JP2002199882A - スナネズミ由来の酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 芳香族ジケトン化合物に対して不斉還元能を
示し、たとえばベンジルに適用した場合には（Ｓ）−ベ
ンゾインを立体選択的に生成する、スナネズミ由来の酸
化還元酵素、同酵素をコードする新規遺伝子、同遺伝子
を含有する組換えベクター、同ベクターによって形質転
換された形質転換体および同酵素の製造方法をそれぞれ
提供すること。 【解決手段】 スナネズミから酸化還元酵素遺伝子をク
ローニングした。得られた遺伝子をベクターに挿入して
組換えベクターを作製し、同ベクターで形質転換した形
質転換体を得ることができた。ついで、該組換えベクタ
ーにより形質転換した形質転換体を培養し、培養物から
酸化還元酵素を採取することにより、酸化還元酵素を得
ることができた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素に関
する。詳しくは、スナネズミ（学名Meriones unguicula
tus）由来の酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝
子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクターで形質転
換した形質転換体および同酵素の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セピアプテリン還元酵素（以下、ＳＰＲ
と略称する）は、短鎖還元酵素／脱水素酵素ファミリー
に属し、葉酸代謝において、セピアプテリンからテトラ
ヒドロプテリンをデノボ（de novo）合成するための最
終酵素である。ＳＰＲは、ヒト、マウスおよびラットな
どについてその遺伝子が同定されている。さらに、ラッ
ト赤血球由来のＳＰＲは、セピアプテリンだけではな
く、ベンジルおよび１−フェニル−１，２−プロパンジ
オンなども還元する活性を有することが報告されている
（スエオカ（Sueoka）ら、Biochim. Biophys. Acta、第
８４３巻、１９３〜１９８頁、１９８５年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、芳香族ジケ
トン化合物に対して還元能を有し、たとえばベンジルを
不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成することができ
るスナネズミ由来の新規酸化還元酵素、同酵素をコード
する遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクター
で形質転換した形質転換体および同酵素の製造方法を提
供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先願の特
願２０００−２５７８２９において、芳香族ジケトン化
合物に対し還元能を有したバチラス セリウス（Bacill
us cereus）由来の酸化還元酵素、同酵素をコードする
新規遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクター
により形質転換した形質転換体および同形質転換体を培
養することを特徴とする該酸化還元酵素の製造法を各々
提供した。その中で、バチラス セリウス由来の酸化還
元酵素のアミノ酸配列は、機能は未知であるがＳＰＲに
類似性を有したバチラス ズブチルス（Bacillus subti
lis）のｙｕｅＤ遺伝子でコードされるアミノ酸配列に
対して、４０％の相同性を有するという知見を得た。

【０００５】この知見に基づき、本発明者らがスナネズ
ミを用いてＳＰＲに相当する遺伝子のスクリーニングを
行なったところ、配列番号１に記載の１５番目から８０
３番目までの塩基配列でコードされるタンパク質が、芳
香族ジケトン化合物に対して還元能を有し、たとえばベ
ンジルを不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成するこ
とを見出した。

【０００６】したがって、本発明者らは、以下に示す発
明を提供することで、前記課題を解決するものである。 （１）配列番号２示したアミノ酸配列を有する酸化還元
酵素、（２）配列番号１に記載の１５番目から８０３番
目までの塩基配列でコードされる酸化還元酵素、（３）
配列番号１に記載の１５番目から８０３番目までの塩基
配列を有する酸化還元酵素遺伝子、（４）配列番号２に
示したアミノ酸配列をコードする酸化還元酵素遺伝子、
（５）配列番号２に示したアミノ酸配列において１もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または
付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸化還元能を有
するタンパク質、（６）前記（３）または（４）記載の
遺伝子を含有する組換えベクター、（７）前記（６）記
載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（８）宿主細胞が微生物である前記（７）記載の形質転
換体、（９）前記微生物が大腸菌である前記（８）記載
の形質転換体、および（１０）前記（７）、（８）また
は（９）記載の形質転換体を培養し、培養物から酸化還
元酵素を採取することを特徴とする酸化還元酵素の製造
方法に関する。

【０００７】本発明にかかる前記酸化還元酵素、同酵素
をコードする遺伝子および同遺伝子を含有するベクター
は、以下に説明する実施の態様に基づいて得ることがで
き、また形質転換体の製法および酸化還元酵素の製造方
法も、以下に示す実施の態様に基づいて実施することが
できる。以下、本発明について詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明にかかるスナネズミ由来の
酸化還元酵素遺伝子としては、当該酵素の酸化還元活性
を付与するものであればどのようなものでもよい。たと
えば、配列番号１に記載の１５番目から８０３番目まで
の当該遺伝子の塩基配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換、挿入または付加された配列を作製する
ことは、当業者にとって極めて容易である。また、当該
遺伝子の５’末端側にプロモーターやエンハンサーをと
いった塩基配列を付加すること、および／または３’末
端側にポリＡ付加シグナル塩基配列を付加することも当
業者にとって極めて容易である。また本発明は、配列表
１の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたポ
リメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略称する）を実施す
ることにより得られ、かつ酸化還元能を有するタンパク
質を規定するＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをも含
む。

