JP2002255849A

JP2002255849A - 細胞免疫療法補助剤

Info

Publication number: JP2002255849A
Application number: JP2001055788A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Hayasawa; 宏紀早澤; Muneo Yamada; 宗夫山田; Takuma Sakurai; 琢磨桜井; Eriko Misawa; 江里子三澤
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2002-09-11

Abstract

(57)【要約】【課題】マクロファージコロニー刺激因子を有効成分
とする細胞免疫療法補助剤を提供する。【解決手段】マクロファージコロニー刺激因子類、及
び該因子類の薬学的に許容される塩類からなる群より選
択される１種又は２種以上の混合物を有効成分として含
有する細胞免疫療法補助剤であり、細胞免疫療法補助剤
が細胞免疫療法に使用する細胞のドナーに投与されるこ
と、該細胞がリンパ球であること、及び補助剤を使用す
る細胞免疫療法で用いられる生体応答調節剤がインター
フェロンである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マクロファージコ
ロニー刺激因子を有効成分とする細胞免疫療法補助剤で
ある。更に詳しくは、リンパ球を使用する細胞免疫療法
において生体応答調節剤の効果を増強させることを特徴
とする細胞免疫療法補助剤に関する。

【０００２】本明細書に記載されている生体応答調節剤
（バイオロジカル・レスポンス・モディファイアー：以
下、ＢＲＭと略記することがある。）とは、癌患者等に
おける治療効果を期待し、主に生体防御機能を介して間
接的に作用し、宿主のウイルス感染細胞や腫瘍細胞に対
する免疫機能を変化させるような機能を有する物質を意
味する。本明細書において百分率は、特に断りのない限
り重量による表示である。

【０００３】

【従来の技術】インターフェロン（以下、ＩＦＮと略記
することがある。）は、ウイルス感染等に際して動物細
胞から産生・分泌される糖タンパク質の総称で、α、
β、γ型に分類される。インターフェロンは、抗ウイル
ス作用の他、抗腫瘍作用や免疫系の活性化等の生体防御
システムの活性化に関連する作用が知られており、現在
では、天然物及び遺伝子組換え体が医薬品として市販さ
れている。臨床において、インターフェロンは、腫瘍や
ウイルス性肝炎の治療薬として広く使用されているが、
間質性肺炎、腎不全、白血球減少症、及び血小板減少症
等の深刻な副作用を引き起こす可能性があり、慎重な投
与が必要とされる。また、インターフェロンに対する反
応性が低い患者の場合、十分な治療効果を得られないこ
とが問題となっている。

【０００４】ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と
記載することがある。）は、腫瘍細胞やウイルス感染細
胞に対してサイトカイン産生や細胞障害活性等の機能を
有するリンパ球であり、初期の生体防御反応や、腫瘍の
転移及び再発の抑制において重要な役割を果たすことが
知られている。前記、インターフェロンは、このＮＫ細
胞の活性化を誘導する為の生体応答調節剤として機能す
ることが知られており、これまでに様々な研究が行われ
てきた。

【０００５】これら研究結果をもとに、実際の癌治療で
は、一般に、体外にリンパ球を取り出して、ＢＲＭ存在
下で培養した後に、リンフォカイン活性化キラー細胞
（lymphokine activated killer cells：以下、ＬＡＫ
細胞と記載することがある。）を患者に輸注する細胞免
疫療法と呼ばれる方法が開発され利用されている。

【０００６】例えば、血球分離装置を用いて大量に取り
出した循環リンパ球を、採取バッグ内でＩＦＮ−αを添
加して３０分間活性化させた後、患者に輸注するイフナ
ンク（ＩＦＮＡＮＫ）療法と呼ばれている方法が実施さ
れ、成果をあげている。この療法は、ＩＦＮ−αの投与
による副作用を軽減できる利点がある。しかし、癌患者
は抗癌剤等の治療を受けている場合が多く、一般の健常
人と比べて血液中のリンパ球の数が著しく減少した状態
にあり、治療のために培養に必要な量のリンパ球を患者
から採取する事自体が、患者に大きな負担をかけてしま
うという点が問題となる。

