JP2002291465A - 新規変異酵母およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ダイアセチル臭の発生を抑制することのできる
変異酵母を得る。 【解決手段】分岐鎖アミノ酸類のアナログ（構造類似
体）に対する感受性を有し、且つトータル・ダイアセチ
ル（ビシナルジケトン類及びその前駆物質であるα−ア
セトハイドロキシ酸類の総称）低蓄積性の清酒酵母、ビ
ール酵母、ワイン酵母を含む新規変異酵母の構成であ
り、酒類製造用酵母を変異処理し、プロパルジルグリシ
ン又はα−アミノ酪酸又は４−アザロイシン又は５，
５，５−トリフルオロロイシン又はＯ−メチルトレオニ
ン又はイソロイシンヒドロキサメートを含む培地で、親
として用いた変異処理前の酵母に比し、増殖の抑制或い
は遅延が見られる分岐鎖アミノ酸アナログ感受性変異株
を分離し、更に感受性変異株からトータル・ダイアセチ
ル低蓄積性酵母を分離する構成である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酒類製造に関する新規
変異酵母、その変異酵母の新規育種方法及びその酵母を
用いた酒類の製造方法に関する。さらに詳細には、本発
明は、トータル・ダイアセチルの蓄積を低減する酒類製
造用酵母に属する変異酵母、その変異酵母の育種方法及
びその酵母を用いた酒類、特に清酒の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】酒類の香気成分の内、ダイアセチル臭は
とりわけ清酒、ビール及びワイン等の醸造酒における代
表的オフフレーバーのひとつである。ダイアセチル臭
（清酒の官能表現ではツワリ香とも云う）は、ダイアセ
チルを主体としたビシナルジケトン類が製品中に閾値以
上存在することによって発生する。清酒における閾値は
１ｐｐｍ（日本醸造協会雑誌,５７,607（1962））、ビ
ールにおける閾値は０．１ｐｐｍ（ジャーナル・オブ・
ジ・インスティチュート・オブ・ブリューイング（Jour
nalof theInstitute of Brewing），７６,486（197
0））と言われている。

【０００３】酒類中のビシナルジケトン類はダイアセチ
ルと２，３−ペンタンジオンに大別される。ダイアセチ
ルと２，３−ペンタンジオンは、それぞれバリン及びイ
ソロイシン生合成系中間産物α−アセトハイドロキシ酸
であるα−アセト乳酸及びα−アセトハイドロキシ酪酸
を前駆体として、酵母の関与しない自動酸化によって生
成される。また、ダイアセチルの一部は、酵母がα−ア
セト乳酸からアセトインを経て生成される。この他に汚
染微生物によってもダイアセチルは生成される。

【０００４】以上のことから、ビシナルジケトン類(ダ
イアセチル及び２，３−ペンタンジオン)及びその前駆
体でα−アセトハイドロキシ酸類（α−アセト乳酸及び
α−アセトハイドロキシ酪酸）全体が製品にダイアセチ
ル臭をもたらす可能性のあるものとして捉えられる。そ
れらトータル・ダイアセチルを安定的に低減させる酵母
の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新
商品開発の可能性を広げることができる。

