副腎
皮質刺激ホルモン放出因子システムの潜在的な役割は確定されていない。従って
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損及び野生型マウスの運動活性
周期の特徴づけが行われた。テスト器具への慣らし期間に続く１２時間の明状態
及び１２時間の暗状態からなる２４時間での基礎運動活性の評価が行われた(図 ５Ｃ)。野生型及び突然変異体マウスの両方とも試験サイクルの明期間に比較し て暗期間に活動の正常な活発化がみられた（野生型及び突然変異体マウスに対し
てそれぞれ、Ｐ＜０．００１及びＰ＜０．０１）。しかし、サイクル中の突然変
異体マウスの運動活性移は、野生型のそれと比較して暗期間(図５Ｄ)だけではな
く明期間（Ｐ＜０．０５）でも著しく活発であり、よってサイクル中、明期間に
比べての暗期間における活動の増加パーセンテージは野生型マウス（８９．２６
±３．２０）においてよりも突然変異体マウス（５６．７０±４．３７）におい
てのほうが低かった（Ｐ＜０．００１）。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ
ター−１突然変異体マウスの活動量の増加は明サイクルの最後数時間中に特に明
白にみられた（図５Ｃ）。従って副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
突然変異体マウスは野生型マウスであれば通常に活動が沈静化する時間帯に活動
の活発化をみせ、その運動活性周期移に明らかな変化を示した。
【００７０】 実施例１３ ホモ接合型副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体雌の子マ
ウスの新生児死亡及びコルチコステロンによるイン・ウテロ救済 上述のように、ヘテロ接合型副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突
然変異体マウスより生まれた子マウスは出生時において生存能力があり、通常の
新生児生存率を示した。さらに、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１
突然変異体の生殖、成長能力の特性を示すために、雄及び雌のホモ接合型突然変 異体マウスを交配させた。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変
異体の繁殖力に顕著な相違は見られなかったものの、ホモ接合型副腎皮質刺激ホ
ルモン放出因子レセプター１突然変異体雌マウスから生まれた子マウスの殆ど全
てが出生後４８時間以内に死亡した。
【００７１】 突然変異体雌マウスで観察された副腎欠失及び新生児の肺成熟にとってのコル
チコステロイドの必要性はすでに十分に解明されている（Ｂａｌｌａｒｄ、１９
８９）ので、これらの動物はほとんどが出生後の呼吸不全によって死んだ可能性
が高い。実際、出生後１日目に行われた組織学的分析によって比較対象マウスか
ら生まれる子マウスに比較して雌ホモ接合型突然変異体マウスに生まれる子マウ
スの方に著しい肺異形成があることが分かった（図６Ａ及び６Ｂ）。突然変異体
の肺は肺胞崩壊及び反応性気種を示し、肺胞内出血とヘモシデリン沈着が認めら
れた(図６Ｂ)。その後、コルチコステロンによる処理が新生児の肺形成不全症を
防ぎ、それに伴ってホモ接合型突然変異体マウスに生まれる子マウスの死亡率が 修正されるかどうかが調べられた。
【００７２】 これらの実験によって、ホモ接合型突然変異体雌マウスを胚発生日１２より出
生後１４日目までコルチコステロンを飲用水に溶かしたものによるイン・ウテロ
処理を施したところ、新生児において正常な肺の成熟が認められた。イン・ウテ
ロでのコルチコステロン処理に続く生後１日目に採取された肺の組織分析によっ
て、肺胞中隔が狭く正常な空気膨張空間を有する正常な構造であることが分かっ
た(図６Ｃ)。イン・ビトロでのコルチコステロイド処理によってホモ接合型突然
変異体雌マウスに生まれる新生児の生後の生存率も正常になることが分かった( データ示さず)。同時に、ヘテロ接合体型副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ ター−１欠損マウスの交配によって生まれる新生児の生存率は正常であり、その
結果ホモ接合型副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウス
に生まれる新生児に肺の成熟不全がみられたり生存率が低かったりする原因が母
体の妊娠期後期及び新生児期におけるコルチコステロイド不足によるものだとい
うことが分かった。
【００７３】 実施例１４ 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおける副腎不全の
ホルモンによる治療 ホモ接合動物における成長及び／又は著しい副腎萎縮に対して内分泌がどのよ
うな影響を及ぼしているか、さらにそうした副腎欠失が最初に明らかになるのは
出世前か出世後かを明らかにするために副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプタ
ー−１突然変異体マウスのさらなる特徴づけを行った。正常な副腎コルチコステ
ロイド生産に対するＡＣＴＨの絶対的な必要性（Ｃｏｌｂｙら、１９７４）を考
えれば、副腎形成不全が副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１依存信号
経路の欠失の直接の結果なのか、あるいは副腎形成中の不充分な腺刺激ホルモン
（ＡＣＴＨ）の間接的な結果なのかを調べる必要があった。
【００７４】 この欠陥が出生前に起きるのかあるいは出世後に起きるのかを調べるために、