【０００７】このようにＮＫ細胞を含むリンパ球の増加
・活性化を誘導するＢＲＭを用いた免疫療法が種々実施
されているが、これらの治療法で必ずしも満足のいく治
療効果が得られていないのが現状である。こうした状況
を改善すべく、ＢＲＭ、特にインターフェロン類の効果
を増強する補助療法の開発が待望されていた。

【０００８】本発明者らは、特開２０００−２５６２０
９号公報においてマクロファージコロニー刺激因子を有
効成分とする癌免疫療法補助剤を開示した。しかしなが
ら、マクロファージコロニー刺激因子がインターフェロ
ンの効果を増強するという報告は従来知られていなかっ
た。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の発明者らは、
細胞免疫療法に対するインターフェロンの効果、及び効
率的なリンパ球の誘導を目的としたインターフェロンを
使用する細胞免疫療法の補助療法について鋭意研究を重
ねた結果、リンパ球を用いた細胞免疫療法を行うにあた
って、あらかじめマクロファージコロニー刺激因子（以
下、Ｍ−ＣＳＦと略記することがある。）を投与する群
では、投与しない群に比して、インターフェロンによる
細胞免疫療法において、活性化されたリンパ球の誘導効
果が増強されることを発見し、本発明を完成した。

【００１０】本発明は、マクロファージコロニー刺激因
子を有効成分とする細胞免疫療法補助剤に関するもので
あり、本発明の細胞免疫療法補助剤を使って、リンパ球
のインターフェロンに対する反応性を亢進させ、その効
果を増強するとともに、血液中により多くのリンパ球を
誘導する事により細胞免疫療法を効率的に行なう事を可
能にする細胞免疫療法補助剤を提供することを目的とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、マクロファージコロニー刺激因子類、及び該因子
類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される
１種又は２種以上の混合物を有効成分として含有する細
胞免疫療法補助剤である。

【００１２】前記課題を解決する本発明の第一の望まし
い態様は、細胞免疫療法補助剤が細胞免疫療法に使用す
る細胞のドナーに投与されることであり、該細胞がリン
パ球であること、及び該リンパ球がナチュラルキラー細
胞又はナチュラルキラー様Ｔ細胞であることである。

【００１３】前記課題を解決する本発明の第二の望まし
い態様は、補助剤を使用する細胞免疫療法で用いられる
生体応答調節剤がインターフェロン−α、インターフェ
ロン−β、又はインターフェロン−γであることであ
る。

【００１４】前記課題を解決する本発明の第三の望まし
い態様は、有効成分が成人患者一人当たり一日少なくと
も５０μｇ投与されることである。次に、本発明につい
て具体的に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の細胞免疫療法補助剤の有
効成分は、マクロファージコロニー刺激因子類、及び該
因子類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択さ
れる１種又は２種以上の混合物である。マクロファージ
コロニー刺激因子類は、マクロファージコロニー刺激因
子又はマクロファージコロニー刺激因子の薬理学的に許
容される誘導体であり、好ましくはマクロファージコロ
ニー刺激因子そのものである。更に、マクロファージコ
ロニー刺激因子はヒト由来が好ましい。

【００１６】マクロファージコロニー刺激因子の製造法
としては、特に制限されるものではないが、例えば、ヒ
ト尿中から物理化学的方法により単離することも可能で
あり、また、遺伝子工学的に製造することもできる。

【００１７】例えば、マクロファージコロニー刺激因子
は、ヒト尿から物理化学的に単離する方法として特開昭
６３−１９８７００号公報、特開昭６３−２５０４００
号公報、特表昭６２−５０１６０７号公報等、また遺伝
子工学的に製造する方法として特表平１−５０２３９７
号公報等に記載された方法により製造することが出来
る。

