WO2024079839A1 - 唾液採取方法及び唾液採取部材並びに出血有無の判定方法及び歯周病の進行状態を判定する方法 - Google Patents

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saliva
periodontal disease
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健一 小峯
優美子 小峯
Original Assignee
三丸化学株式会社
株式会社多機能性蛋白研究所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a saliva collection method and saliva collection member, as well as a method for determining the presence or absence of bleeding and a method for determining the progression of periodontal disease.
  • Non-Patent Document 1 The Relationship Between Periodontal Disease and Lifestyle-Related Diseases, Human 8020 Promotion Foundation, 2005.
  • a probe as shown in Figure 1, to measure periodontal pockets and check for bleeding and redness of the periodontal tissue.
  • using a probe to examine the affected area is often painful.
  • Non-Patent Document 2 Survey Results of Actual Medical Fees for Pets (Dogs and Cats) and Survey of Owner Awareness (2015), compiled by the Japan Veterinary Medical Association, 2015).
  • saliva-based tests such as culturing the causative bacteria and genetic testing are beginning to be used, but a simple saliva testing method that anyone can perform has not yet been established.
  • Periodontal disease is judged by observing whether the position of the periodontal tissue has been lowered, by measuring the depth of the periodontal pocket with a probe, and by measuring the presence or absence of bleeding or pus due to periodontal disease. The judgment is based on the evaluation of the plaque index using the Oral Hygiene Index (OHI) (Non-Patent Document 3, J. Amer. Dent. Ass. 61: 172-179, 1960.), PLI (Plaque Index) (Non-Patent Document 4 Acta. Odont. Scand. 22: 121-135, 1964. ) and the Gingival Index (GI) for evaluating gingival inflammation (Non-Patent Document 5, Acta. Odont. Scand. 21: 533-551, This is done in dental settings using assessment methods such as those used in the past (1963).
  • OHI
  • Non-invasive assessment methods Saliva occult blood detection kit
  • Patent document 1 Japanese Patent No. 4590581, Non-patent document 6: Journal of the Japanese Society of Dentistry 43 (4): 416423, 2001.
  • Fecal occult blood detection kit Non-patent document 7: Research on the standardization of saliva testing, 8020 Promotion Foundation, Designated research project report, 2012).
  • Method for measuring lactate dehydrogenase Patent Document 2: JP 2010-130924 A
  • Non-Patent Document 8 Japanese Journal of Periodontology 44 (3): 261-272, (2002).
  • Non-Patent Document 9 Perioscreen "Sunstar” Package Insert, 2017.).
  • Non-Patent Document 10 Fecal Occult Blood Kit OC-Hemodia Auto III 'Eiken' Package Insert, 2021).
  • Other methods include the usual bacterial testing method for detecting and determining the bacteria that cause periodontal disease contained in saliva, and the genetic testing method using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method, which are performed at external testing institutions equipped with specialized equipment (Non-Patent Document 11: GCCIRCLE. 141: 2012-2016. 2012.
  • Patent Document 3 JP 2017-85944 A). Because early-stage periodontal disease is difficult to detect, these tests are aimed at patients with moderate to severe symptoms who are already showing symptoms such as clear bleeding when a probe is used or who are starting to notice bad breath, rather than those in the early stages.
  • Non-Patent Document 13 Periodontal disease in dogs (diagnosis method)
  • Pocket Pets Doctors https://pocketpetsdoctors.com/?p 134 2021.).
  • I-Lf inflammatory lactoferrin polypeptide
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 4029988), and demonstrated by an immunoenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that this is effective in detecting patients with early-stage periodontal disease without using a probe.
  • ELISA immunoenzyme-linked immunosorbent assay
  • an absorbent carrier selected from paper, cellulose, chemical fiber, synthetic resin woven fabric, and nonwoven fabric is impregnated with an indicator that is oxidized with a color change in the presence of a hemolytic molecule group present in blood, an oxidizing agent effective for oxidizing the indicator, a buffer that maintains the pH in the range of 4 to 7, an activator to increase sensitivity, and saponin.
  • a known nonwoven fabric is that described in Patent Document 7.
  • This nonwoven fabric has a basis weight of 30 to 80 g/ m2 according to JIS P8124:1998, a sheet density of 0.01 to 0.05 g/ cm3 , a compression work load of 0.85 to 5.0 gf ⁇ cm/ cm2 according to the KES method, and a wet tensile strength of 8 N/100 mm or more.
  • its use is cooking paper, and no other uses are disclosed.
  • a nonwoven fabric will be selected that is safe for use on living organisms and is also being considered as a saliva collection material that can measure occult blood in saliva.
  • the nonwoven fabric will not require special processing, but will be one that is commonly available, and a method will be investigated that will allow for a simple and quick determination of occult blood in saliva using the nonwoven fabric after absorbing saliva.
  • the orthotoliidine method and guaiac method are used for routine testing for occult blood in feces, and are also used in some cases for testing occult blood in saliva.
  • Patent Document 6 the nonwoven fabric is soaked in hemolytic components and various drugs, then dried, and attached to a support such as polyvinyl chloride, and judged by color, but this requires complicated work and materials.
  • a support such as polyvinyl chloride
  • the details of the nonwoven fabric are not disclosed, when a commercially available nonwoven fabric is used, the amount of saliva required for judgment is not absorbed, and therefore stable judgment cannot be made.
  • the inventor further investigated the cause of the inability to make a stable judgment and found that the cause is the variation in the amount of absorption.