【０００５】ビール製造用酵母に対しては、ダイアセチ
ル臭の発生を抑制する試みが報告されている。アメリカ
ン・ソサイアティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ，
プロシーディング（American Society of Brewing Chem
ists，Proceeding），９４（1973）には、バリン・ロイ
シン・イソロイシン要求性酵母が、第２１回ヨーロピア
ン・ブリュワリー・コンベンション，プロシーディング
・コングレス，マドリッド（２１th European Brewery
Convention，Proceeding Congress，Madrid），５５３
（1987）にはＩＬＶ５遺伝子のコピー数を増大させた遺
伝子操作酵母がそれぞれ報告されているが、実用化には
至っていない。特開昭６２−２２８２８２号公報、特開
平２−２６５４８８号公報及び特開平７−１７１号公報
にはいずれもα−アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤ
ＮＡ鎖を用いた形質転換酵母が報告されており、実用性
も認められているが、少なくとも国内では実用化されて
いない。ビール製造用酵母以外でも、清酒製造用酵母及
びワイン製造用酵母を含めてダイアセチル臭の発生を抑
制することを目的として育種された酵母の実用例は見ら
れない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ダイ
アセチル臭の発生を抑制することのできる変異酵母を得
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らの研究の結
果、従来の酵母に比べトータル・ダイアセチルの蓄積が
安定して低減される変異酵母を分離できる育種方法を開
発し、この方法で得られた変異酵母の使用により、ダイ
アセチル臭の発生が安定的に抑制された酒類の製造に成
功したものである。前記本発明の課題は、分岐鎖アミノ
酸類のアナログ（構造類似体）に対する感受性を有し、
且つトータル・ダイアセチル（ビシナルジケトン類及び
その前駆物質であるα−アセトハイドロキシ酸類の総
称）低蓄積性の清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母を含
む酒類製造用酵母に属する新規変異酵母を利用して解決
することができる。本発明の新規変異酵母は、酒類製造
用酵母を変異処理し、プロパルジルグリシン又はα−ア
ミノ酪酸又は４−アザロイシン又は５，５，５−トリフ
ルオロロイシン又はＯ−メチルトレオニン又はイソロイ
シンヒドロキサメートを含む培地で、親として用いた変
異処理前の酵母に比して、増殖の抑制或いは遅延が見ら
れる分岐鎖アミノ酸アナログ感受性変異株を分離し、更
に感受性変異株からトータル・ダイアセチル低蓄積性酵
母を分離することによって育種できる。

【０００８】すなわち、本発明は、ダイアセチル臭の原
因物質であるビシナルジケトン類が主に酵母のバリン・
ロイシン・イソロイシンのいわゆる分岐鎖アミノ酸生合
成経路の中間産物であるα−アセトハイドロキシ酸類に
由来することに着目し、分岐鎖アミノ酸アナログに対す
る感受性が従来の酵母に比べて強くなっている酵母では
分岐鎖アミノ酸の生合成系及び／又は取り込み系に何ら
かの変異を生じている可能性が高いことから、分岐鎖ア
ミノ酸アナログ感受性酵母を分離するという方法を新規
に開発し、目的とする変異酵母を効率的に分離すること
に成功した。

【０００９】突然変異酵母としては、自然発生的に生じ
た突然変異株のほか、紫外線や放射線を照射する物理的
変異誘導原を用いる物理的手法或いはエチルメタンサル
フォネート、Ｎ−メチルーＮ一ニトローＮ−ニトロソグ
アニジン、亜硝酸などの化学的変異誘導剤に接触させる
化学的手法による人為的突然変異株など、いかなる方法
によって得たものでもよい。

【００１０】変異処理をする場合に親株として用いる酵
母は、酒類製造用酵母であればよく、清酒酵母、ビール
酵母、ワイン酵母などいずれの酵母でもトータル・ダイ
アセチルの蓄積が安定して低減される変異酵母を取得で
きる。

【００１１】分岐鎖アミノ酸アナログとしてはプロパル
ジルグリシン、α−アミノ酪酸、４−アザロイシン、
５，５，５−トリフルオロロイシン、Ｏ−メチルトレオ
ニン及びイソロイシンヒドロキサメートが利用できる
が、その他の分岐鎖アミノ酸アナログでも、少なからず
酵母の増殖を抑制或いは阻害するものであれば適宜利用
可能である。

【００１２】分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母を分離
・育種する方法は、酒類製造用酵母をそのまま或いはそ
れを変異処理した酵母を、親株において増殖が完全に阻
害されない濃度の分岐鎖アミノ酸アナログを含む培地中
で培養し、増殖しない或いは親株に比して増殖の遅い分
岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母を分離し、さらに分岐
鎖アミノ酸アナログ感受性酵母の中からトータル・ダイ
アセチル低蓄積性変異酵母を分離するものである。

