ES2303605T3 - Metodo de limpieza de reacciones de secuenciacion. - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar un producto de reacción de secuenciación eliminando los terminadores fluorescentes no incorporados de una reacción de secuenciación, que comprende: proporcionar el producto de reacción de la secuenciación; proporcionar al menos una membrana de ultrafiltración que tenga al menos una superficie; proporcionar una solución que comprenda guanidina 0,5 mM, eficaz para eliminar los terminadores fluorescentes no incorporados de dicha reacción de secuenciación; introducir dicho producto de la reacción de secuenciación y dicha solución a dicha al menos una superficie de dicha membrana de ultrafiltración; aplicar una fuerza motriz a dicha membrana de ultrafiltración para producir el producto de la reacción de secuenciación purificado.
Description
Método de limpieza de reacciones de
secuenciación.
Los kits de secuenciación de ADN disponibles
comercialmente, tales como los kits de secuenciación Ready Reaction
Cycle Terminator v 1.0, 1.1, 2.0, 3.0 y 3.1 de ABI PRISMA® BigDye®
disponibles en Applied Biosystems, Inc. utilizan moléculas
fluorescentemente marcadas o terminadores fluorescentes como
componentes. Por ejemplo, son premezclados terminadores
fluorescentes, desoxinucleósido trifosfatos, enzimas de
secuenciación, cloruro de magnesio y tampón y son adecuados para
realizar reacciones de secuenciación cíclicas basadas en la
fluorescencia sobre plantillas de ADN monocatenarias o bicatenarias
y sobre fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa.
Como los terminadores fluorescentes no son los
sustratos naturales de la ADN polimerasa, deben ser proporcionadas
generalmente altas concentraciones en relación con los sustratos de
dNTP naturales para asegurar su incorporación en los productos de
secuenciación polimerizantes. Las moléculas fluorescentemente
marcadas no incorporadas, sin embargo, son difíciles de eliminar si
están presentes a alta concentración. Si no son suficientemente
eliminadas, las moléculas fluorescentemente marcadas no incorporadas
pueden interferir con el análisis corriente abajo (por ejemplo, la
secuenciación del ADN), tal como co-emigrando con
productos de secuenciación cortos durante la electroforesis. En
realidad, estas moléculas tienen tendencia a formar complejos
insolubles a altas concentraciones. Son particularmente
problemáticas en las reacciones que utilizan altas concentraciones
de químicas de secuenciación (por ejemplo, reacciones con fuerza
1x, 1/2x y 1/4x).
Los métodos convencionales para eliminar
terminadores fluorescentes no incorporados a partir de las
reacciones de secuenciación antes de la electroforesis implican la
precipitación con alcohol y la filtración con gel. Sin embargo, las
sales compiten con los productos de secuenciación durante la
inyección electrocinética en los instrumentos de secuenciación con
capilares y también deben ser eliminadas. La precipitación con
etanol tiene pobres capacidades de eliminación de sales que quitan
mérito a su utilidad como método para preparar muestras antes de la
electroforesis capilar porque la eficacia de la inyección
electrocinética de los productos de secuenciación es inversamente
proporcional a la concentración de sales. La filtración con gel es
un método basado en la centrifugación que es difícil de
automatizar, lo que es importante para la secuenciación de ADN de
alto rendimiento.
Otro método para eliminar moléculas
fluorescentemente marcadas no incorporadas, tales como terminadores
fluorescentes, implica usar placas de ultrafiltración MultiScreen®
or Montage® 384-SEQ disponibles en el comercio en la
empresa Millipore. Estas placas son totalmente automatizables y
proporcionan una alternativa de coste-tiempo
eficiente para la precipitación con etanol convencional para la
eliminación del terminador de tinte. Funcionan mediante filtración
al vacío, eliminando así la necesidad de la centrifugación, etapas
de secado con etanol y diversas rutinas de desmontaje. Los
disolventes tales como la formamida o el EDTA ayudan en la
solubilización de los terminadores fluorescentes y previenen la
formación de agregados. Los productos de secuenciación son
purificados filtrando hasta la sequedad y luego lavando las sales
de deshecho y los terminadores fluorescentes. Los productos de
secuenciación purificados entonces son resuspendidos desde la
superficie de la membrana y están listos para su introducción en un
secuenciador de ADN.
