JP2002058490A - 新規チトクロームｐ４５０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ストレプトミセス属に属する放線菌における
UCN-01の生産に関与する新規P450および該P450をコード
するDNAを提供し、該DNAを用いてUCN-01の生産性を改善
する。 【解決手段】 ストレプトミセス属に属する放線菌から
新規チトクロームP450および該チコクロームP450をコー
ドするDNAを得ることができ、これらを用いてストレプ
トミセス属に属する放線菌のUCN-01生産性を向上させる
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、UCN-01を生産する
ストレプトミセス属に属する微生物が有する新規なアミ
ノ酸配列を有するチトクロームP450および該チトクロー
ムP450をコードするDNAならびに該DNAを用いたUCN-01の
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトミセス属をはじめとする放線
菌は抗生物質を始めとするさまざまな二次代謝物を生産
することが知られている。これらの二次代謝系の多くの
水酸化反応にモノオキシゲナーゼであるチトクロームP4
50（以下単にP450と称する。）が関与していることが確
認されている〔Matsuoka T. et al., E. J. Biochem. 1
84, 707 (1989)、Motamedi H. et al., J. Bacteriol.
178, 5243 (1996)、Merson-Davis, L. A. & Cundliffe,
E., Mol. Microbiol. 13, 349 (1994)、Xue, Y.et a
l., Chem. Biol. 5, 661 (1998)、Betlach, M. C. et a
l., Biochemistry37, 14937 (1998)、Lomovskaya N. et
al., J. Bacteriol. 181, 305 (1999)、Weber J. M. e
t al., Science 252, 114 (1991)、Inouye M. et al.,
Mol. Gen.Genet. 245, 456 (1994)〕。

【０００３】抗癌作用を有する物質であるUCN-01は、ス
トレプトミセス属に属する放線菌によって生産される二
次代謝物の一つであり、スタウロスポリンの７位が水酸
化を受けた構造を持っている〔Takahashi, I. et al.,
J.Antibiot. 40, 1782 (1987)、特公平5-74595〕が、ス
タウロスポリンと比較してごく少量しか生産されない。
従来UCN-01生産性のストレプトミセス属に属する放線菌
がP450遺伝子を保有することも、UCN-01の生成における
P450の関与についても報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、スト
レプトミセス属に属する放線菌が生産する新規P450、お
よびP450をコードするDNAを提供し、該DNAを用いて、ス
トレプトミセス属に属する放線菌におけるUCN-01の生産
性を改善することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ストレプ
トミセス属に属する放線菌の既知のP450遺伝子群で保存
されている領域の塩基配列に基づいたプライマーを用い
て、UCN-01を生産するストレプトミセス属に属する放線
菌＃33（FERM BP-7239）株の染色体DNAに対してPCRを行
い、P450遺伝子の断片と考えられるDNAを増幅し単離す
ることにより、＃３３株が少なくとも３種類の新規なP4
50遺伝子を保有することを見出した。さらにこの遺伝子
をもとにしたプローブを用いて、＃33株の染色体DNAラ
イブラリーから、３種類それぞれのP450遺伝子のクロー
ンを単離し、その遺伝子中のP450をコードする領域の塩
基配列およびその遺伝子がコードするP450のアミノ酸配
列を明らかにし、本発明を完成させた。

【０００６】本発明は以下（１）〜（１２）の発明を提
供する。 (1) 配列番号２、４および６記載のアミノ酸配列からな
る群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むチトクロー
ムP450。 (2) 配列番号２、４および６記載のアミノ酸配列からな
る群から選ばれる一つのアミノ酸配列において、１つ以
上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列
を含み、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するチトクロ
ームP450。 (3) 配列番号２、４および６記載のアミノ酸配列からな
る群から選ばれる一つのアミノ酸配列と80％以上の相同
性を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するチトク
ロームP450。このようなP450としては、(6)に記載のDNA
がコードするP450をあげることができる。

【０００７】(4) (1)〜(3)のいずれかに記載のP450をコ
ードするDNA。 (5) 配列番号１、３および５記載の塩基配列からなる群
から選ばれる一つの塩基配列からなる（４）に記載のDN
A。 (6) (5)に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するP4
50をコードするDNA。 (7) (4)〜(6)のいずれか１項に記載のチトクロームP450
をコードするDNAとベクターとからなる組換え体DNA。 (8) (7)記載の組換え体DNAを宿主細胞に導入して得られ
る形質転換体。

【０００８】(9) 宿主細胞がストレプトミセス属に属
する微生物である（８）記載の形質転換体。 (10) （７）記載の組換え体DNAを、UCN-01を生産する
ストレプトミセス属に属する微生物に導入することによ
り、該微生物のUCN-01の生産性を向上させる方法。 (11) （８）または（９）記載の形質転換体を培地に培
養し、培養物中にUCN-01を生成、蓄積させ、該培養物か
らUCN-01を採取することを特徴とするUCN-01の製造法。 (12) スタウロスポリンを含む媒体中、（８）記載の形
質転換体の培養液または培養液の処理物をスタウロスポ
リンと接触させてスタウロスポリンをUCN-01に変換し、
媒体中からUCN-01を採取することを特徴とするUCN-01の
製造法。

【０００９】

【発明の実施の形態】1.UCN-01生産性ストレプトミセス
属放線菌のP450をコードするDNAの単離とその塩基配列
の解析：本発明のDNAは、UCN-01生産性ストレプトミセ
ス属の新規P450をコードするDNAであり、以下のように
他の生物由来の既知P450遺伝子との相同性を利用して取
得することができる。

【００１０】(1)PCRプライマーの設計：種々の生物のP4
50のアミノ酸配列を比較すると、たとえば同じStreptom
yces griseus由来のP450であるSU1とSU2でもＮ末端のア
ミノ酸はほとんど保存されていない〔Omer C. A. et a
l., J. Bacteriol. 172, 3335 (1990)〕ことから分かる
ように、必ずしも分子全体に相同性があるわけではな
く、特に酵素活性と直接関係する分子酸素結合部位およ
びヘム結合部位のアミノ酸配列がよく保存されているこ
とがわかっている〔Poulos, T. L., J. Mol. Biol. 19
5, 687 (1987)〕。したがって、未知のP450遺伝子を得
るためには、P450遺伝子の全体の塩基配列よりも、分子
酸素結合部位およびヘム結合部位に相当する塩基配列の
情報を用いることが好ましいと考えられる。

【００１１】UCN-01生産菌と同じストレプトミセス属に
属し塩基配列の相同性が高いと考えられる微生物からは
いくつかのP450遺伝子がクローン化され、塩基配列が明
らかにされている（GenBankアクセス番号：AB018074、A
F055922、AF072709、AF079139、AF087022、AF127374、A
F145049、AJ002638、AL049754、D30759、E06907、L3720
0、M31939、M32238、M32239、U08223、U65940、U7789
1、X63601、X86780、Y18574等）。

【００１２】これらP450遺伝子の塩基配列のうち分子酸
素結合部位〔コンセンサスアミノ酸配列：Leu-Leu-(Ile
/Val)-Ala-Gly-His-Glu-Thr-Thr〕およびヘム結合部位
に相当する部分〔コンセンサスアミノ酸配列：Phe-Gly-
Phe-(His/Phe/Tyr)-Gly-(Val/Ile)-His-(Gln/His/Tyr)-
Cys-Leu-Gly〕について、塩基配列（以下コンセンサス
な塩基配列という）をストレプトミセス属菌から抽出す
る。コドンの縮重（アミノ酸配列が同じでも対応するコ
ドンは複数あること）から、同じアミノ酸でも遺伝子に
よりコドンの塩基配列が異なっているので、ここで抽出
されたコンセンサスな塩基配列は複数の塩基配列の混合
物となる。塩基配列上、より5'に近い方に存在する分子
酸素結合部位に相当するコンセンサスな塩基配列から、
複数の塩基配列からなる縮重フォワードプライマーを14
〜27塩基の長さで設計し合成する。同じように3'に近い
方に存在するヘム結合部位に相当するコンセンサスな塩
基配列と相補的な塩基配列から、縮重リバースプライマ
ーを14〜33塩基の長さで設計し合成する。プライマーの
合成はパーキンエルマー社製のDNA合成機を用いて行う
ことができる。

【００１３】このようにして設計し合成した縮重フォワ
ードプライマーの例として配列番号10あるいは11に示し
た64種類の塩基配列からなる23残基のプライマーを、縮
重リバースプライマーの例として塩基配列12あるいは13
に示した128種類の塩基配列からなる22残基のプライマ
ーをあげることができる。 (2)PCRによるP450遺伝子断片の増幅：上記の縮重フォワ
ードプライマーと縮重リバースプライマーを組み合わせ
て、UCN-01を生産するストレプトミセス属に属する放線
菌の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行うことにより、P450
遺伝子の部分断片を増幅することができる。

