KR20230145620A - 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스 - Google Patents

사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스 Download PDF

Info

Publication number
KR20230145620A
KR20230145620A KR1020220043747A KR20220043747A KR20230145620A KR 20230145620 A KR20230145620 A KR 20230145620A KR 1020220043747 A KR1020220043747 A KR 1020220043747A KR 20220043747 A KR20220043747 A KR 20220043747A KR 20230145620 A KR20230145620 A KR 20230145620A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
paper
safranin
lamp
substrate
Prior art date
Application number
KR1020220043747A
Other languages
English (en)
Inventor
이내윤
딘부퐁
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가천대학교 산학협력단 filed Critical 가천대학교 산학협력단
Priority to KR1020220043747A priority Critical patent/KR20230145620A/ko
Publication of KR20230145620A publication Critical patent/KR20230145620A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0663—Stretching or orienting elongated molecules or particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/141—Preventing contamination, tampering
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/142—Preventing evaporation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/126—Paper
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스가 개시된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 종이 기반 마이크로 디바이스는 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재; 일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재; 및 반응 챔버에서 샘플 시료에 대해 LAMP가 수행된 후, 반응 챔버로 도입되는 사프라닌 오 올리고머(Safranin O Oligomer), 또는 사프라닌 오 및 양전하를 갖는 산화제를 포함한다.

Description

사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스{A PAPER-BASED MICRODEVICE FOR POINT-OF-CARE TESTING OF INFECTIOUS DISEASE USING SAFRANIN O DYE}
본 발명은 분자 진단용 종이 기반 마이크로 디바이스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 사프라닌 오(Safranin O) 염료를 이용하여 SARS-CoV-2(코로나 바이러스), E.faecium와 같은 감염병을 검출 가능한 종이 기반 마이크로 디바이스에 관한 것이다.
RT-PCR(역전사 중합효소연쇄반응)은 바이러스 내부 유전 물질인 RNA를 상보적 DNA로 역전사 한 후, 타겟 DNA를 증폭해 형광 프로브로 검출하는 것으로 최근 COVID-19 진단법으로 표준화 된 방식이 되어 일반인들에게도 널리 알려지게 되었다. 그러나 RT-PCR은 검출 시간이 상대적으로 길고 복잡할 뿐더러, 고가의 장비가 요구되는 단점이 있다.
RT-PCR의 몇몇 제한들을 극복하기 위해 다양한 등온 핵산 증폭 기술들이 개발되어 왔으며, 예컨대 루프-매개 등온 증폭법(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 재조합효소-중합효소 증폭법(RPA: recombinase polymerase amplification), 롤링 서클 증폭법(RCA: rolling circle amplification) 등이 있다. 이 중 LAMP는 탁월한 특이성을 가지며, 단백질, 탄수화물 및 혈액 성분과 같은 몇몇 증폭 억제제들(inhibitors)에 대하여 높은 내성(tolerance)을 갖는다. 또한 RCA와 같은 추가 과정이 요구되거나 RPA와는 달리 여러 효소가 필요하지 않고 상대적으로 간단한 분석법이라는 장점이 있다.
LAMP를 이용한 종래 마이크로 디바이스에서는 브로민화 에티듐(Ethidium bromide), SYBR 그린, 피코그린과 같은 염료를 이용하여 타겟 DNA를 검출한다. 이들 염료들은 이중가닥 DNA에 결합시 강한 형광 신호를 방출하므로 타겟 DNA 검출에 이용되어 왔다. 그러나 이를 위해서는 UV 광원과 같은 거대 장비들이 요구되고, 이에 따른 검출 비용의 증가, 그리고 사용자에게 해로울 수 있는 염료의 독성 등과 같은 문제점들이 지적되고 있다
한편, 종이는 미세유체 디바이스 개발에서 인기 있는 소재가 되었다. 종이 기반 마이크로 디바이스는 전통적인 마이크로 디바이스에 비해 몇몇 장점을 갖는다. 제조가 용이하고, 비용 효과가 우수하고 일회성 사용이 가능한 점이 그것이다. 이에 따라 최근 측면유동법(LFAs: lateral flow assays)이 감염병 검출에 많이 이용되고 있으나, 이 방법은 항원-항체의 상호 작용에 기반하여 상대적으로 민감도가 낮고 비싼 항체 사용이 요구되는 점에서 대중적으로 확산되기에는 아직 한계가 있다.
이처럼 현장진단(point-of-care testing) 기술은 그간 지속적으로 발전해 왔으나, 여전히 시스템 구성의 복잡성, 고비용성, 환경성 등의 측면에서 개선의 여지가 있다.
한국등록특허 제10-2267968호(2021.06.16. 등록)
본 발명은 SARS-CoV-2(코로나 바이러스), E.faecium와 같은 감염병을 특별한 추가 장비 없이도 간단한 색 변화 전략을 이용하여 높은 민감성 및 특이성으로 신속하게 검출 할 수 있는 종이 기반 마이크로 디바이스를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재; 일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재; 및반응 챔버에서 샘플 시료에 대해 LAMP가 수행된 후, 반응 챔버로 도입되는 사프라닌 오 올리고머(Safranin O Oligomer), 또는 사프라닌 오 및 양전하를 갖는 산화제를 포함하는 종이 기반 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재; 및 일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재를 포함하는 진단 본체; 사프라닌 오(Safranin O); 및 양전하를 갖는 산화제를 포함하는 감염병 진단용 현장진단 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 종이 기반 마이크로 디바이스는 SARS-CoV-2(코로나 바이러스), E.faecium와 같은 감염병을 간단한 방식으로 비색 검출할 수 있다.
