JP2008535487A - 色素アーティファクトを低減させるための製品および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、鎖伸長反応から色素アーティファクトを低減させる製品および方法を提供する。例えば、本発明によって、鎖伸長反応から色素アーティファクトを低減させる方法であって、a)タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と、少なくとも1つのタンパク質結合材料とを接触させて、該タンパク質結合材料と該タンパク質との複合体を形成する工程;およびb)該鎖伸長反応溶液から該複合体を分離する工程を包含する方法が提供される。鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含む、ミクロ流体デバイスもまた提供される。
Description
(関連出願)
本出願は、2005年4月1日に出願された米国特許出願第11/096,731号の利益を主張し、この内容は本明細書中に参考として援用される。
本出願は、2005年4月1日に出願された米国特許出願第11/096,731号の利益を主張し、この内容は本明細書中に参考として援用される。
(発明の背景)
配列決定反応中に生成されるDNAフラグメントは、電気泳動デバイス中に導入される色素標識されたターミネーターの量を低減させるためにサイズ排除クロマトグラフィーに供され得る。これは、配列決定反応の生成物の分析を妨げる色素アーティファクトを低減し得る。しかしながら、多くの配列決定反応の生成物の分析は、サイズを基にした分離技術によって精製されたとしても、色素アーティファクトをなおも被る。
配列決定反応中に生成されるDNAフラグメントは、電気泳動デバイス中に導入される色素標識されたターミネーターの量を低減させるためにサイズ排除クロマトグラフィーに供され得る。これは、配列決定反応の生成物の分析を妨げる色素アーティファクトを低減し得る。しかしながら、多くの配列決定反応の生成物の分析は、サイズを基にした分離技術によって精製されたとしても、色素アーティファクトをなおも被る。
したがって、鎖伸長反応における(例えば、核酸の配列決定反応における)色素アーティファクトを低減させるための製品および方法が必要である。
(発明の特定の実施形態の要旨)
本明細書中に開示されるのは、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する(例えば、DNAポリメラーゼを結合する)材料との接触により、反応生成物を精製して分析する際の色素アーティファクトが低減されるという知見である。
本明細書中に開示されるのは、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する(例えば、DNAポリメラーゼを結合する)材料との接触により、反応生成物を精製して分析する際の色素アーティファクトが低減されるという知見である。
したがって、本発明の一つの実施形態が提供するのは、鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減する方法であり、この方法は、(a)タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と少なくとも1つのタンパク質結合材料とを接触させて、タンパク質とタンパク質結合材料との複合体を形成する工程;および(b)鎖伸長反応溶液からこの複合体を分離する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は酵素(例えば、DNAポリメラーゼ)である。
本特許もしくは出願書類は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許もしくは特許出願公報のコピーは、申し込みをし、必要な手数料を払えば、当局(Office)によって提供される。
(発明の詳細な説明)
本明細書中に開示されるのは、タンパク質結合材料とタンパク質との複合体を形成するために、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する材料とを接触させることにより、複合体を取り除くためにサンプルを精製して分析する際の色素アーティファクトを低減するという知見である。したがって、一つの実施形態において、本発明は、鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減させる方法を提供し、この方法は、(a)タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と少なくとも1つのタンパク質結合材料とを接触させて、タンパク質とタンパク質結合材料の複合体を形成する工程;そして(b)鎖伸長反応溶液からこの複合体を分離する工程を包含する。
本明細書中に開示されるのは、タンパク質結合材料とタンパク質との複合体を形成するために、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する材料とを接触させることにより、複合体を取り除くためにサンプルを精製して分析する際の色素アーティファクトを低減するという知見である。したがって、一つの実施形態において、本発明は、鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減させる方法を提供し、この方法は、(a)タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と少なくとも1つのタンパク質結合材料とを接触させて、タンパク質とタンパク質結合材料の複合体を形成する工程;そして(b)鎖伸長反応溶液からこの複合体を分離する工程を包含する。
本発明の特定の実施形態において、この方法はさらに、工程(a)の前にサイクル配列決定(cycle sequencing)を実施する工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液を精製する工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製によって精製される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除イオン交換を使用して、サイズを基にした精製によって精製される。
本発明の特定の実施形態において、請求項1に記載の方法はさらに、蛍光DNAシークエンサーで鎖伸長反応溶液を分析する工程を包含する。
本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、精製工程中に、タンパク質結合材料と接触される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、精製工程の前に、タンパク質結合材料と接触される。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質は酵素である。本発明の特定の実施形態において、酵素は、DNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、DNAポリメラーゼは、耐熱性DNAポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、DNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、Taq DNAポリメラーゼは、変異Taq DNAポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、変異Taq DNAポリメラーゼは、F667Y変異を有する変異Taq DNAポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、タンパク質は、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している。
