JP2002080392A - 細胞増殖促進剤及びこれを含有する器官再生用の組成物 - Google Patents

細胞増殖促進剤及びこれを含有する器官再生用の組成物

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JP2002080392A
JP2002080392A JP2000266422A JP2000266422A JP2002080392A JP 2002080392 A JP2002080392 A JP 2002080392A JP 2000266422 A JP2000266422 A JP 2000266422A JP 2000266422 A JP2000266422 A JP 2000266422A JP 2002080392 A JP2002080392 A JP 2002080392A
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Masaki Kamakura
昌樹 鎌倉
Toshiyuki Fukuda
寿之 福田
Makoto Mitani
信 三谷
Hirotaka Miyazaki
博隆 宮崎
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 生体の器官の再生能力を向上させしめる手段
を提供する。 【解決手段】 下記に示すタンパク質からなる細胞増殖
促進剤を医薬や食品などの組成物に含有させる。 1)ゲル電気泳動において単一バンドを形成する。 2)還元条件下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定される分子量が約57キロダルトンで
ある。 3)Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Aspのアミノ酸
配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞増殖促進剤と
それを含有する、器官再生用の食品などの組成物に関す
る。
【0002】
【従来の技術】生命体が生命を営んでいく過程に於いて
は、その生命体を構成する器官を損傷する機会が少なく
ない。この様な障害の原因としては事故などの物理的な
損傷や感染症などに起因する生物学的な損傷、或いは化
学物質に起因する化学的な損傷などが挙げられる。この
様な損傷は、疾病などの直接的な要因よりも、生体に及
ぼすダメージが少なくないのでその適切な処置が望まれ
ている。しかしながら、この様に損傷を受けた器官の修
復は通常は生体の自己再生能力に頼るしかなく、感染症
を防ぎつつも、充分な栄養状態を保ち、安静にしている
のが唯一の対応であった。即ち、生体の器官の再生能力
を向上させしめる手段の開発が望まれていた。
【0003】一方、ローヤルゼリー中に含まれる、下記
に示す性質を有するタンパク質についての知見は無く、
従って、このものが優れた細胞増殖作用を有し、以て器
官再生に有用な働きを発現することは全く知られていな
かった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、この様な状
況下為されたものであり、生体の器官の再生能力を向上
させしめる手段を提供することを課題とする。
【0005】
【課題の解決手段】この様な実状に鑑みて、本発明者ら
は、生体の器官の再生能力を向上させしめる手段を求め
て、鋭意研究努力を重ねた結果、以下に示す性質を有す
るタンパク質にその様な作用が備わっていることを見い
だし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下
に示す技術に関するものである。 (1)下記に示すタンパク質からなる細胞増殖促進剤。 1)ゲル電気泳動において単一バンドを形成する。 2)還元条件下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定される分子量が約57キロダルトンで
ある。 3)配列式1のアミノ酸番号1〜8のアミノ酸配列を含
む。 (2)細胞が肝細胞であることを特徴とする、(1)に
記載の細胞増殖促進剤。 (3)(1)又は(2)に記載の細胞増殖促進剤を含有
する器官再生用の組成物。 (4)器官が肝臓であることを特徴とする、(3)に記
載の器官再生用の組成物。(5)(1)又は(2)に記
載の細胞増殖促進剤を、ローヤルゼリーの形態で含 有することを特徴とする、(3)又は(4)に記載の器
官再生用の組成物。 (6)ローヤルゼリーが(1)又は(2)に記載の細胞
増殖促進剤を、全タンパク質量に対して、9重量%以上
含有するものであることを特徴とする、(5)に記載の
器官再生用の組成物。 (7)再生されるべき器官が、肝臓であることを特徴と
する、(4)〜(6)何れか1項に記載の器官再生用の
組成物。 (8)食品であることを特徴とする、(4)〜(7)何
れか1項に記載の器官再生用の組成物。以下、本発明に
ついて実施の形態を中心に更に詳細に説明を加える。
【0006】
【発明の実施の形態】(1) 本発明の細胞増殖促進剤
であるタンパク質 本発明のタンパク質は、ローヤルゼリー中に存在し、以
下の性質を有することを特徴とする。尚、このタンパク
質について、以後、単に57キロダルトンのタンパク質
