JP2002253236A - Ｄｎａの製造法 - Google Patents

Ｄｎａの製造法

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JP2002253236A
JP2002253236A JP2001226158A JP2001226158A JP2002253236A JP 2002253236 A JP2002253236 A JP 2002253236A JP 2001226158 A JP2001226158 A JP 2001226158A JP 2001226158 A JP2001226158 A JP 2001226158A JP 2002253236 A JP2002253236 A JP 2002253236A
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Satoshi Aozuka
聡 青塚
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Nisshinbo Industries Inc
Nisshin Spinning Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡの新規な製造法を提供する。 【解決手段】 目的の塩基配列に基づいて特定の様式で
選択された部分配列を有するオリゴマーを用意し、３’
末端側の部分で対合した２本の１本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲ
におけるプライマー且つ鋳型として用いてＰＣＲを特定
の手順で行い、ＤＮＡを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡの製造法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの製造法としては、ＰＣＲによる
方法、自動合成機を用いた化学合成反応による方法等が
知られている。
【０００３】しかしながら、任意の塩基配列を有するＤ
ＮＡを製造する場合には、ＰＣＲによる方法では、鋳型
として用いる、目的とする塩基配列を有するＤＮＡがす
でに存在することが必要であるという制限があり、ま
た、化学合成反応による方法では、実用的に製造できる
ＤＮＡの長さに上限があるため、それ以上の長さを有す
るＤＮＡの製造には、制限酵素及びリガーゼを用いた連
結処理が必要となり、従って、制限酵素認識配列の存在
に関する制限がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な制限のない、任意の塩基配列を有するＤＮＡの製造法
を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、目的の塩基
配列に基づいて、特定の様式で選択された部分配列を有
するオリゴマーを用意し、３’末端側の部分で対合した
２本の一本鎖ＤＮＡをプライマー且つ鋳型として用いて
ＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成する工程を、特定の手順に
より行うことによって、上記のような制限なく、任意の
塩基配列を有するＤＮＡが合成できることを見いだし、
本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、下記（１）〜（４）
の工程を含む、ＤＮＡの製造法（以下、「第１の本発明
製造法」ともいう）を提供する。
【０００７】（１）合成しようとするＤＮＡの塩基配列
である目的配列を２Ｎ（Ｎは正の整数）個の区間に分割
し、各区間の塩基配列を含み、かつ、隣接する区間の塩
基配列の一部を含む部分配列を設定し、目的配列の５’
側から１〜Ｎ番目の部分配列を有するオリゴマーと、Ｎ
＋１〜２Ｎ番目の部分配列に相補的な塩基配列を有する
オリゴマーとを用意し、ここで、一部とは、その一部の
塩基配列とそれに相補的な塩基配列とが特異的に対合す
るのに十分な部分とする。
【０００８】（２）目的配列の５’側からＮ番目の部分
配列を有するオリゴマーと、Ｎ＋１番目の部分配列に相
補的な塩基配列を有するオリゴマーを用いて、これらの
オリゴマーがプライマー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを
行い、ＤＮＡを合成する。
【０００９】（３）合成したＤＮＡの配列決定を行い、
目的配列の５’側からＮ番目及びＮ＋１番目の部分配列
を含む塩基配列を有するＤＮＡを選択する。
【００１０】（４）下記（４ａ）及び（４ｂ）の工程
を、Ｊ（Ｊは整数）が１からＮ−１になるまで繰り返
す。 （４ａ）選択したＤＮＡと、目的配列の５’側からＮ−
Ｊ番目の部分配列を有するオリゴマーおよびＮ＋１＋Ｊ
番目の部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマー
とを用いて、これらのＤＮＡおよびオリゴマーがプライ
マー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成
する。 （４ｂ）合成したＤＮＡの配列決定を行い、Ｎ−Ｊ番目
からＮ＋１＋Ｊ番目の部分配列を含む塩基配列を有する
ＤＮＡを選択する。
【００１１】また、本発明は、下記（１）〜（４）の工
程を含む、ＤＮＡの製造法（以下、「第２の本発明製造
法」ともいう）を提供する。
【００１２】（１）合成しようとするＤＮＡの塩基配列
である目的配列を２n（ｎは正の整数）個の区間に分割
し、各区間の塩基配列を含み、かつ、隣接する区間の塩
基配列の一部を含む部分配列を設定し、目的配列の５’
側から奇数番目の部分配列を有するオリゴマーと、偶数
番目の部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマー
とを用意し、ここで、一部とは、その一部の塩基配列と
それに相補的な塩基配列とが特異的に対合するのに十分
な部分とする。
【００１３】（２）下記（２ａ）の工程を、ｊ（ｊは整
数）が１から２n-1になるまで繰り返し、２n-1個の反応
産物を製造する。 （２ａ）目的配列の５’側から２ｊ−１番目の部分配列
を有するオリゴマーと、２ｊ番目の部分配列に相補的な
塩基配列を有するオリゴマーとを用いて、これらのオリ
ゴマーがプライマー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行
い、ＤＮＡを合成する。
【００１４】（３）下記（３ａ）の工程を、ｉ（ｉは整
数）が２からｎになるまで繰り返す。 （３ａ）下記（３ａｉ）の工程を、ｋ（ｋは整数）が１
から２n-iになるまで繰り返して、２n-i個の反応産物を
製造する。 （３ａｉ）目的配列の５’側から２i・（ｋ−１）＋１
番目〜２i・（ｋ−１／２）番目の部分配列を含むＤＮ
Ａを含む反応液と、２i・（ｋ−１／２）＋１番目〜２i
・ｋ番目の部分配列に相補的な配列を含むＤＮＡを含む
