JP2005537013A - 配列決定反応物クリーンアップのための溶液の組成 - Google Patents

Abstract

配列決定用反応産物を精製するための洗浄溶液及び方法。洗浄溶液は、配列決定用反応産物中の色素ターミネーターの存在を減少させるか又は排除するのに有効な量のグアニジンを低イオン溶液中に含む。その方法の局面において、本発明は、未取込みの色素ターミネーターを減少させるか又は排除するため、ろ過の前に配列決定用反応産物に洗浄溶液を添加し、その後、ろ過することを含む。次いで、精製された配列決定用産物は再懸濁させられ、配列決定又はさらなる調製のための適切な基質へと移され得る。未取込みの色素ターミネーターから形成される色素斑点は、もはや、試料の電気泳動で作製される電気泳動図を妨害しない。

Description

（背景）
アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）より入手可能なＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）（登録商標）ターミネーター（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）ｖ．１．０、１．１、２．０、３．０及び３．１レディリアクションサイクル配列決定用キット（Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔｓ）のような、市販されているＤＮＡ配列決定用キットは、蛍光標識分子又は色素ターミネーターを成分として利用している。例えば、色素ターミネーター、デオキシヌクレオシド三リン酸、配列決定用酵素、塩化マグネシウム及びバッファーが予め混合されており、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡテンプレート及びポリメラーゼ連鎖反応断片に対して蛍光に基づくサイクル配列決定反応を実行するのに適している。

色素ターミネーターはＤＮＡポリメラーゼの天然の基質ではないため、一般に、重合中の配列決定用産物へのそれらの取り込みを確実にするため、天然のｄＮＴＰ基質に対して高い濃度が提供されなければならない。しかしながら、未取込みの蛍光標識分子は、高濃度に存在する場合、除去するのが困難である。適切に除去されない場合、未取込みの蛍光標識分子は、電気泳動における短い配列決定用産物との共移動等により、下流の分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に干渉する可能性がある。実際、これらの分子は、高濃度で不溶性の複合体を形成する傾向を有する。それらは、高濃度のシーケンシング化学を利用する反応（例えば、１×、１／２×及び１／４×の強度の反応）において特に問題となる。

電気泳動の前に配列決定反応物から未取込みの色素ターミネーターを除去するための従来の方法には、アルコール沈殿及びゲル濾過が含まれる。しかしながら、塩は、キャピラリー型配列決定装置への動電学的注入に関する配列決定用産物と競合し、やはり除去されなければならない。エタノール沈殿は、不十分な塩除去能力を有しており、配列決定用産物の動電学的注入の効率は塩濃度と反比例するため、キャピラリー電気泳動前の試料を調製する方法としてのその利用可能性は低い。ゲル濾過は、ハイスループットＤＮＡ配列決定にとって重要である自動化が困難な、遠心分離に基づく方法である。

色素ターミネーターのような未取込みの蛍光標識分子を除去するもう一つの方法には、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より市販されているマルチスクリーン（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ）（登録商標）又はモンタージュ（Ｍｏｎｔａｇｅ）（商品名）３８４−ＳＥＱ限外ろ過プレートの使用が含まれる。これらのプレートは、完全に自動化可能であり、色素ターミネーター除去のための従来のエタノール沈殿に代わる、費用及び時間に関して効率的な方法を提供する。それらは減圧濾過により作動し、従って、遠心分離、エタノール乾燥工程及びマニフォールド分解ルーチンの必要を排除する。ホルムアミド又はＥＤＴＡのような溶媒が、色素ターミネーターの可溶化及び凝集物形成の防止を補助する。配列決定用産物は、乾燥するまでろ過し、次いで塩及び色素ターミネーターを洗浄廃棄することにより、精製される。次いで、精製された配列決定用産物は、膜表面から再懸濁させられ、ＤＮＡシーケンサーへの導入の準備が整う。

しかしながら、様々な製造業者による新たな配列決定化学の導入は、精製に関する挑戦を提示し続ける。さらに、現在の限外ろ過技術は、ＤＮＡ配列決定反応１回当たり１マイクロリットルの配列決定用試薬（１／８^ｔｈ ＢＤＴ ｖ３．０）という反応強度では、実質的に精製されたＤＮＡ配列決定用産物を提供するが、より高い濃度では、色素斑点（ｄｙｅ ｂｌｏｂｓ）として既知のアーティファクトが、電気泳動図上に明白となる。これらのアーティファクトは、それらを排除するために製造業者により推奨されたプロトコルへの特別な修飾にも関わらず、ゲル濾過及びアルコール沈殿のような他のクリーンアップ法を使用した場合にも、一般に可視的である。