と表現することがある。 1)ゲル電気泳動において単一バンドを形成する。 2)還元条件下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定される分子量が約57キロダルトンで
ある。 3) 配列式1のアミノ酸番号1〜8のアミノ酸配列を
含む。 この様な本発明の細胞増殖促進剤であるタンパク質は、
次に示す手段によってその存在或いは含有量を確認した
り、分離精製したりすることができる。
【0007】1.本発明の細胞増殖促進剤であるタンパ
ク質の分離 凍結乾燥したローヤルゼリーを0.7重量%で10mM
のトリス塩酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、UF10
万(Miniplate100;限外濾過)で6倍濃
縮、7回脱塩を行い、その濾液をさらにUF3万(Mi
niplate30;限外濾過)で8倍濃縮、1回脱塩
を行い、分子量10万〜3万の分画を得た。上記の分子
量10万〜3万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画す
ることで、分子量57キロダルトンタンパク質を分離で
きる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常
に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー
株式会社製DEAEーToyopearl650Mをカ
ラムとして用いて、20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.0)を展開液A、20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.0)と1MNaClを展開液Bとしてグラジェント
により、流速を5ml/min、280nmの吸光度で
検出し、2.5ml/チューブで分画したフラクション
No.119〜127に分子量57キロダルトンのタン
パク質画分を検出することができる。さらにこの画分を
ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製することが
でき、これは通常に知られている方法に従って行えば良
く、この様な好ましい例としては、例えば、ファルマシ
ア株式会社製HiLoad16/60Superdex
200をカラムとして用いて、0.15M塩化ナトリウ
ム含有50mMリン酸カリウムバッファーpH7.0を
展開液とし、流速を1.0ml/min、カラム温度を
35℃に設定し、280nmの吸光度で検出し、2.0
ml/チューブで分画したフラクションNo.35〜4
3に分子量57キロダルトンのタンパク質を検出するこ
とが出来る。(電気泳動にて同一タンパク質を確認)ま
た、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、上記タンパ
ク質は、分子量57キロダルトンモノマータンパク質で
あると確定された。又、このタンパク質は、N−グルコ
シダーゼFによって消化され、消化後の分子量が48キ
ロダルトンになるため糖タンパク質であることを本発明
者は見出している。
【0008】2.高速液体クロマトグラフィーによるロ
ーヤルゼリー中の分子量57キロダルトンタンパク質の
分析 上記の分子量57キロダルトンタンパク質は、高速液体
クロマトグラフィーによるゲル濾過でも識別・定量する
ことが出来る。従って、この様な分析結果をもって、品
質管理や効果の鑑別・評価に使用することもできる。か
かるゲル濾過分析は、通常に知られている方法に従って
行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ト
−ソー株式会社製TSKゲルG3000SWをカラムと
して用いて、0.3M塩化ナトリウム、0.05%アジ
化ナトリウム含有0.1M燐酸緩衝液(pH7.0)を
展開液とし、流速を0.3ml/min、カラム温度を
35℃に設定し、280nmの吸光度で検出した結果、
このタンパク質を求めることが挙げられる。この分析条
件下では、上記分子量57キロダルトンタンパク質は、
保持時間25分〜30分にピークとして現れる。(電気
泳動にて同一蛋白質を確認)また、既知分子量のゲル濾
過分析の結果より、57キロダルトンと確定された。従
って、本発明の細胞増殖促進剤である、この57キロダ
ルトンのタンパク質について定性或いは定量分析を行う
場合には、この様な高速液体クロマトグラフィーを用い
れば良い。
【0009】3.電気泳動によるローヤルゼリー中の分
子量57キロダルトンのタンパク質の定性方法 本発明のローヤルゼリー中の分子量57キロダルトンの
タンパク質は、電気泳動によりタンパク質の構成を分析
し、有効成分であるタンパク質の分子量を特定すること
を特徴とする。電気泳動の方法としては、該有効タンパ
ク質が特定できれば特段の限定は受けないが、好ましい
方法は、水溶性ローヤルゼリータンパク質(10%ロー
ヤルゼリー水溶液(W/V))をポリアクリルアミドゲ
ル(10%均一)にて、電流20mAで電気泳動し、ク
マシーブリリアントブルーにより染色して、タンパク質
を特定する方法である。この様な電気泳動に於ける本発
