JP2002181815A

JP2002181815A - 唾液成分の免疫学的測定法

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Publication number: JP2002181815A
Application number: JP2000378575A
Authority: JP
Inventors: Mitsuhiro Oshima; 光宏大島
Original assignee: Nihon University; Godo Shusei KK
Current assignee: Nihon University; Godo Shusei KK
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2002-06-26
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: JP4590581B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】洗口液で口腔内を漱いだ吐出液を、抗唾
液成分抗体に接触させることを特徴とする唾液成分の測
定法。【効果】本発明によれば、唾液に含まれる成分、特に
潜血を高精度かつ簡便、迅速に測定することが可能にな
った。また、本発明において、歯周病のスクリーニング
テストを特別な装置を必要とせずに一般診察室内あるい
は集団検診等で迅速に行うことが可能になった。さらに
は、受診者及び歯科医師の負担を軽減することが可能に
なった。本発明によって歯周病リスクグループの早期発
見を可能にしたことは、国民のＱＯＬ向上にとって有意
義である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、歯周病等の診断に
有用な唾液中の成分の免疫学的測定法及びこれに用いる
キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】歯周病の早期診断は、有効な早期治療を
可能にし、その結果、病変の重症化及び合併症を防止す
るうえで有用である。歯周病のスクリーニングテストが
具備すべき条件としては、（１）疾病や異常が精度良く
的確に把握できること、（２）簡便で結果が早くわかる
こと、（３）受診者になるべく苦痛を与えないこと、
（４）費用が安価であることなどが挙げられている。

【０００３】歯周病ポケットからの滲出液には、ハイド
ロキシプロリン、グリコサミノグリカンなどの細胞組織
崩壊マーカーや、プロスタグランディンＥ₂、インター
ロイキン１βなどの炎症メディエータ及びアミノトラン
スフェラーゼ、コラゲナーゼなどの酵素類が含まれてい
るので、当該滲出液は歯周病の優れた診断材料であるこ
とが知られている（ＣＤＡＪＯＵＲＮＡＬ２１巻
３５−４１頁１９９３年）。しかしながら、これらの
指標では歯周組織特異性が確認できない。また、滲出液
を採取して測定に供するための試料に調整するまでに
は、マウスリンスで唾液を除くことや遠心分離操作など
が必要（Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．Ｒｅｓ２５巻
２５７−２６７頁１９９０）であり、高価な装置及
び複数の操作を要することから、一般歯科診療室や集団
検診で行うことが出来る歯周病のスクリーニングテスト
としては未だ実用化されていない。

【０００４】このほかにも、採取した歯周ポケット滲出
液の病因微生物を分離して検出する方法や病因微生物由
来の酵素活性を測定する方法も報告されている（日本歯
周病学会誌３２巻２４９−２６０頁１９９０年）
が、歯周ポケットからの微生物の採取や酵素活性の測定
に時間がかかるという欠点があった。

【０００５】一方、歯肉にあるレベル以上の炎症がある
と歯周溝や歯周ポケットから出血がおこり、その結果、
唾液中に潜血が検出されることが報告されている（日本
歯周病学会誌１８巻４０６−４１３頁１９７６
年）。この潜血の濃度を潜血由来ヘモグロビンのペルオ
キシダーゼ様反応にて測定する試験紙は、すでに歯周病
診断用医薬品として発売されている。しかし、唾液中に
は好中球由来のミエロペルオキシダーゼや唾液ペルオキ
シダーゼが普遍的に存在しているために、潜血由来ヘモ
グロビンのペルオキシダーゼ様反応による測定は、偽陽
性を呈することが問題として指摘されていた。