従って、配列決定反応物から未取込みの蛍光標識分子及び残存塩を減少させるか又は排除するための、費用効果が高く効率的な溶液を提供することは、望ましいであろう。

（概要）
先行技術の問題は、配列決定用反応産物を精製するための洗浄溶液及び方法を提供する本発明により克服された。その洗浄溶液は、好ましくは、低イオン溶液中に約１ｍＭ〜約６０ｍＭのグアニジンを含む。その方法の局面において、本発明は、未取込みの色素ターミネーターを減少させるか又は排除するため、ろ過前に配列決定用反応産物に洗浄溶液を添加し、その後、ろ過することを含む。次いで、精製された配列決定用産物は、再懸濁させられ、配列決定又はさらなる調製のための適切な基質へと移され得る。未取込みの色素ターミネーターから形成される色素斑点は、もはや、試料の電気泳動で作製される電気泳動図の分解能に干渉しない。

（詳細な説明）
本発明者らは、配列決定用反応産物中の有効量のグアニジンが、より高い反応スケールですら、電気泳動図に実証されるように、凝集物を粉砕し、かつ／又はそれらの形成を防止することを見出した。グアニジンの有効量とは、未取込みの色素ターミネーターの存在を、下流の分析、特に配列決定用反応産物の電気泳動にそれらが有害に干渉しない程度にまで減少させるのに十分な量である。電気泳動に対する有害な干渉は、電気泳動図における色素斑点の出現中に明示され、色素斑点の存在は、配列決定用産物を正確に分離することを困難又は不可能にする。そのような干渉は、より短いＤＮＡで特に顕著である。より高濃度の色素ターミネーターは、更に下流で配列決定にも干渉する。

過剰量のグアニジンは、より短い配列決定用産物の許容されない損失をもたらす場合がある。不十分な量のグアニジンは、有害なアーティファクトの不充分な減少、又はその再出現をもたらし得る。適切なグアニジンの量は、約１〜約６０ｍＭ、より好ましくは約１〜約３０ｍＭの範囲内であり、約５〜約１０ｍＭが特に好ましい。比較的低い濃度のグアニジンのみが、電気泳動図から色素斑点を十分に減少させるか又は排除するのに有効であったことは、驚くべきことである。

好ましくは、グアニジンは、塩の形態で使用される。適切な塩は、グアニジン炭酸塩又はグアニジン塩酸塩のようなグアニジンのカオトロープを含む。使用される特定の塩は、反応中の望ましくない相互作用を回避するために選択されるべきである。好ましくは、グアニジン塩は、約５〜１１、好ましくは８〜１０のｐＨの０．３ｍＭ ＥＤＴＡのような低イオン溶液中で使用される。

その方法の局面において、本発明は、規定された量の配列決定用反応産物を準備する工程、少なくとも一つの表面を有する少なくとも一つの限外濾過膜を準備する工程、限外濾過膜の表面に配列決定用反応産物を導入する工程、配列決定用反応産物が限外濾過膜表面へ導入される前又は後のいずれかに、グアニジン洗浄溶液を添加する工程、混入物が実質的にない配列決定用反応産物を作製するのに十分な一定の圧力差又は真空のような駆動力を膜の表面に適用する工程、を含む。グアニジン洗浄溶液の添加及び駆動力の適用は、繰り返され得る。配列決定用反応産物は膜表面に保持され、一方、色素ターミネーターを含む混入物はろ過廃棄される。好ましくは、配列決定用反応産物は、乾燥するまで（例えば、可視的液体が残存しなくなるまで）ろ過され、駆動力は、乾燥するまでろ過した後、約１５秒間維持される（マルチウェル装置で複数のろ過が同時に実施される場合には、駆動力は、好ましくは、最後のウェルが空になるまで維持される）。配列決定用反応産物は、（本発明の洗浄溶液等により）洗浄され、再び乾燥するまでろ過され、ホルムアミド又は水のような当業者に既知の低イオン溶液に再懸濁させられ、配列決定（例えば、動電学的注入）、制限消化又はさらなる調製のための適切な基質へと（例えば、ピペッティングにより）移され得る。

以下の表は、ＡＢＩビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）（登録商標）ターミネーターキットを使用した様々な濃度のシーケンシング化学のための成分の適切な量を例示する。