【０００９】本発明にかかるスナネズミ由来の酸化還元
酵素は、当該酵素の酸化還元活性を有するものであれば
どのようなものでもよい。たとえば、酸化還元酵素の検
出または精製を容易にするために、当該酵素のアミノ末
端側やカルボキシル末端側に別の蛋白質、たとえば大腸
菌のβ−ガラクトシダーゼまたはヒスチジンタグ、を周
知の遺伝子工学的手法などを用いて付加されたタンパク
質をも含む。また、本酸化還元酵素の機能をより深く解
析する為に、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方
法によって置換、欠失、挿入および／または付加できる
程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または
付加されたアミノ酸配列をも包含する。本発明は、この
ような当該酸化還元酵素の変異体も包含するものであ
る。さらに本発明は、配列番号１に示した塩基配列と相
補的な塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤ
ＮＡがコードするアミノ酸配列を有し、かつ酸化還元能
を有するタンパク質またはポリペプチドをも包含する。

【００１０】本発明の酸化還元酵素遺伝子をＰＣＲ法に
より得る場合には、当該遺伝子を含有する試料を、プラ
イマー、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシＡＴ
Ｐ、デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴＰおよびデオキシＣ
ＴＰ）ならびに緩衝液を含む溶液に加えた反応液を調製
する。当該ＰＣＲに用いるプライマーは、配列番号１の
塩基配列に基づいて、適宜設定することができる。な
お、ＰＣＲにより増幅した遺伝子をベクターに挿入する
ためには、プライマーの５’末端側に制限酵素の認識配
列を含むのが好ましい。当該制限酵素としては、認識配
列の出現する位置でＤＮＡ鎖を正確に消化することがで
きるという点で、ＩＩ型制限酵素、たとえば制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、Ｎ
ｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓ
ａｐＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩまたはＸｂａＩなどの認識
配列を選択するのが好ましい。当該制限酵素の認識配列
に加え、制限酵素による消化を助けるクランプ（clam
p）とよばれる数個の塩基を付加してもよい。ＰＣＲに
用いる試料としては、所望の遺伝子を含む試料であれば
いずれのものを用いてもよく、たとえばスナネズミの染
色体ＤＮＡ、同染色体のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ
ライブラリーまたは本発明の遺伝子を含むプラスミドを
用いることができる。なお、ＰＣＲに用いる耐熱性ポリ
メラーゼとは、至適温度が７０℃以上で、９０℃でも不
活しにくいＤＮＡ依存性５’→３’ＤＮＡ合成酵素であ
る。当該耐熱性ポリメラーゼとしては、たとえばＴａＫ
ａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商標、宝酒造株式会社製）を用
いることができる。

【００１１】当該遺伝子を増幅するためのＰＣＲ条件
は、当業者により適宜設定することができる。たとえば
９４℃で１分間インキュベーションした後、９４℃で１
分間および７２℃で３分間を１サイクルとしてこれを１
０サイクル、さらに９４℃で１分間、６５℃で２分間お
よび７２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１０サイ
クル、その上さらに９４℃で１分間、６０℃で２分間お
よび７２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１５サイ
クル行うことで実施することができる（Genes toCell
s、第５巻、１１１〜１２５頁、２０００年）。当該遺
伝子の塩基配列はＧＣを多く含むため、たとえばＰＣＲ
Ｘ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコＢＲ
Ｌ ライフテクノロジーズ社（GibcoBRL Life Technolo
gies）製）などを添加するとよい。

【００１２】遺伝子の増幅反応後、たとえば１．５％の
アガロースゲルを用いる電気泳動にてＰＣＲ産物を展開
し、目的のＤＮＡバンドを含む画分を切り出す。つい
で、たとえばＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド社
（BIO-RAD）製）を用いることにより、所望の遺伝子Ｄ
ＮＡを精製することができる。制限酵素の認識配列を含
むプライマーを用いた場合には、ＰＣＲにて増幅された
遺伝子に対して、当該プライマーに含まれた制限酵素の
認識配列を認識する制限酵素を作用させる。

【００１３】酸化還元酵素遺伝子を含有する組換えベク
ターは、制限酵素処理した前記遺伝子とべクターを２〜
５：１のモル比で混合してライゲーションすることによ
り製造することができる。すなわち、ベクターに制限酵
素を作用させて消化し、当該遺伝子を挿入するためのベ
クターを得る。制限酵素による消化反応の反応温度、反
応時間などの反応条件は、選択した酵素に応じて適宜条
件設定することができる。組換えベクターに用いるベク
ターに制約はなく、たとえばプラスミドベクター、バク
テリオファージベクター、レトロウイルスベクター、バ
キュロウイルスベクターまたはパピローマウイルスベク
ターなどをいずれも用いることができる。具体的には、
たとえばｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）、ｐＴ
ＹＢ−１またはｐＴＹＢ−１１（ニューイングランドＢ
ｉｏＬａｂｓ（登録商標）社（NEW ENGLAND BioLabs）
製）などを用いることができる。これらのベクターは、
必要とあればフェノール抽出などの精製手段により精製
し、さらにたとえばエタノール沈殿法などの濃縮手段に
より濃縮することができる。ベクター断片のセルフライ
ゲーションを防ぐために、たとえば仔牛小腸由来のアル
カリホスファターゼなどによるホスファターゼ処理を行
ってもよい。ついで、前記遺伝子とベクターを混合し、
該混合液にリガーゼ、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼ、を
作用させてライゲーションすることにより、組換えベク
ターを得ることができる。具体的には、市販のライゲー
ションキット、たとえばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔＶｅｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）またはＬ
ｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社
製）、を用いて規定の条件にてライゲーションを行うこ
とにより、組換えベクターを得ることができる。