反応液とを混合し、反応液に含まれるＤＮＡがプライマ
ー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成す
る。
【００１５】（４）反応液から、目的配列から予想され
る長さを有するＤＮＡを分離し、分離された二本鎖の配
列決定を行い目的配列を有する二本鎖を選択する。
【００１６】第２の本発明製造法においては、（２ａ）
及び（３ａｉ）の工程において、次の工程に必要な１本
鎖が他方の１本鎖よりも多く合成されるように、反応液
に加えるオリゴマーの比、又は、混合する反応液との比
を調整することが好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】＜第１の本発明製造法＞第１の本
発明製造法は、目的配列のほぼ５’側の半分については
目的配列の部分配列を有するオリゴマーと、目的配列の
ほぼ３’側の半分については目的配列の部分配列に相補
的な配列を有するオリゴマーとを同数、部分配列が隣接
する部分配列と重なりを有するように用意し、最も内側
に位置する二つのオリゴマーをプライマー且つ鋳型とし
て用いてＰＣＲを行い、次いで反応産物とそのすぐ外側
に位置するオリゴマーとをプライマー且つ鋳型として用
いてＰＣＲを行うことを目的配列の長さになるまで繰り
返すことを特徴とする。以下、第１の本発明製造法の各
工程について説明する。
【００１８】（１）の工程では、合成しようとするＤＮ
Ａの塩基配列である目的配列を２Ｎ（Ｎは正の整数）個
の区間に分割し、各区間の塩基配列を含み、かつ、隣接
する区間の塩基配列の一部を含む部分配列を設定し、目
的配列の５’側から１〜Ｎ番目の部分配列を有するオリ
ゴマーと、Ｎ＋１〜２Ｎ番目の部分配列に相補的な塩基
配列を有するオリゴマーとを用意し、ここで、一部と
は、その一部の塩基配列とそれに相補的な塩基配列とが
特異的に対合するのに十分な部分とする。この一部（重
なり）は、末端部の部分配列はその内側のみに、中間部
は両側に含む。
【００１９】ここで設定される部分配列またはその相補
的配列を有するオリゴマーは、ＰＣＲにおいてプライマ
ー且つ鋳型として用いられるものであり、従って、特異
的に対合するとは、（２）および（４ａ）の工程のＰＣ
Ｒの条件で特異的に対合することを意味する。
【００２０】部分配列の長さは長いほど途中工程は効率
的になるが、化学合成により実用的に合成できるＤＮＡ
の長さには限度があるため通常は１５０塩基以下であ
り、収量及び合成効率などを考慮すれば好ましくは８０
〜１２０塩基である。目的の配列の長さは繰り返し配列
などを有する場合以外理論上の制限はないが、シーケン
ス解析により目的の配列を選択することを考えると、１
度のシーケンス解析で確認できる長さであることが好ま
しく、通常は１０００塩基以下である。Ｎの回数は目的
配列と部分配列の長さ、及び、部分配列における隣接す
る区間の塩基配列の重なりの長さから決定される。
【００２１】部分配列における隣接する区間の塩基配列
の重なりの長さは、特異的に対合するのに十分な長さで
あればよく、通常には、１７〜４０塩基である。この重
なりの配列の選定に際しては、通常のＰＣＲにおけるプ
ライマーの設計において考慮されるのと同様に、ＰＣＲ
の条件において、目的部分以外での対合によるプライマ
ーダイマーの形成、プライマー分子内の対合の形成など
が防がれ、また、変性温度（ＧＣ含量）が適切になるよ
うにする。部分配列の長さや重なりの長さは全て同一で
なくてもよく、目的配列と上記の要素とを考慮して適宜
選択される。
【００２２】（２）の工程では、目的配列の５’側から
Ｎ番目の部分配列を有するオリゴマーと、Ｎ＋１番目の
部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマーとを用
いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成する。
【００２３】ここで行うＰＣＲは、２種類のオリゴマー
がプライマーと鋳型の両方を兼ね、プライマーと鋳型の
区別が無い。すなわち、２種類のオリゴマーがその３’
末端で対合し、これが各鎖の伸長においてプライマー兼
鋳型になる。
【００２４】すなわち、目的配列の５’側からＮ番目の
部分配列を有するオリゴマーと、Ｎ＋１番目の部分配列
に相補的な塩基配列を有するオリゴマーを、ＤＮＡポリ
メラーゼによる伸長反応が起こり得る反応液に加え、変
性反応、アニーリング反応及び伸長反応を繰り返し、Ｄ
ＮＡを合成する。
【００２５】ＰＣＲの条件は、通常のＰＣＲと同様に条
件を検討して決定すればよい。ＰＣＲ反応液の代表的な
例としては、0.5μM各オリゴマー、20 mM Tris-HCl (pH
8.3(25℃))、1.5 mM MgCl2、0.05% Tween 20、100μg/
mlゼラチン又はＢＳＡ、50μM 各dNTP、0.02 units/μl
Taq ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる（濃度は最終濃
度）。反応の温度サイクルとしては、変性が94〜98℃30
秒〜１分、アニーリングが50〜60℃30秒〜１分、伸長が
65〜72℃30秒〜１分のサイクルを20〜30回行い、最後の
伸長反応を５〜10分延長するものが挙げられる。サイク
ルの前に変性を２〜５分行ってもよい。反応の停止は、
通常には、４℃への冷却とEDTA（最終濃度10 mM）の添
加によって行われる。
【００２６】dNTPの濃度は通常には0.1〜0.5μMであ
る。dNTPの濃度は、反応産物の収量、対合の特異性、重
合の正確さなどを考慮して決定する。
【００２７】マグネシウム濃度は通常には1.5〜3.5mMで
ある。Mg2+濃度は、反応液中のEDTA濃度、プライマーの
アニーリング、ＤＮＡの変性温度、反応の特異性、プラ
イマーダイマーの形成、酵素活性、重合の正確さなどを
考慮して決定する。
【００２８】プライマー（オリゴマー）の濃度は、通常
には0.1〜0.5μMである。濃度が高すぎると、反応の特
異性が低下し、プライマーダイマーなどが形成されるこ
とがある。
【００２９】DNAポリメラーゼの濃度は、種類によって
異なるが、Taq DNAポリメラーゼの場合には、通常には
１〜４units/100μlである。酵素量が多すぎると非特異
的増幅が起こることがある。
【００３０】この工程でのＰＣＲでは、１サイクル目に
おいては、２種類のオリゴマーが、その３’末端の部分
で対合したものがプライマー兼鋳型になるが、２サイク
ル目からは、伸長により生じたＤＮＡも鋳型として反応
に関与し得る。すなわち、伸長により生じたＤＮＡが鋳
型となり、オリゴマー全体がプライマーのみとして機能
する反応も起こる。従って、変性は、この鋳型となり得
るＤＮＡの変性が十分となるように条件を設定する。
【００３１】アニーリングの条件は、プライマーの変性
温度、長さ、濃度等を考慮して決定する。温度として
は、通常には、プライマーの変性温度より約５℃低い温