【００１４】鋳型となる染色体DNAを調製してくるUCN-0
1を生産するストレプトミセス属に属する放線菌は、い
くつか報告されている〔Takahashi, I. et al., J. Ant
ibiot. 40, 1782 (1987)、Takahashi, I. et al., J. A
ntibiot. 42, 564 (1989)、特公平5-74595 （FERM BP-9
90）〕が、好適な例としてストレプトミセス属＃33株
〔平成12年7月25日付けで工業技術院生命工学工業技術
研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にFE
RM BP-7239として寄託されている。〕をあげることがで
きる。

【００１５】染色体DNAはMarmurらの方法〔Marmur et a
l., J. Mol. Biol., 3, 208, (1961)〕やHopwood, D.
A.らの著書〔Genetic Manupulation of Streptomyces.
A Laboratory Manual. Norwich, The John Innes Found
ation (1985)〕に記載の塩化セシウム法、あるいは染色
体DNA調製用キット、例えばFastDNA Spin Kit（Bio 101
社製）、QIAGEN Genomic-tip System〔キアゲン（QIAGE
N）社製〕、Easy-DNA〔インビトロジェン（Invitroge
n）社製〕を用いることにより菌体から容易に調製する
ことができる。

【００１６】(3)P450遺伝子DNA断片の単離と塩基配列の
解析：PCR反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にか
けることにより約350bpの増幅断片を単離精製し、得ら
れた増幅断片をそのままpT7Blue T-Vector〔ノバジェン
（Novagen）社製〕やTA Cloning Kit中のpCR2.1〔イン
ビトロジェン（Invitrogen）社製〕等のPCR増幅断片ク
ローニング用のベクターにクローニングするか、PCR-Sc
ript Cloning Kit〔ストラタジーン（Stratagene）社
製〕やSureClone Ligation Kit〔アマシャム・ファルマ
シア・バイオテック（Amrsham Pharmacia Biotech）社
製〕等のキットを用いて増幅断片の末端を平滑化し、DN
Aクローニング用ベクターのSmaIやSrfI等の平滑末端を
生ずるサイトに挿入し、宿主大腸菌を形質転換する。

【００１７】DNAクローニングベクターとしては大腸菌
E. coli で自律増幅する多コピーのプラスミドで、DNA
のクローニングに適当な１ヶ所でしか切断されない制限
酵素サイト（クローニングサイト）および形質転換のマ
ーカーとなるアンピシリン等の薬剤耐性マーカーを持
ち、X-galによるDNA挿入クローン選択ができるものが用
いられる。X-galによるDNA挿入クローン選択ができるDN
Aクローニングベクターとは、プロモーター下流にクロ
ーニングサイトを有するlacZ遺伝子を持ち、lacZ ^-の宿
主大腸菌に導入し、X-gal含有培地で培養した場合、ク
ローニングサイトにDNAが挿入されたクローンはコロニ
ーが青くならず白くなるものである。DNAクローニング
ベクターの例としてpBluescript II KS(+)（ストラタジ
ーン社製）、pUC118（宝酒造社製）、pCR- Script Amp
（ストラタジーン社製）等をあげることができる。

【００１８】宿主大腸菌としてはlacZ^-であるXL1BlueMR
F'（ストラタジーン社製）、DH5α〔ライフ・テクノロ
ジーズ（Life Technologies）社製〕、JM105（宝酒造社
製）等を用いることができる。X-gal含有培地上に出て
きた形質転換体の白いコロニーを無作為に単離培養し、
それぞれからプラスミドDNAを精製し、挿入されたDNA断
片の塩基配列を決定する。P450遺伝子はいろいろな代謝
反応に関与していると考えられ、一つの生物種から２つ
以上の異なるP450遺伝子が単離されている例が多数ある
ので、いくつかの数のコロニーを解析すれば、異なる複
数のP450遺伝子の断片を単離できることもある。

【００１９】得られた塩基配列をGenBank、EMBL、Genes
eq〔ダーウエント社（Derwent Publications Ltd.）〕
等の塩基配列データベース中の塩基配列とBLAST〔J. Mo
l. Biol. 215, 403-410 (1990)〕、FASTA（Methods in
Enzymology,183, 63-69）等の相同性解析プログラムを
用いて比較し、得られた塩基配列が新規な塩基配列かど
うかを確認する。またこれらのデータベース中にある既
存のストレプトミセス属に属する放線菌のP450遺伝子の
塩基配列と得られた塩基配列をGenetyx（日立社）、GCG
Package〔ジェネティクス・コンピューター・グループ
（Genetics Computer Group）社〕等の配列解析用ソフ
トウエアを用いて比較し、既存のP450遺伝子の酸素分子
結合部位やヘム結合部位の塩基配列との相同性、全体の
塩基配列についての相同性や長さを調べる。

【００２０】これらの解析により、得られたDNAが既知
のP450の遺伝子と比べて長さがほぼ同じでプライマーに
用いた部分以外の塩基配列についても全体に渡って相同
性を示せば、該DNAがP450遺伝子の断片であることが確
認できる。このようにして得られたUCN-01生産性ストレ
プトミセス属放線菌＃３３株のP450遺伝子DNA断片とし
て、配列番号７、８、９にあげた塩基配列からなる３種
類のDNAをあげることができる。

【００２１】(4)P450全長をコードするP450遺伝子DNAの
取得：このようにして得られたP450遺伝子DNA断片をプ
ローブにして、UCN-01を生産するストレプトミセス属に
属する放線菌の染色体DNAライブラリーをスクリーニン
グすることにより、P450の全長をコードするP450遺伝子
DNAを得ることができる。 (a)UCN-01生産性ストレプトミセス属放線菌染色体DNAラ
イブラリーの作製：染色体DNAライブラリーは、モレキ
ュラークローニング第２版やDNA Cloning 1: Core Tech
niques, Second Edition〔Glover, D. M. & Hames, B.
D., IRL Press (1995)〕等の実験書に記載の方法に従っ
て作製することができる。すなわち、P450遺伝子断片を
得たときにPCRの鋳型に用いたUCN-01を生産するストレ
プトミセス属に属する放線菌の染色体DNAについて、10
〜50kbpの長いDNA断片を得るため切断の進行状況をアガ
ロースゲル電気泳動により確認しながらSau3AI等の適当
な制限酵素で部分切断し、自己連結を防ぐためのアルカ
リフォスファターゼにより脱リン酸反応を行った後、ベ
クターに挿入して染色体DNAライブラリーを作製する。

【００２２】ベクターとしては染色体DNAの長い断片も
挿入することができる置き換え型λファージベクター
（挿入できる断片長：λDASH IIで９〜23kb、λEMBL3で
7〜20kb）やコスミドベクター（挿入できる断片長30〜4
2kb）が望ましい。置き換え型λファージベクターとし
てはλEMBL3〔ストラタジーン社製、Frischauf, A.-M.
et al., J. Mol. Biol., 170, 827 (1983)〕、λ DASH
II（ストラタジーン社製）、コスミドベクターとしては
SuperCOS1（ストラタジーン社製）、pWE15〔ストラタジ
ーン社製、Wahl, G. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA, 84, 2160 (1987)〕などが用いられる。

【００２３】染色体DNAのSau3AIの部分切断断片を挿入
する場合、同じ切断末端をもつベクター中のBamHIサイ
トに挿入する。染色体DNA断片をベクターに挿入した
後、各ベクターに適した大腸菌宿主細胞、例えばλEMBL
3にはE. coli NM538〔Frischauf, A.-M. et al., J. Mo
l. Biol., 170, 827 (1983)〕、λDASH IIにはE. coli
NM539（モレキュラークローニング第2版）あるいはE. c
oli XL1-Blue MRA（ストラタジーン社製）、SuperCOS1
にはE. coli XL1-Blue MR（ストラタジーン社製）、pWE
15にはE. coli DH5あるいはE. coli XL1-Blue MRを用い
てインビトロパッケージングを行うことにより、染色体
DNAライブラリーを作製する。

【００２４】インビトロパッケージングはモレキュラー
クローニング第2版に記載の方法やインビトロパッケー
ジングキット GigaPack XLやGigapack III（ストラタジ
ーン社製）を用いて行うことができる。 (b)染色体DNAライブラリーのスクリーニング：染色体DN
Aライブラリーに対して、(3)で得られたP450遺伝子DNA
断片を³²P等の放射性同位体やジゴキシゲニン、ビオチ
ン等で標識し、これをプローブにしてプラークハイブリ
ダイゼーション（λファージベクターの場合）やコロニ
ーハイブリダイゼーション（コスミドベクターの場合）
によりスクリーニングを行う。