コントロールマウス及び突然変異体マウスからの副腎を出生後３日目に回収して
、組織学的検査を行った。突然変異体の副腎の形状に特別の明瞭な変異は検出さ
れなかった（図７Ａ）が、これは副腎欠失が出世後に現れることを示している。
その後、突然変異体マウスからの副腎が外来のＡＣＴＨと反応して束状帯領域で
の形成不全の減少をもたらすかどうかを調べた。生後１０日目から２１日目まで
の期間に１日２度ＡＣＴＨを注射したところ、副腎サイズと束状帯の幅の両方が
賦形剤を注射された突然変異体マウスと比較して増大した（図７Ｂ）。従って、
突然変異体マウスの副腎は外来の腺刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）処理に応答する能
力を有している。副腎欠陥は通常の出生後の副腎成熟期中の突然変異体マウスに
おける循環性ＡＣＴＨ濃度の減少によるものかもしれない。
【００７５】 突然変異体マウスが副腎成熟期のＡＣＴＨ不足をきたしていることを確認する
ために、生後１０日目に突然変異体マウスと野生型マウスの両方から血漿サンプ
ルを採取した。血漿ＡＣＴＨ濃度の調査は、出生後１０日目で、突然変異体マウ
スのＡＣＴＨ濃度が比較対象マウスと比較してかなり低くいことを示した（図７
Ｃ：Ｐ＜０．０２）。従って、突然変異体動物における副腎不全をもたらすメカ
ニズムは出生後初期のＡＣＴＨ生産の不充分さにその原因を求めることができる
かもしれない。これらの結果は副腎による副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ
ター−１媒介ＡＣＴＨ生産が正常な出世後の成長と副腎の成熟にとって絶対的に
必要であることを示している。
【００７６】 本発明においては、胚性幹細胞におけるジーンターゲッティングによって副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子座における向標的破壊を有する
マウスをつくりだした。突然変異体マウスから採取され培養された脳下垂体細胞
は副腎皮質刺激ホルモン放出因子処理によるＡＣＴＨ分泌の増大を示さず、これ
は突然変異がレセプター機能の喪失につながったことを示した。脳及び脳下垂体
内部での副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター１の広い分布（Ｃｈａｌｍｅ
ｒｓら、１９９５； Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４）と出生前及び後の軸に観察さ
れる副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターの一時的、空間的調節（Ａｖｉｓ
ｈａｉ−Ｅｌｉｎｅｒら、１９９６； Ｉｎｓｅｌら、１９８８）を考えると、
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１媒介経路の喪失が突然変異体動物
における著しい欠陥の形成につながると考えるのが妥当であろう。実際、副腎皮
質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスは副腎の束状帯の著しい形成
不全を示した。観察された副腎欠陥は成熟した動物では循環性コルチコステロン
濃度の著しい低下という現象を伴っており、これは副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１突然変異体における構造的異常及び機能的異常の両方を示して
いる。副腎皮質刺激ホルモン放出因子遺伝子の特定の場所に破壊を有するマウス
も同様の副腎欠失を示す（Ｍｕｇｌｉａら、１９９５）。
【００７７】 これらの系統のマウスの副腎欠失については２つの仮説が可能である。突然変
異体マウスにおける副腎形成不全は間接的で、成長期間中の脳下垂体からの副腎
皮質刺激ホルモン放出因子刺激に基づくＡＣＴＨ分泌の欠失のせいかもしれない
し、あるいは、副腎内での副腎皮質刺激ホルモン放出因子／副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子レセプター１依存成長経路欠如の直接的な結果とかもしれない。副腎
内部で副腎皮質刺激ホルモン放出因子と副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合サイ
トの両方が検出されているが、リガンド及びレセプター発現は髄質領域だけに限
定されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９８４； Ｓｕｄａら、１９８４；
Ｕｄｅｌｓｍａｎら、１９８６）。副腎の髄質からの培養細胞（クロマフィン細
胞）を副腎皮質刺激ホルモン放出因子で処理することによってカテコールアミン
及びメトエンケファリンの分泌が促進される（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、１９８６）
。これらの因子はイン・ビトロで副腎皮質機能に刺激を与えることが報告されて
いるが（Ｋａｐａｓら、１９９５； Ｗａｌｋｅｒら、１９８８）、副腎内での
血流は皮質から髄質に向かう（Ｕｄｅｌｓｍａｎら、１９８６）。従って、副腎
皮質刺激ホルモン放出因子に応答して副腎髄質から放出される因子が副腎皮質の
成熟に栄養的な影響を及ぼす可能性はある。これらの結果は明らかに副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１欠損突然変異体動物における副腎形成不全が
不充分なＡＣＴＨ分泌によって起きるという仮設を裏付けるものである。副腎皮