度が挙げられる。
【００３２】伸長の条件は、用いるDNAポリメラーゼの
種類、伸長したい部分の長さと量、および温度を考慮し
て決定する。温度としては、DNAポリメラーゼとしてTaq
DNAポリメラーゼを用いる場合には、その至適温度が挙
げられる。なお、変性の条件によっては、DNAポリメラ
ーゼの失活が考えられるので、DNAポリメラーゼの追加
も考慮する。
【００３３】上記のようなＰＣＲは、普及しているＰＣ
Ｒ用の機械、酵素などをそのまま使用して行うことがで
きる。
【００３４】また、上記のようなＰＣＲは、鋳型となる
ＤＮＡが一本鎖のため、最初の変性温度に達するまでの
間に非特異的対合と伸長反応が起こり、これにより非特
異的増幅が起こる場合がある。この場合には、最初の変
性温度に達するまでは反応が起こらず、所定温度になっ
てから初めて反応が起こるようにする、ホットスタート
法と呼ばれる手法を採用してもよい。
【００３５】（３）の工程では、合成したＤＮＡの配列
決定を行い、目的配列の５’側からＮ番目及びＮ＋１番
目の部分配列を含む塩基配列を有するＤＮＡを選択す
る。
【００３６】合成したＤＮＡの配列決定は通常の方法に
よって行うことができる。例えば、（２）の工程により
得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、予
測される長さのＤＮＡをゲルから抽出し、適切なベクタ
ーにクローニングし、配列決定を行う。目的配列の５’
側からＮ番目及びＮ＋１番目の部分配列を含むＤＮＡを
選択し、ベクターごと次の反応の鋳型として用いる。
【００３７】（４）の工程では、下記（４ａ）及び（４
ｂ）の工程を、Ｊ（Ｊは整数）が１からＮ−１になるま
で繰り返す。 （４ａ）選択したＤＮＡと、目的配列の５’側からＮ−
Ｊ番目の部分配列を有するオリゴマーおよびＮ＋１＋Ｊ
番目の部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマー
とを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成する。 （４ｂ）合成したＤＮＡの配列決定を行い、Ｎ−Ｊ番目
からＮ＋１＋Ｊ番目の部分配列を含む塩基配列を有する
ＤＮＡを選択する。
【００３８】（４ａ）の工程で行うＰＣＲは、ＤＮＡの
各一本鎖と２種類のオリゴマーがプライマーと鋳型の両
方を兼ね、プライマーと鋳型の区別が無い。すなわち、
一方の一本鎖と一方のオリゴマーおよび他方の一本鎖と
他方のオリゴマーがその３’末端で対合し、これが各鎖
の伸長においてプライマー兼鋳型になる。
【００３９】すなわち、選択されたＤＮＡと、目的配列
の５’側からＮ−Ｊ番目の部分配列を有するオリゴマー
と、Ｎ＋１＋Ｊ番目の部分配列に相補的な塩基配列を有
するオリゴマーを、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応
が起こり得る反応液に加え、変性反応、アニーリング反
応及び伸長反応を繰り返し、ＤＮＡを合成する。
【００４０】（４ａ）の工程は、選択されたＤＮＡがさ
らに含まれていることと、用いるオリゴマーが異なるこ
との他は、（２）の工程と同様でよい。ＰＣＲの条件は
この違いを考慮して決定されるが、（２）の工程の条件
の決定の際に、（４ａ）の条件も考慮しておけば（２）
と同じ条件で行うことができる。
【００４１】（４ｂ）の工程は、（３）の工程と同様で
よい。
【００４２】以下、長さ630塩基の塩基配列を有するＤ
ＮＡを製造する場合を例にして説明する。
【００４３】全長を１０の区間に分割し（Ｎ＝５）、部
分配列の長さを90塩基、重なりの長さを30塩基として、
部分配列を設定する（図１）。次いで５’側から１番目
から５番目について部分配列を有するオリゴマー（U5〜
U1）、６番目から１０番目について部分配列に相補的な
配列を有するオリゴマー（L1〜L5）を合成する。
【００４４】オリゴマーU1およびL1を用いて、９４℃２
分の後、９８℃３０秒、６０℃３０秒および６８℃１分
のサイクルを３０回そして６８℃１０分の条件でＰＣＲ
を行い150塩基のＤＮＡを合成する。得られたＤＮＡの
配列決定を行い、予定された配列を有するものを選択す
る。
【００４５】次いで、下記（Ｉ）〜（IV）の工程を行
う。 （Ｉ）選択されたＤＮＡと、オリゴマーU2およびL2とを
用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、270 bpのＤＮＡを
合成する。得られたＤＮＡの配列決定を行い、予定され
た配列を有するものを選択する。 （II）選択されたＤＮＡと、オリゴマーU3およびL3とを
用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、390 bpのＤＮＡを
合成する。得られたＤＮＡの配列決定を行い、予定され
た配列を有するものを選択する。 （III）選択されたＤＮＡと、オリゴマーU4およびL4と
を用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、510 bpのＤＮＡ
を合成する。得られたＤＮＡの配列決定を行い、予定さ
れた配列を有するものを選択する。 （IV）選択されたＤＮＡと、オリゴマーU5およびL5とを
用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、630 bpのＤＮＡを
合成する。得られたＤＮＡの配列決定を行い、予定され
た配列を有するものを選択する。
【００４６】このようにして、化学合成法で得られたＤ
ＮＡを連結することにより、化学合成法で実用的に得る
ことのできる限度の長さの数倍の長さのＤＮＡを製造で
き、この方法は途中で制限酵素処理が必須ではないため
に、任意の配列のＤＮＡの製造が可能である。
【００４７】＜第２の本発明製造法＞第２の本発明製造
法は、目的配列の部分配列を有するオリゴマーと、目的
配列の部分配列に相補的な配列を有するオリゴマーとを
交互に同数、部分配列が隣接する部分配列と重なりを有
するように用意し、隣接するオリゴマーの各対をプライ
マー且つ鋳型として用いてＰＣＲを行い、次いで、隣接
する反応産物の各対をプライマー且つ鋳型として用いて
ＰＣＲを行うことを目的配列の長さになるまで繰り返す
ことを特徴とする。以下、第２の本発明製造法の各工程
について説明する。
【００４８】（１）の工程では、合成しようとするＤＮ
Ａの塩基配列である目的配列を２n（ｎは正の整数）個
の区間に分割し、各区間の塩基配列を含み、かつ、隣接
する区間の塩基配列の一部を含む部分配列を設定し、目
的配列の５’側から奇数番目の部分配列を有するオリゴ
マーと、偶数番目の部分配列に相補的な塩基配列を有す
るオリゴマーとを用意し、ここで、一部とは、その一部
の塩基配列とそれに相補的な塩基配列とが特異的に対合
するのに十分な部分とする。この一部（重なり）は、末
端部の部分配列はその内側のみに、中間部は両側に含
む。