  • a nonwoven fabric that can control the amount of absorption to a constant level was searched for, and it was found that the nonwoven fabric described in Patent Document 7 has a large amount of saliva absorption and small variation.
  • An object of the present invention is to provide a method for easily collecting saliva for periodontal disease testing from humans, and for easily collecting saliva from animals such as dogs and cats without anesthesia.
  • the present invention aims to provide a saliva collection method and saliva collection member that are simple and non-invasive, can be used without any processing, and do not require complicated operations or materials, and that can determine the presence or absence of bleeding and the progression of periodontal disease stably and with little variation by simply performing centrifugation.
  • the present invention aims to provide a method for easily and quickly determining the progression of periodontal disease by using saliva as a sample, and also aims to provide a saliva collection method that is non-invasive and does not cause pain from a probe in humans, and does not require anesthesia treatment in pets, allowing the periodontal disease to be determined by the person in question and the owner in animals.
  • the present invention is a method for collecting saliva for periodontal disease testing, in which saliva is collected by absorbing the saliva of a human or an animal such as a dog or cat into a saliva collection member made of a nonwoven fabric capable of quantitatively absorbing saliva.
  • the nonwoven fabric preferably has a basis weight of 30 to 80 g/m 2 according to JIS P8124:1998, a sheet density of 0.01 to 0.05 g/cm 3 , a compression work load of 0.85 to 5.0 gf ⁇ cm/cm 2 according to the KES method, and a wet tensile strength of 8 N/100 mm or more.
  • the present invention is a method for determining the presence or absence of bleeding, which comprises collecting saliva using the saliva collection method, attaching the saliva-containing saliva collection member to a centrifugal filtration filter and centrifuging it, and observing the blood cell components retained in the saliva collection member after centrifugation.
  • the present invention relates to a method for determining the progression of periodontal disease by simultaneously measuring the inflammatory lactoferrin polypeptide in the liquid phase obtained by the above-mentioned centrifugation and measuring occult blood.
  • the present invention relates to a saliva collection member used in a method for collecting saliva for periodontal disease testing, and is a saliva collection member made of a nonwoven fabric capable of quantitatively absorbing saliva.
  • the nonwoven fabric preferably has a basis weight of 30 to 80 g/m 2 according to JIS P8124:1998, a sheet density of 0.01 to 0.05 g/cm 3 , a compression work load of 0.85 to 5.0 gf ⁇ cm/cm 2 according to the KES method, and a wet tensile strength of 8 N/100 mm or more.
  • the nonwoven fabric described in Patent Document 7 has the following characteristics necessary for diagnosing periodontal disease using I-Lf concentration and occult blood in saliva as indicators: (1) a large amount of saliva absorbed per unit volume, and (2) extremely small variation in the amount of saliva absorbed per unit volume (and thus the overall amount of saliva absorbed). Based on the discovery of such characteristics, the present inventors have developed an application as a saliva collection member for diagnosing periodontal disease using I-Lf concentration.
  • Saliva was collected using nonwoven fabric (product name "Reed”) made by Oji Kinocloth Co., Ltd. using the airlaid method.
  • This nonwoven fabric has stronger wet tensile strength than nonwoven fabrics made using other methods, and is less likely to tear even when subjected to physical treatments such as centrifugation, with fewer pieces of paper falling off.
  • I-Lf immunoturbidimetry
  • repeated measurements are required 2 to 3 times to increase the reliability of the measured value. Therefore, a sample volume of 40 ⁇ L is required for two measurements. Furthermore, considering the case where the sample is diluted and then remeasured by immunoturbidimetry, it is necessary that a sample volume of 60 ⁇ L or more can be collected.
  • the nonwoven fabric was cut to a volume of 84 mm3 that can be attached to the reservoir of a centrifugal filter using the nonwoven fabric, and it was confirmed that 100 ⁇ L of saliva, which has a high viscosity among body fluids, was quantitatively absorbed to 99.5 + 0.5 ⁇ L (Table 1).
  • Patent Document 7 it is made from wood pulp, but natural fibers such as cotton and rayon, and synthetic fibers such as polyester and polypropylene can also be used as long as they have the same performance as the cooking paper and can absorb highly viscous oils. Therefore, the nonwoven fabric made from the above material is adjusted to match the amount of saliva to be collected, allowing the required amount of saliva to be collected non-invasively, easily and quickly.
  • the collected saliva is placed in a centrifugal filter or a similar centrifugal filter device equipped with a membrane filter with a pore size of 0.2 ⁇ m or 0.45 ⁇ m to remove the influence of bacteria, an ultrafiltration membrane matched to the molecular weight of the saliva component to be measured, and centrifuged for about 5 to 15 minutes at 1,000 to 3,000 G (centrifugal force) that meets the specifications of the filter device.
  • I-Lf which is an indicator of periodontal disease contained in the liquid phase after centrifugation, can be measured by antigen-antibody reaction, enzyme reaction, chemical color reaction, etc.
  • the occult blood in the saliva remaining in the saliva collection material could be visually confirmed by the presence or absence of bleeding on the nonwoven fabric after centrifugation.
  • processing such as the addition of coloring agents to the nonwoven fabric was required, but the present invention has been shown to be a method that does not require such processing and can be easily determined by simply attaching it to a sterilizing filter and centrifugation alone.
  • the method of mounting the nonwoven fabric on a centrifugal filter device is as shown in Figure 2. By folding the nonwoven fabric into a V- or U-shape and mounting it inside the device, blood cell components accumulate on the nonwoven fabric that comes into contact with the bottom of the filter, making it possible to visually confirm the accumulation.