適切な限外濾過膜は、約１０００〜３０，０００ダルトン、好ましくは約３，０００〜１５，０００ダルトンのカットオフ分子量を有する。それらは、以下に限定はされないが、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、セルロース誘導体、再生セルロース及びポリフッ化ビニリデンを含む、多様な材料から作成され得る。それらは、対称であってもよいし又は非対称であってもよいが、好ましいのは後者である。ハイスループット適用のため、好ましくは、複数の限外ろ過が、同時に、最も好ましくは３８４穴フィルタープレートを使用して実施される。９６穴フォーマットを含むその他のサイズのプレートも使用され得る。適切なフィルタープレートには、ミリポア社から市販されているマルチスクリーン（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ）（登録商標）又はモンタージュ（ＭＯＮＴＡＧＥ）（商品名）３８４−ＳＥＱフィルタープレートが含まれる。

適切な真空は、色素ターミネーターを減少させるか又は除去するのに十分なものであり、一般に、約１５〜約２８インチ水銀、好ましくは約２３〜２５インチ水銀の範囲内である。一般に、駆動力は、典型的には約３〜４分であるウェルから可視的液体を全て除去するのに必要な時間より、わずかに（約１５秒）長く適用される。

配列決定反応を熱サイクルプレート（９６穴）でセットアップし、適切な熱サイクルプログラムを使用して増幅した。反応成分は、５ｐｍｏｌのＭ１３プライマー、２００ｎｇのｐＬＨ２（テンプレート）、８μｌのビッグダイプレミックス及び最終容量を２０μｌにするのに十分なミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）（登録商標）水であった。全ての混合物を、ミリポア社から市販されているモンタージュＳＥＱ_９６プレートへ移した。そのプレートをバキュームマニフォールド上に置き、２３〜２５インチＨｇの真空を、可視的液体がウェルに残存しなくなるまで３〜４分間適用した。真空を約１５秒間継続し、プレートをマニフォールドから除去した。積み重ねたペーパータオルにプレートを簡単に押し付けることにより、過剰の液体をプレートの底から除去した。プレートをマニフォールドに戻し、２５μｌの溶液（グアニジンなし）を添加した。再び、２３〜２５インチＨｇの真空を、可視的液体がウェルに残存しなくなるまで３〜４分間、そしてその後約１５秒間、適用した。プレートをマニフォールドから除去し、再び、積み重ねたペーパータオルにプレートを押し付けることにより、過剰の液体をプレートの底から除去した。２５μｌの注入溶液を添加し、１５〜２０回上下にピペッティングすることにより、ＤＮＡを再懸濁させた。精製された配列決定用産物を、２ＫＶ、１５秒でＡＢＩ３７００シーケンサーへ注入した。その結果は、図１Ａ及び１Ｂに示される。大きな色素斑点が明白である。

配列決定反応を熱サイクルプレート（９６穴）でセットアップし、適切な熱サイクルプログラムを使用して増幅した。反応成分は、５ｐｍｏｌのＭ１３プライマー、２００ｎｇのｐＬＨ２（テンプレート）、８μｌのビッグダイプレミックス及び最終容量を２０μｌにするのに十分なミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）（登録商標）水であった。３０μｌの洗浄溶液（グアニジンなし）を各配列決定反応物に添加した。熱サイクル実施の後、ｐＨ８の０．３ｍＭ ＥＤＴＡ中に０．５ｍＭグアニジンを含むシーケンシング洗浄溶液３０μｌを、各反応物に添加し、穏和に混合した。全ての混合物を、ミリポア社から市販されているモンタージュＳＥＱ_９６プレートへ移した。そのプレートをバキュームマニフォールド上に置き、２３〜２５インチＨｇの真空を、可視的液体がウェルに残存しなくなるまで３〜４分間適用した。真空を約１５秒間継続し、プレートをマニフォールドから除去した。積み重ねたペーパータオルにプレートを簡単に押し付けることにより、過剰の液体をプレートの底から除去した。プレートをマニフォールドに戻し、２５μｌのシーケンシング洗浄溶液を添加した。再び２３〜２５インチＨｇの真空を、可視的液体がウェルに残存しなくなるまで３〜４分間、そしてその後約１５秒間、適用した。プレートをマニフォールドから除去し、再び、積み重ねたペーパータオルにプレートを押し付けることにより、過剰の液体をプレートの底から除去した。２５μｌの注入溶液を添加し、１５〜２０回上下にピペッティングすることにより、ＤＮＡを再懸濁させた。精製された配列決定用産物を、２ｋＶ、１５秒でＡＢＩ３７００シークエンサーへ注入した。その結果は、図２Ａ及び２Ｂに示される。図１Ａ及び１Ｂと比較した色素斑点の減少が明白である。