또한, 단일 마이크로 디바이스에서 샘플 시료의 전처리, 증폭 및 검출을 모두 가능케 하였으며, 밸브나 펌프 등의 복잡한 추가 구성이나 장비를 요하지 않고 LAMP 기반의 분자 진단 방식을 사용하므로 복잡한 가열 장치(열원)도 요구되지 않아 사용편의성이 높다.
나아가 종이 기반의 마이크로 디바이스이므로 사용 후 폐기 내지 처리가 용이하여 1회용 현장진단 키트로서 활용 가능성이 높다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 종이 기반 마이크로 디바이스를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 2는 사프라닌 오 다이머(Safranin O dimer)가 형성되는 매커니즘을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 사프라닌 오를 이용한 LAMP 앰플리콘 검출 매커니즘을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스의 사용 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 5는 민감성 시험 결과를 나타낸다.
도 6은 특이성 시험 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따라 제작된 마이크로 디바이스로 온-칩 검출 시험 과정 및 그 결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 첨부된 도면에 한정되지 않는다. 또한 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미한다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 종이 기반 마이크로 디바이스(100, 이하 마이크로 디바이스)를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 1을 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 제1 기재(110), 제2 기재(120)를 포함한다. 제1 기재(110), 제2 기재(120)는 소정 두께를 갖는 플레이트(plate) 형상으로 형성될 수 있으며, 종이 소재를 이용하여 제작될 수 있다. 종이 소재의 예로는 친수성(hydrophilic) 특성을 갖는 일반 종이, 재생 셀룰로오스 종이 등이 있으며, 유기 용매 및 고온(예컨대 LAMP 증폭을 위해 요구되는 65℃를 초과하는 온도)에서 내성을 갖는 종이가 바람직하다. 마이크로 디바이스(100)는 종이 기반으로 형성됨으로써 1회 사용 후에 태우는 등의 방법으로 폐기가 가능하며, 이에 따라 환경 친화적인 현장진단 장치가 될 수 있다.
제1 기재(110)는 1 이상의 샘플 챔버(111)를 포함한다. 분석 대상에 해당하는 샘플 시료는 샘플 챔버(111) 내에서 전처리 될 수 있다. 여기에서 샘플 시료의 전처리란 샘플 시료로부터 타겟 DNA를 정제하는 처리를 의미한다. 샘플 시료는 혈액, 전혈과 같은 바이오 샘플, 우유, 주스와 같은 음료 액적 등의 유체(fluid)일 수 있다. 한편 본 명세서에 첨부된 도면에서는 제1 기재(110)에 샘플 챔버(111)가 6개 마련되어 있는 경우를 도시하고 있으나, 이는 일 예시에 불과하고 샘플 챔버(111)의 수는 이보다 많거나 적을 수 있다.
일 예시에 있어서. 샘플 챔버(111)는 소정 높이를 갖는 원통형으로 형성될 수 있다. 예컨대 샘플 챔버(111)의 단면 직경은 수 mm의 크기를 갖도록 형성될 수 있다.
샘플 챔버(111)의 형성을 위하여, 제1 기재(110)는 복수의 종이 소재를 적층하는 형태로 형성될 수 있다. 예를 들어 소정 크기의 직사각형으로 재단된 한 쌍의 일반 종이 사이에 동일 크기의 재생 셀룰로오스 종이를 개재하여 적층체를 형성한 후, 적층체에는 소정 직경을 갖는 홀을 복수개 형성하고 적층체의 하단에는 실링을 위한 실링 필름을 부착시킴으로써 제1 기재(110) 및 샘플 챔버(111)를 형성할 수 있다. 즉 샘플 챔버(111)의 높이는 제1 기재(110)를 이루는 적층체의 두께에 상응할 수 있다. 한편 실링 필름은 벤딩 가능한 소재로, 예컨대 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PP(폴리프로필렌) 등의 소재를 필름형으로 가공한 것일 수 있다. 나아가 제1 기재(110)의 표면은 샘플 유체의 가이드로 기능하는 소수성 배리어(hydrophobic barrier) 형성을 위해 소수성으로 개질될 수 있다.
샘플 챔버(111)에는 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크(111a)가 각각 삽입 배치될 수 있다. 제1 디스크(111a)는 원형으로 형성될 수 있으며, 샘플 챔버(111)에 삽입될 수 있도록 샘플 챔버(111)의 직경보다 작은 크기의 직경을 가질 수 있다.
일 예시에 있어서, 제1 디스크(111a)는 FTA 카드(Flinders Technology Associates Card, Whatman社의 상품)일 수 있다. FTA 카드는 종이 재질에 흡수된 혈액, 구강세포 시료, 식물 잎 조직 및 박테리아 등의 생물시료를 보존하는 도구로, FTA 카드에 스며든 DNA는 물리적으로 포획될 수 있어 DNA 정제에 많이 활용된다. 예컨대 FTA 카드에 샘플 시료를 도입하고 일정 온도에서 일정 시간 동안 배양한 후(예컨대 37℃에서 30분 동안 배양), FTA 정제 시약(purification reagent)과 TE 버퍼(10nM Tris-HCl, 0.1nM EDTA, pH 8.0)를 추가하여 세척함으로써 DNA를 정제할 수 있다.