  • Non-Patent Document 14 J. Clin. Pathol. 31. 139-143. 1978.
  • Triton/NaOH method Non-Patent Document 15: Clin. Chim. Acta. 136. 95-104. 1984.
  • the present invention it is possible to provide a method for easily collecting saliva for periodontal disease testing from humans, and a method for easily collecting saliva from animals such as dogs and cats without anesthesia.
  • a saliva collection method and saliva collection member that are simple and non-invasive, can be used without requiring any processing, and can determine the presence or absence of bleeding and the progression of periodontal disease stably and with little variation by simply performing centrifugation without the need for complicated operations and materials.
  • Table 1 The results of the investigation into the saliva absorption amount of the nonwoven fabric are shown in Table 1.
  • the present invention determines the progression of periodontal disease by simultaneously measuring I-Lf, a marker for determining very early stage periodontal disease contained in saliva from humans or animals suffering from periodontal disease, and the presence or absence of bleeding in saliva that increases due to bleeding accompanying the progression of periodontal disease.
  • nonwoven fabric product name "Lead” from Oji Kinocloth Co., Ltd. was used as the saliva absorbing member, and was cut to a size with a volume of 84 mm3 in advance so as to absorb 100 ⁇ L of human and dog saliva, respectively, and saliva was collected from patients and animal patients.
  • the size is not limited to the above, and any size that can absorb 100 ⁇ L of sample will suffice. From this perspective, 80 to 90 mm3 is preferred, and 82 to 86 mm3 is more preferred.
  • this saliva-absorbed nonwoven fabric was folded and placed in a commercially available centrifugal filter equipped with a membrane filter with a pore size of 0.2 ⁇ m, and centrifuged at 2,000 G for 5 minutes. After centrifugation, the nonwoven fabric was placed on a white acrylic plate or the like, and the presence or absence of blood cell components was visually observed and judged.
  • i-Lf affinity antibody was adjusted to 1 mg/mL with Tris-HCl buffer, 15 ⁇ L was dispensed into each well, mixed with a plate mixer, 20 ⁇ L of the saliva sample after centrifugation was added, mixed again, and reacted for 8 minutes in a constant temperature bath at 37°C. After the reaction, the plate was mixed again to resuspend the immune complex, and the absorbance was measured at 540 nm to determine the I-Lf concentration in saliva. In addition, if occult blood was found in the saliva and was thought to exceed the measurement range, it was diluted with Tris-HCl buffer and measured again.
  • the value was 8.89 ⁇ 5.25 ⁇ g/ml in the mild to moderate group, but the value was higher at 21.21 ⁇ 11.26 ⁇ g/ml in the severe group.
  • the measurement time was significantly reduced from the start of measurement to obtaining the results in 5 to 10 minutes, compared to the approximately 2 hours required for the conventional immunoenzyme antibody method (ELISA method).
  • hemoglobin In measuring occult blood in saliva, red blood cells, which are non-hemolyzed components, have a relatively large particle size, whereas hemolyzed components such as hemoglobin are difficult to observe visually. Therefore, commercially available hemoglobin (SIGMA, Cat. No. H7379-5G) was dissolved in phosphate physiological buffer and serially diluted from 1 mg/mL to 0.01 ⁇ g/mL to examine the measurement sensitivity of hemoglobin. Hemoglobin solutions of each concentration were soaked in nonwoven fabric and centrifuged at 2,000 G for 15 minutes using a commercially available centrifugal filter equipped with a 0.45 ⁇ m membrane filter. The liquid sample was separated and then removed and observed visually.
  • this measurement method allowed visual confirmation from 1 ⁇ g/mL to 1 mg/mL.
  • the measurement sensitivity of human saliva occult blood detection kits using immunochromatography is 2 ⁇ g/mL to 500 (or less) ⁇ g/mL (non-patent literature, Perioscreen "Sunstar” package insert, 2017.), which suggests that this is roughly the same as the method of the present invention.
  • Table 2 shows the measurement results of occult blood and sloughed epithelium in saliva of the dog with periodontal disease. The bleeding specimen is shown in FIG.
  • the nonwoven fabric contains concentrated bacteria that do not pass through the filtration membrane, so it can be suspended in a small amount of sterile buffer solution and used as a concentrated sample for genetic testing or bacterial culture.
  • the liquid phase can also be used to measure immunoglobulins, other proteins, minerals, enzymes, and other items. Therefore, this method can be applied in a wide range of fields, such as primary screening for periodontal disease in general health checkups for humans and animals, and oral hygiene and health checkups.