明の蛋白質の分子量はその精製タンパク質のSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、57キロダルト
ンと決定された。
【0010】本発明の細胞増殖促進剤である57キロダ
ルトンのタンパク質は、上記のような性質を有しローヤ
ルゼリーそれも新鮮なローヤルゼリー中に含まれている
が、このものを後記に示す組成物に含有させる場合に
は、ローヤルゼリー中より、上記のゲル濾過の手法に従
って分離し、純粋なタンパク質として含有させることも
できるし、ローヤルゼリーの形態で含有させることもで
きる。通常は単離コストが高いため、ローヤルゼリーそ
のままの形で、或いは水可溶分を限外濾過などの精製を
加えた画分として含有させることが好ましく、この様な
場合においては、該タンパク質の含有量がローヤルゼリ
ー蛋白質当たり9重量%以上であるローヤルゼリーを用
いることが好ましい。これは、このような57キロダル
トンのタンパク質が分解しやすいため、この量を充分に
含んだ新鮮なものを用いることが、効果の安定性の維持
に好ましいからである。後記本発明の組成物に於ける、
本発明の細胞増殖促進剤の好ましい含有量は、このもの
が1日あたり、1〜1000mg、更に好ましくは、1
〜100mg摂取するように設計するのが好ましい。か
かる本発明の細胞増殖促進剤は、細胞増殖を促進する作
用に優れ、損傷したり、ダメージを受けた器官の細胞分
裂を促進し、これらの速やかな修復を具現化する作用を
有する。この様な作用を受けるべき適当な器官として
は、代謝・解毒などの重要な役割を担っている肝臓や、
損傷消耗の激しい、外部からの異物侵入を防ぐ器官であ
る皮膚などが特に好適に挙げられる。
【0011】(2) 本発明の器官再生用の組成物 本発明の器官再生用の組成物は、上記本発明の細胞増殖
促進剤を含有することを特徴とし、該細胞増殖促進剤の
損傷したり、ダメージを受けた器官の細胞分裂を促進
し、これらの速やかな修復を具現化する作用を利用した
ものである。組成物としては、肝臓や胃、小腸、大腸な
どの損傷の修復のためには経口投与組成物が好ましく、
中でも、安全性の高さと摂取の容易さから食品が好まし
く例示でき、皮膚などの修復のためには、皮膚外用組成
物、取り分け、化粧料が特に好ましく例示できる。これ
らの組成物に於ける、本発明の細胞増殖促進剤の好まし
い含有量は、0.01〜10重量%であり、更に好まし
くは0.05〜1重量%である。これは少なすぎると効
果を発揮できない場合があり、多すぎると効果が頭打ち
になり、処方の自由度を損なう場合があるからである。
本発明の組成物においては、上記細胞増殖促進剤以外
に、通常、上記の組成物で使用される任意成分を含有す
ることができる。かかる任意成分としては、食品組成物
や経口医薬組成物では、白糖、乳糖等の賦形剤、デンプ
ン、ゼラチン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等
の崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等の界
面活性剤、タルク、ロウ類等の滑沢剤、軽質無水ケイ
酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル等の流動促進剤、生理
食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、矯味矯臭剤、着色
剤、殺菌剤、防腐剤、香料等が挙げられ、化粧料などの
皮膚外用剤では、スクワラン、マイクロクリスタリンワ
ックス、流動パラフィン等の炭化水素類、ジメチコン等
のシリコーン類、ホホバ油などのエステル類、オレイン
酸やステアリン酸などの脂肪酸類、オリーブ油や牛脂な
どのトリグリセライド類、セタノールやオレイルアルコ
ールなどの高級アルコール類、脂肪酸モノグリセライ
ド、ソルビタン脂肪酸、ポリオキシエチレン脂肪酸、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレ
ン硬化ひまし油等の非イオン性界面活性剤類、ラウリル
硫酸ナトリウムやスルホコハク酸エステルなどのアニオ
ン性界面活性剤類、1,3−ブタンジオール、グリセリ
ン、1,2−ペンタンジオール等の多価アルコール類が
好ましく例示できる。これらの成分を常法に従って処理
することにより、本発明の組成物を製造することができ
る。
【0012】
【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明について更
に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ
限定されないことは言うまでもない。
【0013】<実施例1>上記のごとく、ローヤルゼリ
ーをゲル濾過カラムで精製して得た、本発明の細胞増殖
促進剤である、57キロダルトンのタンパク質の細胞増
殖促進作用を、肝細胞を用いて調べた。即ち、ウィスタ
ー系ラット7週齢(体重:約150g)の肝臓をハンク
スバッファーにて灌流後、コラゲナーゼ溶液で灌流し肝
細胞を得た。これをペニシリンとストレプトマイシンを
それぞれ100mg/l含有する、5%FBS添加L1
5培地で2回洗浄し、その後、ペニシリンとストレプト
マイシンをそれぞれ100mg/l含有し、インスリン
10−6M、デキサメタゾン10−5Mを含有する5%