本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応は、DNA配列決定反応である。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、膜である。本発明の特定の実施形態において、この膜は、多孔膜である。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.01μm〜約200μmの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.05μm〜約100μmの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.1μm〜約50μmの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.1μm〜約2000μmの範囲の厚さを有する。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.5μm〜約1500μmの範囲の厚さを有する。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約0.5μm〜約1000μmの範囲の厚さを有する。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体である。本発明の特定の実施形態において、この固体支持体は、ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、このミクロスフィアは、ポリスチレンミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約100nm〜約2000μmの直径を有するポリマーミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約500nm〜約1000μmの直径を有する。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約1μm〜約200μmの直径を有する。本発明の実施形態において、ミクロスフィアは、ノンポーラスミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、ミクロポーラス(microporous)ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、マクロポーラス(macroporous)ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、メガポーラス(magaporous)ミクロスフィアである。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体の表面上に層を形成する。本発明の特定の実施形態において、固体支持体は、多孔膜である。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、共有結合をとおして固体支持体と結合している。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質と混合される。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる。
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、鎖伸長反応の前に、鎖伸長反応溶液と接触される。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、鎖伸長反応中、鎖伸長反応溶液と接触したままである。
本発明の特定の実施形態はまた、鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含むミクロ流体デバイスも提供する。
本発明の特定の実施形態はまた、鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含むスピンカラムも提供する。
本発明の特定の実施形態において、溶液を分析する際の色素アーティファクトの生成を低減させるために、タンパク質(例えば、色素標識されたヌクレオチドと複合体を形成したタンパク質)は、溶液から取り除かれる。色素標識されたヌクレオチドは、鎖伸長反応中にポリヌクレオチド鎖中に取り込まれなかった色素標識されたヌクレオチド(すなわち、取り込まれていない色素標識ヌクレオチド)である。
本発明の特定の実施形態は、取り込まれていないターミネーターを取り除くために処理された鎖伸長反応生成物を含むスピンカラムを提供する。
本発明の特定の実施形態は、タンパク質を取り除くために処理された鎖伸長反応生成物を含むスピンカラムを提供する。
鎖伸長反応としては、ポリヌクレオチド鎖(例えば、DNA鎖)の合成を含む反応が挙げられる。これらの反応は、少なくとも1つのポリメラーゼを使用したテンプレート指向性のポリヌクレオチド伸長プロセスを含み得る。色素標識されたヌクレオチドおよび/もしくはポリヌクレオチドは、鎖伸長反応において利用され得る。鎖伸長反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定反応、一塩基伸長(SBE)反応、ミニ配列決定反応(mini−sequencing reaction)などが挙げられるが、これらに限定されない。鎖伸長反応溶液は、鎖伸長反応が行なわれる溶液である。
タンパク質結合材料は、タンパク質が結合し得る材料である。特定のタンパク質結合材料が本明細書中に例示されているが、本発明はまた、溶液から(例えば、鎖伸長反応溶液から)タンパク質を除去させるのを可能にするためにタンパク質と結合する他の材料を包含していることも意図する。
鎖伸長反応中に存在するタンパク質は、任意のタンパク質(例えば、不純物として存在するタンパク質を含めた、当業者が鎖伸長反応に加え得る任意のタンパク質)であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は酵素である。本発明のいくつかの実施形態において、酵素は、RNAポリメラーゼもしくはDNAポリメラーゼ(例えば、Taq DNAポリメラーゼ)である。Taq DNAポリメラーゼは、変異Taq DNAポリメラーゼ(例えば、F667Y変異を有するTaq DNAポリメラーゼ)であり得る。DNAポリメラーゼは、耐熱性DNAポリメラーゼであってもよいし、そうでなくてもよい。DNAポリメラーゼは、天然に存在するアミノ酸配列を有し得るか、もしくは天然に存在するアミノ酸配列より一部誘導された変異体であり得る。
ポリメラーゼとしては、米国特許第6,534,269号;同第6,399,304号;同第6,365,350号;同第6,265,193号;同第6,197,555号;同第5,876,934号;同第5,871,929号;同第5,466,591号;および同第6,228,628号、ならびにAbramson、「Thermostable DNA Polymerases:An Update」、In PCR Applications:Protocols for Functional Genomics、M.A.Innis、D.H.GelfandおよびJ.J.Sninsky編、Academic Press、33−47(1999);Ignatovら、FEBS Letters、448、145−148(1999);Ignatovら、FEBS Letters、425、249−250(1998);Kalmanら、「Thermostable DNA Polymerases with Altered Discrimination Properties」、Genome Science and Technology、1、Abstract A−14、P−42(1995);ならびにTaborら、PNAS、92、6339−6343(1995)内に開示されているポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、DNA依存性DNAポリメラーゼである。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応は、DNA配列決定反応である。