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Abstract

簡便で非侵襲的に採取可能な唾液採取部材を見出し、何等の加工も必要とせずに使用でき、唾液採取後の採取部材を遠心分離することのみで唾液中潜血の判定と、唾液中の催炎性ラクロフェリン・ポリペプチド濃度を測定し、ヒト並びに動物の歯周病の病態分類を可能とする判定方法を提供する。　定量的に採取可能な不織布を選択し用いることで、唾液を非侵襲的に採取する。採取後の不織布をろ過器具にセットし遠心分離を行い、遠心後の不織布上に残存する血液成分を目視で観察し唾液潜血を検出する。また、併せて遠心分離後の液相検体中のＩ－Ｌｆ濃度を測定することで歯周病の病態ごとに分類することを可能とする。

Description

唾液採取方法及び唾液採取部材並びに出血有無の判定方法及び歯周病の進行状態を判定する方法
　本発明は、唾液採取方法及び唾液採取部材並びに出血有無の判定方法及び歯周病の進行状態を判定する方法に係る。
　ヒトならびにイヌなどのペットにおいて歯周病は、心内膜炎や糖尿病など多岐にわたる疾患を誘発する重大な生活習慣病である（非特許文献１、歯周病と生活習慣病の関係．財団法ヒト８０２０推進財団編．２００５．）。そのため、ヒトに於いては定期管理により、図１に示すようなプローブ（探針）という器具を用いた歯周ポケットの測定や出血、歯周組織の発赤などの検査が行われている。しかし、プローブを用いた患部の検査に際しては痛みを伴うことが多々ある。
　近年では、痛みを伴わない検査、すなわち非侵襲性の検査として歯周組織からの出血に伴う唾液中潜血の測定や唾液中に含まれる血液成分の測定が行われるようになってきているが、測定時の希釈の手間や測定に時間がかかる問題があり、未だ浸透しているとは言えない。
　一方、イヌなどの動物ではレントゲン検査や歯周ポケットの測定をするにも全身麻酔を施してからでないと行えず、ペット自体の負担も大きいことと入院が必要となるために医療費も高額となる課題がある（非特許文献２、家庭飼育動物（犬・猫）の診療料金実態調査及び飼育者意識調査　調査結果．（平成27年度）、日本獣医師会編．　2015．）。
　また、唾液を用いた検査として原因菌の培養や遺伝子検査も行われ始めているが、簡便で誰でも行える唾液検査方法は確立されていない。
　歯周病は、歯周組織の位置が下がっていないか観察することにより、また歯周ポケットの深さをプローブにより測定することにより、さらに、歯周病による出血や膿の有無を測定することにより判定している。判定は、プラーク指数の評価によるＯＨＩ(Oral Hygiene Index)（非特許文献３　J. Amer. Dent.
Ass. 61: 172- 179, 1960.) 、ＰＬＩ（Plaque Index）(非特許文献４　Acta. Odont. Scand. 22: 121-135,
1964. )や歯肉の炎症を評価するＧＩ（Gingival Index）(非特許文献５　Acta. Odont. Scand. 21: 533-551,
1963.)などの判定方法を用い歯科現場では行われている。
　上述の方法は、検査費用も高くなるのと同時に患畜の負担も大きくなり、歯周病の病態判定に有効で安価に行える非侵襲性の検査方法の提供が求められている。
　さらに、これらの判定方法は、すべての歯を対象に行うため時間がかかる判定方法であり、熟練した技術が必要である判定方法であり、そして歯周病による歯肉組織の炎症部位では痛みの検査として唾液を用いた判定方法が導入され始めている。
　非侵襲性の判定方法として導入されているものとしては、次の技術が実施されている。
　唾液潜血検出キット（特許文献１：特許第４５９０５８１号公報、非特許文献６：日歯周誌43 (4) : 416423, 2001）。
　便潜血検出キット（非特許文献７：唾液検査標準化に関する研究　8020 推進財団　指定研究事業報告書. 2012）。
　乳酸脱水素酵素を測定する方法（特許文献２：特開２０１０－１３０９２４号公報、非特許文献８：日 歯 周 誌44 (3) : 261-272,
2002）。
　しかしながら、イムノクロマト法による唾液潜血検出キットでは無糖ガムなど用いて唾液１ｍＬ以上を紙コップなどに吐き出し、ムチンなどのメンブレン上の展開を阻害する物質の影響を抑えるため水で５倍に希釈するか、３ｍＬの水で１０秒間すすいだ後の吐出液とする必要がある（非特許文献９　ペリオスクリーン「サンスター」添付文書、2017.）。
　一方、便潜血検出キットを用いた唾液潜血検査では、イムノクロマトによるキット同様に唾液を採取し測定するが、高額な自動分析装置を備えた外部の検査機関で行わなければならない（非特許文献１０　便潜血キットＯＣ－ヘモディアオートIII‘栄研’ 添付文書、2021.）。
　その他唾液中に含まれる歯周病原因菌を検出し判定する通常の細菌検査法や遺伝子検査であるPolymerase Chain Reaction（PCR）法による方法も行われ専用の機器を備えた外部の検査機関にて行われている（非特許文献１１　GCCIRCLE．141：2012-2016．2012．特許文献３：特開２０１７－８５９４４号公報．）。
　早期の歯周病では自覚症状が現れにくいことから、これらの検査は初期のものよりプローブを使用した際に明確に出血が認められた場合や口臭が気になり始めるといった自覚症状がすでに表れている中等度以上の患者が対象となっている。