【０００６】そこで、本発明者らはヒトヘモグロビンを
特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた試験紙に
よる唾液の潜血反応の測定を検討してきた（日本歯周病
学会誌４０巻１１１−１１８頁１９９８年）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血液成
分であるヒトヘモグロビンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いた試験紙による測定においても、唾液
の粘稠性のためサンプリングしにくく、クロマト法とし
て直接展開することが困難であること、及び充分な測定
精度を得るためには、採取した唾液を適正な濃度に均一
に希釈し赤血球を迅速に溶血させる処理（１９９７年日
本歯周病学会春季学術大会にて発表）が必要であること
など、一般歯科診療室及び集団検診で容易には実施でき
ないという問題があった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはヘモグロビ
ンに代表される唾液成分を一般歯科診療室等で簡便かつ
精度良く測定すべく種々検討した結果、唾液を直接検体
とするのではなく、あらかじめ洗口液で口腔内を漱いだ
吐出液を検体として用い、これを抗ヘモグロビン抗体に
代表される抗唾液成分抗体と接触させれば、唾液成分が
高精度かつ簡便、迅速に測定でき、歯周病等の診断が短
時間で行えることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００９】本発明は、洗口液で口腔内を漱いだ吐出液
を、抗唾液成分抗体に接触させることを特徴とする唾液
成分の測定法を提供するものである。また、本発明は、
洗口液及び抗唾液成分抗体を含む唾液成分測定用キット
を提供するものである。さらに、本発明は、洗口液及び
抗ヘモグロビン抗体を含む歯周病診断用キットを提供す
るものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明においては、検体として洗
口液で口腔内を漱いだ吐出液を用いる。かかる吐出液を
用いることにより、唾液を直接検体とした場合に比べ
て、唾液中のムチン等の粘質物による反応妨害を排除で
きるため反応が速やかになるとともに、抗体を多孔性担
体に担持して用いた場合の操作性が飛躍的に改善され
る。

【００１１】また、洗口液は低浸透圧液を用いるのが好
ましい。すなわち、例えば測定対象の唾液成分が、ヘモ
グロビン等のような赤血球内の成分の場合、洗口液とし
て低浸透圧液を用いると、赤血球がバーストすることに
より、ヘモグロビン等が溶出し、抗体との反応が速やか
に進行する。従って、低浸透圧液としては、赤血球内浸
透圧よりも低い液であればよく、例えば、水、低張食塩
水等が挙げられる。

【００１２】この洗口液としては、カチオン界面活性剤
を含有する水溶液が、唾液中のムチン等の粘質物を凝集
させて唾液の粘稠性を低下させる効果が高く、唾液中に
含まれている上皮細胞等の有形物による濁りを消失させ
る効果があることから、より好ましい。さらに、測定対
象がヘモグロビンの場合には、カチオン界面活性剤含有
水溶液を洗口液として用いると、前記のように赤血球の
バーストが速やかに進行するとともに、静菌作用により
口腔内に存在する微生物によるヘモグロビンの分解を防
止できるので、特に好ましい。

【００１３】カチオン界面活性剤としては、長鎖アルキ
ルピリジニウム塩、長鎖アルキルトリメチルアンモニウ
ム塩、長鎖アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、
ベンジルトリブチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチ
ルアンモニウム塩及びテトラブチルアンモニウム塩から
なる群から選ばれる少なくとも１種を用いるのが好まし
い。具体例としては、塩化セチルピリジニウム、塩化セ
チルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルジメチル
ベンジルアンモニウム、硫酸ベンジルトリブチルアンモ
ニウム、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、臭化テ
トラブチルアンモニウム等が挙げられ、このうち塩化セ
チルピリジニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウ
ム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムが特
に好ましい。

【００１４】洗口液中のカチオン界面活性剤濃度は０．
００５〜１重量％、特に０．０１〜１重量％が好まし
い。

【００１５】また、洗口液中には、上記カチオン界面活
性剤及び水以外に、グリセリン、プロピレングリコール
等の多価アルコール類、エタノール等の低級アルコー
ル、pH調整剤、香料等を配合することができる。

【００１６】口腔内の漱ぎに用いる洗口液の量は１〜１
０mLで十分である。

【００１７】抗唾液成分抗体としては、抗ヘモグロビン
抗体、抗トランスフェリン抗体等が挙げられる。このう
ち、抗ヘモグロビン抗体を用いれば、唾液中の潜血、す
なわちヘモグロビンが測定できることから、歯周病の診
断に有用である。抗ヘモグロビン抗体としては、抗ヒト
ヘモグロビンモノクローナル抗体が好ましい。

【００１８】吐出液と抗唾液成分抗体との接触は、吐出
液中の測定対象唾液成分と抗唾液成分抗体とが反応し、
生成した免疫複合体が検出できる方法であれば特に限定
されないが、抗唾液成分抗体を担持した多孔性担体を用
いる方法、ラテックス凝集法、ＥＩＡ法等が挙げられる
が、抗唾液成分抗体を担持した多孔性担体を用いる方法
が、反応時間の厳密な管理が不要である；判定が容易で
ある；多検体を同時に処理可能である；操作が簡便であ
る等の点で特に好ましい。