【００１３】具体的には、酒類製造用酵母をそのまま又
はそれを変異処理した後、分岐鎖アミノ酸アナログを含
まない固体培地に接種し、３０℃で約２日間培養し、コ
ロニーを形成させる。次に、分岐鎖アミノ酸アナログを
含む寒天平板最少培地（YeastNitrogen Base without a
mino acids（Difco社製）０．６７％、グルコース２
％、寒天２％、ｐＨ６.０）を調製し、これにレプリカ
して、３０℃で培養する。日本醸造協会清酒用７号酵母
を用いる場合の各分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度の
目安と、それぞれの培養日数の目安は以下の通りであ
る。ＤＬ−プロパルジルグリシンを用いる場合は１０μ
Ｍ以下の濃度で、２乃至３日間の培養を目安とする。Ｌ
−α−アミノーｎ−酪酸を用いる場合は２５０μＭ以下
の濃度で、グルコースの代わりにグリセロールを炭素源
とし、５乃至６日間の培養を目安とする。４−アザーＤ
Ｌ−ロイシンを用いる場合は１０ｍＭ以下の濃度で、３
乃至４日間の培養を目安とする。

【００１４】５，５，５−トリフルオローＤＬ−ロイシ
ンを用いる場合は７５μＭ以下の濃度で、３乃至４日間
の培養を目安とする。Ｏ−メチルーＬ−トレオニンを用
いる場合は１００μＭ以下の濃度で、グルコースの代わ
りにグリセロールを炭素源とし、５乃至６日間の培養を
目安とする。Ｌ−イソロイシンヒドロキサメートを用い
る場合は５００μＭ以下の濃度で、グルコースの代わり
にグリセロールを炭素源とし、５乃至６日間の培養を目
安とする。いずれの分岐鎖アミノ酸アナログを用いる場
合においても、添加の目安として示した濃度以下のでき
るだけ低い濃度の培地において生育阻害が認められる変
異酵母の方がより分岐鎖アミノ酸アナログ感受性の強い
ものである可能性が高い。また各分岐鎖アミノ酸アナロ
グの添加濃度は親株として使用する酒類製造用酵母によ
って、多少の加減を要するものである。

【００１５】分岐鎖アミノ酸アナログを含む寒天平板最
少培地における、分岐鎖アミノ酸アナログ感受性酵母の
出現頻度を向上させる場合には、ナイスタチン濃縮法
（ネイチャー（Nature），２１１，206（1966））を用
いる。すなわち、酒類製造用酵母をそのまま又はそれを
変異処理した後、分岐鎖アミノ酸アナログを含まない固
体培地に接種する前にナイスタチン処理を行う。

【００１６】具体的には、酒類製造用酵母をそのまま又
はそれを変異処理した後、液体最少培地（Yeast Nitrog
en Base without amino acids（Difco社製）０．６７
％，グルコース２％，ｐＨ４．５）に−部を接種し、３
０℃で振とう培養する。培養菌体は窒素欠損最少培地
（Yeast Carbon Base（Difco社製）１．１７％、ｐＨ
５．５）に全量を移植し３０℃で窒素飢餓培養する。窒
素飢餓培養菌体は分岐鎖アミノ酸アナログを含む液体最
少培地に一部を接種し、３０℃で振とう培養する。この
培養液にナイスタチンを最終濃度で１０ｐｐｍとなるよ
うに添加し、３０℃で振とうしながら、ナイスタチン処
理を行う。