【００４９】ここで設定される部分配列またはその相補
的配列を有するオリゴマーは、ＰＣＲにおいてプライマ
ー且つ鋳型として用いられるものであり、従って、特異
的に対合するとは、（２ａ）および（３ａｉ）の工程の
ＰＣＲの条件で特異的に対合することを意味する。
【００５０】部分配列の長さは、化学合成により実用的
に製造できるＤＮＡの長さでよく、通常には、８０〜１
２０塩基である。ｎの範囲は、この長さ、目的の配列の
長さ、重合反応の正確さなどにより決定され、通常に
は、２〜４である。この範囲を超えると、変異の入る確
率が高くなり、目的の配列を得られない可能性が高くな
る。
【００５１】部分配列における隣接する区間の塩基配列
の重なりの長さは、特異的に対合するのに十分な長さで
あればよく、通常には、１７〜４０塩基である。この重
なりの配列の選定に際しては、通常のＰＣＲにおけるプ
ライマーの設計において考慮されるのと同様に、ＰＣＲ
の条件において、目的部分以外での対合によるプライマ
ーダイマーの形成、プライマー分子内の対合の形成など
が防がれ、また、変性温度（ＧＣ含量）が適切になるよ
うにする。部分配列の長さや重なりの長さは全て同一で
なくてもよく、目的配列と上記の要素とを考慮して適宜
選択される。例えば、反応の段階が進むにつれてプライ
マー兼鋳型となるＤＮＡの長さが長くなるので、これを
考慮して重なりの長さを変えてもよい。
【００５２】（２）の工程では、下記（２ａ）の工程
を、ｊ（ｊは整数）が１から２n-1になるまで繰り返
し、２n-1個の反応産物を製造する。 （２ａ）目的配列の５’側から２ｊ−１番目の部分配列
を有するオリゴマーと、２ｊ番目の部分配列に相補的な
塩基配列を有するオリゴマーとを用いて、これらのオリ
ゴマーがプライマー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行
い、ＤＮＡを合成する。
【００５３】（２ａ）の工程は、第１の本発明製造法の
（２）の工程と同様にして行うことができる。但し、
（３ａｉ）の工程で用いられる、プライマー兼鋳型とな
るＤＮＡを考慮して条件が決定されることが好ましい。
また、反応の停止にはEDTAを添加しない。
【００５４】（３）の工程では、下記（３ａ）の工程
を、ｉ（ｉは整数）が２からｎになるまで繰り返す。 （３ａ）下記（３ａｉ）の工程を、ｋ（ｋは整数）が１
から２n-iになるまで繰り返して、２n-i個の反応産物を
製造する。 （３ａｉ）目的配列の５’側から２i・（ｋ−１）＋１
番目〜２i・（ｋ−１／２）番目の部分配列を含むＤＮ
Ａを含む反応液と、２i・（ｋ−１／２）＋１番目〜２i
・ｋ番目の部分配列に相補的な配列を含むＤＮＡを含む
反応液とを混合し、反応液に含まれるＤＮＡがプライマ
ー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成す
る。
【００５５】（３ａｉ）の工程では、前段階で得られた
反応液を混合し、ＰＣＲを行う。変性、アニーリングお
よび伸長の反応条件は（２ａ）の工程と同様でよいが、
プライマー兼鋳型となるＤＮＡが長くなるのに合わせて
変性、アニーリングおよび伸長の条件のいずれか又は全
てを変更してもよい。また、ＰＣＲの条件によっては、
反応液の混合の際に、DNAポリメラーゼ等の試薬を添加
してもよい。
【００５６】（４）の工程では、反応液から、目的配列
から予想される長さを有するＤＮＡを分離し、分離され
た二本鎖の配列決定を行い目的配列を有する二本鎖を選
択する。
【００５７】（４）の工程におけるＤＮＡの分離および
配列決定は第１の本発明製造法の（３）の工程と同様に
して行うことができる。
【００５８】以下、長さ500塩基の塩基配列を有するＤ
ＮＡを製造する場合を例にして説明する。
【００５９】図２の枠内に示すようにAa1、Aa2、Ab1、A
b2、Ba1、Ba2、Bb1及びBb2の８個（ｎ＝３）のオリゴマ
ー（長さ９０塩基）を用意する。Aa1とAa2、Ab1とAb2、
Ba1とBa2、Bb1とBb2、Aa2とAb1、Ba2とBb1はそれぞれ３
０塩基、Ab2とBa1は４０塩基重なるように設計する。
【００６０】先ず、Aa1とAa2、Ab1とAb2、Ba1とBa2、Bb
1とBb2をそれぞれ含む反応液を調製し、ＰＣＲを行う。
反応後、Aaの反応液とAbの反応液、Baの反応液とBbの反
応液をそれぞれ混合し、ＰＣＲを行う。２回目の反応
後、２回目の反応で得られた反応液を混合し、ＰＣＲを
行う。得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動にか
け、予測されるサイズの断片をゲルから回収し、ベクタ
ーに組み込み、配列決定を行い目的の配列のクローンを
選択する。
【００６１】第２の本発明製造方法においては、反応産
物の混合の工程数を増やすことによって更に長いものを
合成することは可能であるが、変異の入る確率が高くな
り目的の配列のものが取れない可能性が出てくる。５０
０塩基程度のものを合成した段階で１度配列決定を行
い、他の方法と組み合わせることによってさらに長い最
終産物を製造することができる。
【００６２】第２の本発明製造法によっても、第１の本
発明製造法と同様に途中で制限酵素処理が必須ではない
ために、任意の配列のＤＮＡの製造が可能である。
【００６３】オリゴマー合成の途中で反応が停止したよ
うな5'側が短い不純物は次の段階の反応においてアニー
ル部分が短いか無いために、反応が起こりにくく欠失の
あるクローンが合成される確率を下げることができるた
め、オリゴマーは、その精製度が低くても使用可能であ
る。
【００６４】反応産物が、およそ２倍ずつ長くなるので
最終産物をゲルから回収する際に他の生成物（前段階ま
でしか反応が進んでいないもの等）との長さの差が大き
く回収が容易である。
【００６５】第２の本発明製造法においては、（２ａ）
及び（３ａｉ）の工程において、次の工程に必要な１本
鎖が他方の１本鎖よりも多く合成されるように、反応液
に加えるオリゴマーの比、又は、混合する反応液との比
を調整することが好ましい。
【００６６】最初のオリゴマーの量比、及び、反応液の
最後の混合を除いて混合する反応液の量比を、非対称Ｐ
ＣＲの様に変えて（例えば１：２〜１：９）、次の反応
に必要な側の１本鎖が他方より多く合成されるようにす
る。
【００６７】１：４の場合を図２を参照して説明する。
Aa1とAa2を４：１、Ab1とAb2を１：４、Ba1とBa2を４：
１、Bb1とBb2を１：４の量比で反応液に加えてＰＣＲを
行う（Ba1とBa2、Bb1とBb2は不図示）。Aa1とAa2の反応
液とAb1とAb2の反応液を４：１の量比で混合してＰＣＲ
を行う。また、Ba1とBa2の反応液とBb1とBb2の反応液を
１：４の量比で混合してＰＣＲを行う（不図示）。次い
で、Aa1〜Ab2の反応液とBa1〜Bb2の反応液を１：１の量
比で混合してＰＣＲを行う。得られた反応産物をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、予測されるサイズの断片をゲ
