JP2002065259A - 核酸標識方法および核酸標識用キット - Google Patents
核酸標識方法および核酸標識用キットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 逆転写酵素反応によるｍＲＮＡからの第一鎖
ｃＤＮＡ合成の際に、第一鎖ｃＤＮＡへの標識物質の取
り込み効率が従来より大幅に向上する核酸標識方法およ
び核酸標識キットの提供。 【解決手段】 基質であるデオキシリボヌクレオチド三
リン酸の溶液中で所定のメッセンジャーＲＮＡから逆転
写酵素反応により第一鎖相補的ＤＮＡを合成する際に、
プライマーとして、４種のヌクレオチドからなり４ヌク
レオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダ
ムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物質分
子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させたもの
を用いる。
ｃＤＮＡ合成の際に、第一鎖ｃＤＮＡへの標識物質の取
り込み効率が従来より大幅に向上する核酸標識方法およ
び核酸標識キットの提供。 【解決手段】 基質であるデオキシリボヌクレオチド三
リン酸の溶液中で所定のメッセンジャーＲＮＡから逆転
写酵素反応により第一鎖相補的ＤＮＡを合成する際に、
プライマーとして、４種のヌクレオチドからなり４ヌク
レオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダ
ムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物質分
子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させたもの
を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えばＤＮＡチッ
プによる検体の遺伝子発現レベルの測定などに用いられ
る、試料核酸への標識方法および核酸標識用キットに関
するものである。
プによる検体の遺伝子発現レベルの測定などに用いられ
る、試料核酸への標識方法および核酸標識用キットに関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、ルミネセンス（蛍光、燐光）を測
定対象とする非放射性標識物質を用いた極微量のハイブ
リダイゼーションシグナル検出法を包含する技術とし
て、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップが開発
されている。
定対象とする非放射性標識物質を用いた極微量のハイブ
リダイゼーションシグナル検出法を包含する技術とし
て、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップが開発
されている。
【０００３】この新技術は、ＤＮＡをガラス基盤上に極
微量ずつ配列させたものからなり、基盤上にオリゴヌク
レオチドを合成したもの（以下、オリゴアレイと記す）
と、２本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ産物を使う場合（以下、
ＰＣＲ産物アレイと記す）とに大別される。
微量ずつ配列させたものからなり、基盤上にオリゴヌク
レオチドを合成したもの（以下、オリゴアレイと記す）
と、２本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ産物を使う場合（以下、
ＰＣＲ産物アレイと記す）とに大別される。
【０００４】この新技術は、発現遺伝子の解析を行える
ものである。例えば、調べたい検体の核酸を標識してお
き、これらＤＮＡチップの各スポットに振りかければ配
列が一致している部分に結合するので、その標識物質の
強度測定により特定の遺伝子の発現レベルを測定するこ
とができる。この場合、対象とする試料はメッセンジャ
ーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと記す）である。
ものである。例えば、調べたい検体の核酸を標識してお
き、これらＤＮＡチップの各スポットに振りかければ配
列が一致している部分に結合するので、その標識物質の
強度測定により特定の遺伝子の発現レベルを測定するこ
とができる。この場合、対象とする試料はメッセンジャ
ーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと記す）である。
【０００５】従って、検体である核酸試料には予め標識
しておく必要がある。オリゴアレイの場合は、標識方法
として２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを
用いて標識済リボヌクレオチド三リン酸の存在下で合成
して標識物質を取り込んだＲＮＡを使用している。ま
た、ＰＣＲ産物アレイの場合は、ＲＮＡを鋳型とし、逆
転写酵素とオリゴデオキシミジンヌクレオチド（オリゴ
ｄＴ）を用いて標識済ヌクレオチド三リン酸の存在下で
合成して標識物質を取り込んだ第一鎖相補的ＤＮＡ（以
下、ｃＤＮＡと記す）を使用している。
しておく必要がある。オリゴアレイの場合は、標識方法
として２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを
用いて標識済リボヌクレオチド三リン酸の存在下で合成
して標識物質を取り込んだＲＮＡを使用している。ま
た、ＰＣＲ産物アレイの場合は、ＲＮＡを鋳型とし、逆
転写酵素とオリゴデオキシミジンヌクレオチド（オリゴ
ｄＴ）を用いて標識済ヌクレオチド三リン酸の存在下で
合成して標識物質を取り込んだ第一鎖相補的ＤＮＡ（以
下、ｃＤＮＡと記す）を使用している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、この新
技術における遺伝子発現レベルの測定では、対象とする
試料は、ｍＲＮＡである。しかし、オリゴアレイの場合
は、二本鎖ＤＮＡを標識するための出発材料とする場合
もあるため、ｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡへ変換する過
程、即ち二本鎖ｃＤＮＡの合成を行う必要も生じる。
技術における遺伝子発現レベルの測定では、対象とする
試料は、ｍＲＮＡである。しかし、オリゴアレイの場合
は、二本鎖ＤＮＡを標識するための出発材料とする場合
もあるため、ｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡへ変換する過
程、即ち二本鎖ｃＤＮＡの合成を行う必要も生じる。
【０００７】一方、ＰＣＲ産物アレイの場合は、標識す
るための出発材料としてｍＲＮＡのみを必要とする。即
ち、標識された核酸試料を得るために、オリゴアレイの
場合ではＰＣＲ産物アレイの場合よりも必要工程数が多
くなる。
るための出発材料としてｍＲＮＡのみを必要とする。即
ち、標識された核酸試料を得るために、オリゴアレイの
場合ではＰＣＲ産物アレイの場合よりも必要工程数が多
くなる。
【０００８】さらに、オリゴアレイでは、標識物質とし