【００１７】すなわち、ナイスタチン処理を行う液体最
少培地に含まれる分岐鎖アミノ酸アナログの濃度は、わ
ずかな増殖遅延が認められる程度に設定しておき、その
濃度において増殖の早いものをナイスタチンで淘汰する
ことにより分岐鎖アミノ酸アナログ感受性株を濃縮して
いくものである。日本醸造協会清酒用７号酵母を用いる
場合の各分岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度は、ＤＬ一
プロパルジルグリシンが１００〜２５０μＭ、Ｌ−α−
アミノーｎ一酪酸が１００〜１０００ｍＭ、４−アザー
ＤＬ−ロイシンが１〜１０ｍＭ、５，５，５−トリフル
オローＤＬ−ロイシンが１００〜２５０μＭ、Ｏ−メチ
ルーＬ−トレオニンが５〜５０ｍＭ、Ｌ−イソロイシン
ヒドロキサメートが１０〜１００ｍＭを目安とする。分
岐鎖アミノ酸アナログの添加濃度は親株として使用する
酒類製造用酵母によって、多少の加減を要するものであ
る。

【００１８】次に、これら分岐鎖アミノ酸アナログ感受
性変異酵母を液体培地に接種し、適宜培養した後、培養
液上清中のトータル・ダイアセチルを定量することによ
り、目的とする分岐鎖アミノ酸アナログ感受性であり、
且つトータル・ダイアセチル低蓄積性の変異酵母が取得
できる。

【００１９】このようにして得られるトータル・ダイア
セチル低蓄積性酵母としては、サッカロマイセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＹ−２１４２株
を例示する。この変異酵母は日本醸造協会清酒用７号酵
母を親株として、エチルメタンサルフォネートによる突
然変異処理により得られたプロパルジルグリシン感受性
変異株である。ＭＹ−２１４２株は工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ− １８１２２
として寄託してある。

【００２０】この分離・育種方法によって得られるトー
タル・ダイアセチル低蓄積性酵母は、清酒、ビール、ワ
インを含む各種酒類の一般的製造方法に用いることが可
能である。とりわけ、ダイアセチル臭の発生が散見され
る低アルコール濃度清酒の製造にトータル・ダイアセチ
ル低蓄積性酵母を用いることで、ダイアセチル臭の発生
を容易に防ぐことが可能となるばかりでなく、低アルコ
ール濃度清酒の品質を容易に多様化することができる。

【００２１】

【実施例１】日本醸造協会清酒用７号酵母をＹＰＤ培地
（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）１
０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した後、
無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した。この変異処理前洗浄
菌体を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、
菌濃度を１．０×１０⁸ cells／ｍｌに調製した。リン
酸緩衝液菌体懸濁液２ｍｌに４０％グルコース水溶液
０．５ｍｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）７．
５ｍｌ、エチルメタンサルフォネート０．３ｍｌを加
え、３０℃で４５分間緩やかに振とうしながら変異処理
を行った。変異処理後の菌体をチオ硫酸ナトリウム水溶
液１０ｍｌで１回と滅菌水１０ｍｌで２回洗浄した後、
最少液体培地１０ｍｌに懸濁した。   
   

【００２２】液体最少培地菌体懸濁液０．２ｍｌを液体
最少培地９．８ｍｌに加え、３０℃で２４時間振とう培
養した後、無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した。変異処理
後洗浄菌体を窒素欠損最少培地１０ｍｌに懸濁し、３０
℃で６時間窒素飢餓培養した。窒素飢餓培養菌体を無菌
的に集菌及び滅菌水洗浄した後、ＤＬ−プロパルジルグ
リシン２５０μＭを含む液体最少培地に懸濁し、菌濃度
を１．０×１０⁷ cells／ｍｌに調製した。ＤＬ−プロ
パルジルグリシン含有液体最少培地菌体懸濁液９ｍｌを
３０℃で４時間振とう培養した後、１００ｐｐｍナイス
タチン溶液（１，０００ｐｐｍのナイスタチンを含む９
５％エタノール溶液を滅菌水で１０倍に希釈したもの）
１ｍｌ添加して、さらに３０℃で１時間振とうしなが
ら、ナイスタチン処理を行った。このＤＬ−プロパルジ
ルグリシン含有液体最少培地培養とナイスタチン処理を
合計３回繰り返した。