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体、フィルターもしくは膜である。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質と混合される。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質の表面上にコーティングされる。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる。
本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液とタンパク質結合材料とを接触させる前に、サイクル配列決定を実施する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液を(例えば、サイズを基にした精製によって)精製する工程を含む。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除イオン交換を使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製工程中にタンパク質結合材料と接触される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製工程の前に、タンパク質結合材料と接触される。本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、蛍光DNAシークエンサーで鎖伸長反応溶液を分析する工程を包含する。
本発明の別の実施形態は、配列決定反応生成物の精製のためのキットである。本発明のキットは、タンパク質結合材料およびサイズ排除クロマトグラフィー材料を含み得る。本発明のキットはさらに、核酸配列決定反応を実施するための1つ以上の試薬を含み得る。このような試薬としては、色素標識されたターミネーター、プライマー、および/もしくはDNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。このキットはまた、配列決定反応生成物を精製するためのこれらの使用についての説明書も含み得る。
色素標識されたターミネーターは、核酸配列(例えば、DNA)を配列決定する際に、配列決定反応生成物より取り除かれ得る。例えば、配列決定反応生成物の分析を妨げ得る反応成分を取り除くことを試みて、サイクル配列決定(例えば、サンガー配列決定)の後に、精製工程が実施され得る。色素標識されたジデオキシヌクレオチド(すなわち、色素ターミネーター)を用いたサイクル配列決定の場合、DNA配列決定のラダー(ladder)中に取り込まれなかった色素標識されたジデオキシヌクレオチドを取り除くことは、有用である。これらの取り込まれていない色素標識されたジデオキシヌクレオチドを取り除くことに失敗すると、サンプルが蛍光DNAシークエンサーで分析される際に、電気泳動図中にアーティファクトを生じる。これらのアーティファクト(本明細書中では、「色素アーティファクト」もしくは単に「アーティファクト」と呼ぶ)は、核酸配列の正確な同定を妨げ得る。
本発明を限定するものではないが、配列決定反応において使用される色素標識されたジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼとの間の相互作用は、サイズを基にした精製手順の後に観察される色素アーティファクトの形成を導くと考えられている。ポリメラーゼは、色素標識されたジデオキシヌクレオチドとともに比較的高い分子量の複合体を形成すると考えられている。この複合体は、スピンカラムをとおして保持されずに通過し、そしてDNAとともに溶出されるに充分に大きくそして充分に安定していると考えられている。しかしながら、この複合体が電気泳動注入条件に供された場合、この複合体は解離し、そして色素標識されたジデオキシヌクレオチドが色素アーティファクトとして観察され得るようである。この知見に基づき、分析の前に複合体を取り除くことによって、色素アーティファクトを配列決定反応から低減させる(例えば、取り除く)ための方法および製品が開発された。
本明細書中に記載されている発明は、反応(例えば、鎖伸長反応)を実施するためのミクロ流体プラットフォーム(microfluidic platform)の使用を可能にする。このようなプラットフォームは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,613,525号;同第6,582,987号;同第6,344,326号;同第6,103,537号;および同第6,074,827号中に記載されている。このようなプラットフォームは、配列決定反応のための精製方法としてサイズ排除イオン交換(SEIE)を使用し得、それゆえに、サイズを基にした他の精製と同様の問題に苦しみ得る。SEIEは、例えば、米国特許出願公開第20040055956号;同第20040018559号;同第20040018116号;同第20040016702号;および同第20030228706号中に記載されている。本発明の方法と、ミクロ流体プラットフォームを利用する方法とを合わせることによって、これらの問題は避けられ得る。
ゆえに、本発明の特定の実施形態は、(例えば、タンパク質結合材料をともなうタンパク質を、例えば溶液から取り除くために)本発明の方法を実施するのに使用されることが可能なデバイス(例えば、ミクロ流体デバイス)を提供する。例えば、本発明の特定の実施形態は、タンパク質結合材料を含む領域を有するミクロ流体デバイスを提供する。本発明の特定の実施形態は、タンパク質結合材料を含む第一領域および取り込まれていないヌクレオチド(例えば、色素標識ターミネーター)を取り除くための第二領域を有するミクロ流体デバイスを提供する。第一領域および第二領域は、チャネルによって互いに連結され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、鎖伸長反応の前、鎖伸長反応中および/もしくは鎖伸長反応後に加えられるタンパク質結合材料の使用を含む。このような材料は、タンパク質(例えば、DNAポリメラーゼ)を結合し得、そしてそうする際、蛍光DNA配列決定を行なう前に精製法(例えば、サイズを基にした精製方法)を使用する場合の色素アーティファクトの形成を減少もしくは防止する。
サイズを基にした精製の前もしくはその精製中に配列決定反応生成物がタンパク質結合支持体と反応された場合、色素アーティファクトは減じられることが見出された。本発明のいくつかの実施形態において、配列決定反応生成物は、スピンカラムを使用した精製の前にタンパク質結合膜(例えば、Micropure−EZ(Millipore、Billerica、MA、USA))をとおしてろ過され得る。これは、電気泳動図中の色素アーティファクトを低減させる(図1A、1Bおよび1C)。精製方法としてサイズ排除イオン交換を使用した際に、同様の効果がみられる(図2A、2Bおよび2C)。精製していない配列決定反応生成物もまた、スピンカラムを使用する精製の前にアフィニティークロマトグラフィー支持体(例えば、HiTrap Phenyl Sepharose 6(AP Biotech、Piscataway、NJ、USA))で精製され得、そしてこれもまた、色素アーティファクトを電気泳動図から低減させる(図3Aおよび3B)。