【００１９】抗唾液成分抗体を担持した多孔性担体とし
ては、例えば図１に示すようにスティック状多孔性担体
の下端に標識抗唾液成分抗体が担持され、当該部位と離
れた位置に捕捉試薬が固定化されているものが好まし
い。ここで、多孔性担体としては、前記吐出液が毛細管
現象により移動し得るものであればよく、例えば濾紙
（天然繊維濾紙、ガラス繊維濾紙等を含む）、セルロー
ス膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等が挙げられ
る。多孔性担体の方法は、制限されないが、例えば幅２
〜２０mm、長さ５０〜１５０mm、厚さ２０〜２０００μ
ｍが好ましい。抗体の標識としては蛍光発色性物質、放
射性同位元素を用いることもできるが、コロイド状金粒
子、染料粒子（分散染料、染料ゾル）等が直接目視可能
である点で特に好ましい。

【００２０】捕捉試薬としては、測定対象唾液成分に対
する第二抗体、抗唾液成分抗体に対する第二抗体等が挙
げられる。また、この捕捉試薬は多孔性担体上に固定さ
れているが、標識抗唾液成分抗体は多孔性担体上に移動
可能なように担持されている。

【００２１】多孔性担体の下端を吐出液中に浸すと、標
識抗唾液成分抗体が溶解し、吐出液中の測定対象唾液成
分と反応し免疫複合体が形成される。複合体は毛細管現
象により移動し、固定化された捕捉試薬に捕捉され、標
識が検出される（例えばコロイド状金粒子の場合赤紫色
に発色する）。この標識、例えば赤紫色のスポットを肉
眼で観察することにより唾液中の測定対象成分の有無が
判定できる。ヘモグロビンの場合、検出感度は０．０５
〜２００μｇ／mLである。

【００２２】本発明においては、前記洗口液と抗唾液成
分抗体とを組み合せて唾液成分測定用キットとして供給
するのが好ましい。また、ここで抗唾液成分抗体として
抗ヘモグロビン抗体を採用した場合には、唾液中の潜血
が測定でき、歯周病診断用キットとして有用である。

【００２３】

【実施例】本発明を実施例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００２４】実施例１０．０５％塩化セチルピリジウム（以下、ＣＰＣと示
す）水溶液３mL、あるいは０．０５％塩化セチルトリメ
チルアンモニウム（以下、ＣＴＡＣと示す）水溶液３mL
を洗口液として用いて口腔内を漱ぎ、この吐出液の性状
を観察した。そのままの唾液、蒸留水３mLを洗口液とし
た場合も同様に試験した。

【００２５】実施例で用いた洗口液の組成を表１に、こ
の試験の結果を表２に示した。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】この結果から、カチオン界面活性剤を含む
洗口液によって、唾液のムチン等の粘質物は容易に凝集
し、唾液の粘稠性を低下させることが確認された。ま
た、唾液に含まれている上皮細胞等の有形物などによる
濁りは消失し、その後のクロマトの展開性は水と同程度
の速さに改善された。また、洗口後の吐出液は、遠心分
離操作が不要であり、そのままあるいは希釈してクロマ
トに供することが可能であった。

【００２９】実施例２（検体の調製法）：表１の組成による洗口液（０．０５
％ＣＰＣ含有液）３mLを口に含み口腔内を漱ぎ、容器に
吐出したものを直接サンプル（検体）とした。通常、口
腔内の唾液含量は１mLと言われている。

【００３０】（抗体法）：検体の入った容器に直接試験
紙の下端を浸し、検体液がすべて上昇した時点（浸した
時点から約３分）で試験紙中央のスポット（抗体結合部
分）を観察した。輪郭明瞭な赤紫色のスポットが観察で
きた場合にこれを陽性（＋）と判断した。ここで、試験
紙として、図１のようにスティック状の反応試験紙の下
端に抗ヒトヘモグロビン・マウスモノクローナル抗体結
合金コロイドが塗布され、試験紙中央部に抗ヘモグロビ
ン・マウスモノクローナル抗体がスポット状に固定化さ
れているもの（合同酒精製「クイックゴールドＨｅ
ｍ」）を用いた。

【００３１】（化学法）：ペルオキシダーゼ試験紙（商
品名：サリバスター潜血用、昭和薬品化学工東京）を
用いた。この試験紙は、有機過酸化物であるクメンヒド
ロペルオキシドを唾液中のヘモグロビンの触媒作用によ
り分解して活性酸素を発生させ、３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジンを酸化して発色させる原理に基
づいている。発色の程度はヘモグロビン濃度に対応す
る。ヘモグロビン検出感度は、＋に対応する色調が１．
０mg／dl、＋＋が２．５mg／dlである。唾液を採唾容器
にとり、ペルオキシダーゼ試験紙の試薬貼付部分を浸
し、約３０秒後に、採唾容器に付属する比色表の基準に
従い判定を行った。比色表の１．０mg／dlでの発色程度
を基準とし、これに近いもくしは同等以上の発色がみら
れたものを陽性（＋）と判定した。