質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおいて観察される副腎欠陥
は脳下垂体手術の後に観察される副腎欠陥と構造的にも機能的にも類似している
。脳下垂体手術をうけた動物では、束状帯領域の維持（Ｉｄｅｌｍａｎ、１９７
０；Ｗｙｌｉｎｅら、１９７３）及び正常なコルチコステロイド生産（Ｃｏｌｂ
ｙら、１９７４）の両方にとってＡＣＴＨ補給は絶対的に必要である。
【００７８】 副腎の十分な成熟に副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１に依存した
ＡＣＴＨ分泌が絶対的に必要な時期は出世後の成長におけるクリティカルウイン
ドウであるように見える。副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マ
ウスの出生前の成長期間中の副腎欠失の発現は起こらないようである。副腎皮質
の最初の分化は出生前に起き（Ｄａｉｋｏｋｕら、１９７６）、そして出生後３
日目に採取された副腎の組織学的分析では副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプ
ター突然変異体マウスと野生型マウスとの間の検出可能な違いは認められなかっ
た。従って、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスに
おける副腎欠失は明らかに出生後に発現する。
【００７９】 本研究では出生１０日目の突然変異体動物での血漿ＡＣＴＨ濃度はコントロー
ルにおけるそれと比較してかなり低く、出世後１０日目から２１日目にＡＣＴＨ
を補給すると副腎形成不全が改善された。しかしながら、成熟した突然変異体動
物における循環性ＡＣＴＨレベルはコントロールマウスとほぼ同じであった。突
然変異体動物がＡＣＴＨ合成及び分泌に対するコルチコステロンの強力な阻害的
影響を受けないという事実（Ｋｅｌｌｅｒ−Ｗｏｏｄ及びＤａｌｌｍａｎ，１９
８４）は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター１を欠失している動物のＡＣ
ＴＨがほぼ同じレベルであることと整合している。しかしながら、成熟した突然
変異体動物における見かけ上の正常な循環性ＡＣＴＨ濃度は副腎の成熟と正常な
機能を回復させるのには十分ではない。従って、副腎欠失は出生後の副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１媒介ＡＣＴＨ分泌の欠如によるものであるよ
うに思われる。
【００８０】 副腎欠失とは対照的に、脳及び脳下垂体での解剖学的欠陥は突然変異体動物で
は検出されなかった。副腎皮質刺激ホルモン放出因子がイン・ビボで脳下垂体の
ＡＣＴＨ生産細胞の細胞を発生させる（Ｇｅｒｔｚら、１９８７）ことが報告さ
れており、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１発現が成長中の特定の
時期に脳の異なった領域で開始される（Ａｖｉｓｈａｉ−Ｅｌｉｎｅｒら、１９
９６）ことを考えれば、この結果はある程度驚くべきことである。コルチコトロ
ープの出現及び成熟も副腎皮質刺激ホルモン放出因子欠損マウスにおいて正常で
あった（Ｍｕｇｌｉａら、１９９５）。従って、通常のコルチコトロープの発生
に対して、副腎皮質刺激ホルモン放出因子／副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセ
プター−１は絶対的に必要ではないように思われる。しかしながら、副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスは新生児期間中に循環性Ａ
ＣＴＨレベルの明らかな低下を示したので、出世後の初期の副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子レセプター−１媒介ＡＣＴＨ生産に対する必要性は確定された。
【００８１】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子の突然変異は第２の副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブタイプ（副腎皮質刺激ホルモン放出 因子レセプター−２）の発現の場所又はレベルにおける補正的変化を伴ってはい
なかった。しかしながら、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１に対す
る優越性リガンドの発現における補正的増加が副腎皮質刺激ホルモン放出因子レ
セプター−１欠損マウスのＰＶＮで検出された。副腎皮質刺激ホルモン放出因子
ｍＲＮＡ及びタンパク質の増加はＰＶＮに限定されており、扁桃など脳の他の副
腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター生産領域では検出されなかった。ＰＶＮ
における副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１の発現の増大はコルチコ
ステロイドのネガティブなフィードバック効果が低下することに起因するかもし
れない。ラットで、ＰＶＮにおける副腎皮質刺激ホルモン放出因子及びアルギニ
ン・バソプレシンはコルチコステロイドによって阻害され（Ｓａｗｃｈｅｎｋｏ
、１９８７）、副腎剔除によって増進される（Ｓａｗｃｈｅｎｋｏら、１９８４
）。しかしながら、副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスに
おけるアルギニン・バソプレシン（ＡＣＴＨ分泌のもうひとつの重要な調節因子
）の発現はコントロールにおけるそれとほぼ同じである。それにも拘わらず、成