本発明の別の実施形態は、タンパク質結合材料とサイズを基にした精製の媒質とを混合する工程を包含する方法を含む。例えば、色素アーティファクトの減少を起こすために、HiTrap Phenyl Sepharose 6が、サイズを基にした精製の媒質と混合され得る(例えば、100uLのHiTrap Phenyl Sepharose 6が、800uLのCentriSepカラム中に混合され得る)(図4)。
本発明の別の実施形態は、サイズを基にした精製の媒質の表面上をタンパク質結合材料でコーティングすることを含む(例えば、対立電荷をともなう高分子電解質の複数層でコーティングされた多孔性陰イオン交換樹脂)(米国特許出願第10/780,963号を参照されたい)。
本発明の別の実施形態は、サイズ排除スピンカラムの上部にタンパク質結合材料を重ねることを含む。例えば、色素アーティファクトを低減させるために、100uLのHiTrap Phenyl Sepharose 6が、800uLのCentriSepカラム(Princeton Separations、Adelphia、NJ、USA)の上部にピペットで入れられ得る(図5)。
これらは、タンパク質(DNAポリメラーゼ)に結合し得る、ゆえに色素アーティファクトを配列決定反応から減じ得る材料(例えば、膜およびクロマトグラフィー支持体)の単なる例である。タンパク質に結合することが可能である任意の材料(例えば、DNAポリメラーゼに結合することが可能である材料)もまた使用され得る。
これらの材料としては、POROS 20 HP2(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)、HiTrap Octyl FF、HiTrap Butyl FF、HiTrap Phenyl Sepharose 6 FF−high sub、Octyl SepharoseおよびButyl Sepharose(全てAP Biotechより)、ポリ(4−ビニルフェノール)、MW 1500〜7000(Polysciences,Inc、Warrington、PA、USA)もしくはIsolute ENV+(Argonaut Technologies、Foster City、CA、USA)が挙げられるが、これらに限定されない。
(スピンカラム)
スピンカラムおよびスピンカラムを作るための方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかの会社がスピンカラムを製造し販売しており、このような会社としては、Bio−Rad(Hercules、CA、USA)、Princeton Separations(Adelphia、NJ、USA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway、NJ、USA)およびMillipore Corporation(Billerica、MA、USA)が挙げられる。スピンカラムはまた、当業者によって容易に調製され得、そして多くの手順のバリエーション(例えば、空のカラムにサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を詰めることを含む)が使用され得る。自己充填(self−filled)カラムに有用な樹脂の例は、Sephadex G−50(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ、USA)、Bio−Gel P−10およびBio−Gel P−30(Bio−Rad、Hercules、CA、USA)である。いくつかの取り込まれていない色素アーティファクトをDNA配列決定反応から取り除く際にこれらの製品が使用され得るが、これらは、現代のDNA配列決定キット(例えば、BigDye Terminators v.3.1(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA))とともに使用される際に、残留色素アーティファクトを被る。
スピンカラムおよびスピンカラムを作るための方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかの会社がスピンカラムを製造し販売しており、このような会社としては、Bio−Rad(Hercules、CA、USA)、Princeton Separations(Adelphia、NJ、USA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway、NJ、USA)およびMillipore Corporation(Billerica、MA、USA)が挙げられる。スピンカラムはまた、当業者によって容易に調製され得、そして多くの手順のバリエーション(例えば、空のカラムにサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を詰めることを含む)が使用され得る。自己充填(self−filled)カラムに有用な樹脂の例は、Sephadex G−50(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ、USA)、Bio−Gel P−10およびBio−Gel P−30(Bio−Rad、Hercules、CA、USA)である。いくつかの取り込まれていない色素アーティファクトをDNA配列決定反応から取り除く際にこれらの製品が使用され得るが、これらは、現代のDNA配列決定キット(例えば、BigDye Terminators v.3.1(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA))とともに使用される際に、残留色素アーティファクトを被る。
ゆえに、本発明の特定の実施形態は、(例えば、タンパク質結合材料を伴うタンパク質を、例えば溶液から取り除くために)本発明の方法を実施するために使用されることが可能なデバイス(例えば、スピンカラム)を提供する。
(タンパク質結合材料としての固体支持体)
いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質(例えば、DNAポリメラーゼ)を配列決定反応から取り除くための固体支持体の使用に関連しており、これによって色素アーティファクトを、取り除かないのであれば、低減させる。固体支持体は、約0.01μm〜約200μmの範囲(例えば、約0.05μm〜約100μm、例えば、約0.1μm〜約50μm)の孔サイズ、および約0.1μm〜約2000μmの範囲(例えば、約0.5μm〜約1500μm、例えば、約0.5μm〜約1000μm)の厚さを有する多孔膜であり得る。固体保持体は、約100nm〜約2000μmの範囲(例えば、約500nm〜約1000μm、例えば、約1μm〜約200μm)の粒子サイズを有するポリマーミクロスフィアであり得る。ポリマーミクロスフィアは、ミクロポーラス(約30Å未満の孔サイズ)、マクロポーラス(約30Å〜約4000Åの孔サイズ)もしくはメガポーラス(magaporous)(約4000Åより大きい孔サイズ)(例えば、Polygenetics(Los Gatos、CA)によって、高内部相エマルジョン(high−internal−phase emulsion)(HIPE)技術(米国特許第4,522,953号および同第5,583,162号を参照されたい)を使用して調製されたMagnaporeTM)であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約10Å〜約10,000Åの範囲(例えば、約100Å〜約8,000Å)であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約10,000Åより大きいサイズであり得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質(例えば、DNAポリメラーゼ)を配列決定反応から取り除くための固体支持体の使用に関連しており、これによって色素アーティファクトを、取り除かないのであれば、低減させる。