てビオチンが用いられるため、最終的な標識物測定の前
に、予めビオチンに結合するアビジンにルミネセンスを
発する色素を結合させたアビジン−色素複合体との反応
が必要となる。
てビオチンが用いられるため、最終的な標識物測定の前
に、予めビオチンに結合するアビジンにルミネセンスを
発する色素を結合させたアビジン−色素複合体との反応
が必要となる。
【０００９】また、ＰＣＲ産物アレイでは、標識のため
に蛍光色素を共有結合したデオキシウリジン三リン酸が
用いられているため、蛍光色素は核酸中に直接取り込ま
れて蛍光を発することができる。このように、標識物質
そのものを比較しても、オリゴアレイでは、ＰＣＲ産物
アレイの場合より必要工程数が多くなる。
に蛍光色素を共有結合したデオキシウリジン三リン酸が
用いられているため、蛍光色素は核酸中に直接取り込ま
れて蛍光を発することができる。このように、標識物質
そのものを比較しても、オリゴアレイでは、ＰＣＲ産物
アレイの場合より必要工程数が多くなる。
【００１０】以上のように、ｍＲＮＡを出発材料として
標識から最終的な物理量測定の工程へ至る間、必要とす
る工程が少ないほど出発材料の情報を正確に反映できる
という点から、現行のオリゴアレイよりもＰＣＲ産物ア
レイの方が優位である。
標識から最終的な物理量測定の工程へ至る間、必要とす
る工程が少ないほど出発材料の情報を正確に反映できる
という点から、現行のオリゴアレイよりもＰＣＲ産物ア
レイの方が優位である。
【００１１】しかしながら、製作効率に注目した場合、
オリゴヌクレオチドは自動化して合成できるのに対し、
ＰＣＲ産物を自動化して得ることはできないため、オリ
ゴアレイが優位となる。さらに、アレイを構成する塩基
配列の正確性に着目した場合も、自動化化学反応に基づ
く合成オリゴヌクレオチドは、酵素反応に基づくＰＣＲ
産物の塩基配列に比較して明らかに優位である。
オリゴヌクレオチドは自動化して合成できるのに対し、
ＰＣＲ産物を自動化して得ることはできないため、オリ
ゴアレイが優位となる。さらに、アレイを構成する塩基
配列の正確性に着目した場合も、自動化化学反応に基づ
く合成オリゴヌクレオチドは、酵素反応に基づくＰＣＲ
産物の塩基配列に比較して明らかに優位である。
【００１２】以上のことから、現行のオリゴアレイとＰ
ＣＲ産物アレイでは、互いに比較すると優位性と劣性が
それぞれに見て取れる。そこで、これら２種の異なるア
レイ技術の優位性だけを統合する方法論が望まれる。ア
レイ技術において正確な測定結果を得るためには、ま
ず、アレイ上に供される試料に関して、検体である出発
材料の情報をより正確に反映されたものとすることと共
に、高い効率で標識することが重要である。
ＣＲ産物アレイでは、互いに比較すると優位性と劣性が
それぞれに見て取れる。そこで、これら２種の異なるア
レイ技術の優位性だけを統合する方法論が望まれる。ア
レイ技術において正確な測定結果を得るためには、ま
ず、アレイ上に供される試料に関して、検体である出発
材料の情報をより正確に反映されたものとすることと共
に、高い効率で標識することが重要である。
【００１３】そこで、現状では、ＰＣＲ産物アレイで用
いられている工程数の少ない標識方法、即ちＲＮＡを鋳
型として逆転写酵素とオリゴdTを用いて標識済ヌクレオ
チド三リン酸の存在下で第一鎖ｃＤＮＡを合成する方法
を基本として、より高い効率で試料核酸が標識物質を取
り込めるように改良された核酸標識方法を得ることが最
も望ましいと思われる。このような高い効率で試料核酸
への標識が行える標識方法が得られれば、ＤＮＡマイク
ロアレイ用に限らず、ハイブリダイゼーションを利用し
たＤＮＡ、ＲＮＡの解析、判定一般に有効であることは
言うまでもない。
いられている工程数の少ない標識方法、即ちＲＮＡを鋳
型として逆転写酵素とオリゴdTを用いて標識済ヌクレオ
チド三リン酸の存在下で第一鎖ｃＤＮＡを合成する方法
を基本として、より高い効率で試料核酸が標識物質を取
り込めるように改良された核酸標識方法を得ることが最
も望ましいと思われる。このような高い効率で試料核酸
への標識が行える標識方法が得られれば、ＤＮＡマイク
ロアレイ用に限らず、ハイブリダイゼーションを利用し
たＤＮＡ、ＲＮＡの解析、判定一般に有効であることは
言うまでもない。
【００１４】本発明の目的は、上記問題点に鑑み、逆転
写酵素反応によるｍＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡ合成の
際に、第一鎖ｃＤＮＡへの標識物質の取り込み効率が従
来より大幅に向上する核酸標識方法を提供することにあ
る。
写酵素反応によるｍＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡ合成の
際に、第一鎖ｃＤＮＡへの標識物質の取り込み効率が従
来より大幅に向上する核酸標識方法を提供することにあ
る。
【００１５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１に記載の発明に係る核酸標識方法は、基質
であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸の溶液中で所
定のメッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素反応により第
一鎖ｃＤＮＡを合成する際に、プライマーとして、４種
のヌクレオチドからなり４ヌクレオチド以上４５ヌクレ
オチド以下の長さを持つランダムヌクレオチドオリゴマ
ーの５’端に、単位標識物質分子が複数個連なってなる
標識物質を予め結合させたものを用いることを特徴とす
るものである。
め、請求項１に記載の発明に係る核酸標識方法は、基質
であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸の溶液中で所
定のメッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素反応により第
一鎖ｃＤＮＡを合成する際に、プライマーとして、４種
のヌクレオチドからなり４ヌクレオチド以上４５ヌクレ
オチド以下の長さを持つランダムヌクレオチドオリゴマ
ーの５’端に、単位標識物質分子が複数個連なってなる
標識物質を予め結合させたものを用いることを特徴とす
るものである。
【００１６】また、請求項２に記載の発明に係る核酸標
識方法は、請求項１に記載の核酸標識方法において、前
記デオキシヌクレオチド三リン酸溶液は、標識物質を結
合したデオキシヌクレオチド三リン酸が混在することを
特徴とするものである。
識方法は、請求項１に記載の核酸標識方法において、前
記デオキシヌクレオチド三リン酸溶液は、標識物質を結
合したデオキシヌクレオチド三リン酸が混在することを
特徴とするものである。
【００１７】さらに、請求項３に記載の発明に係る核酸
標識方法は、請求項２に記載の核酸標識方法において、
前記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオキシ
ヌクレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが同一物
質であることを特徴とするものである。
標識方法は、請求項２に記載の核酸標識方法において、