【００１４】本発明の形質転換体は、前記組換えベクタ
ーを既知の形質転換法で宿主に導入することにより、得
ることができる。この形質転換は常法（たとえばMethod
s Enzymol.、第２０４巻、６３〜１１３頁、１９９１
年）により、好適に実施することができる。本発明にお
ける宿主細胞としては、前記組換えベクターが複製可能
なものであれば制限なく使用することができる。宿主細
胞の例としては、たとえば大腸菌および酵母のような微
生物、ｓｆ９株のような昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞の
ような動物細胞などを挙げることができる。具体的に
は、たとえば大腸菌ＤＨ５αまたはＥｐｉｃｕｒｉａｎ
Ｃｏｌｉ（登録商標） ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕ
ｓ（ＤＥ３）（ストラタジーン社（Stratagene）製）を
用いることができる。

【００１５】本発明のさらなる実施態様によれば、本発
明に係る酸化還元酵素は、前記酸化還元酵素遺伝子を含
有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培
養することによって、工業的に有利に製造することがで
きる。

【００１６】当該酵素生産に使用する形質転換体として
は、前記組換えベクターによる形質変換体をそのまま用
いることができる。また、前記組換えベクターの挿入断
片を新たな別の発現ベクターにサブクローニングしても
よいし、あるいは前記組換えベクターを新たな宿主細胞
に導入した形質転換体を用いることもできる。これらの
場合、適当な宿主細胞とベクターの選択、および使用方
法などは当業者に周知であり、それらの中から本発明に
係る酸化還元酵素遺伝子の発現に適した系を任意に選択
することができる。たとえばベクターと宿主細胞として
は、前記遺伝子クローニング工程で例示したものから選
択してもよい。

【００１７】当該形質転換体の培養条件は、宿主細胞に
より適宜選択でき、特定の条件に限定されるわけではな
い。培養は、通常この技術分野で用いられる培地および
培養条件下で行うことができる。たとえば炭素源として
は、グルコース、グリセロール、でんぷんなどを、窒素
源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、トリプト
ン、ペプトンなどを用いることができる。その他微量の
無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチア
ミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよ
い。これらの培地成分は本微生物の生育を阻害しない濃
度であればよい。培地は通常ｐＨ７．０〜７．５に調整
し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は本微生物が生
育し得る温度であればよく、通常は３０〜３７℃で培養
するのが好ましい。本微生物を液体培養する場合は、振
とう培養または通気撹拌培養が好ましい。培養時間は種
々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気
撹拌培養の場合は１２〜３６時間培養するのが適当であ
る。または、５５０〜６００ｎｍの吸光度が１〜６にな
るまで１５〜３７℃で培養した後、イソプロピルチオガ
ラクトシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を加えてさら
に培養することにより、酵素の発現を誘導してもよい。

【００１８】培養終了後、遠心分離、濾過または共沈な
どの通常の方法によって、培養液から菌体細胞壁などの
不溶物を除去した粗酵素液を得ることができる。あるい
は当業者に公知の手段により、該粗酵素液の濃縮液を得
ることもできる。このようにして得られた粗酵素液は、
さらに硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電点沈殿
法またはカラムクロマトグラフィーなどの通常の酵素精
製法を単独または組み合わせて用いることにより、精製
することもできる。

【００１９】当該酵素を用いる酸化還元反応は、周知の
方法にて実施することができる。また、該反応により得
られた産物も、周知の方法にて得ることができる。たと
えば、前記形質転換体を培養することにより酸化還元酵
素を発現させ、培養液中に基質を添加して酸化還元反応
を実施することができる。該反応の生成物は、たとえば
カラムクロマトグラフィーにて得ることができる。さら
に該生成物は、逆層クロマトグラフィーにて、高度に精
製することができる。当該生成物の収率および光学純度
は、周知の方法にて得ることができる。

【００２０】

【実施例】本発明を以下に実施例をあげて説明するが、
本発明は本実施例に限定されるものではない。

【００２１】実施例１ （１）プライマーの作製 公知のヒト、マウスおよびラットのＳＰＲ遺伝子の塩基
配列に基づいて、プライマーを設定した。これらのプラ
イマーは、公知の亜リン酸−トリエステル法により合成
した。該プライマーの配列は、５’−ＡＡＣＡＡＣＴＡ
ＣＴＧＧＧＣＮＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号３）およ
び５’−ＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＲＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧ
Ａ−３’（配列番号４）である。該塩基配列中、Ｎは
Ａ、Ｃ、ＴまたはＧを意味し、ＲはＡまたはＧを意味す
る。