【００２５】プローブの標識およびハイブリダイゼーシ
ョンは、モレキュラークローニング第2版に記載の方法
で行うことができる。また、ジゴキシゲニン標識プロー
ブを用いた場合、プローブの標識、ハイブリダイゼーシ
ョン、ハイブリダイズスポットの検出はDIG標識キット
およびその説明書に従って行うことができる。ハイブリ
ダイズしたシグナルに対応するプラークあるいはコロニ
ーから、それぞれλファージDNAあるいはコスミドDNAを
UCN-01を生産するストレプトミセス属に属する放線菌の
新規P450遺伝子のDNAクローンとして単離する。以上の
方法で単離されるUCN-01を生産するストレプトミセス属
に属する放線菌が有する３種類の新規P450遺伝子のDNA
クローンを含む形質転換体であるEscherichia coli XL1
-Blue MR/pCOS#8、Escherichia coli XL1-Blue MR/pCOS
-B-11、Escherichia coliXL1-Blue MR/pCOS-C-3は、平
成12年７月25日付けで工業技術院生命工学工業技術研究
所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にそれぞ
れFERM BP-7240、FERM BP-7241、FERM BP-7242として寄
託されている。

【００２６】(c)P450遺伝子DNAクローンの塩基配列の解
析：(b)で得られたDNAクローンのベクターに挿入された
DNAの塩基配列を決定し、(3)で得られたP450遺伝子DNA
断片の塩基配列と一致する領域を検索し、その前後の塩
基配列からP450全体をコードするオープンリーディング
フレームを決定し、それをP450全長をコードするDNAと
することができる。

【００２７】また、通常長さが10kb以上もある挿入DNA
の塩基配列全体を決めなくても、適当な制限酵素で切断
した後電気泳動を行い、各断片に対して(b)のハイブリ
ダイゼーションに用いたP450遺伝子断片のプローブを用
いたサザンブロットハイブリダイゼーション（モレキュ
ラークローニング第2版）を行ったり、各切断断片を鋳
型にして遺伝子断片の塩基配列の一部を増幅できるPCR
を行い、P450遺伝子を含む領域を短く限定してからその
領域についてだけ塩基配列を決定し、P450全長をコード
するDNAの塩基配列を決めることもできる。

【００２８】また、(3)で得られたP450遺伝子断片の両
端の塩基配列に基づいたシークエンス用プライマーを用
いることにより、その前後の塩基配列を順次決定してい
くこともできる。以上のようにして得られるUCN-01を生
産するストレプトミセス属に属する放線菌が有する３種
類の新規P450の全長をコードするDNAとして配列番号
１、３、５に示す塩基配列からなるDNAをあげることが
できる。

【００２９】１つ以上のアミノ酸の欠失、置換または付
加されたアミノ酸配列からなるチトクロームP450は、Nu
cleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1
985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Pro
c. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の部
位特異的変異導入法を用いて配列番号２、４または６に
記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNAに部
位特異的変異を導入することにより行うことができる。
欠失、置換、または付加されるアミノ酸の数は特に限定
されないが、公知のポリペプチドとならない範囲に限定
され、１個から数十個、特に１個から数個のアミノ酸で
あることが好ましい。また、本発明のチトクロームP450
が、モノオキシゲナーゼ活性を有するためには、配列番
号配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列からな
る群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも80％以上、
特に95％以上の相同性を有していることが好ましい。

【００３０】「ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするDNA」とは、上記(5)記載のDNAをプローブとし
て、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイ
ブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDN
Aを意味し、具体的には、細菌のコロニーあるいはファ
ージのプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用
いて、0.7〜1 MのNaCl存在下、65℃で標識したDNAとの
ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜２倍濃度のS
SC（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のSSC溶液
の組成は、150 mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナト
リウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗
浄することにより同定できるDNAをあげることができ
る。

【００３１】ハイブリダイゼーションは、Sambrook, J.
et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Se
cond Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)（以降、モレキュラー・クローニング第２版と略
す。）等の実験書に記載されている方法に準じて行うこ
とができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的に
は、配列番号１、３および５記載の塩基配列からなる群
から選ばれる塩基配列を有するDNAと少なくとも80％以
上の相同性を有するDNA、好ましくは95％以上の相同性
を有するDNAをあげることができる。

【００３２】このようにして決定されたP450遺伝子の塩
基配列の5'端の塩基配列に相当するフォワードプライマ
ーと3'端の塩基配列と相補的なリバースプライマーを用
い、(2)で用いたUCN-01を生産するストレプトミセス属
に属する放線菌の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行うこと
により、P450全長をコードするDNAの部分だけを増幅し
単離することもできる。

【００３３】以上のようにして得られたUCN-01を生産す
るストレプトミセス属に属する放線菌のP450遺伝子DNA
の塩基配列からそのコードする新規P450のアミノ酸配列
を決定することができる。得られたアミノ酸配列をGenP
ept、SwissProt、PIRなどのアミノ酸配列データベース
中にある既存のP450のアミノ酸配列とBLAST、FASTAの相
同性解析プログラムを用いて比較することにより、既存
P450との相同性を調べることができる。

【００３４】２．UCN-01を生産するストレプトミセス属
に属する放線菌由来のP450遺伝子DNAとベクターとから
なる組換え体DNAおよび該組換え体DNAを含む形質転換体
の調製：上記１で調製したUCN-01生産性ストレプトミセ
ス属放線菌由来新規P450のDNAを挿入するためのベクタ
ーとしては、宿主生物あるいは宿主細胞内で自律複製で
きるレプリコンを備えたプラスミドDNAあるいは、相同
組換えや部位特異的組換えによって宿主生物あるいは宿
主細胞の染色体に組み込むための機能を備えたクローニ
ングベクターであればいずれも用いることができる。UC
N-01の生産に用いるためには、UCN-0を1生産するストレ
プトミセス属に属する放線菌等の放線菌で自律複製ある
いは染色体DNAへの組み込みができ、かつP450をコード
するDNAを組み込んだ場合その上流に放線菌で働くプロ
モーター領域があるベクターが好ましい。このようなベ
クターとしてtipA、ermE、strR、MelC1等の放線菌遺伝
子由来のプロモーターをクローニングサイトの上流に有
するプラスミドであるpKC1064〔Kuhstoss, S. et al.,
Gene 103, 97 (1993)〕、pWHM643〔Decker, H. et al.,
J. Bacteriol. 175, 3876 (1993)〕、pTMAII〔Vujakli
ja, D. et al., Mol. Gen. Genet. 229, 119 (199
1)〕、pIJ702〔Katz, E. et al., J. Gen. Microbiol.
129, 2703 (1983)〕等をあげることができる。

【００３５】宿主となるUCN-01を生産するストレプトミ
セス属に属する放線菌としては、ストレプトミセス属に
属する菌株（FERM BP-990）〔特公平5-74595〕、ストレ
プトミセス属に属する＃33株（FERM BP-7239）等をあげ
ることができる。形質転換方法としては、HopWoodらの
実験書〔Genetic Manipulation of Streptomyces: A La
boratory Manual, The John Innes Foundation, Norwic
h (1985)〕に記載の方法を用いることができる。

【００３６】３．P450遺伝子の利用法：UCN-01を生産す
るストレプトミセス属に属する放線菌において、スタウ
ロスポリンにP450遺伝子が作用して７位が水酸化される
ことによりUCN-01が生産されていると仮定すると、スタ
ウロスポリンの生産量に比べUCN-01の生産量が非常に低
いのは、UCN-01への水酸化の過程が律速になっている可
能性がある。従って、UCN-01を生産するストレプトミセ
ス属に属する放線菌にP450遺伝子を発現できるようなプ
ラスミドベクターを導入し、P450遺伝子のコピー数を増
加させることにより、当該放線菌内のP450の酵素活性を
増加させ、スタウロスポリンからUCN-01への変換効率を
上昇させてUCN-01の生産量を増加させることができる。
この場合、P450だけでなくP450と複合体を作り電子を供
給するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系も放線
菌内に導入することによりさらに効率的にUCN-01を生産
することができる。

【００３７】また、スタウロスポリンに対してこの本発
明のP450を発現できる形質転換体の培養液または培養液
の処理物を作用させて、スタウロスポリンをUCN-01に変
換することによりUCN-01を生産させることができる。こ
の場合も、必要であればP450と複合体を作り電子を供給
するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系を反応系
に組み込むことにより、より効率的にUCN-01を生産する
ことができる。

【００３８】形質転換体の培養液の処理物としては、培
養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して
得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、
該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該
菌体の機械的摩砕処理物。該菌体の溶媒処理物、該菌体
の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化
物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などを
あげることができる。

【００３９】また、本発明の新規P450が他の放線菌が生
産する二次代謝産物を水酸化することができるようであ
れば、その放線菌に該P450遺伝子を発現できるようなプ
ラスミドベクターを導入することにより、その放線菌が
生産していた二次代謝産物の水酸化物として天然にはな
い新規抗生物質等を得ることも可能である。２．で形質
転換した放線菌の培養は、通常の培養方法に従って行う
ことができる。培養に用いられる培地は、用いる放線菌
が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該
放線菌の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、
合成培地のいずれでもよい。

