JP2002214091A - 試料凍結方法および冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡 - Google Patents
試料凍結方法および冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡Info
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Abstract
ることができる試料凍結方法を提供すること。 【解決手段】 オペレータは、液体窒素で冷却されたキ
ャップ7を冷却ホルダ本体1のキャップ用溝2にはめ込
む。試料10がキャップ7で覆われると、キャップ7内
の試料まわり雰囲気中に存在している水分子は、冷却さ
れたキャップ7の内面にトラップ(吸着)される。次に
オペレータは、冷却ホルダ本体1のピンセット差込穴6
にピンセット13を差込み、キャップ7が取付けられた
冷却ホルダ本体1を液体窒素に浸す。すると、冷却ホル
ダ本体1は極低温に冷却され、試料10は凍結する。こ
の方法によれば、キャップ内の水分子をキャップ内面に
トラップさせた後で冷却ホルダ本体1を冷却するように
しているので、試料が凍結しても試料表面に霜が付くこ
とはない。
Description
料の観察に用いて最適な試料凍結方法および冷却ホルダ
並びに走査電子顕微鏡に関する。
鏡(SEM:ScanningElectron Microscope)で観察する
際、その試料はできるだけ生体時に近い状態に維持する
必要がある。しかし、生物試料はその70〜90数%が
水分であり、試料を摘出後そのまま走査電子顕微鏡内に
挿入すれば装置内が真空のため、水分が気化し乾燥によ
る収縮変形を起こすことが多い。
で観察する場合、液体窒素で試料を冷却する機構を備え
た走査電子顕微鏡を用意し、その走査電子顕微鏡で生物
試料を凍結乾燥させながら観察することが行われてい
る。この場合、試料中の水分は凍結されたままとなり長
時間形態を維持し観察できる利点がある。
では、液体窒素で試料を冷却する機構を備えなければな
らず、その分コストアップとなる。さらに、この走査電
子顕微鏡では、凍結試料表面に付着した霜を除去するた
めのヒーターを備えているが、このようなヒーターの設
置もコストアップにつながっている。
として特公昭51−16252がある。この発明は、生
物試料を試料ホルダ上に保持して試料ホルダと共に液体
窒素に浸して凍結させ、その液体窒素中で凍結試料を蓋
体で包囲し、その後蓋体で包囲された凍結試料を走査電
子顕微鏡の予備室に導入し、その予備室において蓋体を
開けるようにしたものである。この発明を利用すれば、
走査電子顕微鏡に試料冷却機構を備える必要はなく、ま
た、霜取り用のヒーターも走査電子顕微鏡に備える必要
はない。
−16252の発明においては、生物試料を液体窒素に
完全に浸して凍結させるので、液体窒素中で生物試料が
試料ホルダから外れてしまうことがある。
いては、前記蓋体は試料ホルダから取外せないようにな
っており、試料観察中においても蓋体は試料ホルダに付
いたままである。このため、試料傾斜を行ったときに蓋
体が対物レンズなどに当たってしまい、試料傾斜におい
て制限を受けたり、場合によっては対物レンズや試料ホ
ルダが破損してしまう。
おいては、冷却された試料ホルダと、試料観察室の試料
ステージ間の断熱対策は行われていない。このため、試
料ステージ側の熱が試料ホルダに伝わると、試料中の水
分が急激に気化し、長時間にわたって水分を含んだ状態
での試料観察を行えなくなる。一方、試料ホルダ側の熱
が試料ステージに伝わって試料ステージが冷却される
と、試料ステージが熱ドリフトし、観察視野が大きく変
動してしまう。
ので、その目的は、生物試料を霜を付着させずに安全に