熟した突然変異体マウスの正常な循環性ＡＣＴＨレベルはコルチコトロープ機能
性のアルギニン・バソプレシン刺激の増大とは対応していない。
【００８２】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体雌マウスは生殖力を
有しており、生殖上の明らかな異常は示さなかった。ヘテロ接合突然変異体雌マ
ウスから生まれた後代は新生児段階での正常な生存率を示したが、ホモ接合突然
変異体雌マウスから生まれた後代は、出世後４８時間以内に肺異形成で死亡した
。副腎皮質刺激ホルモン放出因子欠損マウスと（Ｍｕｇｌｉａら、１９９５）及
びグルココルチコイド・レセプター遺伝子に標的化された破壊を有するマウス（
Ｃｏｌｅら、１９９５）の両方に関して、同様の病因と新生児死亡率が報告され
ている。ホモ接合体副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体雌
の後代における、新生児の死亡は胎児／新生児期の不十分な肺成熟につながる母
親のコルチコステロン不足の結果であった。本発明においては、子孫の生残りは
胎児期から開始されるコルチコステロン補給によって向上した。ホモ接合副腎皮
質刺激ホルモン放出因子突然変異マウスから生まれた後代を救済するためにも同
様の考え方と手順が用いられ（Ｍｕｇｌｉａら、１９９５）、未熟児での呼吸不
全症候群を措置するためにもコルチコステロイドによる措置が一般的に用いられ
ている（Ｂａｌｌａｒｄ，１９８９）。
【００８３】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損が挙動にどのような影響を
及ぼすかを調べるために、野生型及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター
−１突然変異体マウスをストレスを感じさせる環境への自由選択応答を内容とす
るダーク−ライトエマージェンスタスクで比較した。副腎皮質刺激ホルモン放出
因子レセプター−１突然変異体マウスは野生型のマウスよりより長期間照明を受
けたオープン・フィールドを訪れた。従って、突然変異体マウスは一般的には齧 歯類にとっては望ましくないと考えられる環境に接近する機会が増え（Ａｒｃｈ
ｅｒ、１９７３； Ｃｒａｗｌｅｙ ＆ Ｇｏｏｄｗｉｎ、１９８０； Ｄｅｎ
ｅｎｂｅｒｇｈ、１９６７； Ｍｉｓｓｌｉｎ、１９８９）、この不安を起こさ
せるような刺激に対してより低い感受性を示した。新しい環境でテストされた場
合の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスの急性運動
活性はコントロールマウスと違いは見られず、このことは突然変異体動物におけ
る不安感の低下が新しいものへの反応性の違いによるものではないことを示して
いる。これまでの研究はラットにおける副腎皮質刺激ホルモン放出因子の不安発
生性の影響は脳下垂体−副腎軸の活性化とは無関係であることを示している（Ｂ
ｒｉｔｔｏｎら、１９８６）。副腎皮質刺激ホルモン放出因子アンタゴニスト及
びアンチセンス・オリゴヌクレオチドを中枢神経に注射されたラットに関する従
来のデータもストレスに対する挙動上及び生理的応答が脳系における副腎皮質刺
激ホルモン放出因子作用による可能性があることを示唆している（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｚら、１９９７； Ｓｋｕｔｅｌｌａら、１９９４； Ｓｗｉｅｇｉｅｌら、
１９９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８９）。さらに、副腎皮質刺激ホルモン
放出因子レセプター−１に対する高い選択性を有する非ペプチド・副腎皮質刺激
ホルモン放出因子レセプターアンタゴニストＣＰ−１５４，５２６によってラッ
トを措置した場合も中枢神経に投与された副腎皮質刺激ホルモン放出因子が不安
発生硬化を示すことが報告されている（Ｓｃｈｕｌｚら、１９９６）。従って、
副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスにおける不安性
応答の低下はそれらのコルチコステロン特性の変化によるものではない可能性が
ある。これらのことを考え合わせると、これらの結果は副腎皮質刺激ホルモン放
出因子活性の減衰がストレスのある条件下での研究を容易にしてくれることを示
唆している。これらの結果は副腎皮質刺激ホルモン放出因子の中枢神経投与がス
トレスに対する挙動応答を開始させることを示す文献（Ｂｅｒｒｉｇｅ ＆ Ｄ
ｕｎｎ、１９８６； Ｋｏｏｂ、１９９４； Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９９３； Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８９； Ｌｉａｎｇら、１９９２）との整合性を
示しており、ストレスに対する挙動応答に関与している副腎皮質刺激ホルモン放
出因子依存経路が副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１に媒介されるこ
とを明らかに示している。
【００８４】 視床下部での副腎皮質刺激ホルモン放出因子濃度の概日変化（Ｍｏｌｄｏｗ
＆ Ｆｉｓｈｅｒｍａｎ、１９８４； Ｏｗｅｎｓら、１９９０）と運動活性な
どの挙動応答はすでに確定されているけれども、周期的な運動活性における副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター依存経路の機能的は役割はまだ解明されて