【００２２】（２）スナネズミ肝臓の全ＲＮＡを用いた
逆転写ＰＣＲ スナネズミの肝臓から、公知の手法により全ＲＮＡを抽
出および精製した（チョムクジンスキ ピー（Chomczyn
ski, P.）、Anal. Biochem、第１６２巻、１５６〜１５
９頁、１９８７年）。ついで、該ＲＮＡを鋳型として用
い、逆転写反応（以下、ＲＴ反応と略称する）（西澤
ら、Genes to Cells、第５巻、１１１〜１２５頁、２０
００年）を実施した。すなわち、全ＲＮＡ１０μｇを、
７０℃で１０分間インキュベーションしたのちに急冷し
て熱変性させ、ついで、該溶液に１０ｍＭのｄＮＴＰ２
μｌ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ−ＲＡプライマー
（宝酒造株式会社製）１μｌ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ
ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商
品名、東洋紡績株式会社製）を１００ユニットおよび該
酵素の５倍濃縮緩衝液４μｌに純水を加えて全量２０μ
ｌとし、４７℃で１時間インキュベーションした。

【００２３】ついで、公知の方法（ガブラー ユー（Gu
bler, U.）ら、Gene、第２５巻、２６３〜２６９頁、１
９８３年）で、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、
ＲＴ反応終了後、当該反応により合成されたｃＤＮＡを
鋳型として用い、さらに以下のＰＣＲを行った。ＲＴ反
応後に回収したｃＤＮＡを１μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴ
Ｐ４μｌ、１０μＭの配列番号３と４のプライマーセッ
ト各５μｌ、ＧｅｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ニ
ッポンジーン株式会社製）を１．５ユニットおよび１０
倍濃縮ＧｅｎｅＴａｑユニバーサル緩衝液１０μｌに純
水を加えて全量１００μｌとした。該溶液を用いたＰＣ
Ｒは、９４℃で１分間および７２℃で２分間を１サイク
ルとしてこれを１０サイクル、さらに９４℃で１分間、
６５℃で２分間および７２℃で３０秒間を１サイクルと
してこれを１５サイクル、その上さらに９４℃で１分
間、６０℃で２分間および７２℃で３０秒間を１サイク
ルとしてこれを１５サイクル行うことで実施した。

【００２４】（３）ＤＮＡ断片の精製 ＰＣＲ終了後、反応液を２％のアガロースゲルを用いた
電気泳動により展開し、酸化還元酵素遺伝子のＰＣＲ産
物含有画分をゲルから切り出して、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅ
ｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品名、バ
イオラッド社製）によりＰＣＲ産物を回収した。すなわ
ち、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをＰｒｅｐ−Ａ−
Ｇｅｎｅ結合緩衝液１ｍｌに溶解し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇ
ｅｎｅのマトリックス２０μｌにＤＮＡを吸着させた。
ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄液６００μｌで２
回洗浄した後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中で５０℃で５分間
インキュベートし、ＤＮＡ断片を溶出して回収した。

【００２５】（４）組換えベクターの作製 回収したＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ（商標）−Ｔ Ｅａｓ
ｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を
用いて、ライゲーションした。すなわち、回収したＤＮ
Ａ断片５０ｎｇ、ｐＧＥＭ（商標）−Ｔ Ｅａｓｙ（プ
ロメガ社（Promega Corporation）製）５０ｎｇ、２×
Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、２０ｍＭ ジチオトレイトール（以下、ＤＴ
Ｔと略称する）、１ｍＭ ＡＴＰ、１０％ ポリエチレ
ングリコール）（プロメガ社製）５μｌおよびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（プロメガ社製）１μｌに純水を加えて全量
１０μｌとし、２２℃で１時間ライゲーションを実施し
て、組換えベクターを得た。

【００２６】（５）形質転換体の製法 当該組換えベクターで大腸菌ＤＨ５α株（ギブコＢＲＬ
ライフテクノロジーズ社製）のコンピテント細胞を形
質転換させた（Methods Enzymol.、第２０４巻、６３〜
１１３頁、１９９１年）。すなわち、組換えベクターを
含むライゲーション液１０μｌとＤＨ５α株のコンピテ
ント細胞２００μｌとを穏かに混和した後、氷中で３０
分間放置した。ついで、４２℃で１分間インキュベート
し、氷中で１分間冷却して形質転換体を得た。