　一方、イヌなどの動物では一般的に歯周病の検査の際に全身麻酔を施し行われている（非特許文献１３犬の歯周病について（診断法） | ポケットペッツドクターズ(POCKET PETS DOCTORS )　https://pocketpetsdoctors.com/?p=134　2021.）。
　我々はすでに、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド（Ｉ－Ｌｆ）」が歯周病患者の唾液中に現れることを報告し（非特許文献１２　Mol. Immunol. 44:1498-1508. 2007.　特許文献４：特許第４０２９９８８号公報）、プローブを使用せずに早期の歯周病の患者の発見に有効性の認められることを免疫酵素抗体（ＥＬＩＳＡ）法により示した。
　Ｉ－Ｌｆの測定と同様に、早期の歯周病発見には唾液中の出血を判定する唾液潜血の測定が前記のとおり行われている。その中で、不織布を用いた唾液潜血の測定についても報告がされており（特許文献６　特許第２８６０６６０号公報）、不織布中に溶血成分や各種薬剤を浸漬した後乾燥させさせたのちに乾燥し。ポリ塩化ビニールなどの支持体に貼付け色度により判定している。より詳細に述べると、特許文献６では、血液中に存在する補血分子族の存在で色変化をともなって酸化される指示薬、該指示薬を酸化するのに有効な酸化剤、pHを４～７の範囲に維持する緩衝剤、感度を上げる為の賦活剤、及びサポニンを、紙、セルロース、化学繊維、合成樹脂製織布及び不織布から選択される吸収性担体に含浸させている。
　不織布として特許文献７記載の不織布が知られている。この不織布は、不織布は、ＪＩＳ　Ｐ８１２４：１９９８による坪量３０～８０ｇ／ｍ２、シート密度０．０１～０．０５ｇ／ｃｍ３、ＫＥＳ法による圧縮仕事量が０．８５～５．０ｇｆ・ｃｍ／ｃｍ２、湿潤引張強度が８Ｎ／１００ｍｍ以上である不織布である。ただ、その用途はクッキングペーパーであり、それ以外の用途の開示は無い。
特許第４５９０５８１号公報 特開２０１０－１３０９２４公報 特開２０１７－８５９４４号公報． 特許第４０２９９８８号公報 特許第４６２７２６３号公報 特許第２８６０６６０公報 特許第　６２５９３６５号公報
歯周病と生活習慣病の関係．財団法ヒト8020推進財団編．2005． 家庭飼育動物（犬・猫）の診療料金実態調査及び飼育者意識調査　調査結果（平成27年度）、日本獣医師会編．2015．（http://nichiju.lin.gr.jp/small/ryokin.html） J. Amer. Dent. Ass. 61: 172- 179, 1960. Acta. Odont. Scand. 22: 121-135, 1964. Acta. Odont. Scand., 21: 533-551, 1963. 日歯周誌43 (4) : 416-423, 2001. 唾液検査標準化に関する研究　8020 推進財団　指定研究事業報告書　2012. 日歯周誌44 (3) : 261-272, 2002. ペリオスクリーン「サンスター」添付文書、2017. GCCIRCLE．141：2012-2016．2012. Mol. Immunol. 44:1498-1508. 2007. 便潜血キットＯＣ－ヘモディアオートIII‘栄研’ 添付文書、2021. 犬の歯周病について（診断法） | ポケットペッツドクターズ(POCKET PETS DOCTORS )　 https://pocketpetsdoctors.com/?p=134　2021. J.Clin.Pathol 31: 139-143 1978. Clin. Chim. Acta. 136. 95-104. 1984.
　本発明では唾液中のＩ－Ｌｆの定量を行うため、採取に際し使用する不織布が唾液を定量的に採取できるものを選定し、測定する方法を確立する課題がある。また、採取に際しても、患者やペットなどの患畜に苦痛を与えない非侵襲的な方法である必要がある。特に、ペットなどでは現在口腔内を観察するに際しては全身麻酔を施す必要があるが、麻酔の必要のない採取方法を確立する課題がある。
　非侵襲性の唾液採取方法としては口腔内に含み採取部材に含ませるか、もしくは吐出して採取する方法などでの使用を想定し、生体に使用しても安全で唾液潜血の測定も可能な唾液採取部材としても検討がされている不織布を選定する。不織布は特殊な加工法ではなく一般に入手しやすいものを用いて、唾液吸収後の不織布による簡便で迅速な唾液潜血の判定が行える方法の検討を行うこととした。化学的検査方法としてオルトトリジン法とグアヤック法が便潜血などでは日常検査として、一部唾液潜血の検査にも利用されている。
　また、下部消化管や大腸出血ならびに唾液潜血（非特許文献９　ペリオスクリーン「サンスター」添付文書、2017.）では抗原抗体反応を利用した免疫学的方法が利用されている。
　特許文献６では、不織布中に溶血成分や各種薬剤を浸漬した後乾燥させさせたのちに乾燥し、ポリ塩化ビニールなどの支持体に貼付け色度により判定しているが、煩雑な作業と材料を必要とする。また、不織布の詳細は開示されていないが、市販の不織布を使用した場合には、判定に必要な唾液量の吸収がなされずそのため安定した判定をおこなうことができない。本発明者は、安定した判定を行うことができない原因をさらに探求したところ、その原因は吸収量のバラツキにあることを知見した。本発明では、吸収量を一定に制御すことが可能な不織布を探求したところ特許文献７記載の不織布は唾液吸収量が大きいとともにバラツキが小さいことを発見した。また粘性の高い食用油などのろ過にも用いられ、夾雑物の保持能力も高いことから、唾液を吸収した不織布を遠心ろ過滅菌フィルターや遠心限外濾過フィルターに装着することで、唾液中潜献血を検出することが可能となる知見を得た。