固体支持体は、約0.01μm〜約200μmの範囲(例えば、約0.05μm〜約100μm、例えば、約0.1μm〜約50μm)の孔サイズ、および約0.1μm〜約2000μmの範囲(例えば、約0.5μm〜約1500μm、例えば、約0.5μm〜約1000μm)の厚さを有する多孔膜であり得る。固体保持体は、約100nm〜約2000μmの範囲(例えば、約500nm〜約1000μm、例えば、約1μm〜約200μm)の粒子サイズを有するポリマーミクロスフィアであり得る。ポリマーミクロスフィアは、ミクロポーラス(約30Å未満の孔サイズ)、マクロポーラス(約30Å〜約4000Åの孔サイズ)もしくはメガポーラス(magaporous)(約4000Åより大きい孔サイズ)(例えば、Polygenetics(Los Gatos、CA)によって、高内部相エマルジョン(high−internal−phase emulsion)(HIPE)技術(米国特許第4,522,953号および同第5,583,162号を参照されたい)を使用して調製されたMagnaporeTM)であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約10Å〜約10,000Åの範囲(例えば、約100Å〜約8,000Å)であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約10,000Åより大きいサイズであり得る。
多孔膜の場合、分析物は、膜の孔を通して透過(すなわち、ろ過)されて、タンパク質−色素ターミネーター複合体が隔離され得る。ポリマーミクロスフィアの場合、精製は、分析物をポリマーミクロスフィアのバッチにさらすことによってか、もしくは充填されたミクロスフィアのカラムをとおして溶出することによる、それぞれバッチモードもしくはクロマトグラフィーモードであり得、タンパク質−色素ターミネーター複合体が隔離され得る。いくつかの実施形態において、表面は、ノンポーラスミクロスフィア、ノンポーラス膜、もしくはタンパク質結合表面を提示するために調製された(例えば、表面が官能基化された)他のノンポーラス表面であり得る。
(フェノール部分を有する固体支持体)
本発明の一つの実施形態は、スキーム1に例示されるように、表面にフェノール部分を有するポリマー固体支持体2による色素アーティファクトの除去を含む。例えば、固体支持体は、スチレンとジビニルベンゼンとのフリーラジカル重合、そしてその後のヒドロキシル化によって調製されたポリマーミクロスフィア1であり得る。(スキーム1)。当業者は、フェノール基を表面に有する2を調製するために、1におけるニトロ化/アミノ化、そしてその後のジアゾ化/加水分解を行ない得る。乳化重合中にポロゲン(porogen)(例えば、ヘキサノール)がモノマー中に加えられ得、多孔質ポリスチレンミクロスフィアを得る。当業者は、ポロゲン濃度および実験条件を調整させることによって、多孔度および孔のサイズを調節し得る。2に類似した化学組成を有する市販されている製品は、Isolute ENV+である(Argonaut、Foster City、CA)。
本発明の一つの実施形態は、スキーム1に例示されるように、表面にフェノール部分を有するポリマー固体支持体2による色素アーティファクトの除去を含む。例えば、固体支持体は、スチレンとジビニルベンゼンとのフリーラジカル重合、そしてその後のヒドロキシル化によって調製されたポリマーミクロスフィア1であり得る。(スキーム1)。当業者は、フェノール基を表面に有する2を調製するために、1におけるニトロ化/アミノ化、そしてその後のジアゾ化/加水分解を行ない得る。乳化重合中にポロゲン(porogen)(例えば、ヘキサノール)がモノマー中に加えられ得、多孔質ポリスチレンミクロスフィアを得る。当業者は、ポロゲン濃度および実験条件を調整させることによって、多孔度および孔のサイズを調節し得る。2に類似した化学組成を有する市販されている製品は、Isolute ENV+である(Argonaut、Foster City、CA)。
(スキーム1.フェノール基を表面に有する架橋ポリスチレンミクロスフィアの調製)
(スキーム2.アセトキシスチレンを基にしたフェノールポリマーミクロスフィア)
本発明の別の実施形態は、タンパク質−色素ターミネーター複合体を取り除くことによって色素アーティファクトを低減させるための、PVDFもしくはその誘導体の使用を含む。粒子もしくは膜の形態のPVDFは、色素アーティファクトを低減させるために使用され得る。タンパク質結合材料とタンパク質との複合体に結合するために、PVDFフィルムのスルホン化から調製されたイオン交換膜もまた使用され得る(スキーム3;Richardsら、1964およびYangら、2003)。負に荷電したスルホネート基の存在が、DNAフラグメントの受動吸着を低減させる。
(スキーム3.ポリビニリデンジフルオリドのスルホン化)
本発明のいくつかの実施形態は、タンパク質−色素ターミネーター複合体を結合するために、架橋、アルキル化もしくはアリール化されたデキストランおよびアガロースの使用を含む。架橋デキストランとしては、Sephadex(登録商標)(スキーム4)もしくはSephacryl(登録商標)(スキーム5)が挙げられるが、これらに限定さず、そして架橋アガロースとしては、Sepharose(登録商標)(スキーム6)が挙げられるが、これに限定されない。
(スキーム4.エピクロロヒドリンを有する架橋デキストラン(Sephadex(登録商標)))
(スキーム7.架橋デキストランおよび架橋アガロースの表面修飾)
本発明の一つの実施形態は、その表面上に疎水性部分を含む高架橋ヒドロゲルを用いたタンパク質−色素ターミネーター複合体の除去を提供する。ヒドロゲルの親水性マトリックスは、DNAフラグメントの受動吸着を低減させるが、疎水性部分は、タンパク質−色素ターミネーター複合体と結合するための疎水性相互作用に寄与する。ヒドロゲルは、水溶性モノマー、少なくとも1つの水溶性、わずかに水溶性、もしくは水不溶性のコモノマー、および架橋剤を重合することによって調製され得る。架橋剤は、水溶性でもよいし、わずかに水溶性でもよいし、もしくは水不溶性でもよい(例えば、N,N’−メチレンビスアクリルアミド、テトラエチレングリコールジ(メタ)アクリレート(tetraethyene glycol di(methy)acrylate)、もしくはペンタエリスリトールトリ(メタ)アクリレート))。架橋剤の適切な濃度および化学構造を選択することによって、望ましい物理的特性および化学的特性の水素(hydrogen)が得られ得る。本発明の種々の実施形態において、コモノマーとしては、疎水性部分(例えば、ブチル(メタ)アクリレート(buthyl(methy)acrylate)、スチレン、2−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリルアミド、N−ブチル−N−ビニルホルムアミド、N−ブチル−N−ビニル−アセトアミド、N−フェニル−N−ビニルアセトアミド、ビニルメチルエーテル、ビニルブチルエーテル、アリルエチルエーテル、アリルブチルエーテル、アリルベンジルエーテル、もしくはこれらの2つ以上の組み合わせ)が挙げられる。本発明の種々の実施形態において、コモノマーとしては、陰イオン部分(例えば、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルスルホン酸もしくはスチレンスルホン酸)が挙げられる。疎水性部分は、疎水性相互作用をとおしてタンパク質−色素ターミネーター複合体に結合し得るが、ヒドロゲルマトリックスの陰イオン部分は、負に荷電されたDNAフラグメントの受動吸着を減じ得る。ヒドロゲル粒子を調製するために、通常の乳化重合、逆乳化重合、膜乳化/重合技術が使用され得る。乳化のための条件を調整すること、および適切な界面活性剤を使用することによって、望ましい粒子サイズが得られ得る。