【００２７】（６）ＤＮＡ断片の塩基配列決定 （５）にて得られた形質転換体にＳＯＣ培地（トリプト
ン２０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩化ナト
リウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２０ｍＭグルコー
ス）を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベートし
た。インキュベート後、該形質転換体の菌体溶液をアン
ピシリン含有ＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵
母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、寒天１
５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に塗布し、３７℃で一晩培養
し、酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体のコロニーを得
た。ついで、当該コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体
培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩
化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）３．５ｍｌにて
３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心操作により
菌体を回収した。ついで、市販のＦｌｅｘｉＰｒｅｐ
（商品名）Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク
社（Amersham Pharmacia Biotech）製）を用い、該菌体
からプラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、培養後に
菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ（１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸
（以下、ＥＤＴＡと略称する）、４００μｇ／ｍｌ Ｒ
ＮａｓｅＩ）２００μｌを添加し、ボルテックスにて懸
濁する。ついで、溶液ＩＩ（１Ｍ 水酸化ナトリウム、
５．３％（重量／容量）ＳＤＳ）２００μｌを添加し穏
かに混和した後、溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム、５Ｍ酢
酸）２００μｌを添加し混和した。遠心して得た上清に
対しイソプロパノール沈澱を行った後、遠心によりＤＮ
Ａの沈澱を得た。Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商品名）ＦＰ
（７Ｍグアニジン−塩酸、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１５０μｌを添加して
懸濁し、該ＤＮＡを溶解させた。ついで遠心して上清を
除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナトリウム、
６０％エタノール）２００μｌを添加して懸濁し、再び
遠心により沈澱を得た。該沈殿に７０％エタノール３０
０μｌを添加し、ボルテックスにて軽く撹拌した。再び
遠心して沈澱を得、沈澱を室内で１０分間乾燥させた。
ついで、ＴＥ緩衝液で溶出することによりＤＮＡを回収
し、さらにイソプロパノール沈澱法によりＤＮＡを濃縮
した。

【００２８】当該ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＡＢＩ Ｐ
ＲＩＺＭ（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、ピー
イーアプライドバイオシステムズ社（PE Applied Biosy
stems）製）を用い、プライマーとしてＳＰ６プライマ
ー（宝酒造株式会社製）またはＴ７プライマーを用いた
ジデオキシ法により、当該ＤＮＡ断片の５’側および
３’側から決定した。ジデオキシ法におけるＰＣＲ条件
は、９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間および６０℃
で４分間を１サイクルとしてこれを２８サイクル行うこ
とで実施した。

【００２９】その結果、４１５ｂｐの塩基配列が決定さ
れた。

【００３０】実施例２ （１）ｃＤＮＡの作製と増幅 ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（宝酒造株
式会社製）を用いて、実施例１（２）におけるＲＴ反応
により合成された二本鎖ｃＤＮＡの末端に、該キットに
含まれるＣＡカセットアダプターを連結した。ついで、
実施例１（１）にて作製したプライマーを用いて、以下
に示す５’−ＲＡＣＥ （Rapid Amplification of cDNA
Ends）および３’−ＲＡＣＥ（フローマン エム エ
ー（Frohman M.A.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、
第８５巻、８９９８〜９００２頁、１９８８年）を実施
することにより、該ｃＤＮＡからＳＰＲのｃＤＮＡ断片
を単離し、それぞれの断片の塩基配列を同定した。

【００３１】（２）５’−ＲＡＣＥによるＤＮＡ断片の
単離 ５’−ＲＡＣＥは以下の操作により行なった。（１）に
て調製した二本鎖ｃＤＮＡ２μｌ、２０μＭのプライマ
ー（配列番号４）１μｌ、ｃＤＮＡ ＰＣＲＬｉｂｒａ
ｒｙ Ｋｉｔ中のＣＡプライマー（宝酒造株式会社製）
２．５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ３μｌ、ＴａＫａＲ
ａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）０．４
μｌ、１０倍濃縮Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液１０μｌおよび１
０倍濃縮ＰＣＲＸ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ（ギブコＢＲＬ ライフテクノロジーズ社製）２０μ
ｌに純水を加えて全量１００μｌとし、ＰＣＲを行っ
た。当該ＲＡＣＥにおけるＰＣＲは、９４℃で１分間イ
ンキュベーションした後、９４℃で１分間および７２℃
で３分間を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さら
に９４℃で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分
間を１サイクルとしてこれを１５サイクル、その上さら
に９４℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分
間を１サイクルとしてこれを１０サイクル行うことで実
施した。

【００３２】（３）３’−ＲＡＣＥによるＤＮＡ断片の
単離 ３’−ＲＡＣＥは、１０倍濃縮ＰＣＲＸ Ｅｎｈａｎｃ
ｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用せず、配列番号３に示し
た塩基配列を有するプライマーおよびｃＤＮＡＰＣＲ
Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ中のＲＡプライマー（宝酒造株
式会社製）をプライマーとして用いたほかは、（２）記
載の５’−ＲＡＣＥと同様にして実施した。

【００３３】（４）組換えベクターの作製 （２）または（３）におけるＰＣＲ後の反応液を用いた
ほかは実施例１（３）と同様の方法にて、ＤＮＡ断片を
精製した。ついで、精製した当該ＤＮＡ断片をＤＮＡ断
片として用いたほかは実施例１（４）同様の方法にて、
それぞれのＤＮＡ断片を含有する組換えベクターを得
た。以下、５’−ＲＡＣＥにより得られたＤＮＡ断片を
含有する組換えベクターをｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃ、
また３’−ＲＡＣＥにより得られたＤＮＡ断片を含有す
る組換えベクターをｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｒとよぶ。

【００３４】（５）形質転換体の製法 （４）にて得られたｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃまたはｐ
ＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｒを組換えベクターとして用いた
ほかは実施例１（５）と同様の方法にて、それぞれの形
質転換体を得た。