凍結させることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行
うことができる試料凍結方法および冷却ホルダ並びに走
査電子顕微鏡を提供することにある。
発明の試料凍結方法は、試料を冷却ホルダ本体に取付
け、前記試料を覆うように、冷却されたキャップを前記
冷却ホルダ本体に取付け、そのキャップが取付けられた
冷却ホルダ本体を冷却して前記試料を凍結させることを
特徴としている。
施の形態について説明する。
たものである。
り、冷却ホルダ本体1の形状は円柱状であって、冷却ホ
ルダ本体1は蓄熱性が良いたとえば黄銅(真ちゅう)で
作られている。そして、リング状のキャップ用溝2が冷
却ホルダ本体1の上面に形成されており、この溝2の内
側上面Sは粗めのサンドペーパーでこすられて、カーボ
ンテープ剥離防止溝3がその上面Sに形成されている。
の尖った3本の断熱ピン(断熱部材)4a,4b,4c
(4cは図1に示されていない)が取付けられている。
これら3本の断熱ピンは、熱絶縁部材であるたとえばテ
フロン(登録商標)で作られている。
端の尖った2本の断熱ピン(断熱部材)5a,5bとビ
ス受け5cが取付けられている。これら2本の断熱ピン
とビス受け5cは、熱絶縁部材であるたとえばテフロン
で作られている。また、冷却ホルダ本体1の側面には、
2つのピンセット差込穴6が開けられている。
た図であり、前記断熱ピン5a,5bとビス受け5c
は、冷却ホルダ本体1の側面に120度間隔で取付けら
れている。
このキャップ7の径は前記溝2の径とほぼ同じであり、
キャップ7は溝2にはめ込めるようになっている。そし
て、中空状のキャップ7は蓄熱性が良いたとえばSUS
(ステンレススチール)で作られており、つまみ8がキ
ャップ7の上面中央部分に取付けられている。このつま
み8は、磁性材であるたとえば鉄で作られている。図3
はキャップ7の断面を示したものであり、この図に示す
ように、キャップ内面は凹凸ができるように加工されて
いる。
ダが構成されている。なお、図1において、9はカーボ
ンの両面テープ、10はカビなどの生物試料、11は液
体窒素12を入れた容器、13はピンセットである。
結の手順について説明する。
カーボンの両面テープ9を冷却ホルダ本体1のキャップ
用溝2の内側上面Sに張り付ける。次にオペレータは、
その張り付けたカーボンテープ9の上に生物試料10を
取付ける。
取付けがすむと、オペレータは、キャップ7のつまみ8
をピンセット13でつまんで、キャップ7を容器11中
の液体窒素12に浸す。そしてオペレータは、適当な時
間を待ってからキャップ7を液体窒素12中から取り出
し、冷却されたキャップ7を図4に示すように、冷却ホ
ルダ本体1のキャップ用溝2にはめ込む。
ると、キャップ7内の試料まわり雰囲気中に存在してい
る水分子は、冷却されたキャップ7の内面にトラップ
(吸着)される。このとき、図3に示したように、キャ
ップ内面は表面積が増すように凹凸に加工されているの
で、キャップ7内のほぼ全ての水分子がキャップ内面に
トラップされる。また、冷却されたキャップ7によっ
て、キャップ7の外側面に対向するキャップ用溝2の表
面も冷却されるので、キャップ7の外の水分子がキャッ
プ7内に侵入しようとしても、その水分子は全て溝2の
表面またはキャップ7の外面でトラップされる。
ンセット差込穴6にピンセット13を差込み、冷却され
ているキャップ7が取付けられた冷却ホルダ本体1をピ
ンセット13を用いて液体窒素12に浸す。図5は、冷
却ホルダ本体1が液体窒素12に浸されている状態を示
した図であり、この図に示すように、冷却ホルダ本体1
の中間位までが液体窒素12に浸されている。
で液体窒素温度に冷却され、そして試料10は凍結す
る。
の手順について説明したが、この凍結方法によれば、試
料10を覆うように冷却されたキャップ7を冷却ホルダ