本発明のいくつかの実施形態において、出来上がった配列決定反応の生成物(例えば、サーマルサイクリング後の配列決定反応からの生成物)は、反応の精製の前に、タンパク質結合材料を含む容器に加えられ得る。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、反応をサーマルサイクリングする前に、配列決定反応に直接加えられ得る。タンパク質結合材料は、反応がサーマルサイクリングされている間中、配列決定反応と同じ容器内に残り得る。
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、ビーズもしくは粒子(例えば、クロマトグラフィー支持体)、あるいは不溶性粒子(例えば、ポリマーミクロスフィア)であり得る。タンパク質結合材料は、室温で、反応緩衝液中で、タンパク質(例えば、DNAポリメラーゼ)を結合することが可能であるべきであるが、サーマルサイクリング条件下でこの反応を妨げるべきでない。
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によって説明される。
(実施例1)
配列決定反応生成物を、サイズを基にした精製の前もしくは間に、タンパク質を結合する材料と接触させた場合、この生成物が分析された際に色素アーティファクトは観察されないことが見出された。
配列決定反応生成物を、サイズを基にした精製の前もしくは間に、タンパク質を結合する材料と接触させた場合、この生成物が分析された際に色素アーティファクトは観察されないことが見出された。
DNA配列決定反応
各20uLの反応につき8uLのBigDyeターミネーター(BDT)v.3.1 Ready Reaction Mixを使用して、20uLの配列決定反応を実施した。配列決定プライマーは、1反応につき3.2pmolのM13リバースプライマーであった。(5’−CAGGAAACAGCTATGACC−3’;配列番号1)。テンプレートは、ユニバーサルM13プライミング部位を有するPCR生成物であった。
各20uLの反応につき8uLのBigDyeターミネーター(BDT)v.3.1 Ready Reaction Mixを使用して、20uLの配列決定反応を実施した。配列決定プライマーは、1反応につき3.2pmolのM13リバースプライマーであった。(5’−CAGGAAACAGCTATGACC−3’;配列番号1)。テンプレートは、ユニバーサルM13プライミング部位を有するPCR生成物であった。
20uLの反応につき、約150ngのテンプレートを使用した。この反応を、デフォルトの配列決定条件(96℃で10秒、50℃で5秒、60℃で240秒;25回)を使用して、GeneAmp 9700(Applied Biosystems、Foster City、CA、UA)においてサイクリングし、そして貯留した。図1および図2において配列決定されたPCR生成物は、図3、図4および図5のものとは異なった。配列決定のためのPCR生成物が変わることは、アーティファクトを低減させるためにサンプルを精製する能力に影響を与えなかった。
図1Aは、CentriSepカラム精製で精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。図1Bは、CentriSepカラム精製の前にMicropure−EZ Enzymeデバイスで精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。図1Cは、図1A(上部のパネル)および図1B(下部のパネル)からの生データを表している。
図2Aは、SEIE精製で精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。図2Bは、SEIE精製の前にMicropure−EZ Enzymeデバイスで精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。図2Cは、図2A(上部のパネル)および図2B(下部のパネル)からの生データを表している。
図3Aは、CentriSepカラム精製で精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。図3Bは、20μLの反応と50μLのHiTrap Phenyl Sepharose HP樹脂との反応、続いてCentriSepカラム精製によって精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。
図4は、均質の混合吸着床を形成するためにCentriSep中に混合された100μLのHiTrap Phenyl Separose HP樹脂を有するCentriSepカラムを使用して精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。
図5は、積み重ねられた吸着床を形成するためにCentriSepの上部に重ねられた100μLのHiTrap Phenyl Sepharose HP樹脂を有するCentriSepカラムを使用して精製されたBigDyeターミネーターのバージョン3.1の配列決定反応の結果を表している。
酵素除去
貯留された配列決定反応生成物の50uLのアリコートを、Micropure−EZ Enzymeデバイスに加え、そしてベンチトップ遠心分離機で13,000×gで30秒スピンした。その後、膜をとおった液体をCentriSepもしくはSEIEのいずれかで精製した。CentriSepカラムの前にHiTrap樹脂を使用した精製の場合(図3B)、配列決定反応生成物の25uLのアリコートを5uLのHiTrap樹脂のスラリーと混合し、そして5分間ボルテックスした。この混合物をスピンダウンし、そして20uLの上澄みをとり、そしてCentriSepカラムに入れた。
貯留された配列決定反応生成物の50uLのアリコートを、Micropure−EZ Enzymeデバイスに加え、そしてベンチトップ遠心分離機で13,000×gで30秒スピンした。その後、膜をとおった液体をCentriSepもしくはSEIEのいずれかで精製した。CentriSepカラムの前にHiTrap樹脂を使用した精製の場合(図3B)、配列決定反応生成物の25uLのアリコートを5uLのHiTrap樹脂のスラリーと混合し、そして5分間ボルテックスした。この混合物をスピンダウンし、そして20uLの上澄みをとり、そしてCentriSepカラムに入れた。
CentriSep精製
Princeton SeparationsからのCentriSepカラムを、800uLの高純度の脱イオン水で2時間水和させた。配列決定反応生成物の20uLのアリコートを、カラムをとおして溶出させた。精製されたサンプルを、分析のためにABI 3100に移した。
Princeton SeparationsからのCentriSepカラムを、800uLの高純度の脱イオン水で2時間水和させた。配列決定反応生成物の20uLのアリコートを、カラムをとおして溶出させた。精製されたサンプルを、分析のためにABI 3100に移した。
混合親和性/CentriSepカラム
CentriSepカラムを、800uLの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを30分静置した。HiTrap樹脂のスラリーの100uLのアリコートをピペットで加え、そしてボルテックスした。他の親和性樹脂もまた使用され得た。その後、このカラムを、CentriSepカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
CentriSepカラムを、800uLの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを30分静置した。HiTrap樹脂のスラリーの100uLのアリコートをピペットで加え、そしてボルテックスした。他の親和性樹脂もまた使用され得た。その後、このカラムを、CentriSepカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
層状親和性/CentriSepカラム