【００３５】（６）ＤＮＡ断片の塩基配列決定、および
酸化還元酵素遺伝子の全塩基配列決定 （５）にて得られた当該形質転換体を形質転換体として
用いたほかは実施例１（６）と同様にして、ＰＣＲの試
料となるＤＮＡを調製した。ついで、ＳＰ６プライマー
（宝酒造株式会社製）およびＡＢＩ ＰＲＩＺＭ（商品
名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、ピーイーアプライドバ
イオシステムズ社製）を用いたジデオキシ法により、そ
れぞれのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。またＴ７プ
ライマー（宝酒造株式会社製）および該キットを用いた
ジデオキシ法により、それぞれのＤＮＡ断片の塩基配列
を逆方向からも決定した。その結果、それぞれのＤＮＡ
断片において、両側から決定した塩基配列は同じである
ことを確認した。

【００３６】決定した酸化還元酵素遺伝子の５’側およ
び３’側ＤＮＡ断片の塩基配列から、スナネズミ由来の
酸化還元酵素をコードする塩基配列を含む全塩基配列を
決定した。当該塩基配列を配列番号１に、当該酵素の推
定アミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、推定アミノ
酸配列は、配列番号１に記載の１５番目から８０３番目
までの塩基配列によりコードされる。

【００３７】実施例３ （１）ｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃからの挿入断片の増幅
および調製 実施例２（６）にて調製したｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃ
を用い、ＮｄｅＩおよびＮｃｏＩによる処理で得られる
断片を精製した。すなわち、二本鎖ｃＤＮＡの代わりに
ｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃを１０ｎｇ用い、プライマー
として配列表４および５に示したプライマーを用いたほ
かは、実施例２（２）の５’−ＲＡＣＥと同様にしてＰ
ＣＲを実施した。ＰＣＲ終了後、当該反応液を反応液と
して用いたほかは実施例１（３）と同様の方法にて、Ｄ
ＮＡ断片を精製した。該断片２μｇ、ＮｃｏＩ２０ユニ
ットおよび該酵素の緩衝液（宝酒造株式会社製）２μｌ
に純水を加えて全量２０μｌとして３７℃で２時間反応
させ、フェノール抽出およびエタノール沈澱により該Ｄ
ＮＡ断片を回収した。ついで、該ＤＮＡ断片、ＮｄｅＩ
２０ユニットおよび緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ 塩化ナトリウム）４μｌに純水を
加えて全量を４０μｌとし、３７℃で２時間反応させ、
ＤＮＡ断片を消化した。

【００３８】ついで、ＰＣＲ反応液のかわりに該ＤＮＡ
断片の溶液を用いたほかは実施例１（３）と同様の方法
にて、ＤＮＡ断片を精製した。

【００３９】（２）ｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｒからの挿
入断片の調製 ｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｒ２μｇ、ＮｃｏＩ２０ユニッ
トおよび緩衝液（宝酒造株式会社製）２μｌに純水を加
えて全量２０μｌとし、３７℃で２時間反応させ、フェ
ノール抽出およびエタノール沈澱により、該ＤＮＡ断片
を回収した。ついで、該ＤＮＡ断片、ＮｄｅＩ２０ユニ
ットおよび緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１Ｍ塩化ナトリウム）４μｌに純水を加えて全量を
４０μｌとし、３７℃で２時間反応させ、ＤＮＡ断片を
消化した。

【００４０】ついで、ＰＣＲ反応液のかわりに該ＤＮＡ
断片の溶液を用いたほかは実施例１（３）と同様の方法
にて、ＤＮＡ断片を精製した。

【００４１】（３）ベクターの調製 ２μｇのｐＭＮＴベクター（西澤ら、FEBS Lett.、第２
９９巻、３６〜３８頁、１９９２年）、制限酵素Ｎｄｅ
Ｉ２０ユニット、緩衝液（５００ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴ、１Ｍ塩化ナトリウム）２μｌおよび大腸菌由
来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）０．
６ユニットに純水を加えて全量２０μｌとし、３７℃で
２時間反応させることにより該ベクターを消化した。つ
いでフェノール処理およびエタノール沈澱を行い、該ベ
クターを調製した。

【００４２】（４）組換えベクターの作製 （１）にてｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｃから調製したＤＮ
Ａ断片、（２）にてｐＧＥＭ−ＭＧＳＰＲ−Ｒから調製
したＤＮＡ断片および（３）で調製したｐＭＮＴベクタ
ーを１：１：１のモル比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒ．１（商品名、宝酒造株式会社
製）を用いることにより、１６℃で１時間ライゲーショ
ンを行い、組換えベクターを得た。以下、当該組換えベ
クターをｐＴＭＧ−ＳＰＲとよぶ。

【００４３】（５）形質転換体の製法 （４）にて得られたｐＴＭＧ−ＳＰＲを組換えベクター
として用い、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（登録商
標） ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）（スト
ラタジーン社製）を宿主として用いたほかは実施例１
（５）と同様にして、形質転換体を得た。