いない。運動活性の周期サイクルは副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−
１欠損マウスにおける突然変異によって影響されている。これらの動物は野生型
の動物と比較して暗期と明期との間の活性周期がそれほど明確ではなく、これは
明暗サイクルの明期間中の活性の増大によるもののようである。この点で、副腎
皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスにおける運動活性の
周期サイクルに対する慢性的コルチコステロイドの影響がまだはっきりしておら
ず、さらなる研究を必要とする。しかしながら、ラットにおける従来の研究が副
腎剔除が明期中の運動活性に影響を及ぼしていないことを示している（Ｉｎｖｏ
ｎｅ ＆ Ｖａｎ Ｈａｒｔｅｓｖｅｌｄｔ、１９７７）から、あり得ないよう
に思われる。
【００８５】 上に２つの特殊な副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター・サブタイプにつ
いて述べてきたが、外部的妨害を受けていない状態と、ストレスを受けた状態の
両方での副腎皮質刺激ホルモン放出因子あるいは副腎皮質刺激ホルモン放出因子
レセプター関連リガンドに対しての生物学的応答を媒介する上でのこれらのレセ
プターが果たしている正確な役割は完全には解明されていない。脳及び脳下垂体
の両方の内部での副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１発現は明らかに
ストレス（Ｒａｎｄａｎ−Ｄｉｅｈｌら、１９９６； Ｒｉｖｅｓｔら、１９９
５）及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子及びその他の調節因子（Ｍａｎｓｉら、
１９９６； Ｐｏｚｚｏｌｉら、１９９６）によって調節されており、一方、副
腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−２の発現は同様の条件で構成的に行わ
れる（Ｒｉｖｅｓｔら、１９９５）。これらの結果は、副腎皮質刺激ホルモン放
出因子レセプター−１が副腎皮質刺激ホルモン放出因子に対して脳内での主要な
ストレス・レセプターであること可能性を示唆している。
【００８６】 これらの実験で、ストレスに対する古典的な内分泌及び挙動応答が副腎皮質刺
激ホルモン放出因子レセプター−１によって媒介されることが明らかに示された
。しかしながら、ストレスによって誘発される血清テストステロン濃度の低下は
雄の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体マウスでは減少せ
ず、これはストレスに対する動物の適応性応答が副腎皮質刺激ホルモン放出因子
レセプター１だけで媒介されているわけではないことを示唆している。さらなる
研究によって、ストレスに対する他の応答のどれが副腎皮質刺激ホルモン放出因
子レセプター−１によって媒介されているのかを正確に決めることができるよう
になるであろうし、認識機能における副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター
−１媒介経路の役割を決めることも可能になってくるであろう。各副腎皮質刺激
ホルモン放出因子レセプター・サブタイプの正確な役割をさらに明確にすること
は、種々の神経精神病学的不全の治療及び／又は診断、そして痴呆症における学
習と記憶の改善につながるであろう。
【００８７】 以下の文献を参照した。 Archer, J, (1973). Anim. Behav. 21, 205-235. Avishai-Eliner, et al. (1996). Brain Res. Dev. Brain Res. 91:159-163. Ballard, P. L. (1989). Endocr. Rev. 1O, 165-181. Behan, D. P., et al. (1995). Nature 378, 284-287. Berridge, C,W., et al (1986) Regul, Pept, 16, 83-93. Britton, D. T., et al. (1986). Life Sci. 39, 1281-1286. Chalmers D. T., et al. (1995), J, Neurosci. 15, 6340-6350. Chan, receptor-. K., et al. (1993). J. Neurosci. 13.5126- 5138. Chrousos G. P., et al (1992) J. Am. Med. Assoc. 267 1244-1252. Colby. H.D., et al. (1974). Endocrinology 94, 1346-50. Cole, T. J., et al. (1995). Genes Dev, 9, 1608-1621. Crawley. J., et al (1980). Pharmacol. Biochem. Behav 13, 167-170. Daikoku, S., et al. (1976). Cell Tissue Res. 168, 549-59. De Souza, E. B. (1995). Psychoneuroendocrinology 20, 789-819. Denenbergh, V. (1967). In Biology and Behavior: Neurophysiology and Emotion. D. Glass, ed. (New York: Rockefeller University Press and Russell Sage Foundation). pp. 161-190. Diamant, M,, et al. (1993). Neuroendocrinology 57, 1071-81. Geriz, B. J., et al (1987) Endocrinology 120, 381-388, Grigoriadis, D. E., et al (1996). Ann, N. Y. Acad. Sci 780, 60-80. Hashimoto, K., et al. (1984). Peptides 5, 707-711. Idelman, S, (1970), Int. Rev. Cytol. 