【００４０】炭素源としては、用いる放線菌が資化し得
るものであればよく、グルコース、フルクトース、シュ
ークロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解
物、糖蜜などの糖類や酢酸、乳酸、グルコン酸などの有
機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコ
ール類、あるいは大豆油、オリーブ油等の油脂を用いる
ことができる。

【００４１】窒素源としては、用いる放線菌が資化し得
るものであればよく、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他
含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種菌体およびそ
の消化物等を用いることができる。

【００４２】無機塩としては、用いる放線菌が利用し得
るものであればよく、リン酸カリウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を用いることができ
る。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、銅、コバル
ト、モリブデン等の塩類を加えてもよい。また、必要に
応じてチアミンやビオチンのようなビタミン、グルタミ
ン酸やアスパラギン酸やリジンのようなアミノ酸、アデ
ニンやグアニンのような核酸関連物質を添加してもよ
い。

【００４３】さらに培地には、必要に応じてスタウロス
ポリン等の目的二次代謝産物の前駆体を添加することも
できる。培養は、振とう培養または深部通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行う。培養温度は15〜37℃の範囲
内、好ましくは26〜30℃で行い、pHを５.0〜９.0に保持
する。培養時間は通常１〜10日間である。pHの調整は、
無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル
シウム、アンモニアなどを用いて行う。以下に実施例を
記載するが、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。

【００４４】

【実施例】実施例１ PCRによるUCN-01を生産するスト
レプトミセス属に属する放線菌からのP450遺伝子断片の
取得： (1) UCN-01を生産するストレプトミセス属に属する放線
菌からの染色体DNAの調製：UCN-01を生産するストレプ
トミセス属に属する放線菌＃３３株をSR III培地（5 g/
l酵母エキス、5 g/lバクトトリプトン、10 g/lグルコー
ス、10 g/l可溶性澱粉、3 g/l肉エキス、0.5 g/lリン酸
マグネシウム、pH 7.2）に植菌し28℃で培養した。菌が
十分生育した後、遠心分離により菌体を回収した。得ら
れた菌体0.4ｇを使用し、FastDNA SPIN Kit（BIO101社
製）にて、該キットに添付された説明書に従って染色体
DNAを回収した。

【００４５】(2) PCRプライマーの合成：すでに塩基配
列が明らかになっている放線菌P450遺伝子群を比較し、
よく保存されている塩基配列をもとにPCR用プライマー
の塩基配列を設計した。保存されている領域として選択
したのは、酸素分子結合部位およびヘム結合部位であ
る。

【００４６】酸素分子結合部位から縮合フォワードプラ
イマーとしてそれぞれ64種類の塩基配列からなるプライ
マー１（配列番号10に塩基配列を示した。）およびプラ
イマー２（配列番号11に塩基配列を示した。）を、ヘム
結合部位から縮合リバースプライマーとしてそれぞれ12
8種類の塩基配列からなるプライマー３（配列番号12に
塩基配列を示した。）およびプライマー４（配列番号13
に塩基配列を示した。）を設計し合成した。プライマー
の合成はパーキンエルマー社製のDNA合成機を用いて行
った。

【００４７】(3) PCRおよび増幅断片のクローニング：P
CRは、0.5 ng/μlの上記（１）で得られた鋳型となるス
トレプトミセス属に属する放線菌＃33株の染色体DNA、
各0.625 pmol/μlの縮合フォワードプライマー（プライ
マー１または２）および縮合リバースプライマー（プラ
イマー３または４）、0.2 mmol/l dNTP、0.025 U/μlの
AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ（パーキン・エルマー
社製）を含む、パーキン・エルマー社推奨のPCR用緩衝
液100μl中で行った。反応条件は、95℃で９分間保持し
た後、95℃で１分間、55℃で45秒間、72℃で１分30秒間
のサイクルを35回繰り返し、その後72℃で10分間熱処理
した後４℃で保持した。

【００４８】PCR後の反応溶液を2 %のアガロース（NuSi
eve 3:1 agarose; FMC社製）ゲル中で電気泳動にかけ、
PCRで増幅した約350 bpのDNA断片をQIAquick Gel Extra
ctionキット（キアゲン社製）にて回収した。回収したD
NAはSureCloneキット（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社製）を用いてベクタープラスミドpBluescrip
t II KS(+)（ストラタジーン社製）のSma Iサイトに結
合した後、大腸菌Escherichia coli XL2Blue MRF'（ス
トラタジーン社製）に導入し、形質転換体をX-galを含
有する培地上でコロニーとして得た。以上の操作は各キ
ットに添付の説明書に従い行った。

【００４９】(4) クローン化したDNA断片の塩基配列の
解析：(3)で作製した大腸菌形質転換体コロニーのうち
白色を呈した16個のコロニーからプラスミドDNAを精製
し、DNAシークエンサーにより、それぞれの挿入されたD
NA断片の塩基配列を決定した。その結果、プライマー以
外の塩基配列を分類すると３種類の異なる塩基配列が得
られた（プライマーの塩基配列がもとの遺伝子と完全に
一致しなくても、プライマーの3'側がハイブリダイズで
きればPCR時に増幅されるので、縮重プライマーの場
合、同じ遺伝子から増幅した断片でもプライマーの部分
はハイブリダイズしたプライマーにより異なる塩基配列
をとる）。

【００５０】これらの塩基配列を既存のストレプトミセ
ス属に属する放線菌のP450と比較したところ、長さが35
0bp前後で同じであること、プライマーに用いた部分以
外の塩基配列も含め全体に渡って相同性を有していたこ
とから、これらの３種類のDNA断片は＃33株のP450遺伝
子から増幅されたDNA断片と判断し、それぞれが由来す
る３種類のP450遺伝子をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ型P450遺伝
子と名づけた。

【００５１】得られたＡ型P450遺伝子由来のDNA断片の
塩基配列の一つを配列番号７に、Ｂ型P450遺伝子由来の
DNA断片の塩基配列の一つを配列番号８に、Ｃ型P450遺
伝子由来のDNA断片塩基配列の一つを配列番号９に示し
た。 実施例２ Ａ、Ｂ、Ｃ型P450全長をコードする遺伝子の
取得： (1) 全長遺伝子クローニング用ジゴキシゲニン化プロー
ブの作成：実施例１で得られたDNA断片は、P450遺伝子
に由来するDNA断片と推定されるので、このDNA断片から
ジゴキシゲニン（digoxigenin; DIG）標識プローブを調
製し、P450全長をコードする遺伝子をクローニングし
た。

【００５２】まず、配列番号14〜18に示した塩基配列を
有する増幅用のプライマー５〜９を合成した。これらの
プライマーの塩基配列は、配列番号７〜９に示した塩基
配列を有するＡ、Ｂ、Ｃ型P450遺伝子由来のDNA断片が
増幅された際に用いられた縮重プライマー中の一つの塩
基配列であり、プライマー５、６はフォワードプライマ
ー、プライマー７〜９はリバースプライマーである。Ａ
型P450プローブはＡ型P450 DNA断片を鋳型としてプライ
マー５と７を用いて、Ｂ型P450プローブはＢ型P450 DNA
断片を鋳型としてプライマー５と８を用いて、Ｃ型P450
プローブはＣ型P450 DNA断片を鋳型としてプライマー６
と９を用いてそれぞれ、PCR DIGプローブ合成キット
（ホフマン・ラ・ロシュ社製）を用いてキット付属の説
明書に従ってPCRを行い、DIG標識プローブを作製した。

【００５３】PCRの鋳型に用いた各型のP450 DNA断片
は、実施例１で精製した各型のP450 DNA断片を含む形質
転換体のプラスミドDNAのうち、配列番号７〜９に示し
た塩基配列の挿入DNA断片を有するものについて、それ
ぞれ制限酵素EcoRI、HindIII、XhoI（すべて宝酒造社
製）で切断し、約350 bpのP450 DNA断片を単離後、エタ
ノール沈殿にて回収したものを用いた。

【００５４】(2) ＃３３株の染色体DNAコスミドライブ
ラリーの調製：＃３３株を5 %マンニトールを含むHT培
地（1 g/l酵母エキス、2 g/lＮＺアミン、10 g/l可溶性
澱粉、1 g/l肉エキス、pH7.2）で28℃で培養し、菌が十
分生育した後、遠心分離により菌体を回収した。得られ
た菌体から、Marmurらの方法〔Marmur et al., J. Mol.
Biol., 3, 208, (1961)〕に基づき、染色体DNAを調製
した。

【００５５】この染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分分
解し、プラスミドsuperCOS1（ストラタジーン社製）を
使用して添付の説明書に従い、＃33株の染色体DNAのコ
スミドライブラリー作成を行った。パッケージングには
ストラタジーン社製のキットGIGAPACK Packaging Extra
cts XLを用いた。宿主として大腸菌E. coli XL1-Blue M
R株（ストラタジーン社製）を用い、最終的に約10 cfu/
μlのパッケージング溶液を得た。

