JP2007534303A5 - - Google Patents

Claims (43)

1. DNA配列を合成する方法であって、
   （i）該DNA配列を、隣接する断片が重複する領域を含む、小さいDNA断片に繰り返し分割すること；および
   （ii）隣接するDNA断片に対する優先的なハイブリダイゼーションを容易にし、かつ、他のDNA断片に対する所望されないハイブリダイゼーションを避けるために、それぞれの繰り返し分割から生じるDNA断片の配列を最適化すること
   を含むDNA配列を合成する方法。
2. さらに、以下の工程を含む請求項１に記載の方法：
   （iii）一本鎖DNAの任意の前記隣接する断片の重複する領域が相補的である、最適化された小さいDNA断片を得ること；
   （iv）次に大きいDNA断片の分割に由来するDNA断片を組み合わせること；
   （v）DNA断片を自己集合させて、二本鎖の重複部領域によってつながれた一本鎖DNAセグメントを含むDNA構築物を形成させること；
   （vi）次に大きいDNA断片を前記DNA構築物から作製すること；および
   （vii）工程（iv）、工程（v）および（vi）を工程（i）における繰り返し分割の逆の順序で繰り返して、DNA配列を作製すること。
3. 次に大きいDNA断片がDNA分子の混合物を含み、かつ、前記方法がさらに、
   正しいDNA配列を有することが考えられるDNA分子を前記混合物から選択すること、および
   選択されたDNA分子をDNA配列の合成において使用すること
   を含む、請求項2に記載の方法。
4. DNA分子がクローニングによって前記混合物から分離される、請求項3に記載の方法。
5. 前記選択が、前記混合物に由来するDNA分子のサンプルを配列決定すること、および、所望するDNA配列を有するDNA分子を選択することを含む、請求項3に記載の方法。
6. 前記選択が、前記混合物に由来するDNA分子のサンプルの各メンバーからポリペプチドを発現させること、前記ポリペプチドの分子量を決定すること、および、所定の分子量を有するポリペプチドを発現させるDNA分子を選択することを含む、請求項3に記載の方法。
7. 開始コドンおよび／または停止コドンが、ポリペプチドを発現させるDNA分子に組み込まれている、請求項6に記載の方法。
8. 前記DNA分子の読み枠が開始コドンおよび／または停止コドンに関して調節されている、請求項7に記載の方法。
9. 前記DNA分子のサンプルの各メンバーが発現ベクターに挿入され、かつ、前記発現ベクターは停止コドンを挿入されたDNA分子の下流側に含む、請求項6に記載の方法。
10. 前記ポリペプチドの分子量が電気泳動によって決定される、請求項6に記載の方法。
11. 前記DNA配列が調節配列を含む、請求項1に記載の方法。
12. 前記DNA配列が遺伝子間配列を含む、請求項1に記載の方法。
13. 前記DNA配列がポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
14. 前記ポリペプチドが全長のタンパク質である、請求項13に記載の方法。
15. DNA配列を小さいDNA断片に分割することが1回の分割で行われる、請求項1に記載の方法。
16. DNA配列を小さいDNA断片に分割することが複数回の分割で行われる、請求項1に記載の方法。
17. 前記DNA配列が約1，500塩基以下の長さのDNA断片に分割される、請求項16に記載の方法。
18. 前記小さいDNA断片が約60塩基以下の長さである、請求項1に記載の方法。
19. 前記小さいDNA断片が約50塩基以下の長さである、請求項18に記載の方法。
20. 前記重複する領域が約6塩基対から約60塩基対を含む、請求項1に記載の方法。
21. 最適化することが、DNA断片について融解温度を計算することを含む、請求項1に記載の方法。
22. 最適化することが、DNA断片についてハイブリダイゼーション性向に関係づけられるパラメーターを計算することを含む、請求項1に記載の方法。
23. 前記パラメーターが、自由エネルギー、エンタルピー、エントロピー、およびそれらの算術的または代数的な組合せからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
24. 最も低く融解する正しいハイブリダイゼーションの融解温度が、最も高く融解する正しくないハイブリダイゼーションの融解温度よりも少なくとも1℃高い、請求項21に記載の方法。
25. 最も低く融解する正しいハイブリダイゼーションの融解温度が、最も高く融解する正しくないハイブリダイゼーションの融解温度よりも少なくとも4℃高い、請求項21に記載の方法。
26. 最も低く融解する正しいハイブリダイゼーションの融解温度が、最も高く融解する正しくないハイブリダイゼーションの融解温度よりも少なくとも8℃高い、請求項21に記載の方法。
27. 最も低く融解する正しいハイブリダイゼーションの融解温度が、最も高く融解する正しくないハイブリダイゼーションの融解温度よりも少なくとも16℃高い、請求項21に記載の方法。
28. 最適化することが、調節領域コンセンサス配列における縮重性を利用することを含む、請求項1に記載の方法。
29. 最適化することが直接的な塩基割り当てを含む、請求項1に記載の方法。
30. 最適化することが、隣接するDNA断片との間での境界点を調節することを含む、請求項1に記載の方法。
31. 最適化することが、サイレントなコドン置換を変更することを含む、請求項1に記載の方法。
32. 前記最適化された小さいDNA断片の少なくとも1つが合成である、請求項2に記載の方法。
33. 前記最適化された小さいDNA断片の少なくとも1つが一本鎖である、請求項2に記載の方法。
34. 一本鎖DNAセグメントが約0塩基〜約20塩基の長さを有する、請求項2に記載の方法。
35. 次に大きいDNA断片が、前記DNA構築物をクローニングすることによって作製される、請求項2に記載の方法。
36. 前記クローニングが、エキソヌクレアーゼIIIクローニング、トポイソメラーゼクローニング、制限酵素クローニングおよび相同組換えクローニングからなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
37. 次に大きいDNA断片が、前記DNA構築物を連結することによって作製される、請求項2に記載の方法。
38. 次に大きいDNA断片が、DNAポリメラーゼを使用する反応によって前記DNA構築物を伸長することによって作製される、請求項2に記載の方法。
39. 前記DNAポリメラーゼがプルーフリーディングDNAポリメラーゼである、請求項38に記載の方法。
40. DNAポリメラーゼプライマーを、次に大きいDNA断片の分割に由来するDNA断片と混合することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
41. 重複する領域の中に制限部位を設計することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
42. 前記制限部位を部位特異的な制限酵素により消化することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
43. 請求項１から４２までのいずれかに記載の方法に従って合成されたDNA配列。