도면에 도시되지는 않았으나 제1 기재(110)에는 샘플 챔버(111)를 밀봉하기 위한 커버 필름이 탈부착될 수 있다. 커버 필름은 샘플 챔버(111)의 오염을 방지하고, 샘플 챔버(111) 내 유체의 증발을 막기 위한 것이다. 커버 필름은 상기 실링 필름과 마찬가지로 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PP(폴리프로필렌) 등의 소재를 필름형으로 가공한 것일 수 있고, 탈부착을 위해 일표면이 점착성을 갖도록 처리될 수 있다.
제2 기재(120)는 1 이상의 반응 챔버(121)를 포함한다. 샘플 챔버(111)에서 정제된 타겟 DNA는 반응 챔버(121)로 이동될 수 있고, 반응 챔버(121)에서는 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification, 이하 LAMP) 방법에 의해 타겟 DNA가 증폭될 수 있다. LAMP는 일정한 온도에서 접합 및 신장이 이루어지는 핵산 증폭법의 한 종류로, 구체적인 개념 및 원리 등은 당업계에 알려져 있으므로 생략하도록 한다. 한편 본 명세서에 첨부된 도면에서는 제2 기재(120)에 반응 챔버(121)가 6개 마련되어 있는 경우를 도시하고 있으나, 이는 일 예시에 불과하고 반응 챔버(121)의 수는 이보다 많거나 적을 수 있다. 나아가 반응 챔버(121)는 샘플 챔버(111)와 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 구체적으로 제1 기재(110)와 제2 기재(120)를 서로 포개었을 때, 샘플 챔버(111)와 반응 챔버(121)는 동일한 위치를 가질 수 있다.
일 예시에 있어서, 반응 챔버(121)는 샘플 챔버(111)와 마찬가지로 소정 높이를 갖는 원통형으로 형성될 수 있다. 예컨대 반응 챔버(121)의 단면 직경은 수 mm의 크기를 갖도록 형성될 수 있다.
반응 챔버(121)의 형성을 위하여, 제2 기재(120)는 복수의 종이 소재를 적층하는 형태로 형성될 수 있다. 예를 들어 소정 크기의 직사각형으로 재단된 한 쌍의 일반 종이로 적층체를 형성한 후, 적층체에는 소정 직경을 갖는 홀을 복수개 형성하고 적층체의 하단에는 실링을 위한 실링 필름을 부착시킴으로써 제2 기재(120) 및 반응 챔버(121)를 형성할 수 있다. 즉 반응 챔버(121)의 높이는 제2 기재(120)를 이루는 적층체의 두께에 상응할 수 있다. 실링 필름은 전술한 것과 동일할 수 있으므로 중복 설명은 생략한다. 나아가 제2 기재(120)의 표면은 샘플 유체의 가이드로 기능하는 소수성 배리어 형성을 위해 소수성으로 개질될 수 있다.
반응 챔버(121)에는 DNA 증폭 및 비색 검출을 위한 제2 디스크(121a)가 각각 삽입 배치될 수 있다. 제2 디스크(121a)도 마찬가지로 원형으로 형성될 수 있으며, 반응 챔버(121)에 삽입될 수 있도록 반응 챔버(121)의 직경보다 작은 크기의 직경을 가질 수 있다.
제2 디스크(121a)는 LAMP 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자(DNA) 증폭을 위한 프라이머를 함유할 수 있다. LAMP 반응 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(10x), dNTPs, 100 mM MgSO4 등을 포함할 수 있으며, 통상의 방법을 통해 입수 가능하다. 프라이머는 샘플 시료에 포함되는 분석 대상, 즉 표적 미생물의 유전자에 특이적으로 혼성화 된다. 프라이머는 자유 3'말단 하이드록시기를 포함하는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 표적 미생물의 타겟 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 표적 미생물에 존부를 판단할 수 있도록 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 LAMP 반응에 의해 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭될 수 있다. 따라서 반응 후 LAMP 앰플리콘(amplicon)을 검출함으로써 표적 미생물의 존부를 확인할 수 있다. 이러한 프라이머는 증폭하고자 하는 타겟 유전자의 종류에 따라 설계될 수 있으며, 본 발명에서는 각 표적 미생물의 타겟 유전자에 따라 알려진 방법에 의해 설계된 프라이머를 사용할 수 있다.
제2 디스크(121a)는 각 반응 챔버(121)마다 배치되는 것으로, 이 때 각각의 제2 디스크(121a)에 함유되는 프라이머들은 서로 다른 타겟 유전자에 특이적으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이 경우 반응 챔버(121) 및 제2 디스크(121a)의 수가 늘어날수록 마이크로 디바이스(100)에서 한 번의 샘플 시료 도입을 통해 검출할 수 있는 표적 미생물의 수가 늘어날 수 있다. 즉, 마이크로 디바이스(100)에서 다중 검출이 가능하다.
도면에 도시되지는 않았으나 제2 기재(120)에는 반응 챔버(121)를 밀봉하기 위한 커버 필름이 탈부착될 수 있으며, 커버 필름은 전술한 것과 동일할 수 있으므로 중복 설명은 생략한다.