本体1に取付け、キャップ内の水分子をそのキャップ内
面にトラップさせた後で冷却ホルダ本体1を冷却するよ
うにしているので、試料が凍結してもその試料表面に霜
が付くことはない。
ホルダ本体表面にカーボンテープ剥離防止溝3が形成さ
れていて、カーボンテープ9はその溝3にしっかりと食
い込んでいる。このため、冷却ホルダ本体1が液体窒素
で冷やされてカーボンテープ9が冷却されても、カーボ
ンテープ9が冷却ホルダ本体1から剥がれることはな
い。逆にこのような溝3を設けないと、冷却されたカー
ボンテープ9は粘着性を失って、金属の冷却ホルダ本体
1から簡単に剥がれてしまう。
によれば、試料を液体窒素に全く浸さずに凍結させるの
で、液体窒素中で試料が冷却ホルダから外れるというこ
とはない。
用いた本発明の凍結方法によれば、生物試料を霜を付着
させずに安全に凍結させることができる。
ルダを走査電子顕微鏡で観察するまでの手順について説
明する。
3を用いて冷却ホルダ本体1を液体窒素12から取り出
し、冷却ホルダを図6に示すように試料ホルダ14に取
付ける。
cが試料ホルダ14のビス穴15に一致するように冷却
ホルダが試料ホルダ14に取付けられ、オペレータは、
ビス16をビス穴15にねじ込んでビス受け5cに当接
させる。このようなビス固定により、冷却ホルダ本体1
は試料ホルダ14に固定される。この固定状態において
は、冷却ホルダ本体1は、前記断熱ピン(4a〜4c,
5a,5b)とビス受け5cによって試料ホルダ14と
熱絶縁されているので、試料ホルダ側の熱は冷却ホルダ
本体1に伝わらない。
(図6には示されていない)が設けられており、図6に
示すように、交換棒(キャップ取外し手段)17の先端
がそのネジ穴にねじ込まれて取付けられている。交換棒
17の先端には電磁石18が設けられており、この電磁
石18は、交換棒の内部に引かれた電線19を介して電
源20に電気的に接続されている。この電源20は交換
棒の取手部分に取付けられていて、内部に電池を備える
と共に電磁石への通電をオンオフするスイッチSWを備
えている。
ホルダに取付けると、図7に示すように、試料ホルダ1
4を保持した交換棒17を走査電子顕微鏡の予備室チャ
ンバ21に取付ける。このとき、試料ホルダ14は、予
備室22に設けられた受け台23に取付けられる。
の観察室チャンバ24に取付けられており、前記予備室
22は、観察室チャンバ24の仕切弁25が開けられる
と観察室26に連通するようになっている。これら予備
室22と観察室26は、図示していない排気装置によっ
て排気されるように構成されている。
換棒17を予備室チャンバ21に取付けると、予備室2
2を排気する排気装置を動作させると共に、交換棒17
を回転させて試料ホルダ14から外す。なお、このと
き、仕切弁25は閉じられている。
と、オペレータは電源スイッチSWをオンにし、交換棒
17を操作して、磁化された電磁石18をキャップ7の
つまみ8上に持ってくる。すると、つまみ8は磁性材で
作られているので、つまみ8は電磁石18に吸着され
る。そしてオペレータは、交換棒17を操作してキャッ
プ7を冷却ホルダ本体1から取外し、取外したキャップ
7を台27上に置いてから電源スイッチSWをオフにす
る。
ホルダ14に取付け、前記仕切弁25を開けて、交換棒
17を操作して試料ホルダ14を観察室26の試料ステ
ージ(図示せず)に取付ける。その後、交換棒17が試
料ホルダ14から外され、交換棒17が観察室26から
引き出されてから仕切弁25が閉じられる。
試料ステージに取付けられると、低真空状態にある観察
室26において試料のSEM観察が行われる。この際、
上述したように、冷却ホルダ本体1は、前記断熱ピン
(4a〜4c,5a,5b)とビス受け5cによって試
料ホルダ14と熱絶縁されているので、試料ステージ側