Sin embargo, la introducción de nuevas químicas
de secuenciación por varios fabricantes sigue presentando desafios
en la purificación. Además, aunque la tecnología de ultrafiltración
actual proporcione productos de secuenciación de ADN
sustancialmente purificados con fuerzas de reacción de un microlitro
de reactivo de secuenciación por reacción de secuenciación de ADN
(1/8º x BDT v3.0), a concentraciones más altas se hacen evidentes
los conocidos artefactos como manchas fluorescentes en los
electroferogramas. Estos artefactos son también comúnmente visibles
usando otros métodos de limpieza tales como la filtración con gel y
la precipitación con alcohol a pesar de las modificaciones
específicas frente al protocolo recomendado por el fabricante para
eliminarlos.
El documento WO01/19482 describe un método para
purificar el producto de la reacción de secuenciación eliminando
los terminadores fluorescentes no incorporados de una reacción de
secuenciación (véanse las páginas 3-4). El método
comprende la etapa de ultrafiltrar el producto de la reacción de
secuenciación aplicando una fuerza motriz de vacío (véase la página
7, línea 18, página 11, línea 1) pero no se usa ninguna solución de
guanidina.
El documento WO02/44414 muestra la purificación
de productos de la reacción de secuenciación con soluciones de
guanidina concentradas (0,6-1 M) para promover la
adsorción selectiva de los productos de amplificación del ADN en
partículas de sílice.
Por lo tanto, es deseable proporcionar una
solución rentable y eficiente para reducir o eliminar moléculas
fluorescentemente marcadas no incorporadas y sales residuales a
partir de las reacciones de secuenciación.
Los problemas de la técnica anterior han sido
superados por la presente invención, que proporciona un método para
purificar el producto de una reacción de secuenciación como se
reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 4. En sus
aspectos de método, la presente invención comprende añadir una
solución de lavado al producto de la reacción de secuenciación
antes de la filtración, seguido de filtrar para reducir o eliminar
los terminadores fluorescentes no incorporados. Los productos de
secuenciación purificados pueden ser resuspendidos entonces y
transferidos a un sustrato apropiado para la secuenciación u otra
preparación. Las manchas fluorescentes formadas a partir de los
terminadores fluorescentes no incorporados no interfieren más con la
resolución de los electroferogramas generados en la electroforesis
de la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1A es un electroferograma de una
reacción a escala completa conforme a la técnica anterior;
La figura 1B es una traza cruda de las manchas
fluorescentes de la reacción de la figura 1A;
La figura 2A es un electroferograma de una
reacción a escala completa conforme a la presente invención;
La figura 2B es una traza cruda de las manchas
fluorescentes reducidas de la figura 2A;
La figura 3A es un electroferograma de una
reacción a media escala conforme a la técnica anterior;
La figura 3B es una traza cruda de las manchas
fluorescentes de la reacción de la figura 3A;
La figura 4A es un electroferograma de una
reacción a media escala conforme a la presente invención;
La figura 4B es una traza cruda que muestra la
ausencia de manchas fluorescentes de la figura 4A;
La figura 5A es un electroferograma de una
reacción a cuarta escala conforme a la técnica anterior;
La figura 5B es una traza cruda que muestra las
manchas fluorescentes de la reacción en la figura 5A;
La figura 6A es un electroferograma de una
reacción a cuarta escala conforme a la presente invención;
La figura 6B es una traza cruda que muestra la
ausencia de las manchas fluorescentes de la figura 6A.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han encontrado que
cantidades eficaces de guanidina en el producto de la reacción de
secuenciación rompen los agregados y/o previenen su formación, como
se prueba por los electroferogramas hasta en escalas de reacción
más altas. Las cantidades eficaces de guanidina son cantidades
suficientes para reducir la presencia de terminadores fluorescentes
no incorporados a un grado en el que no interfieran deletéreamente
con el análisis corriente abajo, particularmente la electroforesis
de productos de la reacción de secuenciación. La interferencia
deletérea con la electroforesis es manifestada en el aspecto de las
manchas fluorescentes en los electroferogramas, en los que la
presencia de las manchas fluorescentes hace difícil o imposible
resolver con exactitud los productos de la secuenciación. Tal
interferencia es particularmente sensible cuando el ADN es más
corto. Las concentraciones más altas de terminadores fluorescentes
también interfieren además corriente abajo durante la
secuenciación.