상술한 것과 같이 형성되는 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)는 폴딩(folding) 및 언폴딩(unfolding) 가능하도록 결합할 수 있다. 일 예시에 있어서, 도 1에 도시된바와 같이 제1 기재(110)의 일측부와 제2 기재(120)의 일측부는 힌지(hinge) 결합할 수 있다. 예컨대 제1 기재(110)와 제2 기재(120)를 나란히 배치한 다음, 제1 기재(110)와 제2 기재(120)가 상호 접하는 측부의 상하부에 각각 실링 필름을 도포함으로써 힌지 결합시킬 수 있다. 이에 따라 제1 기재(110)는 힌지 결합된 부분을 통해 제2 기재(120) 쪽으로 폴딩되어 제2 기재(120) 상부에 포개질 수 있고, 다시 제2 기재(120)와 반대 방향으로 언폴딩될 수 있다. 제1 기재(110)가 폴딩되어 제2 기재(120) 상부에 포개질 때, 제1 기재(110)의 샘플 챔버(111)와 제2 기재(120)의 반응 챔버(121)는 서로 접할 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스(100)는 사프라닌 오(Safranin O)를 이용하여 감염병을 검출하는 것을 일 특징으로 한다. 사프라닌 오(safranin; safranin T; Basic Red 2; 3,7-diamino-2,8-dimethyl-5-phenylphenazinium chloride)는 단백질 및 DNA와 같은 거대분자에 인터칼레이트(intercalate) 되는 양전하를 포함하는 평면 구조를 갖는다. 이에 따라 사프라닌 오는 전통적으로 조직학, 세포학에서 염색 염료로 사용되거나, 또는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 사이에서 박테리아 종을 구별하기 위한 그람 염색에 사용되어 왔다. 이와는 달리 본 발명에서는 사프라닌 오를 LAMP 앰플리콘을 검출하기 위한 검출 염료로 이용한다. 이하에서 그 매커니즘에 대해 구체적으로 설명한다.
도 2는 사프라닌 오 다이머(Safranin O dimer)가 형성되는 매커니즘을 개략적으로 도시한 도면이다.
일반적으로 사프라닌 오는 양전하를 갖는 산화제(예컨대 Na2S)에 의해 올리고머(oligomer)로 전환되고, 사프라닌 오 올리고머는 정전기적 인력을 통해 음으로 하전된 LAMP 앰플리콘의 인산기(phosphate group)와 결합하여 적색 응집체를 형성할 수 있다.
여기에서 양전하를 갖는 산화제는 Na2S(Sodium sulfide), NaIO4(Sodium periodate), (NH4)2S2O8(Ammonium persulfate), NaClO4(Sodium perchlorate), Na2O2(Sodium peroxide), NH4MnO4(Ammonium permanganate), H2O2(Hydrogen peroxide), NH4ClO4(Ammonium perchlorate), KClO3(Potassium chlorate), NaClO3(Sodium chlorate) 및 NaNO3(Sodium nitrate)으로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상일 수 있으며, 본 명세서에서는 산화제가 Na2S인 경우를 중심으로 설명하도록 한다.
일 예시에 있어서, 도 2에 나타낸 것처럼 사프라닌 오에 Na2S(산화제로 기능)를 첨가하면 Na2S의 물 용해 과정을 통해 용액 내에서 HS- 및 S2- 음이온들이 생성되고, 이 음이온들의 전자 이송(electron transfer)에 의해 사프라닌 니트리늄 디케이션(Safranin nitrenium dication)이 생성된다. 생성된 사프라닌 니트리늄 디케이션은 강한 친전자체(electrophile)이고 주변의 사프라닌 오 분자들과 반응하여 양성자를 방출함으로써 사프라닌 오 다이머(이량체, dimer)를 형성한다. 도면에 나타내지는 않았으나, 사프라닌 오 다이머는 다른 사프라닌 오 다이머와 다시 반응하여 사프라닌 오 올리고머(Oligomer)를 형성하게 된다.
양으로 하전된 사프라닌 오 올리고머는 음으로 하전된 LAMP 앰플리콘과 정전기적 인력을 통해 결합하고, 그 결과 육안으로 확인 가능한 진한 적색 응집체(dark red aggregates)를 형성하게 된다. 이와는 달리 LAMP 앰플리콘이 없을 때에는, 양으로 하전된 사프라닌 오 올리고머끼리의 반발력에 의해 응집체가 형성되지 않고 용액에 분산되는 경향이 있다. 이 경우에는 사프라닌 오 고유의 색인 핑크색을 띠게 된다.
도 3은 사프라닌 오 올리고머를 이용한 LAMP 앰플리콘 검출 매커니즘을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3을 참조하면, LAMP가 수행된 후에 반응 튜브로 사프라닌 오와 Na2S 용액을 투입하면, 위에서 설명한 것과 같이 사프라닌 오는 Na2S 용액과 반응하여 사프라닌 오 올리고머를 형성한다. 이 때, 반응 튜브에 LAMP 앰플리콘이 존재하면 사프라닌 오 올리고머는 LAMP 앰플리콘과 결합하여 진한 적색 응집체를 형성하며(도 3의 Positive 참조), 반대로 반응 튜브에 LAMP 앰플리콘이 부재하면 사프라닌 오 올리고머는 응집체를 형성하지 않고 용액에 분산된다(도 3의 Negative 참조). 따라서 응집체의 형성 여부나 반응 튜브의 색변화(진한 적색 응집체를 형성하므로 LAMP 앰플리콘이 부재한 경우보다 진한 적색을 띠게 됨)를 통해 LAMP 앰플리콘의 존재 여부를 육안으로 관찰 가능한바, 간단한 방식으로 LAMP 앰플리콘의 존재 여부를 검출할 수 있다. 한편, 본 발명의 발명자들이 시험한 결과 산화제가 Na2S 용액인 경우를 기준으로, Na2S와 사프라닌 오의 최적 몰 비(molar ratio)는 17일 때가 최적 비율로 확인되었다(예컨대 5M Na2S 및 0.3M 사프라닌 오). 또한 사프라닌 오를 포함하는 검출 시약(detection reagent) 10μL을 기준으로(예컨대 5M Na2S(0.5μL) 및 0.3M 사프라닌 오(0.5μL)) LAMP 앰플리콘의 양이 5μL일 때가 응집체 형성에 있어 최적 양으로 확인되었다. 나아가 상기 검출 시약과 LAMP 앰플리콘의 최적 반응 온도 및 시간은 각각 상온(RT) 및 10분으로 확인되었다.