【００５６】(3) コロニーハイブリダイゼーションによ
るP450遺伝子DNAのクローニングと塩基配列の決定：(2)
で得たコスミドライブラリーのパッケージング溶液を用
いて、パッケージングキットに添付の説明書に従い、宿
主大腸菌E. coli XL1-Blue MR株に＃３３株染色体ＤＮ
Ａのコスミドライブラリーを導入し、形質転換体のコロ
ニーを寒天培地（プレート）上に出現させた。

【００５７】一枚あたり約200コロニーの形質転換体が
でているプレート12枚から、各プレート上のコロニーを
ナイロンメンブレン（ホフマン・ラ・ロシュ社製）上に
写し取った。次にその写し取ったマスターメンブレンの
レプリカメンブレンを作成した。マスターおよびレプリ
カメンブレンをアンピシリン50 mg/lを含むLB寒天培地
[バクトトリプトン10g/l、酵母エキス５g/ｌ、NaCl10g/
l、寒天1.5%、pH7.2]上に乗せて37℃で４時間培養し、
コロニーの直径が約1 mm以上になるようにした。

【００５８】その後、実験書〔Maniatis et al., Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory Press (1982)〕のコロニーハイブリダ
イゼーションの方法に従い、メンブレン上にてコロニー
を溶解し、含まれているコスミドDNAをメンブレンに固
定する操作を行った。コスミドを固定したメンブレンに
対し、(2)で作成したＡ、Ｂ、Ｃ型に対応する各DIG標識
プローブを使用してコロニーハイブリダイゼーションを
行った。

【００５９】ハイブリダイズしたDIG標識プローブの検
出はベーリンガーマンハイム社製のDIG検出キットを使
用し、添付の指示書に従い行った。最終的にＡ、Ｂ、Ｃ
型プローブとハイブリダイズするコロニーをそれぞれ
１、10、24個得た。それぞれから代表コスミドとしてＡ
型P450遺伝子コスミドクローンpCOS#8、Ｂ型P450遺伝子
コスミドクローンpCOS-B-11、Ｃ型P450遺伝子コスミド
クローンpCOS-C-3を無作為に選択し、コスミドを鋳型と
する塩基配列決定法〔University of Oklahoma's Advan
ced Center for Genome Technologyのインターネットサ
イト上のBig Dye Protocols and Notes - Cosmid, BAC,
PAC, Fosmid Template (URL; http://www.genome.ou.e
du/big#dyes#cos#bac#pac#fos.html)〕に従い、P450遺
伝子部分の塩基配列を決定した。

【００６０】決定したＡ、Ｂ、Ｃ型P450遺伝子の塩基配
列を、それぞれ塩基番号１、３、５に記載した。なお、
Ｂ型とＣ型についてはさらに無作為に各３個のコスミド
クローンを選択し、それぞれのP450遺伝子の塩基配列を
確認したが、同一であった。また、これらの塩基配列か
ら、それぞれの遺伝子がコードするP450のアミノ酸配列
を明らかにした。Ａ型P450が396アミノ酸（配列番号２
にアミノ酸配列を示す。）、Ｂ型P450が482アミノ酸
（配列番号４にアミノ酸配列を示す。）、Ｃ型P450が45
9アミノ酸（配列番号６にアミノ酸配列を示す。）から
なるP450をコードしていた。

【００６１】これらの塩基配列およびアミノ酸配列につ
いて塩基配列データベースおよびアミノ酸配列データベ
ースに対しプログラムBlastを用いて相同性を調べた
が、データベース中には一致する配列はなく、新規な塩
基配列およびアミノ酸配列であることが分かった。また
PCRプライマーに用いた分子酸素結合部位およびヘム結
合部位以外の部分についても他の放線菌のP450と相同性
があり、この遺伝子がP450遺伝子であることが推察され
た。例えば、Ａ型およびＢ型P450はStreptomyces venez
uelaeのpicK遺伝子がコードするP450（PicK P450)〔Bet
lach, M. C. et al., Biochemistry37, 14937 (1998)〕
と、Ｃ型P450はStreptomyces griseolusのP450 SU2〔Om
er,C.A et al., J.Bacteriol. 172, 3335 (1990)〕とそ
れぞれ最も相同性があり系統的に近いことが示された。
それぞれのアミノ酸配列の相同性は、Ａ型P450とpicK P
450で60％、Ｂ型P450とpicK P450で45％、Ｃ型P450とP4
50 SU2で47％であった。

【００６２】

【発明の効果】本発明により、UCN-01を生産するストレ
プトミセス属に属する放線菌が保有するP450および該P4
50をコードするDNAが提供され、このDNAを用いてUCN-01
の生産性を向上させることができる。

【００６３】「配列表フリーテキスト」 配列番号10−人工配列の説明：P450遺伝子を増幅するた
めの縮重フォワードプライマー１ 配列番号11−人工配列の説明：P450遺伝子を増幅するた
めの縮重フォワードプライマー２ 配列番号12−人工配列の説明：P450遺伝子を増幅するた
めの縮重リバースプライマー３ 配列番号13−人工配列の説明：P450遺伝子を増幅するた
めの縮重リバースプライマー４ 配列番号14−人工配列の説明：Ａ型およびＢ型P450遺伝
子を増幅するためのフォワードプライマー５ 配列番号15−人工配列の説明：Ｃ型P450遺伝子を増幅す
るためのフォワードプライマー６ 配列番号16−人工配列の説明：Ａ型P450遺伝子を増幅す
るためのリバースプライマー７ 配列番号17−人工配列の説明：Ｂ型P450遺伝子を増幅す
るためのリバースプライマー８ 配列番号18−人工配列の説明：Ｃ型P450遺伝子を増幅す
るためのリバースプライマー９

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Novel P450 <130> H11-1491J5 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００６５】 <210> 1 <211> 1191 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1188) <400> 1 atg ggg cat gag cat gtg atc gat ctc ggt gag tac ggt ccg ggg ttc 48 Met Gly His Glu His Val Ile Asp Leu Gly Glu Tyr Gly Pro Gly Phe 1 5 10 15 acc gag aac ccg cat ccc gtc tac gcc gaa ctg cgg gcg cgc ggt ccc 96 Thr Glu Asn Pro His Pro Val Tyr Ala Glu Leu Arg Ala Arg Gly Pro 20 25 30 gtc cac cgg gtc cgg ctg ccc aag cac gac gcg cac cac gag gcc tgg 144 Val His Arg Val Arg Leu Pro Lys His Asp Ala His His Glu Ala Trp 35 40 45 ctc gtc gtc ggg tac gag gag gcg cgg gcg gca ctc gcc gac ccc cgg 192 Leu Val Val Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Ala Ala Leu Ala Asp Pro Arg 50 55 60 ctg tcg aag gac ggc tcg acg atc ggg gtg acc ttc ctc gac gag gag 240 Leu Ser Lys Asp Gly Ser Thr Ile Gly Val Thr Phe Leu Asp Glu Glu 65 70 75 80 ctg atc ggc aag tac ttg ctg atc gcc gac ccg ccc cag cac acc cgg 288 Leu Ile Gly Lys Tyr Leu Leu Ile Ala Asp Pro Pro Gln His Thr Arg 85 90 95 ctg cgc ggg ctg atc gcc cgg gag ttc acc gga cgc cgg gtc gag cgg 336 Leu Arg Gly Leu Ile Ala Arg Glu Phe Thr Gly Arg Arg Val Glu Arg 100 105 110 ctg cgg ccg agg gtc cag gag atc acc gac tcg ctg ctg gac gag atg 384 Leu Arg Pro Arg Val Gln Glu Ile Thr Asp Ser Leu Leu Asp Glu Met 115 120 125 ctg ccg cgc ggc cgc gcc gac ctg gtc gag tcc ttc gcg tac ccg ctg 432 Leu Pro Arg Gly Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser Phe Ala Tyr Pro Leu 130 135 140 ccc ctc acc gtc atc tgc gaa ctc ctc ggg gtg ccc gag atc gac cgg 480 Pro Leu Thr Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Glu Ile Asp Arg 145 150 155 160 gcg gcc ttc cgc aag ctg tcg acg gag gcg gtg gca ccc acc agc ggg 528 Ala Ala Phe Arg Lys Leu Ser Thr Glu Ala Val Ala Pro Thr Ser Gly 165 170 175 gag agc gag tac gcg gcc ttc gtc caa ctc gcc gcc tac ctg gag gag 576 Glu Ser Glu Tyr Ala Ala Phe Val Gln Leu Ala Ala Tyr Leu Glu Glu 180 185 190 ttg gtc gag gag aag cgg tgc gca ccg ccg gcc gac gat ctg ctg agc 624 Leu Val Glu Glu Lys Arg Cys Ala Pro Pro Ala Asp Asp Leu Leu Ser 195 200 205 gcg ctg atc cgg acg acc gac gag gac ggc gac cgt ctg tca ccc gcg 672 Ala Leu Ile Arg Thr Thr Asp Glu Asp Gly Asp Arg Leu Ser Pro Ala 210 215 220 gag ctg cgc ggc atg gcc ttc atc ctg ctg atc gcc ggc cac gag acc 720 Glu Leu Arg Gly Met Ala Phe Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr 225 230 235 240 acc gtc aac ctc atc acc ggt gcc gtc cac gcc ctc ctc acg cat ccc 768 Thr Val Asn Leu Ile Thr Gly Ala Val His Ala Leu Leu Thr His Pro 245 250 255 ggg caa ctc gcc cag gtg cgg ggc gac atg agc ctc gtg gac gcg gtc 816 Gly Gln Leu Ala Gln Val Arg Gly Asp Met Ser Leu Val Asp Ala Val 260 265 270 gtg gag gag acg ctg cgc cat gag ggg ccg gtg gag aac gcg acg ttc 864 Val Glu Glu Thr Leu Arg His Glu Gly Pro Val Glu Asn Ala Thr Phe 275 280 285 cgc ttc gcc gcc gag ccg ctg gag ata ggg ggc acg gtc atc cca gcg 912 Arg Phe Ala Ala Glu Pro Leu Glu Ile Gly Gly Thr Val Ile Pro Ala 290 295 300 ggg gac ccg gtg ctg atc ggg ctg gcc gcg gcc gat cgg gac ggc gcc 960 Gly Asp Pro Val Leu Ile Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Asp Gly Ala 305 310 315 320 cgc tat ccc ggc ccc gac cgc ttc gac atc cac cgg gac aca cgc ggg 1008 Arg Tyr Pro Gly Pro Asp Arg Phe Asp Ile His Arg Asp Thr Arg Gly 325 330 335 cat ctc gcc ttc ggc cac ggc atc cac ttc tgc ctc ggc gcg ccg ctc 1056 His Leu Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu 340 345 350 gcc cgg ctg gag gcc cgg gtg gct ctg cgc gcg ctg ctg gag cgg tgc 1104 Ala Arg Leu Glu Ala Arg Val Ala Leu Arg Ala Leu Leu Glu Arg Cys 355 360 365 cct ggt ctc acg ccg gac ggg gca ccg ggg gag tgg ctg ccg ggg atg 1152 Pro Gly Leu Thr Pro Asp Gly Ala Pro Gly Glu Trp Leu Pro Gly Met 370 375 380 ctg ata cgg ggg gta cgg agc ctg ccg gtg cgc tgg tga 1191 Leu Ile Arg Gly Val Arg Ser Leu Pro Val Arg Trp 385 390 395