【００１８】前記の方法により製造されたマクロファー
ジコロニー刺激因子は、軟寒天中で哺乳動物の骨髄細胞
に作用し、単球、マクロファージ系細胞からなるコロニ
ー形成を促進する活性（以下コロニー刺激活性と記載す
ることがある。）を有している。本発明において使用す
るマクロファージコロニー刺激因子としては、これと同
様のコロニー刺激活性を有するタンパク因子であれば使
用可能であり、その種類は特に限定されず、特開昭６３
−１９８７００号公報の製造法によるヒト尿から物理化
学的に単離したマクロファージコロニー刺激因子、及び
特表平１−５０２３９７号公報の製造法で製造される組
換え体マクロファージコロニー刺激因子が好ましく、当
該マクロファージコロニー刺激因子のアミノ酸配列を有
するペプチド、当該マクロファージコロニー刺激因子の
アミノ酸配列の一部が脱落又は置換したペプチド、当該
マクロファージコロニー刺激因子のアミノ酸配列の一部
に他のアミノ酸が挿入又は付加したペプチド等を例示す
ることができるが、これらに限定されず、前記コロニー
刺激活性を有するものであれば全て本発明に使用するこ
とができる。

【００１９】前記のとおり、物理化学的方法又は遺伝子
工学的方法により得られたマクロファージコロニー刺激
因子に、必要により安定剤としてヒト血清アルブミン、
糖類等を含む緩衝液を添加し、マクロファージコロニー
刺激因子を溶解し、以下、常法により無菌濾過し、凍結
乾燥し、細胞免疫療法補助剤を製造することができる。
尚、ヒト血清アルブミン及び糖類の他に、薬理学的に許
容される成分を添加することも可能である。

【００２０】また、本発明における使用においては、マ
クロファージコロニー刺激因子類の薬学的に許容される
塩類も使用することが可能であり、酸付加塩、金属錯体
等の無毒性の塩、カルボン酸塩等を例示することができ
る。より具体的には、酸付加塩としては塩酸塩、硫酸
塩、リン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アス
コルビン酸塩、酒石酸塩等を、金属錯体としては亜鉛、
鉄、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の錯体
を、カルボン酸塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等
のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の
アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を例示すること
ができる。これらの塩類は常法により製造することがで
きる。

【００２１】本発明に使用するマクロファージコロニー
刺激因子類及び／又はマクロファージコロニー刺激因子
類の薬学的に許容される塩類を、医薬的に許容可能な担
体と組み合わせて製剤にすることが可能である。例えば
常法により滅菌して注射用生理食塩水、注射用蒸留水等
に溶解し、製剤にすることが可能である。また、点滴、
静注、皮下注、腹腔内投与等適宜の投与形態や、年齢、
及び症状に応じ、製剤中の有効成分の量は適宜選択され
る。

【００２２】マクロファージコロニー刺激因子は元来ヒ
トの体液中に含有されている天然の物質であるので、こ
れを有効成分とする細胞免疫療法補助剤は、副作用が極
めて少ない利点がある。尚、マクロファージコロニー刺
激因子の急性毒性については、既に特公平６−１１７０
５号公報の実験例１に具体的に試験データとして記載さ
れているとおり、Ｃ５７ＢＬ系雄性マウスを用いた試験
において、ＬＤ₅₀が、腹腔内投与では４ｇ／ｋｇ体重、
静脈内投与では２ｇ／ｋｇ体重、皮下投与では４ｇ／ｋ
ｇ体重であることが確認されている。

【００２３】また、本発明の細胞免疫療法補助剤の投与
量は、その投与形態、年齢、症状等により異なるが、具
体的には、マクロファージコロニー刺激因子換算で体重
１ｋｇ当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲が挙げられ、
成人一人当たり５０μｇ〜５０ｍｇ投与されることが好
ましい。本発明の細胞免疫療法補助剤は、静脈内に投与
することが好ましく、１日１回を数日間連日投与するこ
とが可能である。

【００２４】本発明に使用するインターフェロンは、マ
ウスなどの異種動物由来の因子を使用することもできる
が、細胞免疫療法を実施する患者に対する場合は、ヒト
由来の因子を使用するが特に望ましい。用いられる因子
は天然由来又は遺伝子組換えにて調製されたものでもよ
く、商業的に市販されているものを使用することができ
る。これらインターフェロンは１〜１０００ｎｇ／ｍｌ
の濃度範囲で使用することが可能である。