CentriSepカラムを、800uLの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを30分静置した。30分の水和の後、スピンカラムの蓋を開け、そして重力によって約10分間排水させた。HiTrap樹脂のスラリーの100uLのアリコートを、CentriSep樹脂吸着床の上部にピペットで慎重に加えた。(他の親和性樹脂もまた使用され得た。)その後、このカラムを、CentriSepカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
CentriSepカラムを、800uLの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを30分静置した。30分の水和の後、スピンカラムの蓋を開け、そして重力によって約10分間排水させた。HiTrap樹脂のスラリーの100uLのアリコートを、CentriSep樹脂吸着床の上部にピペットで慎重に加えた。(他の親和性樹脂もまた使用され得た。)その後、このカラムを、CentriSepカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
サイズ排除イオン交換精製
スラリー(この材料の完全な説明については20040018559A1;20040016702A1;および米国特許出願第10/780,963号を参照されたい)の1uLのアリコートを、MicroAmpチューブに移した。サンプルの1uLのアリコートを加え、そしてこの混合物をピペットで混合し、その後、1分間ボルテックスした。この混合物に、6uLの脱イオン水を加え、ボルテックスし、樹脂をチューブの下部にスピンダウンし、そして分析のために上澄みをABI 3100に移した。
スラリー(この材料の完全な説明については20040018559A1;20040016702A1;および米国特許出願第10/780,963号を参照されたい)の1uLのアリコートを、MicroAmpチューブに移した。サンプルの1uLのアリコートを加え、そしてこの混合物をピペットで混合し、その後、1分間ボルテックスした。この混合物に、6uLの脱イオン水を加え、ボルテックスし、樹脂をチューブの下部にスピンダウンし、そして分析のために上澄みをABI 3100に移した。
電気泳動条件
ABI 3100で、36cmのキャピラリーアレイ、POP−6ポリマーおよびデフォルトの「高速配列決定(rapid seq)」法の改変版で電気泳動を実施した。この方法は、注入条件を1000Vで22秒から500Vで11秒に下げることによって改変された。注入物は、脱イオン水から作った。
ABI 3100で、36cmのキャピラリーアレイ、POP−6ポリマーおよびデフォルトの「高速配列決定(rapid seq)」法の改変版で電気泳動を実施した。この方法は、注入条件を1000Vで22秒から500Vで11秒に下げることによって改変された。注入物は、脱イオン水から作った。
(実施例2)
この実施例は、酵素結合材料が、サーマルサイクリングの前に配列決定反応に直接加えられ得ることを示す実験を説明する。ゆえに、酵素結合材料は、反応がサーマルサイクリングされている間中、配列決定反応と同じ容器中に残り得る。酵素結合材料は、反応緩衝液中で、室温でタンパク質(例えば、ポリメラーゼ)を結合することが可能であるべきであるが、酵素結合材料は、サーマルサイクリング条件下でこの反応を妨げるべきでない。
この実施例は、酵素結合材料が、サーマルサイクリングの前に配列決定反応に直接加えられ得ることを示す実験を説明する。ゆえに、酵素結合材料は、反応がサーマルサイクリングされている間中、配列決定反応と同じ容器中に残り得る。酵素結合材料は、反応緩衝液中で、室温でタンパク質(例えば、ポリメラーゼ)を結合することが可能であるべきであるが、酵素結合材料は、サーマルサイクリング条件下でこの反応を妨げるべきでない。
80uLのBigDyeターミネーター v.3.1 Ready Reaction Mix(Applied Biosystems)と、3.2pmol/uLの10uLのM13ユニバーサルフォワード配列決定プライマー(5’−TGTAAAACGACGGCCAGT−3’;配列番号2)、15uLのpGEM(200ng/uL)プラスミドテンプレート、および95uLの脱イオン水とを合わせることによって、BigDye v.3.1ターミネーター反応溶液を調製した。
反応溶液の20uLのアリコートを、96ウェルPCRトレーの6つのウェルにピペットで加えた。2つの異なるタイプのタンパク質結合材料を、反応への付加物としてテストした。以下に説明する両方の添加物(それぞれ100uL)を、反応溶液に加える前に、脱イオン水の500uLアリコートで5回洗浄した。洗浄の後、全ての材料をスピンダウンし、そして樹脂の高さよりも高い最小量の水を残した。
溶液を以下のようにして調製した。チューブ1&2において、何も添加していない20uLの反応溶液をコントロールとして使用した。チューブ3&4において、20uLの反応溶液を、1uLのPOROS 20 HP2(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)と合わせた。チューブ5&6において、20uLの反応溶液を、1uLのPhenyl Sepharose 6 FF high sub(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)と合わせた。
その後、PCRトレーを、デフォルトのBigDyeサイクリング条件を使用して、Applied Biosystems 9700サーマルサイクラーでサーマルサイクリングした。サーマルサイクリングの後、96ウェルのトレーをサーマルサイクラーから取り出し、そして1分間ボルテックスした。その後、このプレートを遠心分離機でスピンダウンした。
製造業者の説明書のとおりに、6つのCentriSepカラムを、800uLの脱イオン水で水和させ、ボルテックスし、そして2時間静置した。CentriSepカラムに入れる前に、再び水和したカラムを、ベンチトップ遠心分離機で3000rpmにて2分間遠心分離した。それぞれの配列決定反応溶液の20uLのアリコートを、CentriSepカラム上にピペットで入れた。サンプルとともに酵素結合樹脂をピペットで入れることを避けるために、特別な注意をはらわなかったが、実際はいくつかの樹脂がCentriSepカラムに移された。サンプルを含むカラムを、ベンチトップ遠心分離機で3000rpmにて2分間遠心分離した。約20uLのサンプルを、それぞれのカラムから回収した。DNAシークエンサーでの分析のために、20uLの精製されたサンプルのアリコートを、96ウェルプレートに移した。サンプルを、ABI 3100 DNAシークエンサー(Applied Biosystems)で、36cmのキャピラリーアレイを使用し、POP−6ポリマーおよびデフォルトのRapidSeq36法を使用して分析した。
結果を、図6〜図8として示す。それぞれのサンプルを2連で実施したが、それぞれのうちの一つの例のみを図に示す。
図6は、配列決定反応において何の添加物も使用されず、そして生じた配列決定反応が、CentriSepカラムを使用して精製された際の結果を表している。2つの色素アーティファクトが見え、これは、塩基25と塩基35との間でデータの誤読(miscall)を生じた。
図7は、サーマルサイクリングの前に、1uLのPOROS 20 HP2を配列決定反応に加えた際の結果を表している。反応をサーマルサイクリングする間中、酵素結合材料(POROS 20 HP2)が、配列決定反応と同じ容器中に残ったことに注意されたい。生じた配列決定反応を上記で説明したとおりに精製し、そして分析した際に、色素アーティファクトは観察されなかった。
図8は、サーマルサイクリングの前に、1uLのPhenyl Sepharose 6 FF high subを配列決定反応に加えた際の結果を表す。反応をサーマルサイクリングする間中、酵素結合材料(POROS 20 HP2)が、配列決定反応と同じ容器中に残ったことに注意されたい。生じた配列決定反応を上記で説明したとおりに精製し、そして分析した際に、色素アーティファクトは観察されなかった。