한편, 위 예시와는 달리 LAMP가 수행된 후에 반응 튜브로 사프라닌 오와 산화제를 각각 투입하는 것이 아닌 사프라닌 오 올리고머를 단독 투입하는 것도 가능하다.
본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스(100)는 LAMP 반응을 수행하기 위한 열원을 제공하는 가열부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 가열부는 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 가열부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스(100)의 사용 방법을 설명한다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)의 사용 방법을 개략적으로 나타낸다. 도 4를 참조하면, 우선 마이크로 디바이스(100)의 제1 기재(110)와 제2 기재(120)를 언폴딩 한 후에, 분석 대상인 샘플 시료(10)를 제1 기재(110)의 샘플 챔버(111)에 도입한다. 샘플 챔버(111)에는 DNA 추출을 위한 제1 디스크(111a)로 FTA 카드가 삽입되어 있다. 다음으로 오염 및 증발을 피하기 위하여 커버 필름을 부착하여 샘플 챔버(110)를 밀봉한다. 소정 시간(예컨대 30분) 상온에서 건조한 후에 커버 필름을 떼어내고, FTA 정제 시약과 TE 버퍼를 각각 샘플 챔버(111)로 도입하여 제1 디스크(111a)를 세척한다(이상, DNA 추출 및 정제 단계).
다음으로 제2 기재(120)의 반응 챔버(121)에 소정의 물을 채운 후, 제1 기재(110)를 제2 기재(120) 쪽으로 폴딩시켜 제1 디스크(111a)에 포획된 DNA를 반응 챔버(121)로 용출시킨다. 다음으로 오염 및 증발을 피하기 위하여 커버 필름을 부착하여 반응 챔버(120)를 밀봉한다. 이후, 제2 기재(120)의 바닥면을 히터 상에 배치하고 LAMP를 수행한다(예컨대 65℃에서 30분 수행, 이상 DNA 증폭 단계).
반응이 종료된 후, 커버 필름을 제거하고 소정의 사프라닌 오 및 Na2S(도 4에서 130으로 표기)를 각각 첨가하고 그 결과를 관측한다. 그리고 대략 10분 이내에 진한 적색 응집체가 형성되면 양성 반응, 즉 타겟 DNA가 존재하는 것으로 볼 수 있다. 이와는 달리 응집체가 형성되지 않고 분산되면 음성 반응, 즉 타겟 DNA가 부재하는 것으로 볼 수 있다(이상, 검출 단계).
이상에서 설명한 것처럼, 본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스(100)는 사프라닌 오를 이용하여 타겟 유전자의 존재를 신속하게 검출할 수 있다. 또한 단일 마이크로 디바이스(100)에서 샘플 시료의 전처리, 증폭 및 검출을 모두 가능케 하였으며, 밸브나 펌프 등의 복잡한 추가 구성이나 장비를 요하지 않고 LAMP 기반의 분자 진단 방식을 사용하므로 복잡한 가열 장치(열원)도 요구되지 않아 사용편의성이 높다. 나아가 종이 기반의 마이크로 디바이스이므로 사용 후 폐기 내지 처리가 용이하여 1회용 현장진단 키트로서 활용 가능성이 높다.
예를 들어, 본 발명에 따른 감염병 진단용 현장진단 키트는 다음과 같이 구성될 수 있다.
가. 진단 본체: 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재; 및 일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재를 포함함.
나. 진단 시약: 예를 들어 사프라닌 오 올리고머가 밀봉된 소형 튜브, 또는 사프라닌 오와 산화제가 각각 밀봉된 한 쌍의 소형 튜브. 여기에서 산화제는 Na2S, NaIO4, (NH4)2S2O8, NaClO4, Na2O2, NH4MnO4, H2O2, NH4ClO4, KClO3, NaClO3 및 NaNO3으로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상임.
다. 시료 채취 도구: 예컨대 시료 채취용 면봉 및 시료 회수용 소형 튜브
라. 시약 도입 도구: 예컨대 진단 본체로 시약을 도입하기 위한 소형 스포이드
마. 커버 필름: 시료의 오염/증발 방지를 위해 진단 본체의 샘플 챔버 또는 반응 챔버 상부에 탈부착 되는 1 이상의 커버 필름으로, 이형지를 포함할 수 있음.
바. 히터: 등온 증폭을 위한 소형 히터로 예컨대 고무 히터.
이하에서는 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명은 하기 시험예들에 의해 제한되지 않는다. 또한 설명의 편의를 위해 아래 시험예에서는 마이크로 디바이스(100)의 각 구성에 대하여 도 1에 표시된 도면 부호를 병기하여 기재하였다.