【００２５】リンパ球の培養には、ＲＰＭＩ−１６４０
培地やダルベッコ改変イーグル培地などの適当な市販さ
れた培地を使用することができる。これら培地には、５
〜２０％程度のヒト血清及びウシ血清、ウシ胎児血清を
使用することができ、必要に応じて、ヒト血清アルブミ
ン及びウシ血清アルブミン、並びに抗生物質、抗体及び
２−メルカプトエタノール等を添加することが可能であ
る。

【００２６】インターフェロン、及び細胞免疫療法補助
剤を使用して増殖させたリンパ球は、その細胞傷害活性
を検出することにより確認することができる。例えば、
放射線標識したＹａｃ−１細胞などの癌細胞を標的細胞
として、リンパ球と混合培養すると、リンパ球が癌細胞
を殺傷し、生き残った細胞中に残存する放射能から、細
胞障害活性を測定することができる。

【００２７】本発明の細胞免疫療法補助剤を、ＢＲＭを
投与する免疫賦活療法に使用する場合、リンパ球の活性
化剤であるインターフェロンの作用を増強することによ
り、インターフェロンの投与量や投与回数を抑えて、副
作用を低減させる効果が期待できる。また、本発明の細
胞免疫療法補助剤をＬＡＫ療法や癌の細胞ワクチン療法
等の養子免疫療法に利用する場合においても、インター
フェロンによるin vitroでのリンパ球の活性化が効率良
く行われることにより、効果的な治療が可能となる。

【００２８】次に試験例を示して本発明を詳細に説明す
る。試験例１この試験は、本発明の細胞免疫療法補助剤によるインタ
ーフェロンのリンパ球活性化の増強効果を検討するため
に、Ｙａｃ−１細胞に対する脾臓中のＮＫ１．１陽性細
胞の細胞障害活性を調べた。

【００２９】（１）試験動物体重２０〜２５ｇの７〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６系雄性マ
ウス（日本チャールスリバーから購入）を、無作為に３
群（１群５匹）に分けて使用した。

【００３０】（２）試料の調製実施例１に基づいて製造した本発明の細胞免疫療法補助
剤を生理食塩水（大塚製薬社製）で１００倍に希釈して
試験試料とした。また、マウスＩＦＮ−α（コスモバイ
オ社製）を１０００単位／ｍｌに調製し、ＩＦＮ溶液と
した。

【００３１】（３）試験方法マウスに、試験試料を２００μｌずつ３日間連日投与し
た後に、クロロホルム麻酔下にて脾臓を採取して細胞懸
濁液を調製し、抗ＮＫ１．１抗体ビーズ及び磁気細胞分
離装置（第一化学薬品社製）を用いて、ＮＫ１．１陽性
細胞を分離した。更に、細胞を洗浄し、２×１０⁶個／
ｍｌとなるようにＮＫ１．１陽性細胞懸濁液を調製し
た。これとは別に、事前にトリチウム標識チミジンを添
加して培養しておいたＹａｃ−１細胞（理研セルバンク
より入手）を、２×１０⁵個／ｍｌとなるようにＹａｃ
−１細胞懸濁液を調製した。９６穴プレートに、１ウェ
ル当たり、ＮＫ１．１陽性細胞懸濁液５０μｌ、及びＹ
ａｃ−１細胞懸濁液５０μｌを添加し、更に、ＩＦＮ溶
液を１００μｌ添加して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気
下で２４時間共培養し、試験群とした。

【００３２】試験群において、試験試料の代わりに生理
食塩水をマウスに投与して、ＮＫ１．１陽性細胞を分離
したのち、試験群と同様の方法で共培養した試験を対照
試験群とした。更に、対照試験群において、ＩＦＮ溶液
の代わりに生理食塩水を添加して共培養した試験を陰性
試験とした。

【００３３】培養後に、各試験群の細胞に残存する放射
活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、Ｙａ
ｃ−１細胞に対するＮＫ１．１陽性細胞のＥ／Ｔ比率１
０における細胞障害活性（％）を検討した。