４μｌのビッグダイプレミックスのみが使用され、最終容量が１０μｌである半分の反応スケールであったことを除き、実施例１と同じ手順を実施した。その結果は、図３Ａ及び３Ｂに示される。

４μｌのビッグダイプレミックスのみが使用され、最終容量が１０μｌである半分の反応スケールであったことを除き、実施例２と同じ手順を実施した。その結果は、図３Ａ及び３Ｂに示される。図３Ａ及び図３Ｂと比較して、色素斑点の欠如が明白である。

２μｌのビッグダイプレミックスのみが使用され、最終容量が５μｌである４分の１の反応スケールであったことを除き、実施例１と同じ手順を実施した。ＡＢＩ３１００アバント（Ａｖａｎｔ）シーケンサーへの注入は、１ｋＶ、２２秒で行った。その結果は、図５Ａ及び５Ｂに示される。

２μｌのビッグダイプレミックスのみが使用され、最終容量が５μｌである半分の反応スケールであったことを除き、実施例２と同じ手順を実施した。ＡＢＩ３１００アバント（Ａｖａｎｔ）シーケンサーへの注入は、１ｋＶ、２２秒で行った。その結果は、図６Ａ及び６Ｂに示される。図５Ａ及び５Ｂと比較して、色素斑点の欠如が明白である。

先行技術による完全スケールの反応の電気泳動図である。 図１Ａの反応色素斑点の生のトレースである。 本発明による完全スケールの反応の電気泳動図である。 図２Ａの減少した色素斑点の生のトレースである。 先行技術による半分のスケールの反応の電気泳動図である。 図３Ａの反応色素斑点の生のトレースである。 本発明による半分のスケールの反応の電気泳動図である。 図４Ａの色素斑点の欠如を示す生のトレースである。 先行技術による４分の１のスケールの反応の電気泳動図である。 図５Ａ中の反応色素斑点を示す生のトレースである。 本発明による４分の１のスケールの反応の電気泳動図である。 図６Ａの色素斑点の欠如を示す生のトレースである。

Claims (15)

1. 配列決定反応物から未取込みの色素ターミネーターを除去することにより、配列決定用反応産物を精製する方法であって、
   配列決定用反応産物を準備すること；
   少なくとも一つの表面を有する少なくとも一つの限外濾過膜を準備すること；
   該配列決定反応物から未取込みの色素ターミネーターを除去するために有効な量のグアニジンを含む溶液を準備すること；
   該配列決定用反応産物及び該溶液を、該限外濾過膜の該少なくとも一つの表面に導入すること；
   該限外濾過膜に駆動力を適用して、精製された配列決定用反応産物を作製すること、を含む方法。
2. 該精製された配列決定用反応産物を低イオン溶液に再懸濁させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 該再懸濁させられた産物を配列決定用の基質へ移すことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 配列決定反応物から未取込みの色素ターミネーターを除去することにより、配列決定用反応産物を精製する方法であって、
   配列決定用反応産物を準備すること；
   少なくとも一つの表面を有する限外濾過膜を各々有する複数個のウェルを準備すること；
   該配列決定反応物から未取込みの色素ターミネーターを除去するために有効な量のグアニジンを含む溶液を準備すること；
   該配列決定用反応産物及び該溶液を、該複数個のウェルに導入すること；
   該複数個のウェルの各々に駆動力を適用して、精製された配列決定用反応産物を作製すること、を含む方法。
5. 該精製された配列決定用反応産物を低イオン溶液に再懸濁させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 該再懸濁させられた産物を配列決定用の基質へ移すことをさらに含む、請求項５の方法。
7. 低イオン溶液中にグアニジン又はその塩を含む洗浄溶液。
8. 該低イオン溶液がＥＤＴＡを含む、請求項７に記載の洗浄溶液。
9. 該塩がカオトロピック塩である、請求項７に記載の洗浄溶液。
10. 該塩がグアニジン塩酸塩である、請求項７に記載の洗浄溶液。
11. 該塩がグアニジン炭酸塩である、請求項７に記載の洗浄溶液。
12. 色素ターミネーターをさらに含む、請求項７に記載の洗浄溶液。
13. 該グアニジンの量が、約１ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲内である、請求項７に記載の洗浄溶液。
14. 該グアニジンの量が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭである、請求項７に記載の洗浄溶液。
15. 該グアニジンの量が、約５ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項７に記載の洗浄溶液。

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