ルから回収し、ベクターに組み込み、配列決定を行い目
的の配列のクローンを選択する。
【００６８】第２の本発明製造法においては、伸長の必
要がないオリゴマーの３’末端部分を、伸長が起こらな
いように修飾して、目的の生成物の合成効率を上げても
よい。このような３’末端の修飾としては、アミノ化、
ビオチン化、ジゴキシゲニン(digoxigenin)化などが挙
げられるが、Ｔｍにあまり影響を与えない様にするに
は、分子的に小さな修飾であるアミノ化が好ましい。
【００６９】第２の本発明製造法においては、合成され
た最終産物の両側に２０ｍｅｒ程度のプライマーを設計
して、最終産物を鋳型としてＰＣＲ反応を行ってもよ
い。このようにすれば、合成量が少なかった場合に量を
増やしたり、一端又は両端に欠失があるものを除いたり
することができる。
【００７０】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。
【００７１】
【実施例１】配列番号１に示す塩基配列（目的配列）を
有するＤＮＡを合成するため、目的配列を１０区間に分
割し、長さを９０塩基、隣接する区間の重なりの長さを
３０塩基として、目的配列の部分配列を設定し、目的配
列の部分配列を有するオリゴマー（U1〜U5）及び目的配
列の部分配列に相補的な配列を有するオリゴマー（L1〜
L5）を合成した。U1〜U5及びL1〜L5の塩基配列を配列番
号２〜１１にそれぞれ示す。また、U1〜U5及びL1〜L5の
位置関係を図１に示す。
【００７２】反応には、Clontech社製のＰＣＲキットで
あるAdvantage cDNA PCR Kitを用いて、0.4μM U1及びL
1、40 mMトリシン-KOH(25℃でpH 9.2)、15 mM酢酸カリ
ウム（KOAc）、1.5 mM酢酸マグネシウム（Mg(OAc)2）、
75μg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.2 mM 各dNTP、
0.5μl Advantage KlenTaq Polymerase Mixを含む反応
液25μlを調製した。
【００７３】反応条件は以下の通りとした。９４℃で２
分置いた後、９８℃で３０秒の変性反応、６０℃で３０
秒のアニーリング反応、及び、６８℃で１分の伸長反応
のサイクルを３０回行い、最後の伸長反応を１０分延長
した。反応は４℃に冷却して停止した。
【００７４】得られた反応産物をアガロース電気泳動に
より分離し、U1及びL1の塩基配列から期待される長さの
断片をゲルから抽出精製した。得られた断片を、TAクロ
ーニング用ベクターキットであるpGEM-T Vector System
（Promega社）でダイレクトにクローニングした。
【００７５】得られたクローンの一部について挿入配列
の配列決定を行った結果、表１〜４に示す塩基配列を有
するクローンが得られた。表１〜４において１番上に目
的配列を示す。括弧内の数字はクローン名であり、クロ
ーン名の右に「*」の付いているものは目的配列を有す
るクローンである。
【００７６】目的配列を有するクローンをそのまま次の
反応に使用した。U1及びL1の代わりに、このプラスミド
およそ5 ngと、U2及びL2とを含む他は上記と同様の反応
液を調製し、上記と同様の反応条件で反応産物を得た。
【００７７】得られた反応産物をアガロース電気泳動に
より分離し、U1、U2、L1及びL2の塩基配列から期待され
る長さの断片をゲルから抽出精製した。得られた断片
を、TAクローニング用ベクターであるpGEM-T Vector Sy
stem（Promega社）でダイレクトにクローニングした。
【００７８】得られたクローンの一部について挿入配列
の配列決定を行った結果、表５〜１０に示す塩基配列を
有するクローンが得られた。表５〜１０において１番上
に目的配列を示す。括弧内の数字はクローン名であり、
クローン名の右に「*」の付いているものは目的配列を
有するクローンである。
【００７９】目的配列を有するクローンをそのまま次の
反応に使用した。U1及びL1の代わりに、このプラスミド
およそ5 ngと、U3及びL3とを含む他は上記と同様の反応
液を調製し、上記と同様の反応条件で反応産物を得た。
【００８０】得られた反応産物をアガロース電気泳動に
より分離し、U1〜U3及びL1〜L3の塩基配列から期待され
る長さの断片をゲルから抽出精製した。得られた断片
を、TAクローニング用ベクターであるpGEM-T Vector Sy
stem（Promega社）でダイレクトにクローニングした。
【００８１】得られたクローンの一部について挿入配列
の配列決定を行った結果、表１１〜１８に示す塩基配列
を有するクローンが得られた。表１１〜１８において１
番上に目的配列を示す。括弧内の数字はクローン名であ
り、クローン名の右に「*」の付いているものは目的配
列を有するクローンである。
【００８２】目的配列を有するクローンをそのまま次の
反応に使用した。U1及びL1の代わりに、このプラスミド
およそ5 ngと、U4及びL4とを含む他は上記と同様の反応
液を調製し、上記と同様の反応条件で反応産物を得た。
【００８３】得られた反応産物をアガロース電気泳動に
より分離し、U1〜U4及びL1〜L4の塩基配列から期待され
る長さの断片をゲルから抽出精製した。得られた断片
を、TAクローニング用ベクターであるpGEM-T Vector Sy
stem（Promega社）でダイレクトにクローニングした。
【００８４】得られたクローンの一部について挿入配列
の配列決定を行った結果、表１９〜２９に示す塩基配列
を有するクローンが得られた。表１９〜２９において１
番上に目的配列を示す。括弧内の数字はクローン名であ
り、クローン名の右に「*」の付いているものは目的配
列を有するクローンである。
【００８５】目的配列を有するクローンをそのまま次の
反応に使用した。U1及びL1の代わりに、このプラスミド
およそ5 ngと、U5及びL5とを含む他は上記と同様の反応
液を調製し、上記と同様の反応条件で反応産物を得た。
【００８６】得られた反応産物をアガロース電気泳動に
より分離し、U1〜U5及びL1〜L5の塩基配列から期待され
る長さの断片をゲルから抽出精製した。得られた断片
を、TAクローニング用ベクターであるpGEM-T Vector Sy
stem（Promega社）でダイレクトにクローニングした。
【００８７】得られたクローンの一部について挿入配列
の配列決定を行った結果、表３０〜４２に示す塩基配列
を有するクローンが得られた。表３０〜４２において１
番上に目的配列を示す。括弧内の数字はクローン名であ
り、クローン名の右に「*」の付いているものは目的配
列を有するクローンである。
【００８８】このようにして目的配列を有するＤＮＡを
製造することができた。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
【表３】