　唾液潜血測定、Ｉ－Ｌｆならびに原因菌などの現行報告されている測定法では、唾液検体により歯周病の病態を分類する検査方法は確立されていない。そのため、歯周病の発見に有効で唾液中の判定指標でもあるＩ－Ｌｆ濃度と唾液潜血の両方を指標として歯周病態分類を可能とする判定方法を確立し課題の解決を図ることとする。
　本発明は、ヒトでは簡便に歯周病検査のための唾液を、そしてイヌやネコの動物でも麻酔なしで簡便に行える唾液採取方法を提供することを目的とする。
　本発明は、簡便で、非侵襲的で、何等の加工も必要とせずに使用でき、煩雑な作業と材料を必要とせずに、遠心分離することのみで唾液中潜血の判定と、唾液中の催炎性ラクロフェリン・ポリペプチド濃度をバラツキが少なく安定して測定することが可能な唾液採取方法及び唾液採取部材並びに出血有無の判定方法及び歯周病の進行状態を判定する方法を提供することを目的とする。
　本発明は、歯周病の進行状態について唾液を検体とすることで簡便に且つ短時間で判定する方法を提供することを目的とするとともに、非侵襲性でヒトではプローブによる苦痛を伴わず行え、ペットなどでも麻酔による処置を施す必要のない唾液採取方法を人では本人、動物では飼い主でも歯周病の判定が行える唾液採取方法を提供することを目的としている。
発明が解決しようとするための手段
　本発明は、歯周病検査のための唾液採取方法であり、唾液を定量的に吸収可能な不織布からなる唾液採取用部材に人又はイヌやネコなどの動物の唾液を吸収させることにより唾液を採取する唾液採取方法である。
　前記不織布は、ＪＩＳ　Ｐ８１２４：１９９８による坪量３０～８０ｇ／ｍ２、シート密度０．０１～０．０５ｇ／ｃｍ３、ＫＥＳ法による圧縮仕事量が０．８５～５．０ｇｆ・ｃｍ／ｃｍ２、湿潤引張強度が８Ｎ／１００ｍｍ以上である不織布であることが好ましい。
　本発明は、前記唾液採取方法により唾液採取後、唾液を含む唾液採取部材を遠心分離ろ過フィルターに装着して遠心分離し、遠心分離後の前記唾液採取部材中に保持されている血球成分を観察する出血有無の判定方法である。
　本発明は、前記における遠心分離で得られた液相中の催炎性ラクトフェリン・ポリペプチドと潜血測定を併せて測定することにより、歯周病の進行状態を判定する方法である。
　本発明は、歯周病検査のための唾液採取方法に用いられる唾液採取部材であり、唾液を定量的に吸収可能な不織布からなる唾液採取用部材である。
　前記不織布は、ＪＩＳ　Ｐ８１２４：１９９８による坪量３０～８０ｇ／ｍ２、シート密度０．０１～０．０５ｇ／ｃｍ３、ＫＥＳ法による圧縮仕事量が０．８５～５．０ｇｆ・ｃｍ／ｃｍ２、湿潤引張強度が８Ｎ／１００ｍｍ以上である不織布であることが好ましい。
　本発明の効果を、本発明をなすに際して得た知見などとともに説明する。
　本発明者は、特許文献７記載の不織布が、Ｉ－Ｌｆ濃度と唾液潜血を指標とする歯周病の判定を行うために必要な、（１）単位体積当たりの唾液吸収量が大きいという特性を有し、また、（２）単位体積当たりの唾液吸収量のバラツキ（ひいては全体の唾液吸収量のバラツキ）が極めて少ないこという特性を有していることを見出したものである。かかる特性の発見に基づき、Ｉ－Ｌｆ濃度による歯周病の判定に用いる唾液採取部材という用途を開発したことに基づきなされたものである。
　唾液の採取にはエアレイド法により作成された王子キノクロス株式会社製の不織布(商品名「リード」)を用いる。当該不織布は他の方法で作成される不織布より湿潤引張強度が強く、遠心など物理的処理でも破れにくく紙片の脱落の少ない特性を有している。
　Ｉ－Ｌｆの免疫比濁法による測定では測定値の信頼を高めるため２～３回の反復測定が必要となる。そのため、検体量は２回測定として４０μＬが必要となる。さらに免疫比濁法で希釈して最測定を行う場合を考慮し、検体量が６０μＬ以上採取可能であることが必要である。本発明では前記不織布を使用する遠心ろ過フィルターのリザーバーに装着可能となる体積８４ｍｍ3となるように切断し、体液の中でも粘性の高い唾液１００μＬを９９．５＋０．５μＬと定量的に吸収することが確認できた（表1）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　特許文献７に示されたとおり、木材パルプを原料とし作成されるが、コットン、レーヨンなどの天然繊維やポリエステル、ポリプロピレンなどの合成繊維などでも粘性の高い油分でも吸収可能な当該クッキングペーパーと同等の性能を有するものであれば使用が可能である。そのため前記素材で作成された不織布を採取唾液量に合わせ調整し、非侵襲的に検査必要量の唾液を簡便で迅速に採取することを特徴とする。