27, 181-281. Insel, T. R., et al. (1988) J Neurosci. 8, 4151-4158. Iuvone, P. M. et al. (1977). Bebav Biol 19, 228-237 Kapas, S., et al. (1995), J. Endocrinol. 144, 503-510. Keller-Wood, M. E., et al. (1984). Endocr, Rev. 5, 1-24 Kishimoto, et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1108-1112. Koob, G., et al. (1994). Semin. Neurosci. 6. 221-229. Koob,G, F., et al (1985). Fed. Proc. 44, 259-63. Lee, K. F., et al. (1992). Cell 69, 737-749. Liang, K. C., et al. (1988). Psychopharmacology (Berl) 96, 232-6. Liang, K. C., et al. (1992). J Neurosci. 12, 2303-2312. Lovenberg, T. W., et al. (1995). Endocrinology 136, 4139-4142 Mansi, J. A., et a]. (1996). Endocrinology 137, 4619-4629. Martinez, V., et al. (1997), J. Pharmacol, Exp, Ther. 280, 754-760. Misslin R., et al (1989) Behav. Process. 18, 119-132. Moldow, R L., et al (1984) Peptides 5, 1213-1215. Morimoto, A., et al. (1993). J. Physiol. (Lond) 460, 221-229. Muglia, L,. et al. (1995). Nature 373, 427-432. Orth, D.N (1992). Endocr, Rev. 13. 164-191. Owens, M. J,, et al. (1990). Neuroendocrinology 52, 626-631. Owens. M. J., et al. (1991). Pharmacol. Rev. 43, 425-473. Perrin, M., et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2969-2973. Potter, E,, et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91. 8777-878l. Pozzoli, G., et al (1996). Endocrinology 137, 65-71. Rabadan-Diehl, C., et al. (1996). Endocrinology 137, 3808-3814. Rivest. S., el al. (1995). J. Neurosci. 15, 2680-2695. Sawchenko P. E.(1987). J. Neurosci, 7, 1093-1106. Sawchenko, et al. (1984). Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81, 1883-1887. Schulz, D., et al. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10477-l0482. Segre, G. V., et al. (1993). Trends Endocrinol. Metab. 4,309-314. Skutella, T., et al, (1994). Neuroreport 5, 2181-2185. Spina, M., et al. (1996). Science 273, 1561-1564. Stenzel, P., et al. (1995). Mol. Endocrinol. 9, 637-645. Suda, T., et al. (1984). J. Clin. Endocrinol. Metab. 58, 919-924. Swiergiel. A. H., et al. (1993). Brain Res, 623, 229-234. Takahashi, L. K., et al. (1989). Behav. Neurosci. 103. 648-654. Turnbull, A. V., et al, (1996), Eur. J. Pharmacol. 