前記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオキシ
ヌクレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが同一物
質であることを特徴とするものである。
【００１８】また、請求項４に記載の発明に係る核酸標
識方法は、請求項２に記載の核酸標識方法において、前
記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオキシヌ
クレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが互いに異
なる物質であることを特徴するものである。
識方法は、請求項２に記載の核酸標識方法において、前
記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオキシヌ
クレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが互いに異
なる物質であることを特徴するものである。
【００１９】さらにまた、請求項５に記載の発明に係る
核酸標識方法は、請求項４に記載の核酸標識方法におい
て、前記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオ
キシヌクレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが、
蛍光共鳴エネルギー移動現象を生ずる蛍光色素物質であ
ることを特徴とするものである。
核酸標識方法は、請求項４に記載の核酸標識方法におい
て、前記プライマーに結合させた標識物質と、前記デオ
キシヌクレオチド三リン酸に結合させた標識物質とが、
蛍光共鳴エネルギー移動現象を生ずる蛍光色素物質であ
ることを特徴とするものである。
【００２０】また、請求項６に記載の発明に係る核酸標
識キットは、プライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌ
クレオチド三リン酸溶液とを備えた試薬キットであっ
て、前記プライマーは、４種のヌクレオチドからなり４
ヌクレオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つラ
ンダムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物
質分子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させた
ものである。
識キットは、プライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌ
クレオチド三リン酸溶液とを備えた試薬キットであっ
て、前記プライマーは、４種のヌクレオチドからなり４
ヌクレオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つラ
ンダムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物
質分子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させた
ものである。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の核酸標識方法において
は、ｍＲＮＡから逆転写酵素反応によって第一鎖ｃＤＮ
Ａを合成する際にプライマーとして用いるランダムヌク
レオチドオリゴマーを、予めその５’端に標識物質を結
合させておいたものとすることによって、該プライマー
の３’端から生合成が開始されて得られたｃＤＮＡに
は、必ず標識物質が取り込まれることとなるため、従来
の核酸標識方法に比べて簡便な工程でありながらも格段
に高い標識効率を得ることができる。しかも、本発明に
おける標識物質は、単位標識物質分子が複数個連なって
なるものであるため、一個の標識物質分子のみが標識さ
れる場合よりも検出感度が高く、本発明の方法によって
標識された核酸試料を用いれば、各種核酸解析や判定等
の測定精度を向上させることができる。
は、ｍＲＮＡから逆転写酵素反応によって第一鎖ｃＤＮ
Ａを合成する際にプライマーとして用いるランダムヌク
レオチドオリゴマーを、予めその５’端に標識物質を結
合させておいたものとすることによって、該プライマー
の３’端から生合成が開始されて得られたｃＤＮＡに
は、必ず標識物質が取り込まれることとなるため、従来
の核酸標識方法に比べて簡便な工程でありながらも格段
に高い標識効率を得ることができる。しかも、本発明に
おける標識物質は、単位標識物質分子が複数個連なって
なるものであるため、一個の標識物質分子のみが標識さ
れる場合よりも検出感度が高く、本発明の方法によって
標識された核酸試料を用いれば、各種核酸解析や判定等
の測定精度を向上させることができる。
【００２２】特に、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）用
の検体試料への標識においては、本発明の標識方法によ
れば、少ない工程数のまま従来のマイクロアレイ用標識
方法に比べて標識効率が格段に向上し、本発明の方法に
より標識された検体試料を用いてマイクロアレイによる
遺伝子発現レベルの測定を行えば、より正確な測定結果
を得ることができる。
の検体試料への標識においては、本発明の標識方法によ
れば、少ない工程数のまま従来のマイクロアレイ用標識
方法に比べて標識効率が格段に向上し、本発明の方法に
より標識された検体試料を用いてマイクロアレイによる
遺伝子発現レベルの測定を行えば、より正確な測定結果
を得ることができる。
【００２３】その他、本発明の核酸標識方法は、例え
ば、サザンブロット、ノーザンブロット等の核酸ブロッ
トとハイブリダイゼーションさせるプローブの標識に利
用することも可能である。また、本発明による標識方法
での出発材料となるｍＲＮＡは、組織あるいは細胞、組
織培養液または細胞培養液、体液、生検材料など、種々
の検体を起原としたものが対象となりうる。
ば、サザンブロット、ノーザンブロット等の核酸ブロッ
トとハイブリダイゼーションさせるプローブの標識に利
用することも可能である。また、本発明による標識方法
での出発材料となるｍＲＮＡは、組織あるいは細胞、組
織培養液または細胞培養液、体液、生検材料など、種々
の検体を起原としたものが対象となりうる。
【００２４】これらの検体からは、例えばグアニジウム
イソチアネート法やアシッドグアニジウム・フェノール
−クロロホルム法などの、従来から一般的にＲＮＡ抽出
方法として用いられている容易な方法でＲＮＡを抽出す
れば良い。このように検体から抽出したＲＮＡから、オ
リゴdT樹脂、オリゴdTセルロールカラム等を用いて、ｍ
ＲＮＡを選択的に濃縮した試料を得ることができる。
イソチアネート法やアシッドグアニジウム・フェノール
−クロロホルム法などの、従来から一般的にＲＮＡ抽出
方法として用いられている容易な方法でＲＮＡを抽出す
れば良い。このように検体から抽出したＲＮＡから、オ
リゴdT樹脂、オリゴdTセルロールカラム等を用いて、ｍ
ＲＮＡを選択的に濃縮した試料を得ることができる。
【００２５】また、請求項２に記載したように、プライ