　また採取した唾液は、雑菌などの影響を除くために０．２μｍもしくは０．４５μｍのポアサイズであるメンブレンフィルターや測定指標となる唾液成分の分子量に合わせた限外濾過膜を装着した遠心分離ろ過フィルターもしくは類似の機能を有する遠心ろ過器具にセットし、ろ過器具の規格に適合する１，０００～３，０００G(遠心力)で５～１５分程度遠心分離する。遠心分離後の液相中に含まれる歯周病の判定指標となるＩ－Ｌｆを抗原抗体反応や酵素反応、化学的呈色反応などで測定することができる。一方、唾液採取材に残存する唾液中潜血は遠心分離後、不織布上に出血の有無を目視で確認することができた。今まで不織布に発色剤などの添加などの加工が必要であったが、本発明ではそれらの加工を必要とせずにろ過滅菌フィルターに装着し、遠心分離のみで簡便に判定できる方法であることが示された。当該不織布の遠心ろ過器具への装着方法は図２に示した通りで、V字もしくはU字型に折り器具内に装着することで濾過フィルター底部に接触する不織布に血球成分が集積し、目視での確認が可能となることを特徴とする。当該不織布と他の方法で作成された不織布では、吸収した唾液量は２倍以上唾液保持量が異なり、また保持量のバラツキも１００倍以上異なり、測定に必要十分な唾液検体を安定的に収集することができないことが判明した。そのため本測定法において当該不織布の使用が極めて有効な唾液採取部材となることが示された。
　さらにより微量の出血を定量的に確認するには、遠心後の不織布中に含まれる血液成分を各測定法に適合する緩衝液中に分散させ、国際標準法であるシアンメトヘモグロビン法（非特許文献１４　J.Clin.Pathol.  31.  139-143.  1978.）やＴｒｉｔｏｎ／ＮａＯＨ法（非特許文献１５　Clin. Chim. Acta. 136. 95-104. 1984.）などで吸光度を測定し定量することも可能な方法を確立した。
　発明によれば、ヒトでは簡便に歯周病検査のための唾液を、そしてイヌやネコの動物でも麻酔なしで簡便に行える唾液採取方法を提供することができる。
　本発明によれば、簡便で、非侵襲的で、何等の加工も必要とせずに使用でき、煩雑な作業と材料を必要とせずに、遠心分離することのみで唾液中潜血の判定と、唾液中の催炎性ラクロフェリン・ポリペプチド濃度をバラツキが少なく安定して測定することが可能な唾液採取方法及び唾液採取部材並びに出血有無の判定方法及び歯周病の進行状態を判定する方法を提供することができる。
　当該不織布の唾液吸収量の検討結果を表１に示した。
唾液検体の処理方法と測定までのフロー図 免疫比濁法による検量線作成例 歯周病罹患患畜（イヌ）唾液検体の病状によるＩ－Ｌｆ濃度 歯周病罹患患者唾液検体の病状によるＩ－Ｌｆ濃度 本発明において使用した不織布を用いた唾液中潜血観察感度試験 歯周病羅漢イヌの出血検体を示す外観写真 プローブを用いた歯周病診断の概略図
　本発明は、歯周病を罹患したヒトや動物の唾液から唾液中に含まれる極早期の歯周病判定マーカーとなるＩ－Ｌｆと歯周病の進行に伴う出血により唾液中に増加する出血の有無を同時に測定し、歯周病の進行状況を判定するものである。
　本試験においては唾液吸収部材として、王子キノクロス株式会社の不織布（製品名「リード」）を予め１００μＬのヒトならびにイヌ唾液をそれぞれ吸収するよう体積が８４ｍｍ３のサイズに切断し、患者ならびに患畜から唾液を採取した。なお、上記サイズに限定されるものではなく、１００μLの検体の吸収が可能となるサイズであればよい。その観点から、　　　　　　８０～９０ｍｍ３が好ましく、８２～８６ｍｍ３がより好ましい。
　そして、この唾液吸収済み不織布をポアサイズ０．２μｍのメンブレンフィルターを装填した市販の遠心分離ろ過フィルターに折り曲げて設置し、２，０００Ｇで５分間遠心分離した。そして、遠心分離後の不織布を白地のアクリル板などの上に置き血球成分の有無を目視により観察し判定を行った。
　次に遠心分離後の濾液については、Ｉ－Ｌｆを抗Ｉ－Ｌｆウサギ血清から作成したアフィニティー抗体を用い、短時間での測定が可能な免疫比濁法により測定を行った。測定には、ポリエチレングリコール８０００を４．５％含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を反応緩衝液として用い、マイクロプレート（ＭＩＣＲＯＬＯＮ　７６２０７０、　gｒｅｉrｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）の各ウェルに１２０μＬずつ分注して３７℃で保温しておいた。次いで、ｉ－Ｌｆアフィニティー抗体を１ｍｇ／ｍＬにトリス塩酸緩衝液で調整し、各ウェルに１５μＬ分注しプレートミキサーで混和後、遠心分離後の唾液検体を２０μＬ加え再度混和し３７℃の恒温槽期内で８分間反応させた。反応終了後、免疫複合体を再浮遊させるためにプレートミキサーで再度混和して５４０ｎｍで吸光度を測定し唾液中Ｉ－Ｌｆ濃度を求めた。なお、唾液中潜血が認められ測定範囲を超えると考えられるものについては、トリス塩酸緩衝液で希釈して再度測定した。
　イヌ唾液では軽度～中等度で８．８９±５．２５μｇ／ｍｌの値であったが、重度と判定された群では２１．２１±１１．２６μｇ／ｍｌとより高い値であった。しかしながら、重度および軽度～中等度の群はそれぞればらつきが大きく、Ｉ－Ｌｆの測定のみではそれぞれの症状の分類に当てはめることは難しい結果であった。一方、測定時間は従来行われていた免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）の測定時間である約２時間に対し、測定開始から結果を得るまでの時間を５～１０分と大幅に短縮できた。
　一方ヒトの唾液検体では、ＧＩ値による判定で重度患者とされた患者の唾液では６２．２±１０．３μｇ／ｍｌと高値であったが、中等度患者唾液（３１．０±８．３μｇ／ｍｌ）そして軽度患者唾液（８．４±２．０μｇ／ｍｌ）と症状の軽い患者唾液ほど低くなっていた。