FBS添加L15培地にて37℃、3時間、CO2イン
キュベーターで培養し、その後、無血清培地で、同条件
で22時間培養した。無血清培地に添加したサンプル
は、57キロダルトンのタンパク質(0.5mg/m
l)、牛血清アルブミン(1.5mg/ml)、ポジテ
ィブコントロールとして、5%FBSと無添加の対象群
とした。その後、同培地にトリチウムラベルチミジン
(2μCi/ml)を加え、37℃、2時間培養後、培
地を除去し、PBSで2回洗浄し、10%TCA固定の
後、0.5N NaOHにて細胞を可溶化した後、細胞
中に取り込まれたトリチウムラベルチミジンを液体シン
チレーターにて測定した。結果を図1に示す。この結果
から、57キロダルトンのタンパク質に細胞増殖促進作
用があることがわかる。さらに、同実験にて、57キロ
ダルトンのタンパク質を0、01mg〜1mgまでの濃
度で培地に添加し培養した時、図2に示す様にドーズデ
ペンデントに細胞中へのチミジンの取り込み量が増加し
ていることがわかる。即ち、本発明の細胞増殖促進剤
(57キロダルトンのタンパク質)により、細胞増殖が
促進し、ラベル化チミジンの取り込みが高まっているこ
とがわかる。
【0014】<実施例2>10週齢のウィスター系のラ
ット(雄性、210〜240g)1群10匹を開腹し、
肝臓の半葉を結索、切除し、ペニシリンで処置した後、
縫合した。1群には、固形餌を粉砕しこの中に5重量%
57キロダルトンのタンパク質を混ぜ込み、加圧成形し
て、餌とし、このものを1週間投与した。もう1群は固
形餌を1週間投与した。8日後開腹し、肝臓を取り出し
重量を計測したところ、57キロダルトンのタンパク質
投与群は肝臓重量が、5.98±0.87gであったの
に対し、通常餌群では4.53±2.31gであり、投
与群において明らかなリカバリーの促進が認められた。
【0015】<実施例3>下記に示す処方に従って、本
発明の組成物である化粧料(化粧水)を作成した。即
ち、処方成分を80℃で加熱攪拌可溶化し、攪拌冷却し
て化粧水を得た。このものを、背部皮膚を剃毛し、パン
チしたモルモット(雄性、300〜400g、1群6
匹)に投与しパンチ部位の治癒を観察した。対照群とし
て、57キロダルトンのタンパク質を水に置換したもの
を用いた。処置は1日1回0.03mlを部位に塗布
し、これを1週間続けた。観察は最終投与の24時間後
に、++:対照群の平均的治癒に比して極めて良好に治
癒、+:対照群の平均的治癒に比して明らかに治癒、
±:対照群の平均的治癒に比してやや良好に治癒、−:
対照群の平均乃至はそれ以下程度の治癒の基準で判定し
た。判定結果は、++が1例、+が3例、±が1例及び
−が1例であり、本発明の組成物の投与により、皮膚に
於ける細胞増殖が促進され、治癒が早まっていることが
わかった。 グリセリン 3 重量部 1,2−ペンタンジオール 5 重量部 イソプレングリコール 2 重量部 57キロダルトンのタンパク質 0.1重量部 フェノキシエタノール 0.2重量部 メチルパラベン 0.1重量部 エタノール 5 重量部 水 84.6重量部
【0016】<実施例4>下記に示す処方に従って、本
発明の組成物である化粧料(化粧水)を作成した。即
ち、処方成分を80℃で加熱攪拌可溶化し、攪拌冷却し
て化粧水を得た。このものを、背部皮膚を剃毛し、パン
チしたモルモット(雄性、300〜400g、1群6
匹)に投与しパンチ部位の治癒を観察した。対照群とし
て、57キロダルトンのタンパク質を水に置換したもの
を用いた。処置は1日1回0.03mlを部位に塗布
し、これを1週間続けた。観察は最終投与の24時間後
に、++:対照群の平均的治癒に比して極めて良好に治
癒、+:対照群の平均的治癒に比して明らかに治癒、
±:対照群の平均的治癒に比してやや良好に治癒、−:
対照群の平均乃至はそれ以下の程度の治癒の基準で判定
した。判定結果は、++が1例、+が2例、±が2例及
び−が1例であり、本発明の組成物の投与により、皮膚
に於ける細胞増殖が促進され、治癒が早まっていること
がわかった。 グリセリン 3 重量部 1,2−ペンタンジオール 5 重量部 イソプレングリコール 2 重量部 ローヤルゼリー 10 重量部 (全タンパク質に対する57キロダルトンのタンパク質の含有量11.2%) フェノキシエタノール 0.2重量部 メチルパラベン 0.1重量部 エタノール 5 重量部 水 74.7重量部
【0017】<実施例5>下記に示す処方に従って、健
康食品を作成した。即ち、処方成分をフローコーターに
仕込み、20重量部の水を噴霧しながら、送風して造粒
し、70℃の温風を送風して乾燥させ顆粒を得た。この
顆粒を打錠し、素錠を得、これに10重量部のセラック
を80%エタノール水溶液にとかしてコーティングし、
10重量部の白糖と1重量部のゼラチンで糖衣を施し、
健康食品用の錠剤を得た。このものをGPT値が300
の肝炎が疑われる人に、1日1g1ヶ月食してもらった
ところ、213に軽快した。 結晶セルロース 40重量部 デンプン 20重量部 ヒドロキシプロピルセルロース 10重量部 57キロダルトンのタンパク質 1重量部 乳糖 8重量部
【0018】<実施例6>下記に示す処方に従って、健
康食品を作成した。即ち、処方成分をフローコーターに
仕込み、20重量部の水を噴霧しながら、送風して造粒