【００６６】 <210> 2 <211> 396 <212> PRT <213> Streptomyces sp. <400> 2 Met Gly His Glu His Val Ile Asp Leu Gly Glu Tyr Gly Pro Gly Phe 1 5 10 15 Thr Glu Asn Pro His Pro Val Tyr Ala Glu Leu Arg Ala Arg Gly Pro 20 25 30 Val His Arg Val Arg Leu Pro Lys His Asp Ala His His Glu Ala Trp 35 40 45 Leu Val Val Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Ala Ala Leu Ala Asp Pro Arg 50 55 60 Leu Ser Lys Asp Gly Ser Thr Ile Gly Val Thr Phe Leu Asp Glu Glu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Tyr Leu Leu Ile Ala Asp Pro Pro Gln His Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Gly Leu Ile Ala Arg Glu Phe Thr Gly Arg Arg Val Glu Arg 100 105 110 Leu Arg Pro Arg Val Gln Glu Ile Thr Asp Ser Leu Leu Asp Glu Met 115 120 125 Leu Pro Arg Gly Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser Phe Ala Tyr Pro Leu 130 135 140 Pro Leu Thr Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Glu Ile Asp Arg 145 150 155 160 Ala Ala Phe Arg Lys Leu Ser Thr Glu Ala Val Ala Pro Thr Ser Gly 165 170 175 Glu Ser Glu Tyr Ala Ala Phe Val Gln Leu Ala Ala Tyr Leu Glu Glu 180 185 190 Leu Val Glu Glu Lys Arg Cys Ala Pro Pro Ala Asp Asp Leu Leu Ser 195 200 205 Ala Leu Ile Arg Thr Thr Asp Glu Asp Gly Asp Arg Leu Ser Pro Ala 210 215 220 Glu Leu Arg Gly Met Ala Phe Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr 225 230 235 240 Thr Val Asn Leu Ile Thr Gly Ala Val His Ala Leu Leu Thr His Pro 245 250 255 Gly Gln Leu Ala Gln Val Arg Gly Asp Met Ser Leu Val Asp Ala Val 260 265 270 Val Glu Glu Thr Leu Arg His Glu Gly Pro Val Glu Asn Ala Thr Phe 275 280 285 Arg Phe Ala Ala Glu Pro Leu Glu Ile Gly Gly Thr Val Ile Pro Ala 290 295 300 Gly Asp Pro Val Leu Ile Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Asp Gly Ala 305 310 315 320 Arg Tyr Pro Gly Pro Asp Arg Phe Asp Ile His Arg Asp Thr Arg Gly 325 330 335 His Leu Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu 340 345 350 Ala Arg Leu Glu Ala Arg Val Ala Leu Arg Ala Leu Leu Glu Arg Cys 355 360 365 Pro Gly Leu Thr Pro Asp Gly Ala Pro Gly Glu Trp Leu Pro Gly Met 370 375 380 Leu Ile Arg Gly Val Arg Ser Leu Pro Val Arg Trp 385 390 395

