CN115927553A - 一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒 - Google Patents

一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒。本申请中，所述方法包括步骤一：使用氨的水溶液配制所述荧光寡核苷酸的标准溶液。本发明的实施方式提供的构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法，构建的荧光寡核苷酸标准曲线线性良好，可用于测量响应值极低的TaqMan探针本底荧光强度。

Description

一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒
技术领域
本发明实施例涉及分析检测领域，特别涉及一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒。
背景技术
实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)技术是一种在PCR反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
实时荧光定量PCR常用的检测模式有TaqMan探针和SYBR Green I检测模式，TaqMan探针由于可以实现多重检测及特异性强的特点，更广泛的应用在该项技术中。TaqMan探针5端标记一个荧光报告基团，3端标记一个荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团所吸收而发生荧光共振能量转移(FRET)，此时检测不到该探针5端荧光报告基团发出的荧光。在PCR扩增过程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针5端连接的荧光报告基团从探针上切割下来,从而游离于反应体系中，不能发生FRET而发出荧光信号。这个过程中切割的荧光分子数与PCR产物的量成正比，因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量
TaqMan探针采用固相合成法进行合成，采用连有淬灭基团的CPG(玻璃珠)为载体，通过A、G、C、T亚磷酰胺单体及荧光报告基团亚磷酰胺单体按照探针序列由3’-5’方向进行合成，合成完毕后经过切割脱保护、纯化及定量浓缩，后续应用于实时荧光定量PCR中。用于合成TaqMan探针的5’报告基团染料荧光性能下降或者TaqMan探针纯度不高或者降解都会影响TaqMan探针的发光性能，进而造成实时荧光定量PCR曲线平台期的荧光强度下降，也会导致曲线的Ct(cycle threshold)靠后。
然而，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：由于TaqMan探针本底荧光强度响应值极低，检测TaqMan探针本底荧光强度，需要使用对照TaqMan探针构建线性良好的标准曲线，现有技术中，采用tris-HCl溶液或水作为溶媒介质，构建的TaqMan探针标准曲线线性很差，难以满足标准曲线法测试TaqMan探针本底荧光强度的需求。因此，本领域需要寻找一种构建线性良好的TaqMan探针本底荧光强度的方法。
发明内容
本发明实施方式的目的在于提供一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法。
本发明实施方式的另一目的在于提供一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式第一方面提供了一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法，所述方法包括步骤一：
使用氨的水溶液配制所述荧光寡核苷酸的标准溶液。
在一些优选的方案中，所述步骤一之后还包括步骤二：
测定步骤一所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
在一些优选的方案中，所述步骤二之后还包括步骤三：
根据所述荧光寡核苷酸的标准溶液的浓度和步骤二所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度构建标准曲线。
在一些优选的方案中，所述氨的水溶液中氨的质量百分含量为0.008～0.012％。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸标准溶液浓度范围为1～10pmol/μL。
在一些优选的方案中，至少配置三个所述荧光寡核苷酸标准溶液。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸中荧光报告基团为FITC、5-FAM、6-FAM、HEX、Rhodamine B、texas red、Cy3或Cy5。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸选自FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针、HEX-BHQ1修饰的TaqMan探针或FAM修饰的5’报告基团。
在一些优选的方案中，使用酶标仪或荧光分光光度计测定所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
在一些优选的方案中，至少配置五个所述荧光寡核苷酸标准溶液，所述五个荧光寡核苷酸标准溶液的浓度分别为2pmol/μL、4pmol/μL、6pmol/μL、8pmol/μL和10pmol/μL。