Las cantidades excesivas de guanidina pueden
causar una pérdida inaceptable del producto de secuenciación más
corto. Las cantidades insuficientes de guanidina pueden causar una
reducción inadecuada de artefactos deletéreos, o su reaparición.
Las cantidades adecuadas de guanidina son 0,5 mM. Es sorprendente
que sólo concentraciones relativamente bajas de guanidina sean
eficaces en reducir suficientemente o eliminar las manchas
fluorescentes de los electroferogramas.
Preferiblemente la guanidina se usa en su forma
de sal. La sales adecuadas incluyen caótropos de guanidina, tales
como el carbonato de guanidina o el hidrocloruro de guanidina. La
sal particular usada debe ser escogida para evitar interacciones
indeseables en la reacción. Preferiblemente la sal de guanidina se
usa en una solución poco iónica, tal como EDTA 0,3 mM a un pH de
aproximadamente 5-11, preferiblemente
8-10.
En sus aspectos de método, la presente invención
comprende las etapas de proporcionar una cantidad definida del
producto de la reacción de secuenciación, proporcionar al menos una
membrana de ultrafiltración que tenga al menos una superficie,
introducir el producto de la reacción de secuenciación en la
superficie de la membrana de ultrafiltración, añadir la solución de
lavado de guanidina antes o después de que el producto de la
reacción de secuenciación sea introducido en la superficie de la
membrana de ultrafiltración, aplicar una fuerza motriz, tal como un
diferencial de presión constante o vacío, a la superficie de la
membrana suficiente para producir el producto de la reacción de
secuenciación sustancialmente sin contaminantes. La adición de la
solución de lavado de guanidina y la aplicación de una fuerza
motriz pueden ser repetidas. El producto de la reacción de
secuenciación es conservado sobre la superficie de la membrana
mientras que los contaminantes, incluyendo los terminadores
fluorescentes, son filtrados para deshecharlos. Preferiblemente, el
producto de la reacción de secuenciación es filtrado hasta sequedad
(por ejemplo, no queda ningún fluido visible), y la fuerza motriz
es mantenida durante aproximadamente 15 segundos después de la
filtración hasta sequedad (en la que son llevadas a cabo múltiples
filtraciones simultáneamente en un dispositivo multipocillos,
preferiblemente la fuerza motriz es mantenida hasta que el último
pocillo está vacío). El producto de la reacción de secuenciación
puede ser lavado (tal como con la solución de lavado de la presente
invención), filtrado hasta sequedad de nuevo, resuspendido en una
solución poco iónica conocida por los expertos en la técnica, tal
como formamida o agua y transferida (por ejemplo, pipeteando) a un
sustrato apropiado para la secuenciación (por ejemplo, inyección
electrocinética), digestión de restricción u otra preparación.
La Tabla siguiente ilustra las cantidades
adecuadas de componentes para varias concentraciones de químicas de
secuenciación usando el kit de ABI BigDye® Terminator:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las membranas de ultrafiltración adecuadas
tienen poros moleculares entre aproximadamente 1000 y 30.000
Daltons, preferiblemente entre aproximadamente 3.000 y 15.000
Daltons. Pueden ser hechas a partir de una variedad de materiales,
incluyendo, pero no limitadas, a poliamidas, polisulfonas,
polietersulfonas, poliarilsulfonas, materiales celulósicos,
celulosa regenerada y poli(fluoruro de vinilideno). Pueden
ser simétricos o asimétricos, siendo éste el preferido. Para
aplicaciones de alto rendimiento, preferiblemente se llevan a cabo
simultáneamente una pluralidad de ultrafiltraciones, más
preferiblemente usando una placa de filtro de 384 pocillos. Otras
placas de tamaño, incluyendo el formato de 96 pocillos, también
pueden ser usadas. Las placas de filtro adecuadas incluyen las
placas de filtro MultiScreen® o MONTAGE® 384-SEQ
disponibles en el comercio en la empresa Millipore.