【００４４】（６）酸化還元酵素の精製 （５）にて得られた形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍｌ加
え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベー
ト後、該形質転換体の懸濁液をアンピシリン含有ＬＢ寒
天培地に塗付して３７℃で一晩培養し、酸化還元酵素遺
伝子含有形質転換体のコロニーを得た。当該コロニーを
２５０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、
６００ｎｍの吸光度が１になるまで３７℃で振とう培養
した。ついで、培養液における最終濃度が０．４ｍＭと
なるようにＩＰＴＧを添加した後、該培養液をさらに３
７℃で９時間培養した。

【００４５】培養後、遠心して集菌した菌体を緩衝液
（２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ 塩化
ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ）２０
ｍｌに懸濁した後、超音波処理により菌体を破砕した。
該溶液を遠心して得られた上清に硫酸アンモニウムを加
え、４０〜５０％飽和沈澱したタンパク質を分離した。
ついで、該タンパク質を緩衝液（２０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ
ＤＴＴ）を用いて４℃で一晩透析した。

【００４６】透析後、該透析液をＤＥＡＥセファロース
（商標）（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に
注入した。ついで、３０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１
００ｍＭまたは２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝
液（２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ）を溶出液として該
カラムに適用し、透析物を段階的に溶出した。溶出した
それぞれの画分の１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により展開したところ、６０ｍＭ 塩化
ナトリウムを含む溶出液にて溶出された画分が単一のバ
ンドを与えた。該バンドの位置から推定されたタンパク
質の分子量は、配列番号２のアミノ酸配列から推定され
る分子量とほぼ同じであった。したがって、当該画分が
スナネズミ由来のＳＰＲであると予想された。なお、該
画分の総タンパク質量は１５０μｇであった。

【００４７】ＳＲＰと推定されるタンパク質および基質
を様々な混合比で反応させ、吸光度の変化を測定するこ
とにより、該タンパク質の還元活性を測定した（西澤
ら、Genes to Cells、第５巻、１１１〜１２５頁、２０
００年）。基質は、生理的基質としてセピアプテリン、
または人工基質としてベンジルもしくはフェニルプロパ
ンジオンを用いた。すなわち、当該精製タンパク質０．
５〜１．０μｇ／ｍｌ、２００μＭ 還元型のニコチン
アミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＰＨ）、１００ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）および１〜１
００μＭの基質を含む反応液１ｍｌを調製した。つい
で、３７℃で保温して吸光度の変化を測定し、該測定値
からＫ_m、ｋ_catおよびｋ_cat／Ｋ_mを算出した。なお、Ｋ
_mはミカエリス定数を、ｋ_catは酵素反応の触媒速度定数
を意味する。これらの結果を表１に示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】実施例４ 実施例３（４）にて得た形質転換体のコロニーを、アン
ピシリン含有ＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、６００
ｎｍの吸光度が５になるまで３７℃で培養した。つい
で、ＩＰＴＧおよび基質のベンジルを、最終濃度が各々
０．５ｍＭおよび１ｍＭとなるように添加した後、さら
に３７℃で２４時間培養した。培養終了後、培養液に酢
酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌し、遠心により酢酸エチ
ルの層を分離した。当該操作をさらに２回繰り返し、得
られた酢酸エチル層１２０ｍｌを濃縮した。得られた生
成物を、ヘキサン：エーテル：酢酸（容量比４５：５：
１）を展開溶媒としたシリカゲルのカラムにかけて、ベ
ンゾインの画分を分取した。さらに、逆層高速液体クロ
マトグラフィーにかけ、ベンゾインを高度に精製した。
収率は８０％、光学純度は９７％ｅｅ（Ｓ）−ベンゾイ
ンであった。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、芳香族ジケトン化合物に対し
て還元能を有し、たとえばベンジルを不斉還元して
（Ｓ）−ベンゾインを生成することができるスナネズミ
由来の新規酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、
同遺伝子を含有するベクター、同ベクターで形質転換し
た形質転換体および同酵素の製造方法を提供した。