本发明的实施方式构建的荧光寡核苷酸标准曲线，相关系数≥0.999。
本发明的实施方式第二方面提供一种用于构建荧光寡核苷酸标准曲线的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
荧光寡核苷酸标准品；和质量百分含量为0.008～0.012％的氨水。
本发明实施方式相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明的实施方式提供的构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法，构建的荧光寡核苷酸标准曲线线性良好，可用于测量响应值极低的TaqMan探针本底荧光强度。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
TaqMan探针本底荧光强度响应值极低，导致获得的TaqMan探针本底荧光强度标准曲线线性极差。本发明人经过详尽的研究，发现将TaqMan探针或者合成TaqMan探针的5’报告基团置于氨的水溶液中，可以起到稳定这些基团，使得其本底荧光标准曲线，相关系数均在0.999以上。
在上述研究发现的基础上，发明人提出一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以获得线性良好的标准曲线。此外发明人还提供了一种用于构建荧光寡核苷酸标准曲线的试剂盒。
术语
如本文所用，术语“荧光寡核苷酸”指的是使用荧光报告基团标记的2～30核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段，可作为DNA合成的引物和基因探针。
如本文所用，术语“本底荧光强度”指的是样品未发生荧光猝灭时，在测量荧光的仪器中测得的荧光响应。例如本发明中TaqMan探针的本底荧光强度指TaqMan探针未发生断裂时，在测量荧光的仪器中产生的极微弱的荧光信号。
如本文所用，术语“FITC”指的是异硫氰酸荧光素，常用的荧光标记物。
如本文所用，术语“5-FAM”指的是5-羧基荧光素，常用的荧光标记物，用于标记蛋白、多肽、抗体以及寡核苷酸。
如本文所用，术语“6-FAM”指的是5-羧基荧光素，常用的荧光标记物，用于标记蛋白、多肽、抗体以及寡核苷酸。
如本文所用，术语“HEX”指的是六氯-6-甲基荧光素，常用的荧光标记物。
如本文所用，术语“Rhodamine B”指的是罗丹明B，常用的荧光染色剂。
如本文所用，术语“texas red”指的是亮红色磷酯，常用的荧光染色剂。
如本文所用，术语“Cy3”和“Cy5”为花青素染料，是近红外荧光染料中常用的一类荧光染料，可通过其反应基团和核酸或者蛋白质相连，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记。
如本文所用，术语“FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针”值得是TaqMan探针5’端被FAM修饰且3’端被BHQ1修饰。
如本文所用，术语“HEX-BHQ1修饰的TaqMan探针”值得是TaqMan探针5’端被HEX修饰且3’端被BHQ1修饰。
PCR本发明的实施方式第一方面提供了一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法，所述方法包括步骤一：
使用氨的水溶液配制所述荧光寡核苷酸的标准溶液。
在一些优选的方案中，所述步骤一之后还包括步骤二：
测定步骤一所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
在一些优选的方案中，所述步骤二之后还包括步骤三：
根据所述荧光寡核苷酸的标准溶液的浓度和步骤二所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度构建标准曲线。
在一些优选的方案中，所述氨的水溶液中氨的质量百分含量为0.008～0.012％。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸标准溶液浓度范围为1～10pmol/μL。其他浓度范围所得标准曲线的线性回归常数可能不达标。
在一些优选的方案中，至少配置三个所述荧光寡核苷酸标准溶液。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸中荧光报告基团为FITC、5-FAM、6-FAM、HEX、Rhodamine B、texas red、Cy3或Cy5。
在一些优选的方案中，所述荧光寡核苷酸选自FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针、HEX-BHQ1修饰的TaqMan探针和FAM修饰的5’报告基团中的至少一种。
在一些优选的方案中，使用酶标仪或荧光分光光度计测定所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
使用荧光分光光度计和酶标仪进行测量时，采用终点法按照荧光报告基团的最佳吸收波长及最佳发射波长进行测量。上述荧光报告基团FAM最佳吸收波长为474-494nm,最佳发射波长为525-545nm；荧光报告基团HEX最佳吸收波长为515-535nm，最佳发射波长为556-576nm；荧光报告基团CY3最佳吸收波长为526-546nm,最佳发射波长为563-583nm；荧光报告基团texas red最佳吸收波长为576-586nm,最佳发射波长为615-635nm；荧光报告基团CY5最佳吸收波长为626-646nm,最佳发射波长为662-682nm，其余荧光报告基团的最佳吸收及发射波长不做一一列举。