El vacío adecuado es el que reduce
suficientemente o elimina los terminadores fluorescentes, y
generalmente está en el intervalo de aproximadamente 15 pulgadas de
mercurio (50,79 kPa) a aproximadamente 28 pulgadas de mercurio
(94,81 kPa), preferiblemente de aproximadamente
23-25 pulgadas de mercurio
(77,89-84,66 kPa). Generalmente la fuerza motriz es
aplicada ligeramente más tiempo (aproximadamente 15 segundos) que el
necesario para eliminar todo el líquido visible de los pocillos,
que típicamente es de aproximadamente 3-4
minutos.
Ejemplo
1
Una reacción de secuenciación fue puesta en una
placa de un ciclador térmico (96 pocillos) y fue amplificada usando
un programa de ciclación térmica apropiado. Los componentes de la
reacción fueron 5 pmol del cebador M13, 200 ng de pLH2 (plantilla),
8 \mul de premezcla BigDye y suficiente agua
Milli-Q® para completar un volumen final de 20
\mul. Toda la mezcla fue transferida a una placa Montáge SEQ96
disponible en el comercio en la empresa Millipore. La placa fue
colocada en un colector de vacío y fue aplicado un vacío de
23-25 pulgadas Hg (77,89-84,66 kPa)
durante 3-4 minutos hasta que ningún fluido visible
permaneció en los pocillos. El vacío fue aplicado durante
aproximadamente 15 segundos, y la placa fue retirada del colector.
El fluido en exceso fue eliminado del fondo de la placa presionando
la placa brevemente en un montón de toallitas de papel. La placa
fue devuelta al colector y fueron añadidos 25 \mul de la solución
(sin ninguna guanidina). Fue aplicado de nuevo el vacío a
23-25 pulgadas Hg (77,89-84,66 kPa)
durante 3-4 minutos hasta que ningún fluido visible
permaneció en los pocillos, y durante aproximadamente 15 segundos a
partir de entonces. La placa fue retirada del colector y el fluido
en exceso fue eliminado de nuevo del fondo de la placa presionando
la placa contra un montón de toallitas de papel. Fueron añadidos 25
\mul de la solución de inyección, y el ADN fue resuspendido
pipeteando de arriba a abajo 15-20 veces. Los
productos de secuenciación purificados fueron inyectados en un
secuenciador ABI 3700 a 2 KV, 15 segundos. Se muestran los
resultados en las figuras 1A y 1B. Manchas fluorescentes grandes
son evidentes.
Ejemplo
2
Una reacción de secuenciación fue montada en una
placa de un ciclador térmico (96 pocillos) y fue amplificada usando
un programa de ciclación térmica apropiado. Los componentes de la
reacción fueron 5 pmol de cebador M13, 200 ng de pLH2 (plantilla),
8 \mul de premezcla BigDye, y agua Milli-Q®
suficiente para completar el volumen final a 20 \mul. Fueron
añadidos a cada reacción de secuenciación 30 \mul de solución de
lavado (sin ninguna guanidina). Después de la ciclación térmica, 30
\mul de la solución de lavado de la secuenciación, que comprende
guanidina 0,5 mM en EDTA 0,3 mM a pH 8, fueron añadidos a cada una
de las reacciones y fue mezclado con cuidado. Toda la mezcla fue
transferida a una placa Montáge SEQ_{96} disponible en el comercio
en la empresa Millipore. La placa fue colocada en un colector de
vacío y fue aplicado un vacío de 23-25 pulgadas Hg
(77,89-84,66 kPa) durante 3-4
minutos hasta que ningún fluido visible permaneció en los pocillos.