【００３４】（４）試験結果この試験の結果は図１に示すとおりである。図１は、脾
臓中のＮＫ１．１細胞のＹａｃ−１細胞に対する細胞障
害活性を表わす図である。図１から明らかなとおり、本
発明の細胞免疫療法補助剤を投与した試験群は、細胞免
疫療法補助剤を投与しない対照試験群に比して、細胞障
害活性は約３倍に増加した。従って、細胞免疫療法補助
剤によって、インターフェロン−αによるリンパ球の活
性化は相乗的に高められることが明らかとなった。次に
実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明
は以下の実施例に限定されるものではない。

【００３５】

【実施例】実施例１本発明の細胞免疫療法補助剤を注射剤として、次の組成
に基づいて常法により製造した。マクロファージコロニー刺激因子（森永乳業社製）０．６２５（％）塩化ナトリウム（和光純薬社製）０．９注射用蒸留水（大塚製薬社製）９８．４７５

【００３６】実施例２本発明の細胞免疫療法補助剤を注射剤として、次の組成
に基づいて常法により製造した。マクロファージコロニー刺激因子（森永乳業社製）０．６２５（％）アクチノマイシンＤ（シグマ社製）０．００５塩化ナトリウム（和光純薬社製）０．９マンニトール（関東化学社製）１．０注射用蒸留水（大塚製薬社製）９７．４７

【００３７】実施例３本発明の細胞免疫療法補助剤を錠剤として、次の組成に
基づいて常法により製造した。マクロファージコロニー刺激因子（森永乳業社製）１．０（ｍｇ）アクチノマイシンＤ（シグマ社製）０．０２乳糖（メグレ社製）１６２．９８結晶セルロース（和光純薬社製）３０．０ポリビニルピロリドン（和光純薬社製）５．０ステアリン酸マグネシウム（和光純薬社製）１．０

【００３８】

【発明の効果】以上記載したとおり、本発明はマクロフ
ァージコロニー刺激因子を有効成分とする細胞免疫療法
補助剤に関するものであり、本発明により奏される効果
は次のとおりである。（１）本発明の細胞免疫療法補助剤を投与することによ
り、生体応答調節剤の機能を簡便に増強することが可能
である。（２）本発明の細胞免疫療法補助剤と生体応答調節剤を
組み合わせて使用することにより、リンパ球を効果的に
活性化することが可能である。（３）本発明の細胞免疫療法補助剤は、ＩＦＮＡＮＫ療
法、ＬＡＫ細胞療法及び細胞ワクチン療法などに利用す
ることが可能である。（４）本発明の細胞免疫療法補助剤の有効成分であるマ
クロファージコロニー刺激因子は、既に医薬品として認
可されており、副作用が少なく安全性が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞免疫療法補助剤の投与によるＹａ
ｃ−１細胞に対するＮＫ１．１陽性細胞の細胞障害活性
を表わす図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者桜井琢磨神奈川県座間市東原五丁目１番83号森永乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者三澤江里子神奈川県座間市東原五丁目１番83号森永乳業株式会社生物科学研究所内Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 DA02 DA19 DA22 DA23 DA24 MA02 MA35 MA66 NA05 NA06 ZB071 ZB221 ZB261 ZB331

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マクロファージコロニー刺激因子類、及
び該因子類の薬学的に許容される塩類からなる群より選
択される１種又は２種以上の混合物を有効成分として含
有する細胞免疫療法補助剤。
【請求項２】細胞免疫療法に使用する細胞のドナーに
投与する請求項１に記載の細胞免疫療法補助剤。
【請求項３】細胞がリンパ球である請求項２に記載の
細胞免疫療法補助剤。
【請求項４】リンパ球がナチュラルキラー細胞又はナ
チュラルキラー様Ｔ細胞である請求項２又は請求項３に
記載の細胞免疫療法補助剤。
【請求項５】細胞免疫療法で使用する生体応答調節剤
がインターフェロン−α、インターフェロン−β、及び
インターフェロン−γのいずれかである請求項１乃至請
求項４のいずれかに記載の細胞免疫療法補助剤。
【請求項６】有効成分が成人患者一人当たり一日少な
くとも５０μｇ投与される請求項１乃至請求項５のいず
れかに記載の細胞免疫療法補助剤。