将荧光报告基团按如下序列在DNA合成仪上由3’-5’进行合成。ID1:5’报告基团-TTTTTTTTTT，氨解纯化后使用相应溶媒按规定浓度进行稀释，测定不同浓度下的ID1序列下的荧光报告基团的荧光强度，绘制ID1序列下荧光报告基团的荧光强度与浓度的曲线。
在一些优选的方案中，至少配置五个所述荧光寡核苷酸标准溶液，所述五个荧光寡核苷酸标准溶液的浓度分别为2pmol/μL、4pmol/μL、6pmol/μL、8pmol/μL和10pmol/μL。
本发明的实施方式构建的荧光寡核苷酸标准曲线，相关系数≥0.999。
本发明的实施方式第二方面提供一种用于构建荧光寡核苷酸标准曲线的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：荧光寡核苷酸标准品；和质量百分含量为0.008～0.012％的氨水。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例一、FAM-BHQ1修饰的Taqman探针标准曲线的构建
不同浓度的对照探针溶液配制：
取FAM-BHQ1修饰的TaqMan对照探针干粉10nmol置于离心管，(FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针序列如下：ID2:TTGTTGCGTGCACACCCACCG(5’FAM,3’BHQ1))，取质量浓度为0.01％氨水1000μL加入到上述探针中在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，获得探针浓度为10pmol/μL的对照探针母液。
2pmol/μL对照探针溶液的配制：取对照探针母液60μL到新的1.5ml离心管，加0.01％氨水240μL,在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s,得探针浓度为2pmol/μL。
4pmol/μL对照探针溶液的配制：取对照探针母液120μL到新的1.5ml离心管，加0.01％氨水180μL，在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，得探针浓度为4pmol/μL。
6pmol/μL对照探针溶液的配制：取对照探针母液180μL到新的1.5ml离心管，加0.01％氨水120μL，在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，得探针浓度为6pmol/μL的对照探针溶液。
8pmol/μL对照探针溶液的配制：取对照探针母液240μL到新的1.5ml离心管加0.01％氨水60μL，在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，得探针浓度为8pmol/μL的对照探针溶液。
10pmol/μL对照探针溶液的配制：取对照探针母液240μL到新的1.5ml离心管，得探针浓度为10pmol/μL的对照探针溶液。
不同浓度的对照探针构建标准曲线：
取上述浓度为2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/μL的对照探针溶液各200μL加入到荧光酶标板中，位置为A2,B2,C2,D2,E2,F2；用Thermo ScientificVarioskan LUX酶标仪采用终点法进行检测，吸收波长和发射波长分别设为494nm和525nm。
测得标准曲线测得数据如下表1：
表1
Figure BDA0003222297580000061
由上表1可得，R2≥0.999，线性良好，标准曲线构建成功。
实施例二、HEX-BHQ1修饰的TaqMan探针标准曲线的构建
不同浓度的对照探针溶液配制：
取对照HEX-BHQ1干粉10nmol置于离心管，(HEX-BHQ1干粉序列如下：ID3:CAGCCACTCCCGTGAAACATCAGGG(5’HEX,3’BHQ1))，取质量浓度为0.01％氨水1000μL加入到上述探针中在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，获得探针浓度为10pmol/μL的对照HEX-BHQ1探针母液。
按照与实施例一中的同样的方式配置2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/μL的对照HEX-BHQ1干粉溶液。
不同浓度的对照探针构建标准曲线：
取上述浓度为2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/u的对照HEX-BHQ1干粉溶液各200μL加入到荧光酶标板中，位置为A2,B2,C2,D2,E2,F2；用ThermoScientific Varioskan LUX酶标仪采用终点法进行检测，吸收波长和发射波长分别设为494nm和525nm。
测得标准曲线测得数据如下表2：
表2
Figure BDA0003222297580000071
由上表2可得，R2≥0.999，线性良好，标准曲线构建成功。
实施例三、5’报告基团(FAM)标准曲线的构建
不同浓度的对照5’报告基团(FAM)溶液配制：
取对照5’报告基团(FAM)干粉10nmol置于离心管，(5’报告基团(FAM)序列如下：FAM ID1(5’FAM-TTTTTTTTTT))，取质量浓度为0.01％氨水1000μL加入到上述探针中在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，获得探针浓度为10pmol/μL的对照5’报告基团(FAM)母液。