【００３２】唾液採取後に、歯科医師による口腔内診査
を行い、プロービング時に出血が認められた部位を全プ
ロービング歯面数から判定できるＢＯＰ値（％）及び、
１本の歯に対して４ヶ所の歯周ポケットの深さ（以下、
ＰＤと示す単位mm）を測定した。

【００３３】抗体法及び化学法での判定は、（＋）、
（±）及び（−）の３区とした。歯周病有病者と健常者
の区別は、口腔内診査においてＢＯＰ２０％以上もしく
はＰＤ６mm以上の場合を有病者、それ以外の場合を健常
者とした。各人数から、スクリーニングテストの有効性
を評価した。なお、（±）と判定された場合は陽性
（＋）の区分に含めた。

【００３４】スクリーニングテストの有効性を評価する
指標は、敏感度（以下、ＳＴと示す）、特異度（以下、
ＳＰと示す）、陽性反応適中率（以下、ＰＶＰと示
す）、陰性反応適中率（以下、ＰＶＮと示す）の４種を
次の式により計算した。８３例を対象に行った評価試験
結果を表３に示した。

【００３５】

【数１】

【００３６】

【表３】

【００３７】抗体法と化学法を比較すると、歯周病有病
者を陽性（＋）とする敏感度（ＳＴ）は抗体法８８．４
％、化学法９５．２％とほぼ同等であった。しかし、陽
性（＋）反応を示した中で実際に有病者である確率をあ
らわす陽性反応適中率をみると、抗体法が９０．５％で
あるのに比べて、化学法では５９．７％と顕著な差がみ
られた。また、健常者の中で確実に陰性（−）判定とな
る割合をあらわす特異度（ＳＰ）においても、抗体法が
９０．０％であるのに対して化学法は３４．１％と大き
な差がみられた。有病者及び健常者（非有病者）に関わ
らず陽性反応の割合が高くなる化学法に比べて、抗体法
による分析は有病者を特異的に検出できる方法であり、
歯周病スクリーニングテストとして精度が高いことが示
された。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、唾液に含まれる成分、
特に潜血を高精度かつ簡便、迅速に測定することが可能
になった。また、本発明において、歯周病のスクリーニ
ングテストを特別な装置を必要とせずに一般診察室内あ
るいは集団検診等で迅速に行うことが可能になった。さ
らには、受診者及び歯科医師の負担を軽減することが可
能になった。本発明によって歯周病リスクグループの早
期発見を可能にしたことは、国民のＱＯＬ向上にとって
有意義である。

【図面の簡単な説明】

【図１】標識抗唾液成分抗体を担持し、捕捉試薬を固定
化した多孔性担体の概略図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】洗口液で口腔内を漱いだ吐出液を、抗唾
液成分抗体に接触させることを特徴とする唾液成分の測
定法。
【請求項２】唾液成分がヘモグロビンであり、抗唾液
成分が抗ヘモグロビン抗体である請求項１記載の測定
法。
【請求項３】抗唾液成分抗体が、多孔性担体に担持さ
れているものである請求項１又は２記載の測定法。
【請求項４】洗口液が、低浸透圧液である請求項１〜
３のいずれか１項記載の測定法。
【請求項５】洗口液が、長鎖アルキルピリジニウム
塩、長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩、長鎖アル
キルジメチルベンジルアンモニウム塩、ベンジルトリブ
チルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム
塩及びテトラブチルアンモニウム塩からなる群から選ば
れる少なくとも１種のカチオン界面活性剤を含有する水
溶液である請求項１〜４のいずれか１項記載の測定法。
【請求項６】洗口液及び抗唾液成分抗体を含む唾液成
分測定用キット。
【請求項７】洗口液及び抗ヘモグロビン抗体を含む歯
周病診断用キット。
【請求項８】抗ヘモグロビン抗体が、多孔性担体に担
持されているものである請求項７記載のキット。
【請求項９】洗口液が、長鎖アルキルピリジニウム
塩、長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩、長鎖アル
キルジメチルベンジルアンモニウム塩、ベンジルトリブ
チルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム
塩及びテトラブチルアンモニウム塩からなる群から選ば
れる少なくとも１種のカチオン界面活性剤を含有する水
溶液である請求項７又は８記載のキット。