し、70℃の温風を送風して乾燥させ顆粒を得た。この
顆粒を打錠し、素錠を得、これに10重量部のセラック
を80%エタノール水溶液にとかしてコーティングし、
10重量部の白糖と1重量部のゼラチンで糖衣を施し、
健康食品用の錠剤を得た。このものをGPT値が421
の肝炎が疑われる人に、1日1g1ヶ月食してもらった
ところ、343に軽快した。 結晶セルロース 40重量部 デンプン 20重量部 ヒドロキシプロピルセルロース 10重量部 ローヤルゼリー 9重量部 (全タンパク質に対する57キロダルトンのタンパク質の含量11.2%)
【0019】
【発明の効果】本発明によれば、生体の器官の再生能力
を向上させしめる手段を提供することができる。
【0020】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ポーラ化成工業株式会社 <120> 細胞増殖促進剤及びこれを含有する器官再生用の組成物 <130> P2000109 <140> <141>2000-09-04 <160> 1 <170> PatentIn Ver.2.0
【0021】 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Apis mellifera <220> <221> UNSURE <222> (24) <223> Xaa=unknown <400> 1 Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His 1 2 10 10 Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp 20 25
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1の57キロダルトン蛋白質の細胞増
殖促進作用を示す図である。
【図2】 実施例1の57キロダルトン蛋白質の添加濃
度と細胞増殖促進の関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 35/64 A61P 1/16 A61P 1/16 43/00 105 43/00 105 C07K 14/435 ZNA // C07K 14/435 ZNA A61K 37/02 (72)発明者 宮崎 博隆 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560番地 ポ ーラ化成工業株式会社戸塚研究所内 Fターム(参考) 4B018 LB10 LE02 MD20 MD76 ME14 4C083 AA071 AA072 AC102 AC112 AC122 AC172 AC482 AD412 CC04 DD23 EE13 4C084 AA02 BA02 BA08 BA22 DB62 NA14 ZA752 ZB212 4C087 BB22 CA06 CA16 CA33 NA14 ZA75 ZB21 4H045 AA10 BA10 CA51 DA01 EA28 FA71 GA22 GA30

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記に示すタンパク質からなる細胞増殖
    促進剤。 1) ローヤルゼリー中に存在し、該タンパク質が非変
    性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンド
    を形成する。 2) 還元条件下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル
    電気泳動により測定される分子量が約57キロダルトン
    である。 3)配列式1のアミノ酸番号1〜8のアミノ酸配列を含
    む。
  2. 【請求項2】 細胞が肝細胞であることを特徴とする、
    請求項1に記載の細胞増殖促進剤。
  3. 【請求項3】 請求項1又は2に記載の細胞増殖促進剤
    を含有する器官再生用の組成物。
  4. 【請求項4】 器官が肝臓であることを特徴とする、請
    求項3に記載の器官再生用の組成物。
  5. 【請求項5】 請求項1又は2に記載の細胞増殖促進剤
    を、ローヤルゼリーの形態で含有することを特徴とす
    る、請求項3又は4に記載の器官再生用の組成物。
  6. 【請求項6】 ローヤルゼリーが請求項1又は2に記載
    の細胞増殖促進剤を、ローヤルゼリーの全タンパク質量
    に対して、9重量%以上含有するものであることを特徴
    とする、請求項5に記載の器官再生用の組成物。
  7. 【請求項7】 再生されるべき器官が、肝臓であること
    を特徴とする、請求項4〜6何れか1項に記載の器官再
    生用の組成物。
  8. 【請求項8】 食品であることを特徴とする、請求項4
    〜7何れか1項に記載の器官再生用の組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2004099503A (ja) * 2002-09-09 2004-04-02 Nonogawa Shoji Kk Hgf産生促進剤およびこれを含有する化粧料

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