【００６７】 <210> 3 <211> 1449 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1446) <400> 3 gtg ata ttg ctg aag agc ttg gcg gcg aat ggg ctg acc gct tcc tcg 48 Val Ile Leu Leu Lys Ser Leu Ala Ala Asn Gly Leu Thr Ala Ser Ser 1 5 10 15 tgc ttt acg gta tcg ccg ctc ccg att cgc agc gca tcg cct tct atc 96 Cys Phe Thr Val Ser Pro Leu Pro Ile Arg Ser Ala Ser Pro Ser Ile 20 25 30 gcc ttc ttg acg agt tct tct gag cgg gac tct ggg gtt cga aat gac 144 Ala Phe Leu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Arg Asn Asp 35 40 45 cga cca agc gac gcc caa cct gcc atc gcg aga ttt cga ttc ccc acc 192 Arg Pro Ser Asp Ala Gln Pro Ala Ile Ala Arg Phe Arg Phe Pro Thr 50 55 60 ccg ccc cac cca cgc aac cca acc cag ccc cac cca acc cca ccg cgc 240 Pro Pro His Pro Arg Asn Pro Thr Gln Pro His Pro Thr Pro Pro Arg 65 70 75 80 ccc tca ccc acc gac gac ccc cta cag gcc ccc acc ttc ttc gcc gac 288 Pro Ser Pro Thr Asp Asp Pro Leu Gln Ala Pro Thr Phe Phe Ala Asp 85 90 95 ccc tac ccg acc tac gcc cgc ctc cga gac acg gca ccg gta ctc aag 336 Pro Tyr Pro Thr Tyr Ala Arg Leu Arg Asp Thr Ala Pro Val Leu Lys 100 105 110 gtc ccc acc ggt tca gga gga gga ggc cgc cac agc tac gtg gtc acc 384 Val Pro Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg His Ser Tyr Val Val Thr 115 120 125 ggc tac gcc gag gcc cgg gag gcc ttc acc gac ccc cgc ctc tcg aag 432 Gly Tyr Ala Glu Ala Arg Glu Ala Phe Thr Asp Pro Arg Leu Ser Lys 130 135 140 gac acc gcg agc ttc ttc gca ggc cga ccg tcg cag cgc gat ctc cat 480 Asp Thr Ala Ser Phe Phe Ala Gly Arg Pro Ser Gln Arg Asp Leu His 145 150 155 160 ccg gcc gtc tcc cgg aac atg ctc gcc aca gac cct ccc caa cac gcc 528 Pro Ala Val Ser Arg Asn Met Leu Ala Thr Asp Pro Pro Gln His Ala 165 170 175 cgg cta cgg gcg ctg gtg acg aag gcg ttc acc acg ggg gcg gtg gcg 576 Arg Leu Arg Ala Leu Val Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gly Ala Val Ala 180 185 190 cgt ctg cgc ccc tac atc tcc tcc ctg gtc gac gag ttg ctc gac acc 624 Arg Leu Arg Pro Tyr Ile Ser Ser Leu Val Asp Glu Leu Leu Asp Thr 195 200 205 tgg ccg acc cac gga acg gtg gac ctg atc gcc gac ctc gcg gtg ccg 672 Trp Pro Thr His Gly Thr Val Asp Leu Ile Ala Asp Leu Ala Val Pro 210 215 220 ctc ccc gtc acg gtc atc tgc gag ctg ctc ggg gtg ccg gat tcc gac 720 Leu Pro Val Thr Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Asp Ser Asp 225 230 235 240 cgc gcg tcc gta cgc acc tgg tcg agc gac ctg ttc gct gcc gga gac 768 Arg Ala Ser Val Arg Thr Trp Ser Ser Asp Leu Phe Ala Ala Gly Asp 245 250 255 ccg cag cgg atc gac gcc gcc tcc cac gcc gtc ggc gac tac atg acc 816 Pro Gln Arg Ile Asp Ala Ala Ser His Ala Val Gly Asp Tyr Met Thr 260 265 270 gcc ctc gtc gcc gcc aag cgc acc gca ccc ggc gac agc ctg ctc gac 864 Ala Leu Val Ala Ala Lys Arg Thr Ala Pro Gly Asp Ser Leu Leu Asp 275 280 285 gac ctc atc gcc gta cgc gac ggc cag gac cac ctg tcc gag gac gaa 912 Asp Leu Ile Ala Val Arg Asp Gly Gln Asp His Leu Ser Glu Asp Glu 290 295 300 ctc gta tcg ctc gcc gta ctc ctg ctg gtg gcc ggc cac gag acc acc 960 Leu Val Ser Leu Ala Val Leu Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr 305 310 315 320 acc aac ttc atc ggc aac gcc gcc ctg gcc ctc cta cgg cac ccg gag 1008 Thr Asn Phe Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Leu Arg His Pro Glu 325 330 335 tcg ctc gcg cac ctg agg gcc gag ccg caa ctc ctc ggc ggc gca ctg 1056 Ser Leu Ala His Leu Arg Ala Glu Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ala Leu 340 345 350 gac gag ttg ctg cgc tac gac tcg ccc gtc ggg atc gcg acg ttc cgc 1104 Asp Glu Leu Leu Arg Tyr Asp Ser Pro Val Gly Ile Ala Thr Phe Arg 355 360 365 ttc agc acc gag gcg ctc acg ctc ggc ggc acc gag atc ccc gaa ggc 1152 Phe Ser Thr Glu Ala Leu Thr Leu Gly Gly Thr Glu Ile Pro Glu Gly 370 375 380 gta ccg gtc ctc atc gca ccc ggc gcc gcc aat cgc gac ccg gac cgc 1200 Val Pro Val Leu Ile Ala Pro Gly Ala Ala Asn Arg Asp Pro Asp Arg 385 390 395 400 ttc ccc gac ccc gac cgc ctg gac ctc acc cgc ggc gcc acc ggt cac 1248 Phe Pro Asp Pro Asp Arg Leu Asp Leu Thr Arg Gly Ala Thr Gly His 405 410 415 ctg gcc ttc ggc cac ggc atc cac cgc tgc ctg gga gcc ccg ttg gcc 1296 Leu Ala Phe Gly His Gly Ile His Arg Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala 420 425 430 cga gcc gaa gcc gaa ctg gcc ctc cac gcc gtc atc acc cgc tac ccc 1344 Arg Ala Glu Ala Glu Leu Ala Leu His Ala Val Ile Thr Arg Tyr Pro 435 440 445 caa gcc gcc ctg gcg acg ccg ccc gaa acc ctc cct tgg cgc cac acc 1392 Gln Ala Ala Leu Ala Thr Pro Pro Glu Thr Leu Pro Trp Arg His Thr 450 455 460 cgt ctg acc cga ggc ctg gcg tcc ctg ccc atc acc ctc cga gat cac 1440 Arg Leu Thr Arg Gly Leu Ala Ser Leu Pro Ile Thr Leu Arg Asp His 465 470 475 480 ccc aag tga 1449 Pro Lys

【００６８】 <210> 4 <211> 482 <212> PRT <213> Streptomyces sp. <400> 4 Val Ile Leu Leu Lys Ser Leu Ala Ala Asn Gly Leu Thr Ala Ser Ser 1 5 10 15 Cys Phe Thr Val Ser Pro Leu Pro Ile Arg Ser Ala Ser Pro Ser Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Arg Asn Asp 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ala Gln Pro Ala Ile Ala Arg Phe Arg Phe Pro Thr 50 55 60 Pro Pro His Pro Arg Asn Pro Thr Gln Pro His Pro Thr Pro Pro Arg 65 70 75 80 Pro Ser Pro Thr Asp Asp Pro Leu Gln Ala Pro Thr Phe Phe Ala Asp 85 90 95 Pro Tyr Pro Thr Tyr Ala Arg Leu Arg Asp Thr Ala Pro Val Leu Lys 100 105 110 Val Pro Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg His Ser Tyr Val Val Thr 115 120 125 Gly Tyr Ala Glu Ala Arg Glu Ala Phe Thr Asp Pro Arg Leu Ser Lys 130 135 140 Asp Thr Ala Ser Phe Phe Ala Gly Arg Pro Ser Gln Arg Asp Leu His 145 150 155 160 Pro Ala Val Ser Arg Asn Met Leu Ala Thr Asp Pro Pro Gln His Ala 165 170 175 Arg Leu Arg Ala Leu Val Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gly Ala Val Ala 180 185 190 Arg Leu Arg Pro Tyr Ile Ser Ser Leu Val Asp Glu Leu Leu Asp Thr 195 200 205 Trp Pro Thr His Gly Thr Val Asp Leu Ile Ala Asp Leu Ala Val Pro 210 215 220 Leu Pro Val Thr Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Asp Ser Asp 225 230 235 240 Arg Ala Ser Val Arg Thr Trp Ser Ser Asp Leu Phe Ala Ala Gly Asp 245 250 255 Pro Gln Arg Ile Asp Ala Ala Ser His Ala Val Gly Asp Tyr Met Thr 260 265 270 Ala Leu Val Ala Ala Lys Arg Thr Ala Pro Gly Asp Ser Leu Leu Asp 275 280 285 Asp Leu Ile Ala Val Arg Asp Gly Gln Asp His Leu Ser Glu Asp Glu 290 295 300 Leu Val Ser Leu Ala Val Leu Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr 305 310 315 320 Thr Asn Phe Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Leu Arg His Pro Glu 325 330 335 Ser Leu Ala His Leu Arg Ala Glu Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ala Leu 340 345 350 Asp Glu Leu Leu Arg Tyr Asp Ser Pro Val Gly Ile Ala Thr Phe Arg 355 360 365 Phe Ser Thr Glu Ala Leu Thr Leu Gly Gly Thr Glu Ile Pro Glu Gly 370 375 380 Val Pro Val Leu Ile Ala Pro Gly Ala Ala Asn Arg Asp Pro Asp Arg 385 390 395 400 Phe Pro Asp Pro Asp Arg Leu Asp Leu Thr Arg Gly Ala Thr Gly His 405 410 415 Leu Ala Phe Gly His Gly Ile His Arg Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala 420 425 430 Arg Ala Glu Ala Glu Leu Ala Leu His Ala Val Ile Thr Arg Tyr Pro 435 440 445 Gln Ala Ala Leu Ala Thr Pro Pro Glu Thr Leu Pro Trp Arg His Thr 450 455 460 Arg Leu Thr Arg Gly Leu Ala Ser Leu Pro Ile Thr Leu Arg Asp His 465 470 475 480 Pro Lys