【００５１】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：スナネズミ由来
の酸化還元酵素の遺伝子断片を得るためのプライマー。
配列中、ｎはａ、ｃ、ｔまたはｇである。 配列番号４：スナネズミ由来の酸化還元酵素の遺伝子断
片を得るためのプライマー。配列中、ｒはａまたはｇで
ある。 配列番号５：ＮｄｅＩ部位および開始コドンを含むスナ
ネズミＳＰＲに特異的なプライマー。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Arakawa Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha <120> Oxido-reductase derived from Mongolian gerbil, Gene encoding the enzyme, Transformant having the gene and Preparing the enzyme <130> JP-12484 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1208 <212> DNA <213> Meriones unguiculatus <400> 1 ggctgagttc cgtcatggag agcggagggc tgggctgcgc ggtctgcgtg ctgaccgggg 60 cctcccgggg cttcgggcgc gcgctggccc cgcggctggc gcagctgctg gcacccgggt 120 ccgtgctgct cctatgcgca cgcagcgact cggcgctgcg gcggctggag gaggagctgg 180 gcgcgcagca gcccggcctg cgagtggtgc gggccgcagc cgatctaggt accgaggccg 240 gcttgcggca ggtgctgcgc gcggtgcgcg agctccccaa gcccgagggg ctgcagcgcc 300 tgctgctcat caacaacgca ggcacccttg gagacatgtc caaaggcgtg ttgaacgtga 360 atgacccagc tgaggtgaac aactactggg ccctgaacct gacctccatg ctctgcttga 420 cctcgggcac cctgaatgcc ttcccagata gcccaggcct gagcaagact gtggttaaca 480 tctcatctct gtgtgccctg cagcccttca agggctgggg actgtactgc acagggaagg 540 ctgcccgaga catgctgtgc caggtcttgg ctgctgagga acccagtgtg agggtgctga 600 gctatgcccc aggtcccttg gacacagaca tgcagcagtt ggctcgggaa acctccatgg 660 acccagagtt acggaacaga ctgcagaggc tgaagtcgga gggggagctg gtggactgtg 720 ggacgtcagc ccagaaactg ctgaatttgc tgcagaagga caccttccag tctggagccc 780 acgtggactt ctatgacaat taagccccat gtcctgcccc agtgccccac acacaccaac 840 cctgcctaac acaagtataa gccctcagat atagccaaca ggttgtagct ggcattacca 900 ggcttctgta ggtgcctgag agagagttga tgggtattgg agttctctgt ccccaggaag 960 aaaattttag aactgggggc cgcaaaaatg aaaacactgg agagatgagg ttgagtatct 1020 tgtctttggt cagtctgtga ggtgaggagg gtgtggcctg atgcagaaag agggtgaggg 1080 catcacatgt gtgtgttcct tggatggggt gtctttgttc tgctgccttt tcctctggta 1140 ctcgctggtc ctcccccgac tctagtccaa atacataatt gtaaggcaga tgcaaaaaaa 1200 aaaaaaaa 1208 <210> 2 <211> 262 <212> PRT <213> Meriones unguiculatus <400> 2 Met Glu Ser Gly Gly Leu Gly Cys Ala Val Cys Val Leu Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Phe Gly Arg Ala Leu Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu Leu 20 25 30 Ala Pro Gly Ser Val Leu Leu Leu Cys Ala Arg Ser Asp Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Leu Glu Glu Glu Leu Gly Ala Gln Gln Pro Gly Leu Arg Val 50 55 60 Val Arg Ala Ala Ala Asp Leu Gly Thr Glu Ala Gly Leu Arg Gln Val 65 70 75 80 Leu Arg Ala Val Arg Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Gln Arg Leu 85 90 95 Leu Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Leu Gly Asp Met Ser Lys Gly Val 100 105 110 Leu Asn Val Asn Asp Pro Ala Glu Val Asn Asn Tyr Trp Ala Leu Asn 115 120 125 Leu Thr Ser Met Leu Cys Leu Thr Ser Gly Thr Leu Asn Ala Phe Pro 130 135 140 Asp Ser Pro Gly Leu Ser Lys Thr Val Val Asn Ile Ser Ser Leu Cys 145 150 155 160 Ala Leu Gln Pro Phe Lys Gly Trp Gly Leu Tyr Cys Thr Gly Lys Ala 165 170 175 Ala Arg Asp Met Leu Cys Gln Val Leu Ala Ala Glu Glu Pro Ser Val 180 185 190 Arg Val Leu Ser Tyr Ala Pro Gly Pro Leu Asp Thr Asp Met Gln Gln 195 200 205 Leu Ala Arg Glu Thr Ser Met Asp Pro Glu Leu Arg Asn Arg Leu Gln 210 215 220 Arg Leu Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Asp Cys Gly Thr Ser Ala Gln 225 230 235 240 Lys Leu Leu Asn Leu Leu Gln Lys Asp Thr Phe Gln Ser Gly Ala His 245 250 255 Val Asp Phe Tyr Asp Asn 260 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for obtaining a gene fragment of the oxido-reductase derived from Mongolian gerbil. In the sequence, n is a, c, t or g. <400> 3 aacaactact gggcnctgaa c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for obtaining a gene fragment of the oxido-reductase derived from Mongolian gerbil. In the sequence, r is a or g. <400> 4 agaagtccac rtgggctcca ga 22 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:specific primer to SPR of Mongolian gerbil, which comprises NdeI site and initiation codon <400> 5 ggaattccat atggagagcg gagggctggg ct 32

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者 丸山 励治 富山市寺町けや木台52 つかさハイツ寺町 203号 (72)発明者 糸井 泰 大阪府大東市南新田一丁目21−502 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA06 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL05 4B065 AA26X AA90Y AB01 BA02 CA28

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
   列を有する酸化還元酵素。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載の１５番目か
   ら８０３番目までの塩基配列でコードされる酸化還元酵
   素。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載の１５番目か
   ら８０３番目までの塩基配列を有する酸化還元酵素遺伝
   子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
   列をコードする酸化還元酵素遺伝子。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
   列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿
   入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、か
   つ酸化還元能を有するタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項３または４記載の遺伝子を含有す
   る組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターで形質転
   換された形質転換体。
8. 【請求項８】 宿主細胞が微生物である請求項７記載の
   形質転換体。
9. 【請求項９】 前記微生物が大腸菌である請求項８記載
   の形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項７、８または９記載の形質転換
    体を培養し、培養物から酸化還元酵素を採取することを
    特徴とする酸化還元酵素の製造方法。