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】
【表８】
【００９７】
【表９】
【００９８】
【表１０】
【００９９】
【表１１】
【０１００】
【表１２】
【０１０１】
【表１３】
【０１０２】
【表１４】
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
【表１７】
【０１０６】
【表１８】
【０１０７】
【表１９】
【０１０８】
【表２０】
【０１０９】
【表２１】
【０１１０】
【表２２】
【０１１１】
【表２３】
【０１１２】
【表２４】
【０１１３】
【表２５】
【０１１４】
【表２６】
【０１１５】
【表２７】
【０１１６】
【表２８】
【０１１７】
【表２９】
【０１１８】
【表３０】
【０１１９】
【表３１】
【０１２０】
【表３２】
【０１２１】
【表３３】
【０１２２】
【表３４】
【０１２３】
【表３５】
【０１２４】
【表３６】
【０１２５】
【表３７】
【０１２６】
【表３８】
【０１２７】
【表３９】
【０１２８】
【表４０】
【０１２９】
【表４１】
【０１３０】
【表４２】
【０１３１】
【実施例２】配列番号１２に示す塩基配列（目的配列）
を有するＤＮＡを合成するため、配列番号１３〜２０に
示す塩基配列をそれぞれ有する、長さ１０４塩基のオリ
ゴマー1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a及び4bを合成した。
これらのオリゴマーはそれぞれ、図２の枠内に示すAa
1、Aa2、Ab1、Ab2、Ba1、Ba2、Bb1及びBb2に相当する。
【０１３２】４本のチューブに下記表４３に示す組成の
反応液をそれぞれ調製し（Tube1〜Tube4）、９４℃で１
分置いた後、９４℃で３０秒及び６８℃で３０秒のサイ
クルを３０回の条件でＰＣＲ反応を行った。この段階で
１７９ｂｐの断片が合成される。
【０１３３】
【表４３】 表４３ 反応液組成（単位：μl） Tube 1 Tube2 Tube3 Tube4 10×pyrobest PCR反応緩衝液 10 10 10 10 2.5 mM dNTPミクスチャー 2 2 2 2 プライマーａ 10 pmol/μl 4(1a) 1(2a) 4(3a) 1(4a) プライマーｂ 10 pmol/μl 1(1b) 4(2b) 1(3b) 4(4b) pyrobest DNAポリメラーゼ 5 unit/μl 0.5 0.5 0.5 0.5水 82.5 82.5 82.5 82.5 計 100 100 100 100
【０１３４】反応終了後、Tube1より80μl、Tube2より2
0μl取り、新しいチューブで混合した（Tube5）。同様
に、Tube3より20μl、Tube4より80μl取り、新しいチュ
ーブで混合した（Tube6）。Tube5及びTube6を上記の反
応条件で反応させた。この段階で３２６ｂｐの断片が合
成される。
【０１３５】反応終了後、Tube5より50μl、Tube6より5
0μl取り、新しいチューブで混合した（Tube7）。Tube7
を上記の反応条件で反応させた。これにより目的の６１
２ｂｐの断片が合成される。
【０１３６】次いで、目的の断片の増幅を行った。目的
配列の両末端の配列に基づき配列番号２１及び２２に示
す塩基配列をそれぞれ有する20merのオリゴマーを調製
した。このオリゴマーをプライマー（Upper及びLower）
として用い、下記表４４に示す組成の反応液をそれぞれ
調製し（Tube8）、９８℃で１分置いた後、９８℃で３
０秒及び６８℃で９０秒のサイクルを３０回の条件でＰ
ＣＲ反応を行った。
【０１３７】
【表４４】表４４ 反応液組成（単位：μl） 10×pyrobest PCR反応緩衝液 10 Tube7反応産物 4 2.5 mM dNTPミクスチャー 2 プライマーUpper 10 pmol/μl 5 プライマーLower 10 pmol/μl 5 pyrobest DNAポリメラーゼ 5 unit/μl 0.5水 73.5 計 100
【０１３８】上記の反応後、Tube1〜Tube8の反応産物を
各５μｌ電気泳動に付し、増幅を確認した（図３）。増
幅が確認されたため、Tube8の目的の長さの反応産物を
電気泳動ゲルより回収して、pGEM-T Vector System（Pr
omega社）でダイレクトにクローニングした。
【０１３９】得られたクローンを１５個配列決定したと
ころ、目的の配列を持つクローンが１個得られた。
【０１４０】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡの新規な製造法が
提供される。第１の本発明製造法によれば、化学合成法
で実用的に得ることのできる限度の長さの数倍の長さの
ＤＮＡを実用的に製造でき、製造中において制限酵素処
理が必須ではないため、製造できるＤＮＡの配列に対す
る制限が減少する。加えて、第２の本発明製造法によれ
ば、途中段階でクローニングの工程を含まず、更にその
工程で反応産物の長さがおよそ２倍ずつ長くなるため
に、最終産物の選択が容易となる。これらのことからよ
り迅速で効率的な製造が可能となる。
【０１４１】
【配列表】 <110> 日清紡績株式会社(Nisshinbo Industries, Inc.) <120> ＤＮＡの製造法 <130> P-9086 <150> JP 2000-229284 <151> 2000-07-28 <160> 22 <210> 1 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 1 ggctcgaggt accgcggccg ctcacaagac aaggcaacca gattttttct tcccacgtct 60 agcttgcaga gcagctctcg tagccatttc aaaaacctct ctcactccat ctttggtctt 120 tgctgaacac tccatgtacc caaaagcgcc aatcctgttt gccatatctc tgccttcttc 180 aggtttcacc ggctcctgct tcatcttggc tagctcccgc cttgtgtgct catcattccg 240 aagatccttc ttattcccaa cccggatgat gggcacgttg ggacagaaat gcttgacttc 300 tggggtccac ttttctggga tgttttctaa actatcaggg ctgtcgatgg aaaaacacat 360 cagtataaca tcggtatctg ggtaggagag gggcctcagg cgatcataat cttcctgccc 420 agctgtgtcc cacaaagcca actctacctg ctttccatcc acctcgatat ctgccacata 480 gttctcaaac actgtgggca catacacctc tgggaactgg tccttgctga