マーへの標識物質結合だけでなく、基質であるデオキシ
ヌクレオチド三リン酸の溶液中にも、標識物質を結合し
たデオキシヌクレオチド三リン酸を混在しておけば、合
成された第一鎖ｃＤＮＡには、プライマー以外の部分に
も直接標識物質が取り込まれるため、最終的にルミネセ
ンスを測定する場合、全体的に検出感度が向上し、測定
精度の向上も可能となる。
マーへの標識物質結合だけでなく、基質であるデオキシ
ヌクレオチド三リン酸の溶液中にも、標識物質を結合し
たデオキシヌクレオチド三リン酸を混在しておけば、合
成された第一鎖ｃＤＮＡには、プライマー以外の部分に
も直接標識物質が取り込まれるため、最終的にルミネセ
ンスを測定する場合、全体的に検出感度が向上し、測定
精度の向上も可能となる。
【００２６】なお、プライマー側の標識物質とデオキシ
ヌクレオチド三リン酸側の標識物質とは、検出操作の簡
便性と効率性および検出感度の観点から、請求項３に記
載したように同じ物質を用いることが望ましい。但しこ
の場合、標識物質は、基質としてｃＤＮＡ中に取り込ま
れ得るデキシヌクレオチド三リン酸にも結合させておく
ものであるため、逆転写酵素反応およびハイブリダイゼ
ーションに関して障害的に働くことのないものを選択す
る必要がある。
ヌクレオチド三リン酸側の標識物質とは、検出操作の簡
便性と効率性および検出感度の観点から、請求項３に記
載したように同じ物質を用いることが望ましい。但しこ
の場合、標識物質は、基質としてｃＤＮＡ中に取り込ま
れ得るデキシヌクレオチド三リン酸にも結合させておく
ものであるため、逆転写酵素反応およびハイブリダイゼ
ーションに関して障害的に働くことのないものを選択す
る必要がある。
【００２７】一方、請求項４に記載した如く、プライマ
ー側とデオキシヌクレオチド三リン酸側とで互いに異な
る標識物質を用いるものとすれば、もちろんデオキシヌ
クレオチド三リン酸側用には逆転写酵素反応およびハイ
ブリダイゼーションに関して障害的に働くことのないも
のを選択する必要があるが、プライマー側に関してみれ
ば、逆転写酵素反応およびハイブリダイゼーションへの
影響に左右されることなく、単位標識物質分子当たりで
高い検出強度を現すもの、例えば蛍光標識物質であれば
標識物質一分子当たりの蛍光強度が強いものなど、より
検出精度を向上させ得るものを広い範囲から選んで用い
ることができる。
ー側とデオキシヌクレオチド三リン酸側とで互いに異な
る標識物質を用いるものとすれば、もちろんデオキシヌ
クレオチド三リン酸側用には逆転写酵素反応およびハイ
ブリダイゼーションに関して障害的に働くことのないも
のを選択する必要があるが、プライマー側に関してみれ
ば、逆転写酵素反応およびハイブリダイゼーションへの
影響に左右されることなく、単位標識物質分子当たりで
高い検出強度を現すもの、例えば蛍光標識物質であれば
標識物質一分子当たりの蛍光強度が強いものなど、より
検出精度を向上させ得るものを広い範囲から選んで用い
ることができる。
【００２８】また、互いに異なる標識物質を用いること
によって、最終的に検出精度を高めることができる場合
もある。例えば、異なる２種の蛍光色素が、蛍光共鳴エ
ネルギー移動（ＦＲＥＴ：fluorescence resonant ener
gy transfer ）現象を生ずる関係にあるものを標識物質
に用いれば、たとえ一種の蛍光色素のみを標識した場合
では検出が困難であった検体でも、前記ＦＲＥＴ現象を
利用して、同一励起波長で異なった波長にエネルギーを
移転させてＳ／Ｎ比を向上させることにより微細なシグ
ナルを検出可能とすることもできる。
によって、最終的に検出精度を高めることができる場合
もある。例えば、異なる２種の蛍光色素が、蛍光共鳴エ
ネルギー移動（ＦＲＥＴ：fluorescence resonant ener
gy transfer ）現象を生ずる関係にあるものを標識物質
に用いれば、たとえ一種の蛍光色素のみを標識した場合
では検出が困難であった検体でも、前記ＦＲＥＴ現象を
利用して、同一励起波長で異なった波長にエネルギーを
移転させてＳ／Ｎ比を向上させることにより微細なシグ
ナルを検出可能とすることもできる。
【００２９】さらに、本発明による核酸標識方法を用い
る試薬キット、即ち、プライマーとして、５’端に標識
物質が結合された４種のヌクレオチドからなり４ヌクレ
オチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダム
ヌクレオチドオリゴマーと、基質溶液と、逆転写酵素を
備えたセットを核酸標識用キットとして製造しておけ
ば、マイクロアレイによる遺伝子発現レベルの測定の際
などに、試料検体から抽出、調整したｍＲＮＡを用い
て、標識された第一鎖ｃＤＮＡが簡便に合成でき、測定
工程全体の簡略化が図れると共に、従来のものより正確
な測定結果が得られるものである。
る試薬キット、即ち、プライマーとして、５’端に標識
物質が結合された４種のヌクレオチドからなり４ヌクレ
オチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダム
ヌクレオチドオリゴマーと、基質溶液と、逆転写酵素を
備えたセットを核酸標識用キットとして製造しておけ
ば、マイクロアレイによる遺伝子発現レベルの測定の際
などに、試料検体から抽出、調整したｍＲＮＡを用い
て、標識された第一鎖ｃＤＮＡが簡便に合成でき、測定
工程全体の簡略化が図れると共に、従来のものより正確
な測定結果が得られるものである。
【００３０】なお、本発明におけるプライマーとしての
ランダムヌクレオチドオリゴマーとは、基質となる４種
のデオキシリヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）がランダム
な順序で結合したヌクレオチドの集合体であり、例え
ば、ホスホロアミダイド法を用いた自動ＤＮＡ合成機で
容易に合成できる。この自動合成の際に標識物質のアミ
ダイドを用いることによってヌクレオチドの５’端に標
識物質を容易に共有結合で導入することができる。
ランダムヌクレオチドオリゴマーとは、基質となる４種
のデオキシリヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）がランダム
な順序で結合したヌクレオチドの集合体であり、例え
ば、ホスホロアミダイド法を用いた自動ＤＮＡ合成機で
容易に合成できる。この自動合成の際に標識物質のアミ
ダイドを用いることによってヌクレオチドの５’端に標
識物質を容易に共有結合で導入することができる。
【００３１】なお、本発明のヌクレオチドオリゴマー
は、その長さをプライマーとして実用に適した４〜４５
ヌクレオチドとするが、６〜１８ヌクレオチドのものを
選択することが好ましい。これは、数の増加に伴い、シ
グナル強度とＳ／Ｎ比が低下するためである。
は、その長さをプライマーとして実用に適した４〜４５
ヌクレオチドとするが、６〜１８ヌクレオチドのものを
選択することが好ましい。これは、数の増加に伴い、シ
グナル強度とＳ／Ｎ比が低下するためである。
【００３２】また、本発明に用いられる標識物質として
は、例えば、ＨＥＸ，ＴＥＴ，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ5.