El vacío fue seguido durante aproximadamente 15 segundos, y la
placa fue retirada del colector. El fluido en exceso fue eliminado
del fondo de la placa presionando la placa brevemente en un montón
de toallitas de papel. La placa fue devuelta al colector y fueron
añadidos 25 \mul de la solución de lavado de la secuenciación. Fue
aplicado de nuevo el vacío a 23-25 pulgadas Hg
(77,89-84,66 kPa) durante 3-4
minutos hasta que ningún fluido visible permaneció en los pocillos,
y durante aproximadamente 15 segundos a partir de entonces. La placa
fue retirada del colector y el fluido en exceso fue eliminado de
nuevo del fondo de la placa presionando la placa contra un montón
de toallitas de papel. Fueron añadidos 25 \mul de la solución de
inyección, y el ADN fue resuspendido pipeteando de arriba a abajo
15-20 veces. Los productos de secuenciación
purificados fueron inyectados en un secuenciador ABI 3700 a 2 kV,
15 segundos. Se muestran los resultado en las figuras 2A y 2B. La
reducción de las manchas fluorescentes comparado con las figuras 1A
y 1B es evidente.
Ejemplo
3
El mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 fue
llevado a cabo a una escala de reacción media, en la que sólo
fueron usados 4 \mul de premezcla BigDye y el volumen final era 10
\mul. Se muestran los resultados en las figuras 3A y 3B.
Ejemplo
4
El mismo procedimiento que en el Ejemplo 2 fue
llevado a cabo a una escala de reacción media, en la que sólo
fueron usados 4 \mul de premezcla BigDye, y el volumen final era
10 \mul. Se muestran los resultados en las figuras 4A y 4B. La
ausencia de manchas fluorescentes es evidente en comparación con las
figuras 3A y 3B.
Ejemplo
5
El mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 fue
llevado a cabo a una escala de reacción de un cuarto, en el que
fueron usados sólo 2 \mul de premezcla BigDye, y el volumen final
era 5 \mul. La inyección en un secuenciador ABI 3100 Avant fue a
1 kV, 22 segundos. Se muestran los resultados en las figuras 5A y
5B.
Ejemplo
6
El mismo procedimiento que en el Ejemplo 2 fue
llevado a cabo a una escala de reacción media, en el que sólo
fueron usados 2 \mul de premezcla BigDye, y el volumen final era 5
\mul. La inyección en un secuenciador ABI 3100 Avant fue a 1 kV,
22 segundos. Se muestran los resultados en las figuras 6A y 6B. La
ausencia de manchas fluorescentes es evidente en comparación con
las figuras 5A y 5B.
Claims (6)
1. Un método para purificar un producto de
reacción de secuenciación eliminando los terminadores fluorescentes
no incorporados de una reacción de secuenciación, que comprende:
proporcionar el producto de reacción de la
secuenciación;
proporcionar al menos una membrana de
ultrafiltración que tenga al menos una superficie;
proporcionar una solución que comprenda
guanidina 0,5 mM, eficaz para eliminar los terminadores
fluorescentes no incorporados de dicha reacción de
secuenciación;
introducir dicho producto de la reacción de
secuenciación y dicha solución a dicha al menos una superficie de
dicha membrana de ultrafiltración;
aplicar una fuerza motriz a dicha membrana de
ultrafiltración para producir el producto de la reacción de
secuenciación purificado.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además resuspender dicho producto de la reacción de
secuenciación purificado en una solución poco iónica.
3. El método de la reivindicación 2, que
comprende además transferir dicho producto resuspendido a un
sustrato para la secuenciación.
4. Un método para purificar el producto de la
reacción de secuenciación eliminando los terminadores fluorescentes
no incorporados de una reacción de secuenciación, que comprende:
proporcionar el producto de la reacción de
secuenciación;
proporcionar una pluralidad de pocillos,
teniendo cada pocillo una membrana de ultrafiltración que tiene al
menos una superficie;
proporcionar una solución que comprenda
guanidina 0,5 mM, eficaz para eliminar los terminadores
fluorescentes no incorporados de dicha reacción de
secuenciación;
introducir dicho producto de la reacción de
secuenciación y dicha solución a dicha pluralidad de pocillos;
aplicar una fuerza motriz a dicha pluralidad de
pocillos para producir el producto de la reacción de secuenciación
purificado.
5. El método de la reivindicación 4, que
comprende además resuspender dicho producto de la reacción de
secuenciación purificado en una solución poco iónica.
6. El método de la reivindicación 5, que
comprende además transferir dicho producto resuspendido a un
sustrato para la secuenciación.
Applications Claiming Priority (2)
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2003
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