按照与实施例一中的同样的方式配置2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/μL的5’报告基团(FAM)溶液。
不同浓度的对照5’报告基团(FAM)溶液构建标准曲线
取上述浓度为2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/u的对照5’报告基团(FAM)溶液各200μL加入到荧光酶标板中，位置为A2,B2,C2,D2,E2,F2；用ThermoScientific Varioskan LUX酶标仪采用终点法进行检测，吸收波长和发射波长分别设为494nm和525nm。
测得标准曲线测得数据如下表3：
表3
Figure BDA0003222297580000072
由上表3可得，R2≥0.999，线性良好，标准曲线构建成功。
对比例一、使用FAM-BHQ1修饰的Taqman探针标准曲线的构建
取FAM-BHQ1修饰的TaqMan对照探针干粉10nmol置于离心管，(FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针序列如下：ID2:TTGTTGCGTGCACACCCACCG(5’FAM,3’BHQ1))，取质量浓度为0.01％tris-盐酸1000μL加入到上述探针中在混匀器中1500rpm振摇3min，瞬时离心15s，获得探针浓度为10pmol/μL的对照探针母液。除将稀释液换成质量浓度为0.01％tris-盐酸外，按照与实施例一相同的方式分别配制摩尔浓度为浓度分别为：2pmol/μL,4pmol/μL,6pmol/μL,8pmol/μL,10pmol/μL的溶液，按照与实施例一中测定不同浓度对照探针溶液相同的方法使用Thermo Scientific Varioskan LUX酶标仪测定各浓度下的响应值，并作出浓度-响应值曲线，计算R2。各浓度响应值和R2值结果如下表4。
表4
Figure BDA0003222297580000081
由上表数据可知，使用10mM pH为8.0的tris-盐酸作溶媒介质，所得标准曲线R2值很差，无法用作定量分析。
对比例二、使用FAM-BHQ1修饰的Taqman探针标准曲线的构建
对比例二中，构建FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针标准曲线的方法与对比例一大致相同，不同在于，使用10mM pH 8.0的TE缓冲液(Tris和EDTA配制而成)作为溶媒介质。各浓度响应值和R2值结果如下表5。
表5
Figure BDA0003222297580000082
所得标准曲线的R2值为：0.8739。
对比例三、使用FAM-BHQ1修饰的Taqman探针标准曲线的构建
对比例三中，构建FAM-BHQ1修饰的TaqMan探针标准曲线的方法与对比例一大致相同，不同在于，使用去离子水作为溶媒介质。各浓度响应值和R2值结果如下表6。
表6
Figure BDA0003222297580000083
所得标准曲线的R2值为：0.8847。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法，其特征在于，所述方法包括步骤一：
使用氨的水溶液配制所述荧光寡核苷酸的标准溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一之后还包括步骤二：
测定步骤一所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二之后还包括步骤三：
根据所述荧光寡核苷酸的标准溶液的浓度和步骤二所得所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度构建标准曲线。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氨的水溶液中氨的质量百分含量为0.008～0.012％。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光寡核苷酸标准溶液浓度范围为1～10pmol/μL。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，至少配置三个所述荧光寡核苷酸标准溶液。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光寡核苷酸中荧光报告基团为FITC、5-FAM、6-FAM、HEX、Rhodamine B、texas red、Cy3或Cy5。
8.根据权利要求2～3中任一项所述的方法，其特征在于，使用酶标仪或荧光分光光度计测定所述荧光寡核苷酸的标准溶液的本底荧光强度。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，至少配置五个所述荧光寡核苷酸标准溶液，所述五个荧光寡核苷酸标准溶液的浓度分别为2pmol/μL、4pmol/μL、6pmol/μL、8pmol/μL和10pmol/μL。
10.一种用于构建荧光寡核苷酸标准曲线的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
荧光寡核苷酸标准品；和质量百分含量为0.008～0.012％的氨水。
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