【００２３】３回目のナイスタチン処理を終えた菌体を
無菌的に集菌及び滅菌水洗浄した後、滅菌水で適宜希釈
してから寒天平板最少培地に塗沫し、３０℃で２日培養
したものをマスター・プレートとした。マスター・プレ
ート上のコロニーを寒天平板最少培地と１０μＭ ＤＬ
−プロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地にレプリ
カし、３０℃で３日間培養した。寒天平板最少培地にお
いては親株並みの増殖を示すが、１０μＭ ＤＬ一プロ
パルジルグリシン含有寒天平板最少培地においては増殖
のできないもの、及び増殖の極端に弱いものを一次選抜
対象とした。一次選抜対象株を集めたマスター・プレー
トを作成し、寒天平板最少培地と５μＭＤＬ−プロパル
ジルグリシン含有寒天平板最少培地にレプリカし、３０
℃で２日間培養した。

【００２４】寒天平板最少培地においては親株並みの増
殖を示すが、５μＭ ＤＬ−プロパルジルグリシン含有
寒天平板最少培地においては増殖のできないもの、及び
増殖の極端に弱いものを二次選抜対象とした。二次選抜
対象株を集めたマスター・プレートを作成し、寒天平板
最少培地と５μＭ ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒
天平板最少培地にレプリカし、３０℃で３日間培養し
た。寒天平板最少培地においては親株並みの増殖を示す
が、５μＭ ＤＬ−プロパルジルグリシン含有寒天平板
最少培地においては増殖のできないもの、及び増殖の極
端に弱いものを三次選抜対象とした。

【００２５】次に三次選抜対象株をＹＰＤ培地にて３０
℃で２日間振とう培養した後、無菌的に集菌及び滅菌水
洗浄した菌体を３％カザミノ酸（Difco社製）含有液体
最少培地（ｐＨ４．５）４０mｌに初発菌濃度１．０×
１０⁷ cells/mlになるように加え、２０℃で３日間静置
培養した。この培養上清液中のトータル・ダイアセチル
濃度を蒸留法（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソ
サイアティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ（Journa
1of the American Society of Brewing Chemists），３
６，139（1978））により測定した。ここで親株に比
べ、安定したトータル・ダイアセチル低蓄積性が認めら
れたＭＹ−２１４２株を得た。この変異株は工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−
１８１２２として寄託してある。この時の結果を第１表
に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】またＭＹ−２１４２株の５μＭ ＤＬ−プ
ロパルジルグリシン含有寒天平板最少培地における増殖
阻害が、バリン添加によって解除されたことから、ＭＹ
−２１４２株におけるプロパルジルグリシン感受性がバ
リン・アナログとしてのプロパルジルグリシンによるも
のであることが確認された。この結果を第２表に示す。

【００２９】

【実施例２】ＭＹ−２１４２株及び親株である日本醸造
協会清酒用７号酵母を用いて、第３表に示す仕込配合で
清酒を製造した。高温糖化酒母を製造し、もろみの仕込
温度を初添１４℃、仲添１０℃、留添８℃とし、最高品
温を１４℃として発酵させた。このもろみにおける各ア
ルコール度数帯における成分を第４表に示す。

【００３０】

【表３】

【００３１】

【表４】

【００３２】本発明者らは市販低アルコール濃度清酒に
おけるトータル・ダイアセチル濃度の調査（宮城県工業
技術センター研究報告，２８，74（1997））を行い、そ
の結果において低アルコール濃度清酒におけるダイアセ
チル臭に係るトータル・ダイアセチルの認知閾値を０．
５ｐｐｍ、ダイアセチル臭の発生を予防するトータル・
ダイアセチルの管理目標値を０．２ｐｐｍと示した。Ｍ
Ｙ−２１４２株は発酵期間を通してトータル・ダイアセ
チル濃度が０．２０ｐｐｍ以下であり、安定したトータ
ル・ダイアセチル低蓄積性が認められた。このことか
ら、従来は困難であった発酵中のもろみを任意の時期に
上槽することが可能となり、例えば第４表に示すよう
に、多様な品質の低アルコール濃度清酒を従来の一般的
な製造方法からも得られるようになつた。