303, 213-2l6. Udelsman, R, et al. (1986). Nature 319, 147-150. Vale, W., et al. (1981). Science 213, 1394-1397. Vale. W., et al. (1997). The Endocrinologist 7, 3S-9S. Vale W., et al (1983). In Methods in Enzymology: Neuroendocrins Peptides, P. M. Conn, ed. (New York: Academic Press), pp. 565-577. Vaughan, J., et al. (1995). Nature 37B, 287-292. Walker, S. W., et al. (1988). Mol. Cell. Endocrinol, 57, 139-147. Wyllie, A, H., et al. (1973). J. Pathol. 111, 85-94. Xu, M., et al. (1994). Cell 79, 729-742.
【００８８】 本明細書で触れられたすべての特許及び刊行物はこの技術分野における当業者
の技術レベルを示すものである。さらに、これらの特許及び刊行物は参照によっ
て具体的、個別的に本明細書に組み込まれるのと同じ程度にここに組み込まれる
ものである。
【００８９】 当業者であれば、本発明がここに述べられているような課題を実施し、目的と
利点を得るのに適していること、及びそれらに本質的に付随した課題、目的、利
点を達成するのに適していることは容易に理解できるであろう。ここに述べられ
ている事例は、その方法、手順、処理、分子及び具体的な化合物と共に現段階で
の好ましい実施の形態を示すものであり、例として示されるものであって、本発
明の範囲の限定は目的としていない。当業者であれば以下の権利請求の範囲で定
義されるような本発明の範囲内での変更や他の使用法も容易に想起できるであろ
う。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスの発生を示す
図である。
【図２】 図２は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異マウスの副腎欠
失を示す図である。
【図３】 図３は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター欠損マウスの視床下部内で副
腎皮質刺激ホルモン放出因子の発現が増大されているが、アルギニン・バソプレ
シンがない状態を示す図である。
【図４】 図４は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスでのストレス
に対する内分泌応答の低下を示す図である。
【図５】 図５は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１欠損マウスにおける不安
感の低下を示す図である。
【図６】 図６はヘテロ接合副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１突然変異体雌
マウスから生まれた後代のコルチコステロンでのイン・ウテロ処理で直すことが
できる著しい肺形成不全を示す図である。
【図７】 図７は副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター１欠損マウスにおける腎臓欠
失のホルモンによる治療を示す図である。
【符号の説明】
ＺＦ 束状帯 ＺＧ 球状帯 ＺＲ 網状帯 Ｍ 髄質 Ａ 下垂体前葉 Ｉ 下垂体中葉 ＊ Ｐ＜０．０５ ＊＊ Ｐ＜０．０２ ＊＊＊ Ｐ＜０．００１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ０７Ｋ 14/72 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 // Ｃ０７Ｋ 14/72 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴエイル，ワイリ アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア， ラ ジョラ，バルデス 1643 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 BA63 CA03 DA02 EA04 GA14 HA12 4C086 AA01 AA02 DA08 MA01 MA04 MA55 NA14 ZA59 ZA81 ZC08 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 FA74

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 体細胞及び生殖細胞が副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１を実質的
    に欠損しているトランスジェニックマウスにおいて、副腎皮質刺激ホルモン放出
    因子レセプター−１の対立遺伝子の１つ又は両方が破壊され、コントロールと比
    較して、不安感が少なく、ストレスに対する内分泌応答が低下し、そして、運動
    活性リズムが変化していることを特徴とするトランスジェニックマウス。
  2. 【請求項２】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウロコルチン又は副腎皮質刺激ホルモン放出
    因子レセプター−１以外のレセプターを通じて作用する関連リガンドのアゴニス
    トの確認方法において、 ａ）請求項１に記載のトランスジェニックマウスにテスト化合物又は偽薬化合