agactattaa 540 taggcatgtc tttccacagg ctacatcacc aacaatcacc agtttcttcc ggttcaggtc 600 ctcctcggag atcagcttct gctccatggg 630 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 2 aagatccttc ttattcccaa ccaggatgat gggcacgttg ggacagaaat gcttgacttc 60 tggggtccac ttttctggga tgttttctaa 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 3 aggtttcacc ggctcctgct tcatcttggc tagctcccgc cttgtgtgct catcattccg 60 aagatccttc ttattcccaa ccaggatgat 90 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 4 tgctgaacac tccatgtacc caaaagcgcc aatcctgttt gccatatctc tgccttcttc 60 aggtttcacc ggctcctgct tcatcttggc 90 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 5 agcttgcaga gcagctctcg tagccatttc aaaaacctct ctcactccat ctttggtctt 60 tgctgaacac tccatgtacc caaaagcgcc 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 6 ggctcgaggt accgcggccg ctcacaagac aaggcaacca gattttttct tcccacgtct 60 agcttgcaga gcagctctcg tagccatttc 90 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 7 ctctcctacc cagataccga tgttatactg atgtgttttt ccatcgacag ccctgatagt 60 ttagaaaaca tcccagaaaa gtggacccca 90 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 8 caggtagagt tggctttgtg ggacacagct gggcaggaag attatgatcg cctgaggccc 60 ctctcctacc cagataccga tgttatactg 90 <210> 9 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 9 gaggtgtatg tgcccacagt gtttgagaac tatgtggcag atatcgaggt ggatggaaag 60 caggtagagt tggctttgtg ggacacagct 90 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 10 ggtgatgtag cctgtggaaa gacatgccta ttaatagtct tcagcaagga ccagttccca 60 gaggtgtatg tgcccacagt gtttgagaac 90 <210> 11 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 11 cccatggagc agaagctgat ctccgaggag gacctgaacc ggaagaaact ggtgattgtt 60 ggtgatgtag cctgtggaaa gacatgccta 90 <210> 12 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 12 attaagaaac atgtagaatt aggttttcca ccaacaagct ttgtacccct tgatgtaaag 60 aaccgtaaac aacacgttgc tttgcttatg aattcttctg gatctactgg tttacctaaa 120 ggtgtacgaa ttacccacga aggtgcagtt acaagattct cacacgctaa ggatccaatt 180 tacggaaacc aagtttcacc tggtactgct attttaactg tcgttccgtt ccatcatgga 240 tttggaatgt ttaccacttt aggatacttt gcttgcggat accgtgttgt aatgttaaca 300 aaatttgatg aagaactgtt tttgagaact ttgcaagatt ataagtgtac cagtgtgatt 360 cttgtaccaa ccttatttgc tattctcaac aagagtgaat tgatcgataa gttcgattta 420 tctaatctaa ctgaaattgc ttctggtgga gctcctttgg caaaagaagt tggcgaagca 480 gtcgctagaa gatttaatct acccggtgtc cgtcagggtt acggattaac agaaacaaca 540 tctgcattta ttattactcc agaaggtgat gataaacctg gagcatctgg aaaagtggta 600 cccttattca aa 612 <210> 13 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 13 attaagaaac atgtagaatt aggttttcca ccaacaagct ttgtacccct tgatgtaaag 60 aaccgtaaac aacacgttgc tttgcttatg aattcttctg gatc 104 <210> 14 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 14 ttggatcctt agcgtgtgag aatcttgtaa ctgcaccttc gtgggtaatt cgtacacctt 60 taggtaaacc agtagatcca gaagaattca taagcaaagc aacg 104 <210> 15 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 15 ttacaagatt ctcacacgct aaggatccaa tttacggaaa ccaagtttca cctggtactg 60 ctattttaac tgtcgttccg ttccatcatg