【００３３】

【実施例３】実施例２と同じ仕込配合で、仕込温度及び
発酵温度を変えて清酒を製造した。高温糖化酒母を製造
し、もろみの仕込温度を初添１２℃、仲添８℃、留添６
℃とし、最高品温を１３℃として発酵させた。このもろ
みにおける各アルコール度数帯における成分を第５表に
示す。ＭＹ−２１４２株は発酵期間を通してトータル・
ダイアセチル濃度が０．２０ｐｐｍ以下であり、実施例
２と同様に安定したトータル・ダイアセチル低蓄積性が
認められた。このことから、従来は困難であった発酵中
のもろみを任意の時期に上槽することが可能となり、例
えば第５表に示すように、さらに多様な品質の低アルコ
ール濃度清酒を従来の一般的な製造方法からも得られる
ようになった。

【００３４】

【表５】

【００３５】実施例２及び実施例３に示した発酵温度の
異なるいずれのもろみにおいてもＭＹ−２１４２株はト
ータル・ダイアセチル濃度を低く抑えたことから、ＭＹ
−２１４２株が清酒製造におけるダイアセチル臭の発生
防止に役立つのみでなく、低アルコール濃度清酒の製造
管理を容易なものとし、また低アルコール濃度清酒の品
質の多様化に貢献し得ることが確認された。

【００３６】

【発明の効果】本発明の変異酵母を使用すれば、酒類製
造においてダイアセチル臭の発生を容易に抑えることが
できる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865 (Ｃ１２Ｎ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 橋本 建哉 宮城県仙台市泉区明通２丁目２番地 宮城 県産業技術総合センター内 (72)発明者 伊藤 謙治 宮城県仙台市青葉区上杉２丁目３番１号 宮城県酒造協同組合内 (72)発明者 菅澤 聡 宮城県塩釜市本町２番19号 株式会社佐浦 内 (72)発明者 関東 宣道 宮城県加美郡中新田町字西町88−１ 株式 会社田中酒造店内 Ｆターム(参考） 4B065 AA80X AC14 AC20 BA18 BB12 BC03 CA09 CA42

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分岐鎖アミノ酸類のアナログ（構造類似
   体）に対する感受性を有し、且つトータル・ダイアセチ
   ル（ビシナルジケトン類及びその前駆物質であるα−ア
   セトハイドロキシ酸類の総称）低蓄積性の清酒酵母、ビ
   ール酵母、ワイン酵母を含む酒類製造用酵母に属する新
   規変異酵母。
2. 【請求項２】酒類製造用酵母を変異処理し、プロパルジ
   ルグリシン又はα−アミノ酪酸又は４−アザロイシン又
   は５，５，５−トリフルオロロイシン又はＯ−メチルト
   レオニン又はイソロイシンヒドロキサメートを含む培地
   で、親として用いた変異処理前の酵母に比して、増殖の
   抑制或いは遅延が見られる分岐鎖アミノ酸アナログ感受
   性変異株を分離し、更に感受性変異株からトータル・ダ
   イアセチル低蓄積性酵母を分離することを特徴とする新
   規変異酵母の育種方法。
3. 【請求項３】サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharo
   myces cerevisiae）に属する清酒酵母を変異処理し、プ
   ロパルジルグリシン感受性を有し、且つトータル・ダイ
   アセチル低蓄積性であることを特徴とする変異酵母ＭＹ
   −２１４２。
4. 【請求項４】請求項１或いは請求項３記載の新規変異酵
   母を用いることを特傲とする酒類の製造方法。