    物を投与するステップと、 ｂ）前記マウスにおける不安感、ストレスに対する内分泌反応、及び運動活性
    リズムのレベルに対する前記テスト化合物又は偽薬化合物の効果を判定するステ
    ップと、そして ｃ）不安感、ストレスに対する内分泌、及び運動活性リズムのレベルに対する
    前記テスト化合物及び偽薬の効果を比較するステップであって、前記不安感レベ
    ルの変化、ストレスに対する前記内分泌応答おける変化、そして変化した運動活
    性リズムが副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウロコルチン、又は副腎皮質刺激ホ
    ルモン放出因子レセプター−１以外のレセプターを通じて作用する関連リガンド
    のアゴニストの存在を示しているステップ、とを含む確認方法。
  3. 【請求項３】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１以外のレセプターが副腎皮質刺
    激ホルモン放出因子レセプター−２及び新規の副腎皮質刺激ホルモン放出因子レ
    セプターによって構成されるグループから選択される請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウロコルチン、又は副腎皮質刺激ホルモン放
    出因子レセプター−１以外のレセプターを通じて作用する関連リガンドのアンタ
    ゴニストを確認する方法であって、 ａ）請求項１に記載のトランスジェニックマウスに対してテスト化合物又は偽
    薬化合物を投与するステップと、 ｂ）前記マウスにおける不安感、ストレスに対する内分泌応答、及び運動活性
    リズムのレベルに対する前記化合物又は前記偽薬の効果を判定するステップと、 ｃ）不安感、ストレスに対する内分泌応答、及び運動活性リズムのレベルに対
    する前記テスト化合物及び偽薬の効果を比較するステップであって、前記不安感
    レベルの変化、前記ストレスに対する内分泌応答の変化、そして変化した運動活
    性リズムが副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ウロコルチン又は副腎皮質刺激ホル
    モン放出因子レセプター−１以外のレセプターを通じて作用する関連リガンドの
    アンタゴニストの存在を示しているステップ、とを含む確認方法。
  5. 【請求項５】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１以外の前記レセプターが副腎皮
    質刺激ホルモン放出因子レセプター−２、及び新規の副腎皮質刺激ホルモン放出
    因子レセプターで構成されるグループから選択される請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 コルチコステロン又は副腎皮質刺激ホルモンのアナローグ又はアゴニストであ
    る化合物をスクリーニングする方法において、 ａ）請求項１に記載のマウスのホモ接合雌マウスと請求項１に記載のマウスの
    ホモ接合雄マウスとの間の交配を行うステップと、 ｂ）受胎した前記雌マウスに薬学的に受け入れられる量の前記化合物を投与す
    るステップと、及び、 ｃ）前記雌マウスから生まれた子どもの肺の組織状態を判定するステップであ
    って、ディスプレジア、肺胞虚脱、及び肺胞内出血を伴う反応性気腫、及びへモ
    ジデリン沈着の無いことがコルチコステロン又は副腎皮質刺激ホルモンのアナロ
    ーグ又はアゴニストの存在をしめすステップ、とを含む方法。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のマウスと他の系統のマウスとの交配によって得られる子孫マ
    ウス。
  8. 【請求項８】 副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１が実質的に欠損しているトラン
    ジェニックマウスをつくりだす方法において、 ａ）マウス・副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子から誘導さ
    れた副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１トランスジーンを胚性幹細胞
    に導入することによって、陽性ＥＳ細胞を生産するステップであって、前記トラ
    ンスジーンが前記副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター−１遺伝子のエクソ
    ン５からエクソン８まで代わりに識別可能なマーカーをコードする遺伝子が含ま
    れ、前記選択可能なマーカーによる選択下で生残及び成長するＥＳ細胞が陽性Ｅ
    Ｓ細胞であるステップと、 ｂ）前記陽性ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に導入することによってトラン
    スジェニックマウスを発生させるステップ とを含む方法。
  9. 【請求項９】 トランスジェニックマウスを交配させて、トランスジーンがホモ接合であるト
    ランスジェニックマウスつくりだすステップをさらに含む請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 薬学的に受け入れ可能な量のコルチコステロンをイン・ウテロで呼吸不全症候
    群を有していると疑われる胎児に投与するステップで構成される胎児の呼吸不全
    症候群を緩解させる方法。
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