の熱が試料ホルダ14を介して冷却ホルダ本体1に伝わ
ることはない。このため、試料10中の水分はかなり長
い時間をかけて気化し、長時間にわたって水分を含んだ
生体時の状態での試料観察を行うことができる。
と熱絶縁されているので、冷却ホルダ本体1側の熱が試
料ホルダ14を介して試料ステージに伝わることはな
い。このため、試料ステージが冷却されて熱ドリフトす
ることはなく、良好な試料観察および写真撮影を行うこ
とができる。
試料10はカーボンテープ9に取付けられているが、カ
ーボンは導電性があってイオンをためない。このため、
電子線照射時にカーボンテープはチャージアップせず、
良好な試料像を得ることができる。
けると、電子線照射を行ったときに、金属である冷却ホ
ルダ本体1からの反射電子量が試料からの反射電子量よ
りもかなり多くなり、得られた試料部分の反射電子像が
暗くなることがある。一方、カーボンテープを用いる
と、冷却ホルダ本体1からの反射電子放出を抑えること
ができ、試料に関する良好なコントラストの反射電子像
を得ることができる。
はこの例に限定されるものではなく、種々の変形が考え
られる。
の代わりに、図8に示すような冷却ホルダ本体28を用
いるようにしても良い。
8には、ホルダ取付穴29が中央に開けられていると共
に、その穴29に直交および通ずるようなビス穴30が
開けられている。そして、この冷却ホルダ本体28を用
いた冷却ホルダにおいては、たとえば黄銅またはアルミ
ニウムで作られた円筒状の試料ブロック(試料保持ホル
ダ)31が用意されており、試料ブロック31の上面S
0は粗めのサンドペーパーでこすられてカーボンテープ
剥離防止溝が形成されている。この試料ブロック31は
前記ホルダ取付穴29に落とし込まれて、ビス32によ
って冷却ホルダ本体28に固定される。
同じものには図1と同じ番号が付けられている。
合には、生物試料はカーボン両面テープによって前記試
料ブロック上面S0に取付けられ、前記図4〜7を用い
て説明した手順で試料凍結およびSEM観察が行われ
る。
物試料を凍結乾燥させるときには、オペレータは、生物
試料が取付けられた冷却ホルダ本体28を液体窒素に浸
して試料を凍結させ、その冷却された冷却ホルダ本体2
8を試料ホルダにセットしてからSEM観察室の試料ス
テージに装着し、観察室を排気するという手順で試料を
凍結乾燥させる。この場合にも、冷却ホルダ本体28は
試料ホルダと熱絶縁され、また、小型の試料ブロック3
1は冷却ホルダ本体28からの冷熱によって低温に冷却
されるので、乾燥時に冷熱を長時間必要とする生物試料
の凍結乾燥を容易に行うことができる。
31を冷却ホルダ本体28から外して試料に真空蒸着を
行えば、試料を高真空SEMで観察することができる。
に、フィルターを備えると共に注射器で吸引可能な試料
保持ホルダを用いるようにしても良い。この場合にオペ
レータは、生物試料をフィルター上に置いて試料保持ホ
ルダを注射器に取付け、注射器で水分を吸引して生物試
料をフィルター上に固定し、注射器から試料保持ホルダ
を外して図8に示したホルダ取付穴29にセットする。
そして、上述した手順で、凍結した試料のSEM観察や
生物試料の凍結乾燥、または真空蒸着後における高真空
SEMでの観察が行われる。
冷却ホルダ本体の内部を中空状に形成し、その空間に保
冷剤(例えばポリアクリル酸誘導体)を充填するように
しても良い。このようにすれば、試料を更に長い時間冷
却しておくことができる。
に3本の断熱ピンが設けられているが、この本数はこれ
に限定されるものではなく、たとえば4本設けるように
しても良い。同様に、冷却ホルダ本体の側面に設けられ
る断熱ピンについてもその本数は2本に限定されるもの
ではなく、たとえば90度間隔に3本設けるようにして
も良い。
によれば、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させ
ることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行うことが
できる。
る。
である。
である。
ある。
ある。
ある。
ある。
る。
ーボンテープ剥離防止溝、4a,4b,4c,5a,5
b…断熱ピン、5c…ビス受け、6…ピンセット差込
穴、7…キャップ、8…つまみ、9…カーボンテープ、
10…試料、11…容器、12…液体窒素、13…ピン
セット、14…試料ホルダ、15,30…ビス穴、1
6,32…ビス、17…交換棒、18…電磁石、19…
電線、20…電源、21…予備室チャンバ、22…予備
室、23…受け台、24…観察室チャンバ、25…仕切
弁、26…観察室、27…台、28…冷却ホルダ本体、
29…ホルダ取付穴、31…試料ブロック
Claims (11)
- 【請求項1】 試料を冷却ホルダ本体に取付け、前記試
料を覆うように、冷却されたキャップを前記冷却ホルダ
本体に取付け、そのキャップが取付けられた冷却ホルダ
本体を冷却して前記試料を凍結させることを特徴とする
試料凍結方法。 - 【請求項2】 前記冷却ホルダ本体を冷媒中に浸して冷
却するようにしたことを特徴とする請求項1記載の試料
凍結方法。 - 【請求項3】 試料を取付けるための冷却ホルダ本体
と、その冷却ホルダ本体に取付けられる試料を覆うため
に、その冷却ホルダ本体に取外し可能に取付けられるキ
ャップと、前記冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断
熱部材を備えたことを特徴とする冷却ホルダ。 - 【請求項4】 前記キャップをはめ込むためのキャップ
用溝が前記冷却ホルダ本体に形成されていることを特徴
とする請求項3記載の冷却ホルダ。 - 【請求項5】 前記断熱部材は先端の尖った断熱ピンで
あり、その断熱ピンは冷却ホルダ本体の側面および底面
にそれぞれ複数取付けられていることを特徴とする請求
項3記載の冷却ホルダ。 - 【請求項6】 前記冷却ホルダ本体の内部に保冷剤が充
填されていることを特徴とする請求項3から5の何れか
に記載の冷却ホルダ。 - 【請求項7】 試料を保持するための試料保持ホルダ
と、その試料保持ホルダを取付けるための冷却ホルダ本
体と、その冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断熱部
材を備えたことを特徴とする冷却ホルダ。 - 【請求項8】 前記断熱部材は先端の尖った断熱ピンで
あり、その断熱ピンは冷却ホルダ本体の側面および底面
にそれぞれ複数取付けられていることを特徴とする請求
項7記載の冷却ホルダ。 - 【請求項9】 前記冷却ホルダ本体の内部に保冷剤が充
填されていることを特徴とする請求項7または8に記載
の冷却ホルダ。 - 【請求項10】 試料観察室に連通する予備室を備えた
走査電子顕微鏡において、次の(a)〜(c)の構成を
有する冷却ホルダを備えると共に、(a)試料を取付け
るための冷却ホルダ本体(b)その冷却ホルダ本体に取
付けられる試料を覆うために、その冷却ホルダ本体に取
外し可能に取付けられるキャップ(c)前記冷却ホルダ
本体の表面に取付けられた断熱部材前記冷却ホルダが前
記予備室に配置されたときに、前記キャップを冷却ホル
ダ本体から取外すキャップ取外し手段が前記予備室に設
けられていることを特徴とする走査電子顕微鏡。 - 【請求項11】 前記キャップ取外し手段は電磁式の吸
着機能を有すると共に、前記キャップは磁性材で作製さ
れており、前記キャップはキャップ取外し手段により吸
着されて冷却ホルダ本体から取外されることを特徴とす
る請求項10記載の走査電子顕微鏡。
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