gatttggaat gttt 104 <210> 16 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 16 ctcaaaaaca gttcttcatc aaattttgtt aacattacaa cacggtatcc gcaagcaaag 60 tatcctaaag tggtaaacat tccaaatcca tgatggaacg gaac 104 <210> 17 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 17 ttgtaatgtt aacaaaattt gatgaagaac tgtttttgag aactttgcaa gattataagt 60 gtaccagtgt gattcttgta ccaaccttat ttgctattct caac 104 <210> 18 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 18 tttgccaaag gagctccacc agaagcaatt tcagttagat tagataaatc gaacttatcg 60 atcaattcac tcttgttgag aatagcaaat aaggttggta caag 104 <210> 19 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 19 aattgcttct ggtggagctc ctttggcaaa agaagttggc gaagcagtcg ctagaagatt 60 taatctaccc ggtgtccgtc agggttacgg attaacagaa acaa 104 <210> 20 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 20 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【図面の簡単な説明】
【図１】 第１の本発明製造法の一例におけるオリゴマ
ーの位置関係を示す。
【図２】 第２の本発明製造法の一例におけるオリゴマ
ーの位置関係および工程の概略を示す。
【図３】 実施例２で得られたＰＣＲ反応産物(Tube1〜
Tube8)の電気泳動による分析結果（電気泳動写真）を示
す。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記（１）〜（４）の工程を含む、ＤＮ
    Ａの製造法。 （１）合成しようとするＤＮＡの塩基配列である目的配
    列を２Ｎ（Ｎは正の整数）個の区間に分割し、各区間の
    塩基配列を含み、かつ、隣接する区間の塩基配列の一部
    を含む部分配列を設定し、目的配列の５’側から１〜Ｎ
    番目の部分配列を有するオリゴマーと、Ｎ＋１〜２Ｎ番
    目の部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマーと
    を用意し、ここで、一部とは、その一部の塩基配列とそ
    れに相補的な塩基配列とが特異的に対合するのに十分な
    部分とする。 （２）目的配列の５’側からＮ番目の部分配列を有する
    オリゴマーと、Ｎ＋１番目の部分配列に相補的な塩基配
    列を有するオリゴマーを用いて、これらのオリゴマーが
    プライマー且つ鋳型となる条件でポリメラーゼ連鎖反応
    （ＰＣＲ）を行い、ＤＮＡを合成する。 （３）合成したＤＮＡの配列決定を行い、目的配列の
    ５’側からＮ番目及びＮ＋１番目の部分配列を含む塩基
    配列を有するＤＮＡを選択する。 （４）下記（４ａ）及び（４ｂ）の工程を、Ｊ（Ｊは整
    数）が１からＮ−１になるまで繰り返す。 （４ａ）選択したＤＮＡと、目的配列の５’側からＮ−
    Ｊ番目の部分配列を有するオリゴマーおよびＮ＋１＋Ｊ
    番目の部分配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマー
    とを用いて、これらのＤＮＡおよびオリゴマーがプライ
    マー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成
    する。 （４ｂ）合成したＤＮＡの配列決定を行い、Ｎ−Ｊ番目
    からＮ＋１＋Ｊ番目の部分配列を含む塩基配列を有する
    ＤＮＡを選択する。
  2. 【請求項２】 下記（１）〜（４）の工程を含む、ＤＮ
    Ａの製造法。 （１）合成しようとするＤＮＡの塩基配列である目的配
    列を２n（ｎは正の整数）個の区間に分割し、各区間の
    塩基配列を含み、かつ、隣接する区間の塩基配列の一部
    を含む部分配列を設定し、目的配列の５’側から奇数番
    目の部分配列を有するオリゴマーと、偶数番目の部分配
    列に相補的な塩基配列を有するオリゴマーとを用意し、
    ここで、一部とは、その一部の塩基配列とそれに相補的
    な塩基配列とが特異的に対合するのに十分な部分とす
    る。 （２）下記（２ａ）の工程を、ｊ（ｊは整数）が１から
    ２n-1になるまで繰り返し、２n-1個の反応産物を製造す
    る。 （２ａ）目的配列の５’側から２ｊ−１番目の部分配列
    を有するオリゴマーと、２ｊ番目の部分配列に相補的な
    塩基配列を有するオリゴマーとを用いて、これらのオリ
    ゴマーがプライマー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行
    い、ＤＮＡを合成する。 （３）下記（３ａ）の工程を、ｉ（ｉは整数）が２から
    ｎになるまで繰り返す。 （３ａ）下記（３ａｉ）の工程を、ｋ（ｋは整数）が１
    から２n-iになるまで繰り返して、２n-i個の反応産物を
    製造する。 （３ａｉ）目的配列の５’側から２i・（ｋ−１）＋１
    番目〜２i・（ｋ−１／２）番目の部分配列を含むＤＮ
    Ａを含む反応液と、２i・（ｋ−１／２）＋１番目〜２i
    ・ｋ番目の部分配列に相補的な配列を含むＤＮＡを含む
    反応液とを混合し、反応液に含まれるＤＮＡがプライマ
    ー且つ鋳型となる条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成す
    る。 （４）反応液から、目的配列から予想される長さを有す
    るＤＮＡを分離し、分離された二本鎖の配列決定を行い
    目的配列を有する二本鎖を選択する。
  3. 【請求項３】 （２ａ）及び（３ａｉ）の工程におい
    て、次の工程に必要な１本鎖が他方の１本鎖よりも多く
    合成されるように、反応液に加えるオリゴマーの比、又
    は、混合する反応液との比を調整する請求項２記載の製
    造法。
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