시험예
(1) 마이크로 디바이스의 제조
제1 기재(110) 제조를 위해 0.5mm 두께를 갖는 종이 2장을 30mmⅹ20mm로 레이저 커팅하여 재단하고, 샘플 챔버(111) 형성을 위해 6개의 홀(직경 5mm)을 형성하였다. 다음으로 동일 크기의 실링 필름 상에 적층시켜 적층체를 형성하였다. 이후 양 단부를 클램핑 한 상태의 적층체를 PDMS 용액에 5분 동안 침지시킨 후에 80℃에서 2시간 동안 인큐베이팅 하여 표면을 소수성으로 개질하였다. PDMS 용액으로는 PDMS 프리폴리머(SYLGARD 184)와 경화제(Dow Corning社)의 10:1(v/v) 믹스쳐를 이용하였다.
이어 제2 기재(120) 제조를 위해 0.5mm 두께를 갖는 종이 2장 및 재생 셀룰로오스 종이(포어 사이즈 0.2㎛)를 30mmⅹ20mm로 레이저 커팅하여 재단하고, 반응 챔버(121) 형성을 위해 6개의 홀(직경 5mm)을 형성하였다. 다음으로 한 쌍의 종이 사이에 재생 셀룰로오스 종이를 개재하고, 실링 필름 상에 적층시켜 적층체를 형성하였다. 이후 제1 기재(110) 제조와 마찬가지로 양 단부를 클램핑 한 상태의 적층체를 PDMS 용액에 5분 동안 침지시킨 후에 80℃에서 2시간 동안 인큐베이팅 하여 표면을 소수성으로 개질하였다.
다음으로, 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 일측부를 실링 필름으로 결합시킴으로써 폴딩 동작이 가능하도록 하였고, 샘플 챔버(111)에는 제1 디스크(111a)로 FTA 카드(직경 3mm, Sigma-Aldrich社)를 각각 삽입하고 반응 챔버(121)에는 LAMP 반응 시약 및 프라이머를 함유하는 제2 디스크(121a)를 각각 삽입함으로써 마이크로 디바이스(100)를 제조하였다. LAMP 반응 시약(New England BioLabs社)은 Bst 2.0 WarmStart DNA 폴리머라제, dNTP mix, 등온 증폭 버퍼(10x), MgSO4 등을 포함하였고, 시험 물질인 SARS-CoV-2(코로나 바이러스) 및 E.faecium(장내구균) 유전자를 LAMP 증폭하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다.
(2) 민감성 시험
샘플 시료로는 병원균인 pDONR207 SARS-CoV-2 E 플라스미드(plasmid COVID-19, Addgene社)와 E.faecium(ATCC:BAA-2127, ATCC)를 이용하였다. 각 병원균은 접종 배지(5mL)에서 37℃에서 16시간 동안 배양되었다(200rpm 정속).
민감성 시험을 위하여 10배 희석된 샘플 시료의 농도를 달리하여 200μL PCR 튜브에서 오프-칩 시험을 수행하였다. LAMP는 65℃에서 30분 동안 수행하였고, 비교를 위해 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 실시하였다. 관련하여 도 5는 민감성 시험 결과를 나타낸다. 도 5a는 SARS-CoV-2의 민감성 시험 결과이고, 도 5b는 E.faecium의 민감성 시험 결과이다.
도 5a를 참조하면, 1 ng/μL ~ 0 ng/μL에 해당하는 레인 1~8에서 1 ng/μL ~ 10-4 ng/μL 범위의 DNA를 포함하는 레인이 성공적으로 증폭되었고, 이에 따라 LOD(limit of detection, 검출한계)는 대략 10-4 ng/μL로 확인되었다. 이는 겔 전기영동의 결과와도 일치하였다. 또한 DNA 농도를 추정하기 위하여 그레이스케일 분석(gray-scale analysis)을 수행하였다. 1 ng/μL ~ 0 ng/μL의 범위를 갖는 DNA 질량에 동일한 사프라닌 오 올리고머를 노출시킨 후에 디지털 카메라로 연속 광학 이미지를 캡처하였다. 그 결과, 사프라닌 오-DNA 응집체는 종이 상에서 명확히 구분됨을 확인할 수 있었다. 그레이스케일 분석 데이터는 도 4a 우측의 DNA 농도별 색 강도(color intensity) 그래프를 그리는 데 사용되었으며, 그래프에서 확인되듯이 DNA 농도에 따라 응집체의 색 강도 값이 상당히 차이 있음을 알 수 있다.
도 5b를 참조하면, 108 ~ 100 CFU/mL에 해당하는 레인 1~9에서 108 ~ 105 CFU/mL 범위의 DNA를 포함하는 레인이 성공적으로 증폭되었고, 이에 따라 LOD는 대략 3ⅹ102 CFU/Samples로 확인되었다(샘플 시료의 도입량 3μL 기준). 이는 겔 전기영동의 결과와도 일치하였다. 도 4a에서와 마찬가지로 DNA 농도별 색 강도와 육안으로 확인된 응집체도 관측되었다.
상술한 민감성 시험을 통해, 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)가 플라스미드 COVID-19 DNA 및 E.faecium DNA에 대하여 10-4 ng/μL 및 3ⅹ102 CFU/Samples 가량의 LOD를 가져 높은 민감성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
(3) 특이성 시험
도 6은 특이성 시험 결과를 나타낸다. 도 6a, 6b는 플라스미드 COVID-19 DNA에 대해 프라이머 세트를 달리하여 시험한 결과이고, 도 6c, 6d는 E.faecium DNA에 대해 프라이머 세트를 달리하여 시험한 결과이다.