5，Ｂ−ＦＡＭ，ＪＯＥ，６−ＲＯＸ，Cascade Blue，T
exasRed，Rhodamine，Rhodamine green，Rhodamine re
d，Rhodamine 6G，6-TAMRA，5-TMRIA，Alexa 430，Alex
a 488，Alexa 594，Bodipy R6G 等の蛍光色素およびビ
オチン等の比色素系物質など、従来から標識用色素とし
て用いられているものが広く使用可能である。特に、蛍
光色素を使用する場合は、蛍光を検出するためのスキャ
ナのフィルター特性に適合する特性を持つ物質を選択す
る必要が生じることから、現状のスキャナの普及度合い
を考慮するとＣｙ３およびＣｙ５を用いるのが好まし
い。
は、例えば、ＨＥＸ，ＴＥＴ，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ5.
5，Ｂ−ＦＡＭ，ＪＯＥ，６−ＲＯＸ，Cascade Blue，T
exasRed，Rhodamine，Rhodamine green，Rhodamine re
d，Rhodamine 6G，6-TAMRA，5-TMRIA，Alexa 430，Alex
a 488，Alexa 594，Bodipy R6G 等の蛍光色素およびビ
オチン等の比色素系物質など、従来から標識用色素とし
て用いられているものが広く使用可能である。特に、蛍
光色素を使用する場合は、蛍光を検出するためのスキャ
ナのフィルター特性に適合する特性を持つ物質を選択す
る必要が生じることから、現状のスキャナの普及度合い
を考慮するとＣｙ３およびＣｙ５を用いるのが好まし
い。
【００３３】本発明における逆転写酵素反応では、市販
の逆転写酵素およびそれに付随する緩衝液が使用可能で
あり、これら製品の付随するプロトコールに従って反応
操作を行えばよい。なかでも、モロニーマウス白血病
（Moloney murine leukemia ）ウイルス由来逆転写酵素
が好適である。
の逆転写酵素およびそれに付随する緩衝液が使用可能で
あり、これら製品の付随するプロトコールに従って反応
操作を行えばよい。なかでも、モロニーマウス白血病
（Moloney murine leukemia ）ウイルス由来逆転写酵素
が好適である。
【００３４】また、この逆転写酵素反応の基質としてｄ
ＮＴＰを用いるが、基質溶液中に標識済ｄＮＴＰを混在
させてｃＤＮＡ合成反応を行う場合に、この標識済ｄＮ
ＴＰとして標識済デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴ
Ｐ）を用いる場合は、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）の濃
度を他の３種のヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ）に比して減らすことになる。ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ濃度は、市販の逆転写酵素に付
随するプロトコール通りとし、ＴＴＰの濃度を他の１／
10以下にすることが可能であり、好ましくは１／50〜１
／50000が良い。
ＮＴＰを用いるが、基質溶液中に標識済ｄＮＴＰを混在
させてｃＤＮＡ合成反応を行う場合に、この標識済ｄＮ
ＴＰとして標識済デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴ
Ｐ）を用いる場合は、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）の濃
度を他の３種のヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ）に比して減らすことになる。ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ濃度は、市販の逆転写酵素に付
随するプロトコール通りとし、ＴＴＰの濃度を他の１／
10以下にすることが可能であり、好ましくは１／50〜１
／50000が良い。
【００３５】ランダムプライマーの濃度は、合成する第
一鎖ｃＤＮＡの平均ヌクレオチド長に応じて増減するこ
とができる。一般に、ランダムプライマーの濃度が高い
ほど、第一鎖ｃＤＮＡの平均長は短くなる。好ましく
は、ｍＲＮＡ 1μｇあたり４nmolプライマーが良い。し
かし、この量はｍＲＮＡの精製度に依るため、必ずしも
至適ではなく、その場合、４nmol以上使用すれば良い。
一鎖ｃＤＮＡの平均ヌクレオチド長に応じて増減するこ
とができる。一般に、ランダムプライマーの濃度が高い
ほど、第一鎖ｃＤＮＡの平均長は短くなる。好ましく
は、ｍＲＮＡ 1μｇあたり４nmolプライマーが良い。し
かし、この量はｍＲＮＡの精製度に依るため、必ずしも
至適ではなく、その場合、４nmol以上使用すれば良い。
【００３６】逆転写酵素反応後に、取り込まれなかった
ランダムプライマーと基質ｄＮＴＰとを除去すること
が、非特異的ハイブリダイゼーションを防止することに
なる。例えば、スピンカラム等の機器を用いてランダム
プライマーとｄＮＴＰが含まれる低分子分画を除去する
ことが必要である。この場合、限界分子量を３０００〜
１０００００程度に選定することが可能であり、分子量
１００００以下を除去することが望ましい。
ランダムプライマーと基質ｄＮＴＰとを除去すること
が、非特異的ハイブリダイゼーションを防止することに
なる。例えば、スピンカラム等の機器を用いてランダム
プライマーとｄＮＴＰが含まれる低分子分画を除去する
ことが必要である。この場合、限界分子量を３０００〜
１０００００程度に選定することが可能であり、分子量
１００００以下を除去することが望ましい。
【００３７】
【実施例】本発明の一実施例として、それぞれプライマ
ーとしてランダムヘキサマーの５’末端に蛍光標識物質