　この結果は、ヒトの方が歯周病によるＩ－Ｌｆの濃度変化がイヌに比べ鋭敏に変動しており、イヌに比べ分類しやすくなることを示唆している。またヒトでは、口腔内の衛生環境を保つための歯磨きや洗口液、歯間ブラシなど様々な自己管理対策がなされているため、歯垢や歯石の沈着などが抑制されているために病態による個体差が少なくなっているものと推察される。それに対し、イヌの場合は口腔内の衛生環境維持については歯磨きなどの管理方法や意識に差があり、口腔内衛生環境の個体差が大きくＩ－Ｌｆの値にバラツキが大きく出ていることも推察された。
　唾液中潜血の測定において、非溶血成分である赤血球は比較的大きな粒子径であるのに対し、溶血成分であるヘモグロビンなどは目視での観察が難しい。そのため市販のヘモグロビン（ＳＩＧＭＡ社、Cat.No.H7379-5G）をリン酸生理緩衝液に溶解し、１ｍｇ／ｍＬから０．０１μｇ／ｍＬまで段階希釈した溶液を用いヘモグロビンの測定感度を検討した。それぞれの濃度のヘモグロビン溶液を不織布に含ませ、０．４５μｍのメンブレンフィルターを装填した市販の遠心分離ろ過フィルターを用い２，０００Ｇで１５分遠心分離し、液体検体を分離した後に取り出して目視で観察した。その結果、本測定法では1μｇ/ｍＬ～１ｍｇ/ｍＬまで目視による確認ができた。一方、すでに市販されているイムノクロマト法によるヒト唾液潜血検出キットの測定感度が２μｇ／ｍＬ～５００（未満）μｇ／ｍＬ（非特許文献、ペリオスクリーン「サンスター」添付文書、2017.）であり、本発明の方法とほぼ同程度であることが示唆された。
　その結果を第５図に示す。
　前記の結果を基に唾液中潜血の観察をイヌ唾液について行ったところ、歯周病の病態の悪化に伴い、唾液中の潜血検出率は歯周病が軽度の検体では検出されなかったが中等度で８８％、重度で１００％と増加していた。さらに口腔内の脱落上皮組織についても病態の悪化に伴い軽度では検出されなかったが中等度で１２％、そして重度で８０％と検出率が増加していた。
　歯周病の進行状況を確認するのに唾液中潜血の観察は有効ではあるが、軽度のものでは潜血の観察だけでは歯周病の検出が難しく、Ｉ－Ｌｆと組み合わせることでより効率的に歯周病の進行状態を的確に判断できることが示唆された。
　その結果を表２に示す。すなわち、表２は、歯周病羅漢イヌ唾液艦隊の唾液中潜血ならびに脱落上皮の測定結果である。なお、その出血検体を図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　何等の加工も必要とせず不織布を遠心処理することだけで唾液中潜血を判定できたことで、同時に唾液中潜血と唾液中Ｉ－Ｌｆ濃度の２項目を測定ができ、歯周病の病態判定をより正確に判定できることと判定時間を飛躍的に短縮することが可能となった。
　また、本方法ではＩ－Ｌｆ以外でも歯周病の判定に有効な項目の測定に応用できる。唾液採取後の不織布は、ろ過膜を通過しない細菌が濃縮された状態で含まれているため、微量の滅菌緩衝液に懸濁させ濃縮検体として遺伝子検査や細菌培養に使用できる。また、液相部分はイムノグロブリンやその他の蛋白、無機質、酵素など多方面での測定に利用可能である。そのため、ヒトならびに動物の一般健診における歯周病の一次スクリーニングや口腔内の衛生ならびに健康診断など幅広い分野での応用が可能な方法である。
　イヌなどのペットにおいては詳細な検査を行うためには全身麻酔が必要となるため、ヒトに比べ歯周病の判定が困難であることと、発見が遅くなる傾向がある。そのため重症化してからの発見が多く、本発明のように非侵襲性の検査方法により歯周病が検出できることで、早期の治療が開始できる。さらに、全身麻酔によるペットへの負担を低減するとともに高額なペットの医療費低減にも資するものである。

Claims (6)

  1. 歯周病検査のための唾液採取方法であり、唾液を定量的に吸収可能な不織布からなる唾液採取用部材に人又はイヌやネコなどの動物の唾液を吸収させることにより唾液を採取する唾液採取方法。
  2. 前記不織布は、ＪＩＳ　Ｐ８１２４：１９９８による坪量３０～８０ｇ／ｍ２、シート密度０．０１～０．０５ｇ／ｃｍ３、ＫＥＳ法による圧縮仕事量が０．８５～５．０ｇｆ・ｃｍ／ｃｍ２、湿潤引張強度が８Ｎ／１００ｍｍ以上である不織布である請求項１記載の唾液採取方法。
  3. 請求項１記載の唾液採取方法により唾液採取後、唾液を含む唾液採取部材を遠心分離ろ過フィルターに装着して遠心分離し、遠心分離後の前記唾液採取部材中に保持されている血球成分を観察する出血有無の判定方法。
  4. 請求項３における遠心分離で得られた液相中の催炎性ラクトフェリン・ポリペプチドと潜血測定を併せて測定することにより、歯周病の進行状態を判定する方法。
  5. 歯周病検査のための唾液採取方法に用いられる唾液採取部材であり、唾液を定量的に吸収可能な不織布からなる唾液採取用部材。
  6. 前記不織布は、ＪＩＳ　Ｐ８１２４：１９９８による坪量３０～８０ｇ／ｍ２、シート密度０．０１～０．０５ｇ／ｃｍ３、ＫＥＳ法による圧縮仕事量が０．８５～５．０ｇｆ・ｃｍ／ｃｍ２、湿潤引張強度が８Ｎ／１００ｍｍ以上である不織布である請求項５記載の唾液採取部材。
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