우선 200μL PCR 튜브를 준비하고 1번 튜브에는 LAMP 반응시약과 E.faecium DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 로딩하고, 2번 튜브에는 LAMP 반응시약과 플라스미드 COVID-19 DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 로딩하였다. 다음으로 1,2번 튜브 모두에 플라스미드 COVID-19 DNA를 투입한 후, 65℃에서 30분 동안 LAMP를 수행하고 반응이 종료된 후에 상태 변화를 관측하였다. 비교를 위해 겔 전기영동도 실시하였다. 그 결과, 도 6a에서 확인되듯이 적합한 프라이머 세트를 갖는 2번 튜브에서만 성공적으로 증폭되었고, 도 6b에서 확인되듯이 2번 튜브에서만 진한 적색 응집체가 관측되었다.
마찬가지로 200μL PCR 튜브를 준비하고 3번 튜브에는 LAMP 반응시약과 플라스미드 COVID-19 DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 로딩하고, 4번 튜브에는 LAMP 반응시약과 E.faecium DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 로딩하였다. 다음으로, 3,4번 튜브 모두에 E.faecium DNA를 투입한 후, 65℃에서 30분 동안 LAMP를 수행하고 반응이 종료된 후에 상태 변화를 관측하였다. 그 결과, 도 6c에서 확인되듯이 적합한 프라이머 세트를 갖는 4번 튜브에서만 성공적으로 증폭되었고, 도 6d에서 확인되듯이 4번 튜브에서만 진한 적색 응집체가 관측되었다.
상술한 특이성 시험을 통해, 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)가 플라스미드 COVID-19 DNA 및 E.faecium DNA에 대하여 특이성이 있음을 확인할 수 있었다.
(4) 온-칩 검출 시험
제조된 마이크로 디바이스(100)를 통해 온-칩 검출 시험을 수행하였다. 관련하여 도 7은 본 발명의 일 구체예에 따라 제작된 마이크로 디바이스(100)로 온-칩 검출 시험 과정 및 그 결과를 나타낸다.
도 7a를 참조하면, DNA 추출 및 정제는 샘플 챔버(111)의 제1 디스크(111a)에 해당하는 FTA 카드를 활용하였으며, 샘플 시료 3μL를 도입하고 30분 동안 상온에서 건조한 후에 FTA 정제 시약 25μL과 TE 버퍼 μL를 각각 첨가하여 FTA 카드를 두 번에 걸쳐 세척하였다. 이후 DNA를 반응 챔버(121)로 옮겨 65℃에서 30분 동안 LAMP를 수행하였다. 시험에 사용된 DNA는 플라스미드 COVID-19 DNA(10-4 ng/μL)과 E.faecium DNA(105CFU/sample)였다. 반응이 종료된 후, 반응 챔버(121)로 5M Na2S(0.5μL) 및 0.3M 사프라닌 오(0.5μL)를 투입하였고 10분 이내에 변화를 육안으로 관찰하였다. 또한 비교를 위해 동 샘플 시료 2μL를 사용하여 겔 전기영동을 실시하였다.
도 7b는 마이크로 디바이스(100)에서 플라스미드 COVID-19 DNA의 단일 검출 시험 결과를 나타낸다. 단일 검출 시험에서는 6개의 반응 챔버(121) 중 4개의 반응 챔버(121)에 LAMP 반응 시약 및 플라스미드 COVID-19 DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 도입하였다(도 7b에서 1~4번 반응 챔버). 그 결과, 1~4번 반응 챔버(121)에서 LAMP 기반 증폭이 성공적으로 수행되었고, LAMP 앰플리콘이 사프라닌 오 올리고머와 결합하여 진한 적색 응집체를 형성하였음을 확인하였다. 또한 그레이스케일 분석을 통해 1~4번 반응 챔버(121)의 색 강도가 두드러지게 높음을 확인하였다.
도 7c는 마이크로 디바이스(100)에서 플라스미드 COVID-19 DNA 및 E.faecium DNA의 다중 검출 시험 결과를 나타낸다. 다중 검출 시험에서는 6개의 반응 챔버(121) 중 2개의 반응 챔버(121)에 LAMP 반응 시약 및 플라스미드 COVID-19 DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 도입하고(도 7c에서 1,2번 반응 챔버), 다른 2개의 반응 챔버(121)에 LAMP 반응 시약 및 E.faecium DNA 증폭을 위한 프라이머 세트를 도입하였다(도 7c에서 5,6번 반응 챔버). 그 결과, 1,2,5,6번 반응 챔버(121)에서 LAMP 앰플리콘이 사프라닌 오 올리고머와 결합하여 진한 적색 응집체를 형성하였음을 확인하였다. 또한 그레이스케일 분석을 통해 마찬가지로 1,2,5,6번 반응 챔버(121)의 색 강도가 두드러지게 높음을 확인하였다.