前述の明細書中で、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して説明され、そして多くの詳細が説明の目的のために述べられたが、本発明は、さらなる実施形態が可能であり、そして本明細書中に述べられる詳細のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱せずに大きく変えられ得ることは、当業者に明らかである。
本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
Claims (44)
- 鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減させる方法であって、該方法は:
a)タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と、少なくとも1つのタンパク質結合材料とを接触させて、該タンパク質結合材料と該タンパク質との複合体を形成する工程;および
b)該鎖伸長反応溶液から該複合体を分離する工程
を包含する方法。 - 前記タンパク質が、酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、DNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記Taq DNAポリメラーゼが、変異Taq DNAポリメラーゼである、請求項5に記載の方法。
- 前記変異Taq DNAポリメラーゼが、F667Y変異を有する変異Taq DNAポリメラーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質が、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している、請求項1に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応が、DNA配列決定反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、膜である、請求項1に記載の方法。
- 前記膜が、多孔膜である、請求項10に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.01μm〜約200μmの範囲のサイズの孔を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.05μm〜約100μmの範囲のサイズの孔を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.1μm〜約50μmの範囲のサイズの孔を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.1μm〜約2000μmの範囲の厚さを有する、請求項11に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.5μm〜約1500μmの範囲の厚さを有する、請求項15に記載の方法。
- 前記多孔膜が、約0.5μm〜約1000μmの範囲の厚さを有する、請求項16に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、固体支持体である、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体が、ミクロスフィアである、請求項18に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、ポリスチレンミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、約100nm〜約2000μmの直径を有するポリマーミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、約500nm〜約1000μmの直径を有する、請求項21に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、約1μm〜約200μmの直径を有する、請求項21に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、ノンポーラスミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、ミクロポーラスミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、マクロポーラスミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記ミクロスフィアが、メガポーラスミクロスフィアである、請求項19に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、固体支持体の表面上に層を形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体が、多孔膜である、請求項28に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、共有結合をとおして前記固体支持体と結合している、請求項28に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、サイズを基にした精製の媒質と混合される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質結合材料が、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の前に、サイクル配列決定を実施する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応溶液を精製する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応溶液が、サイズを基にした精製によって精製される、請求項34に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応溶液が、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される、請求項35に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応溶液が、サイズ排除イオン交換を使用する、サイズを基にした精製によって精製される、請求項35に記載の方法。
- 前記鎖伸長反応溶液を、蛍光DNAシークエンサーで分析する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記精製工程中に、前記鎖伸長反応溶液が、タンパク質結合材料と接触される、請求項34に記載の方法。
- 前記精製工程の前に、前記鎖伸長反応溶液が、タンパク質結合材料と接触される、請求項34に記載の方法。
- 鎖伸長反応の前に、前記タンパク質結合材料が、前記鎖伸長反応溶液と接触される、請求項1に記載の方法。
- 鎖伸長中、前記タンパク質結合材料が、前記鎖伸長反応溶液と接触されたままである、請求項41に記載の方法。
- 鎖伸長反応溶液中のタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含む、ミクロ流体デバイス。
- 鎖伸長反応溶液中のタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む、スピンカラム。
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