Ｃｙ３を２分子連ねて結合させたものを用い、同じ蛍光
標識物質Ｃｙ３を標識したｄＮＴＰを混在させた基質ｄ
ＮＴＰの溶液中（条件Ａ）、および標識済ｄＮＴＰ無し
の基質ｄＮＴＰ溶液中（条件Ｂ）において、ヒト正常線
維芽細胞由来のｍＲＮＡから逆転写酵素反応により第一
鎖ｃＤＮＡを合成した場合を以下に示す。
ーとしてランダムヘキサマーの５’末端に蛍光標識物質
Ｃｙ３を２分子連ねて結合させたものを用い、同じ蛍光
標識物質Ｃｙ３を標識したｄＮＴＰを混在させた基質ｄ
ＮＴＰの溶液中（条件Ａ）、および標識済ｄＮＴＰ無し
の基質ｄＮＴＰ溶液中（条件Ｂ）において、ヒト正常線
維芽細胞由来のｍＲＮＡから逆転写酵素反応により第一
鎖ｃＤＮＡを合成した場合を以下に示す。
【００３８】なお、上記条件Ａおよび条件Ｂに加え、対
照として、従来から一般的に行われている方法と同様に
プライマーに標識なしのランダムヘキサマーを用い、基
質ｄＮＴＰに蛍光標識物質Ｃｙ３を結合させた標識済ｄ
ＮＴＰを混在させた溶液を用いた場合を条件Ｘとして同
時に検討した。
照として、従来から一般的に行われている方法と同様に
プライマーに標識なしのランダムヘキサマーを用い、基
質ｄＮＴＰに蛍光標識物質Ｃｙ３を結合させた標識済ｄ
ＮＴＰを混在させた溶液を用いた場合を条件Ｘとして同
時に検討した。
【００３９】まず、検体用ｍＲＮＡは、ヒト正常線維芽
細胞からトリゾル試薬（ライフテックオリエンタル社
製、＃15596-026 ）を用いて抽出した全ＲＮＡから、Po
ly(A)Pure キット（Ambion社製、＃1915）を用いてポリ
アデニル酸（ポリ(A) ）＋ＲＮＡを抽出して得た。この
ＲＮＡは、 上記３つの条件別用にそれぞれ３本の試験
管（条件別に試験管Ｘ，試験管Ａ，試験管Ｂと記す）内
に 250ｎｇずつ分注しておく。
細胞からトリゾル試薬（ライフテックオリエンタル社
製、＃15596-026 ）を用いて抽出した全ＲＮＡから、Po
ly(A)Pure キット（Ambion社製、＃1915）を用いてポリ
アデニル酸（ポリ(A) ）＋ＲＮＡを抽出して得た。この
ＲＮＡは、 上記３つの条件別用にそれぞれ３本の試験
管（条件別に試験管Ｘ，試験管Ａ，試験管Ｂと記す）内
に 250ｎｇずつ分注しておく。
【００４０】さらにこれらの試験管に、対応するプライ
マー水溶液を加えた。即ち試験管Ｘへはランダムヘキサ
マー１ｎｍｏｌ／μＬ水溶液、試験管Ａおよび試験管Ｂ
へがＣｙ３−Ｃｙ３−ランダムヘキサマー１ｎｍｏｌ／
μＬ水溶液をそれぞれ１μＬずつ加え、ポリ(A) ＋ＲＮ
Ａと混合して各１５μＬ水溶液に調整した。これら各試
験管内のプライマー、ＲＮＡ混合水溶液は、７０℃で１
０分間熱変性させた後、氷上に素早く移して５分間冷却
し、以下の試薬を加え、逆転写酵素反応による第一鎖ｃ
ＤＮＡ合成を行った。
マー水溶液を加えた。即ち試験管Ｘへはランダムヘキサ
マー１ｎｍｏｌ／μＬ水溶液、試験管Ａおよび試験管Ｂ
へがＣｙ３−Ｃｙ３−ランダムヘキサマー１ｎｍｏｌ／
μＬ水溶液をそれぞれ１μＬずつ加え、ポリ(A) ＋ＲＮ
Ａと混合して各１５μＬ水溶液に調整した。これら各試
験管内のプライマー、ＲＮＡ混合水溶液は、７０℃で１
０分間熱変性させた後、氷上に素早く移して５分間冷却
し、以下の試薬を加え、逆転写酵素反応による第一鎖ｃ
ＤＮＡ合成を行った。
【００４１】上記３つの試験管に、ジチオスレイトール
（ライフテックオリエンタル社製：SuperScript II、＃
18064-014 付属品）を３μＬ，５×バッファー（ライフ
テックオリエンタル社製：SuperScript II、＃18064-01
4 付属品）を６μＬ，デオキシヌクレオチド三リン酸混
合液（０．２ｍＭデオキシアデニン三リン酸、０．２ｍ
Ｍデオキシグアニン三リン酸、０．２ｍＭデオキシシト
シン三リン酸、５４０ｎＭチミジン三リン酸）を１．５
μＬ，逆転写酵素（ライフテックオリエンタル社製：Su
perScript II、＃18064-014 付属品）を２μＬ、それぞ
れ加えた。
（ライフテックオリエンタル社製：SuperScript II、＃
18064-014 付属品）を３μＬ，５×バッファー（ライフ
テックオリエンタル社製：SuperScript II、＃18064-01
4 付属品）を６μＬ，デオキシヌクレオチド三リン酸混
合液（０．２ｍＭデオキシアデニン三リン酸、０．２ｍ
Ｍデオキシグアニン三リン酸、０．２ｍＭデオキシシト
シン三リン酸、５４０ｎＭチミジン三リン酸）を１．５
μＬ，逆転写酵素（ライフテックオリエンタル社製：Su
perScript II、＃18064-014 付属品）を２μＬ、それぞ
れ加えた。
【００４２】最後に、上記条件Ａ，Ｂ，Ｘに従って試験
管Ａおよび試験管Ｘには標識済ヌクレオチド溶液として
Ｃｙ３−デオキシウリジン三リン酸（Ｃｙ３−ｄＵＴ
Ｐ）１ｍＭ溶液を１．５μＬずつ、また試験管Ｂには標
識済ヌクレオチドに代わる未標識ヌクレオチド溶液とし
てチミジン三リン酸（ＴＴＰ）１ｍＭ溶液を１．５μＬ
加え、最終反応溶液をそれぞれ３０μＬとし、４２℃で
６０分間保温して逆転写反応を行った。
管Ａおよび試験管Ｘには標識済ヌクレオチド溶液として
Ｃｙ３−デオキシウリジン三リン酸（Ｃｙ３−ｄＵＴ
Ｐ）１ｍＭ溶液を１．５μＬずつ、また試験管Ｂには標
識済ヌクレオチドに代わる未標識ヌクレオチド溶液とし
てチミジン三リン酸（ＴＴＰ）１ｍＭ溶液を１．５μＬ
加え、最終反応溶液をそれぞれ３０μＬとし、４２℃で
６０分間保温して逆転写反応を行った。
【００４３】反応後、各試験管に１Ｍ水酸化ナトリウム
−２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム溶液を
１．５μＬ、１０％ドジテル硫酸ナトリウムを３μＬ加
え、６５℃、１０分間加温してＲＮＡを分解した。
−２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム溶液を