상술한 온-칩 시험 결과를 통해, 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)가 특별한 장비 없이도 간단한 색 변화 전략을 이용하여 높은 민감성 및 특이성으로 병원균 검출이 가능함을 확인할 수 있었다. 또한 온-칩 시험에서 DNA 추출 및 정제 - 증폭 - 검출에 이르기까지 소요된 총 시간은 60분 이하인바, 신속한 검출이 가능함도 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
10: 샘플 시료 100: 마이크로 디바이스
110: 제1 기재 111: 샘플 챔버
111a: 제1 디스크 120: 제2 기재
121: 반응 챔버 121a: 제2 디스크
130: 사프라닌 오 올리고머

Claims (8)

  1. 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재;
    일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재; 및
    반응 챔버에서 샘플 시료에 대해 LAMP가 수행된 후, 반응 챔버로 도입되는 사프라닌 오 올리고머(Safranin O Oligomer), 또는 사프라닌 오 및 양전하를 갖는 산화제를 포함하는 종이 기반 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 양전하를 갖는 산화제는 Na2S, NaIO4, (NH4)2S2O8, NaClO4, Na2O2, NH4MnO4, H2O2, NH4ClO4, KClO3, NaClO3 및 NaNO3으로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상인 종이 기반 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 디스크는 FTA 카드(Flinders Technology Associates Card)인 종이 기반 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 플라스미드 COVID-19 DNA 또는 E.faecium DNA를 증폭시키기 위한 것인 종이 기반 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 샘플 챔버 또는 반응 챔버 상부에 탈부착 되는 커버 필름을 더 포함하는 종이 기반 마이크로 디바이스.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    LAMP 수행을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함하는 종이 기반 마이크로 디바이스.
  7. 샘플 시료를 전처리하는 제1 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 샘플 챔버를 포함하는 종이 기반의 제1 기재; 및 일측부가 제1 기재의 일측부와 힌지 결합되는 것으로, 각 샘플 챔버의 위치와 상응하는 위치에 형성되고 LAMP(루프-매개 등온증폭, loop-mediated isothermal amplification) 반응 시약과 샘플 시료 내 타겟 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 제2 디스크가 삽입 배치되는 1 이상의 반응 챔버를 포함하는 종이 기반의 제2 기재를 포함하는 진단 본체;
    사프라닌 오(Safranin O); 및
    양전하를 갖는 산화제를 포함하는 감염병 진단용 현장진단 키트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 양전하를 갖는 산화제는 Na2S, NaIO4, (NH4)2S2O8, NaClO4, Na2O2, NH4MnO4, H2O2, NH4ClO4, KClO3, NaClO3 및 NaNO3으로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상인 감염병 진단용 현장진단 키트.
KR1020220043747A 2022-04-08 2022-04-08 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스 KR20230145620A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220043747A KR20230145620A (ko) 2022-04-08 2022-04-08 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220043747A KR20230145620A (ko) 2022-04-08 2022-04-08 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230145620A true KR20230145620A (ko) 2023-10-18

Family

ID=88508311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220043747A KR20230145620A (ko) 2022-04-08 2022-04-08 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230145620A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102267968B1 (ko) 2019-10-29 2021-06-21 가천대학교 산학협력단 종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102267968B1 (ko) 2019-10-29 2021-06-21 가천대학교 산학협력단 종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Safavieh et al. Emerging loop-mediated isothermal amplification-based microchip and microdevice technologies for nucleic acid detection
Seok et al. A paper-based device for performing loop-mediated isothermal amplification with real-time simultaneous detection of multiple DNA targets
Barreda-García et al. Helicase-dependent isothermal amplification: a novel tool in the development of molecular-based analytical systems for rapid pathogen detection
Choi et al. Advances and challenges of fully integrated paper-based point-of-care nucleic acid testing
Trieu et al. based all-in-one origami microdevice for nucleic acid amplification testing for rapid colorimetric identification of live cells for point-of-care testing
Choi et al. based sample-to-answer molecular diagnostic platform for point-of-care diagnostics
US10620200B2 (en) Methods and compositions for hybrid microfluidic devices integrated with nano-biosensors
Chen et al. A self-contained microfluidic in-gel loop-mediated isothermal amplification for multiplexed pathogen detection
Trinh et al. A foldable isothermal amplification microdevice for fuchsin-based colorimetric detection of multiple foodborne pathogens
Mao et al. based microfluidics for rapid diagnostics and drug delivery
AU753191B2 (en) Devices and methods for detecting target molecules in biological samples
US20160016166A1 (en) Molecular diagnostic devices with magnetic components
US20180036727A1 (en) Apparatuses and methods for pathogen detection using microfluidic biochips
US20160008809A1 (en) Methods and compositions for paper-based and hybrid microfluidic devices integrated with nucleic acid amplification for disease diagnosis
Li et al. Recent advancements in nucleic acid detection with microfluidic chip for molecular diagnostics
Dinh et al. Fabrication of a fully integrated paper microdevice for point-of-care testing of infectious disease using Safranin O dye coupled with loop-mediated isothermal amplification
Tavakoli et al. A microfluidic fully paper-based analytical device integrated with loop-mediated isothermal amplification and nano-biosensors for rapid, sensitive, and specific quantitative detection of infectious diseases
KR102267968B1 (ko) 종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법
KR20200013932A (ko) 종이기반 핵산검출용 키트 및 pcr 증폭산물을 분석하기 위한 방법
Mahardika et al. Point‐of‐Care Testing (POCT) Devices for DNA Detection: A Comprehensive Review
KR20230145620A (ko) 사프라닌 오 염료를 이용한 감염병의 현장진단을 위한 종이 기반 마이크로 디바이스
AU2017393112B2 (en) Analytical device and method for assessing analyte within a sample
Hosseini et al. Bio-microelectromechanical systems (BioMEMS) in bio-sensing applications-colorimetric detection strategies
Choudhury Molecular tools for the detection of waterborne pathogens
KR102221289B1 (ko) 폴더블 타입의 등온 증폭 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법