１．５μＬ、１０％ドジテル硫酸ナトリウムを３μＬ加
え、６５℃、１０分間加温してＲＮＡを分解した。
【００４４】その後、各試験管内の反応液から濾過フィ
ルタ MicropureEZ（ Millipore社製、＃42530 ）を用い
て酵素を除去し、次いで濾過フィルタ Microcon-30（ M
illipore社製、＃42410 ）を用いたスピンカラム法によ
り各反応液中のデオキシヌクレオチド三リン酸、プライ
マー、および約６０塩基以下の短いｃＤＮＡを除去し、
それぞれ５μＬ以下に濃縮した。
ルタ MicropureEZ（ Millipore社製、＃42530 ）を用い
て酵素を除去し、次いで濾過フィルタ Microcon-30（ M
illipore社製、＃42410 ）を用いたスピンカラム法によ
り各反応液中のデオキシヌクレオチド三リン酸、プライ
マー、および約６０塩基以下の短いｃＤＮＡを除去し、
それぞれ５μＬ以下に濃縮した。
【００４５】これら３つの濃縮されたｃＤＮＡを含む溶
液を、それぞれ純水を加えて１００μＬに調整し、０．
５０μＬずつスライドガラス上にスポットし、風乾し
た。これらスライドガラス上の、前記条件Ｘ，条件Ａ，
条件Ｂに対応する各スポット１，スポット２，スポット
３に対し、蛍光検出スキャナ（Axon社製、GenePix4000
A）を用いて波長５３２ｎｍにおける蛍光シグナルを測
定し、各スポットの全ピクセルの蛍光強度の平均値を算
出した。結果を図１の棒グラフに示す。
液を、それぞれ純水を加えて１００μＬに調整し、０．
５０μＬずつスライドガラス上にスポットし、風乾し
た。これらスライドガラス上の、前記条件Ｘ，条件Ａ，
条件Ｂに対応する各スポット１，スポット２，スポット
３に対し、蛍光検出スキャナ（Axon社製、GenePix4000
A）を用いて波長５３２ｎｍにおける蛍光シグナルを測
定し、各スポットの全ピクセルの蛍光強度の平均値を算
出した。結果を図１の棒グラフに示す。
【００４６】図１からも明らかなように、従来方法に相
当する条件Ｘ、即ち基質ｄＮＴＰに標識済ｄＮＴＰを混
在させただけでｍＲＮＡから逆転写酵素反応で第一鎖ｃ
ＤＮＡを合成した場合（スポット１）にくらべ、条件
Ｂ、即ち、プライマーに標識物質（標識物質分子二連結
合）を結合させたものを用いてｃＤＮＡを合成した場合
（スポット３）では、測定された蛍光強度は３倍近く強
くなっている。
当する条件Ｘ、即ち基質ｄＮＴＰに標識済ｄＮＴＰを混
在させただけでｍＲＮＡから逆転写酵素反応で第一鎖ｃ
ＤＮＡを合成した場合（スポット１）にくらべ、条件
Ｂ、即ち、プライマーに標識物質（標識物質分子二連結
合）を結合させたものを用いてｃＤＮＡを合成した場合
（スポット３）では、測定された蛍光強度は３倍近く強
くなっている。
【００４７】これは、プライマー側に標識物質を結合さ
せておくことにより、ｃＤＮＡの合成の際に標識物質が
非常に高い効率で確実に取り込まれたためであり、また
各標識物質が、通常一分子単位で用いられている標識物
質を二分子連ねたものを用いたことが蛍光強度の向上に
寄与したものと思われる。本実施例では、単位標識物質
分子を二分子連ねたものを用いた場合を示したが、さら
に三分子以上と増やしていけば、蛍光感度のさらなる向
上が期待できる。
せておくことにより、ｃＤＮＡの合成の際に標識物質が
非常に高い効率で確実に取り込まれたためであり、また
各標識物質が、通常一分子単位で用いられている標識物
質を二分子連ねたものを用いたことが蛍光強度の向上に
寄与したものと思われる。本実施例では、単位標識物質
分子を二分子連ねたものを用いた場合を示したが、さら
に三分子以上と増やしていけば、蛍光感度のさらなる向
上が期待できる。
【００４８】また、条件Ａ、すなわち、プライマー側だ
けでなく基質ｄＮＴＰ側にも標識済ｄＮＴＰを混在させ
ておいた場合には、双方の標識物質が同一物質であるこ
とも加わって検出強度は格段に向上している。
けでなく基質ｄＮＴＰ側にも標識済ｄＮＴＰを混在させ
ておいた場合には、双方の標識物質が同一物質であるこ
とも加わって検出強度は格段に向上している。
【００４９】以上の如く、本実施例において得られるｃ
ＤＮＡは、高い効率で標識物質を取り込んでおり、また
出発材料であるｍＲＮＡから逆転写反応で合成されたも
のであるため、検体出発材料からの工程数が少なく、そ
の情報が正確に反映されたものであることから、特にＤ
ＮＡマイクロアレイ上に供される試料として優れたもの
である。
ＤＮＡは、高い効率で標識物質を取り込んでおり、また
出発材料であるｍＲＮＡから逆転写反応で合成されたも
のであるため、検体出発材料からの工程数が少なく、そ
の情報が正確に反映されたものであることから、特にＤ
ＮＡマイクロアレイ上に供される試料として優れたもの
である。
【００５０】
【発明の効果】以上説明したとおり、本発明の核酸標識
方法によれば、従来得られなかった高い標識効率で試料
核酸に標識物質を取り込ませることができると共に、よ
り高い検出強度が期待できるものである。従って、この
本発明の標識方法で得られた標識核酸を用いれば、例え
ば合成ヌクレオチドを用いたマイクロアレイに対して従
来の検出装置を用いても充分容易に測定可能なハイブリ
ダイゼーションシグナルが得られるという効果がある。
方法によれば、従来得られなかった高い標識効率で試料
核酸に標識物質を取り込ませることができると共に、よ
り高い検出強度が期待できるものである。従って、この
本発明の標識方法で得られた標識核酸を用いれば、例え
ば合成ヌクレオチドを用いたマイクロアレイに対して従
来の検出装置を用いても充分容易に測定可能なハイブリ
ダイゼーションシグナルが得られるという効果がある。
【図１】本発明の一実施例による核酸標識方法で標識さ
れたｃＤＮＡの蛍光強度測定値を対照と比較して示した
棒グラフである。
れたｃＤＮＡの蛍光強度測定値を対照と比較して示した
棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 渡辺 慎哉 東京都港区白金台３−18−８−804 (72)発明者 今井 順一 東京都目黒区平町２丁目４番３号202 (72)発明者 本郷 邦広 富山県富山市曙町６−34−306 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FB07 FB12 GC15 2G054 CA22 EA03 4B024 AA20 CA04 CA12 FA01 HA19 4B029 AA07 AA23 FA12 4B063 QA13 QQ42 QQ53 QR32 QR36 QR62 QS03 QS25 QS36 QX02
Claims (6)
- 【請求項１】 基質であるデオキシリボヌクレオチド三
リン酸の溶液中で所定のメッセンジャーＲＮＡから逆転
写酵素反応により第一鎖相補的ＤＮＡを合成する際に、
プライマーとして、４種のヌクレオチドからなり４ヌク
レオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダ
ムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物質分
子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させたもの
を用いることを特徴とする核酸標識方法。 - 【請求項２】 前記デオキシヌクレオチド三リン酸溶液
は、標識物質を結合したデオキシヌクレオチド三リン酸
が混在することを特徴とする請求項１に記載の核酸標識
方法。 - 【請求項３】 前記プライマーに結合させた標識物質
と、前記デオキシヌクレオチド三リン酸に結合させた標
識物質とが同一物質であることを特徴とする請求項２に
記載の核酸標識方法。 - 【請求項４】 前記プライマーに結合させた標識物質
と、前記デオキシヌクレオチド三リン酸に結合させた標
識物質とが互いに異なる物質であることを特徴とする請
求項２に記載の核酸標識方法。 - 【請求項５】 前記プライマーに結合させた標識物質
と、前記デオキシヌクレオチド三リン酸に結合させた標
識物質とが、蛍光共鳴エネルギー移動現象を生ずる蛍光
色素物質であることを特徴とする請求項４に記載の核酸
標識方法。 - 【請求項６】 プライマーと、逆転写酵素と、デオキシ
ヌクレオチド三リン酸溶液とを備えた試薬キットであっ
て、 前記プライマーは、４種のヌクレオチドからなり４ヌク
レオチド以上４５ヌクレオチド以下の長さを持つランダ
ムヌクレオチドオリゴマーの５’端に、単位標識物質分
子が複数個連なってなる標識物質を予め結合させたもの
であることを特徴とする核酸標識用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000254172A JP2002065259A (ja) | 2000-08-24 | 2000-08-24 | 核酸標識方法および核酸標識用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000254172A JP2002065259A (ja) | 2000-08-24 | 2000-08-24 | 核酸標識方法および核酸標識用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002065259A true JP2002065259A (ja) | 2002-03-05 |
Family
ID=18743164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000254172A Pending JP2002065259A (ja) | 2000-08-24 | 2000-08-24 | 核酸標識方法および核酸標識用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002065259A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008535487A (ja) * | 2005-04-01 | 2008-09-04 | アプレラ コーポレイション | 色素アーティファクトを低減させるための製品および方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH06303997A (ja) * | 1993-04-16 | 1994-11-01 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | ｃＤＮＡの分析方法 |
| WO1999027090A1 (en) * | 1997-11-20 | 1999-06-03 | Smithkline Beecham Corporation | Methods for identifying the toxic/pathologic effect of environmental stimuli on gene transcription |
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| WO2000039339A1 (en) * | 1998-12-28 | 2000-07-06 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Statistical combining of cell expression profiles |
-
2000
- 2000-08-24 JP JP2000254172A patent/JP2002065259A/ja active Pending
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