【００６９】 <210> 5 <211> 1380 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1377) <400> 5 gtg atc cag gtc acg tca ggt ttc tgt cag gca act ggc cgg gag tcg 48 Val Ile Gln Val Thr Ser Gly Phe Cys Gln Ala Thr Gly Arg Glu Ser 1 5 10 15 tca gat cgc tct gtt tgc atg agt gca tcg agg cct cga agc atc ccc 96 Ser Asp Arg Ser Val Cys Met Ser Ala Ser Arg Pro Arg Ser Ile Pro 20 25 30 cgg cgc tcc ccc tca ccg gag ccc cca cac cga gga gag acc atg gcc 144 Arg Arg Ser Pro Ser Pro Glu Pro Pro His Arg Gly Glu Thr Met Ala 35 40 45 gac acc ctg acc gac gcc gcc ccc gac acc gac ggg cgg gtc ccc gag 192 Asp Thr Leu Thr Asp Ala Ala Pro Asp Thr Asp Gly Arg Val Pro Glu 50 55 60 tac ccc atg ccg agg gcg acg ggc tgt ccg ctc gct ccg tct ccg gcc 240 Tyr Pro Met Pro Arg Ala Thr Gly Cys Pro Leu Ala Pro Ser Pro Ala 65 70 75 80 gcc gcc gaa ctc cgc ggc gac cgg ccg atc acc cgg gtg cgg atc tgg 288 Ala Ala Glu Leu Arg Gly Asp Arg Pro Ile Thr Arg Val Arg Ile Trp 85 90 95 aac ggc agc acc ccg tgg ctc atc acc cgc cac gcc gac cag cgc acc 336 Asn Gly Ser Thr Pro Trp Leu Ile Thr Arg His Ala Asp Gln Arg Thr 100 105 110 ctg ctc acc gac ccg cgc gtc agc aac gac gac cac gag ccc gac ttc 384 Leu Leu Thr Asp Pro Arg Val Ser Asn Asp Asp His Glu Pro Asp Phe 115 120 125 ccc cac gtc aac gcc cac cgc gcg gcc att gcc ccg cac acc ccg aag 432 Pro His Val Asn Ala His Arg Ala Ala Ile Ala Pro His Thr Pro Lys 130 135 140 ctg atc acc aac acc gac gcc ccc gag cac acc cgg ctg cgt cgc tcg 480 Leu Ile Thr Asn Thr Asp Ala Pro Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Ser 145 150 155 160 gtg aac gcc ccg ttc ctg gtg aaa cgg atc gag gcc atg cgc ccg gcg 528 Val Asn Ala Pro Phe Leu Val Lys Arg Ile Glu Ala Met Arg Pro Ala 165 170 175 gtg cag aaa atc gtc gac gac ctg atc gac gac atg ctg gcc ggc ccc 576 Val Gln Lys Ile Val Asp Asp Leu Ile Asp Asp Met Leu Ala Gly Pro 180 185 190 agc ccg gcc gac ctg ctc acc gcc ctc gcc ctg ccg gtg ccc tcg ctc 624 Ser Pro Ala Asp Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu 195 200 205 gtc atc gcc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gag gac cac cac ttc ttc 672 Val Ile Ala Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His His Phe Phe 210 215 220 cag gag aac agc aac cgc gtc ctc gac aac tcc ctc acc gcg gaa gag 720 Gln Glu Asn Ser Asn Arg Val Leu Asp Asn Ser Leu Thr Ala Glu Glu 225 230 235 240 gcc cag gag tcc agc cgc gcg ctc ggc ggc tat ctg gac acc ctg ttc 768 Ala Gln Glu Ser Ser Arg Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Asp Thr Leu Phe 245 250 255 cgg acg aag ctc gaa cag ccg ggc gaa gac gtg ctg tcg gag atg ggc 816 Arg Thr Lys Leu Glu Gln Pro Gly Glu Asp Val Leu Ser Glu Met Gly 260 265 270 tcc aag gtc aag gcc ggg gag atg acc cac cag gag gcc gtc agc atg 864 Ser Lys Val Lys Ala Gly Glu Met Thr His Gln Glu Ala Val Ser Met 275 280 285 ggc gtc gcc atg ctg atc gcc ggg cac gag acc acc gcc acg atg atc 912 Gly Val Ala Met Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Thr Met Ile 290 295 300 agc ctc ggc acg ctc gcc ctg ttc gag cac ccc gac caa ctc gcc gtg 960 Ser Leu Gly Thr Leu Ala Leu Phe Glu His Pro Asp Gln Leu Ala Val 305 310 315 320 ctg cgc gac acc gag gac ccc aag gtc gtc gcg ggc gcc gtc gac gag 1008 Leu Arg Asp Thr Glu Asp Pro Lys Val Val Ala Gly Ala Val Asp Glu 325 330 335 ctg ctg cgc tac ctc tcc atc gtg cac tcc ggc ctg cgc cgg gtc gcc 1056 Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Ile Val His Ser Gly Leu Arg Arg Val Ala 340 345 350 aag ggc gac atc gag atc gac ggc cgg ctc atc cgc aag ggc gac ggc 1104 Lys Gly Asp Ile Glu Ile Asp Gly Arg Leu Ile Arg Lys Gly Asp Gly 355 360 365 ctc ctc ttc gac ctc cag acc gcc aac tgg gac ccg aac gcc ttc ccg 1152 Leu Leu Phe Asp Leu Gln Thr Ala Asn Trp Asp Pro Asn Ala Phe Pro 370 375 380 ggg gcc gag cgt ctg gac ctc gcc cgc ccc gcc cgc cag cac aat gcc 1200 Gly Ala Glu Arg Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ala Arg Gln His Asn Ala 385 390 395 400 ttc ggt tac ggc ccc cac cag tgc ctc ggg cag aac ctc gcc cgc ctc 1248 Phe Gly Tyr Gly Pro His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu 405 410 415 gaa ctc cag gtc gtc tac ggc acg ctc tac cgc cgc gtc ctc acc ctc 1296 Glu Leu Gln Val Val Tyr Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Val Leu Thr Leu 420 425 430 cgc ccg gcc gtc ccc gtc gac cag ctg gcc ttc aac cac acc ggc acc 1344 Arg Pro Ala Val Pro Val Asp Gln Leu Ala Phe Asn His Thr Gly Thr 435 440 445 acc tac ggc gtg aag tgc ctg ccg gtc acc tgg tga 1380 Thr Tyr Gly Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Trp 450 455

【００７０】 <210> 6 <211> 459 <212> PRT <213> Streptomyces sp. <400> 6 Val Ile Gln Val Thr Ser Gly Phe Cys Gln Ala Thr Gly Arg Glu Ser 1 5 10 15 Ser Asp Arg Ser Val Cys Met Ser Ala Ser Arg Pro Arg Ser Ile Pro 20 25 30 Arg Arg Ser Pro Ser Pro Glu Pro Pro His Arg Gly Glu Thr Met Ala 35 40 45 Asp Thr Leu Thr Asp Ala Ala Pro Asp Thr Asp Gly Arg Val Pro Glu 50 55 60 Tyr Pro Met Pro Arg Ala Thr Gly Cys Pro Leu Ala Pro Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ala Ala Glu Leu Arg Gly Asp Arg Pro Ile Thr Arg Val Arg Ile Trp 85 90 95 Asn Gly Ser Thr Pro Trp Leu Ile Thr Arg His Ala Asp Gln Arg Thr 100 105 110 Leu Leu Thr Asp Pro Arg Val Ser Asn Asp Asp His Glu Pro Asp Phe 115 120 125 Pro His Val Asn Ala His Arg Ala Ala Ile Ala Pro His Thr Pro Lys 130 135 140 Leu Ile Thr Asn Thr Asp Ala Pro Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Ser 145 150 155 160 Val Asn Ala Pro Phe Leu Val Lys Arg Ile Glu Ala Met Arg Pro Ala 165 170 175 Val Gln Lys Ile Val Asp Asp Leu Ile Asp Asp Met Leu Ala Gly Pro 180 185 190 Ser Pro Ala Asp Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu 195 200 205 Val Ile Ala Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His His Phe Phe 210 215 220 Gln Glu Asn Ser Asn Arg Val Leu Asp Asn Ser Leu Thr Ala Glu Glu 225 230 235 240 Ala Gln Glu Ser Ser Arg Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Asp Thr Leu Phe 245 250 255 Arg Thr Lys Leu Glu Gln Pro Gly Glu Asp Val Leu Ser Glu Met Gly 260 265 270 Ser Lys Val Lys Ala Gly Glu Met Thr His Gln Glu Ala Val Ser Met 275 280 285 Gly Val Ala Met Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Thr Met Ile 290 295 300 Ser Leu Gly Thr Leu Ala Leu Phe Glu His Pro Asp Gln Leu Ala Val 305 310 315 320 Leu Arg Asp Thr Glu Asp Pro Lys Val Val Ala Gly Ala Val Asp Glu 325 330 335 Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Ile Val His Ser Gly Leu Arg Arg Val Ala 340 345 350 Lys Gly Asp Ile Glu Ile Asp Gly Arg Leu Ile Arg Lys Gly Asp Gly 355 360 365 Leu Leu Phe Asp Leu Gln Thr Ala Asn Trp Asp Pro Asn Ala Phe Pro 370 375 380 Gly Ala Glu Arg Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ala Arg Gln His Asn Ala 385 390 395 400 Phe Gly Tyr Gly Pro His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu 405 410 415 Glu Leu Gln Val Val Tyr Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Val Leu Thr Leu 420 425 430 Arg Pro Ala Val Pro Val Asp Gln Leu Ala Phe Asn His Thr Gly Thr 435 440 445 Thr Tyr Gly Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Trp 450 455

【００７１】 <210> 7 <211> 344 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 7 tcctcatcgc gggtcacgag accaccgtca acctcatcac cggtgccgtc cacgccctcc 60 tcacgcatcc cgggcaactc gcccaggtgc ggggcgacat gagcctcgtg gacgcggtcg 120 tggaggagac gctgcgccat gaggggccgg tggagaacgc gacgttccgc ttcgccgccg 180 agccgctgga gatagggggc acggtcatcc cagcggggga cccggtgctg atcgggctgg 240 ccgcggccga tcgggacggc gcccgctatc ccggccccga ccgcttcgac atccaccggg 300 acacacgcgg gcatctcgcc ttcggcttcg gcacgcaccg gtgc 344

【００７２】 <210> 8 <211> 344 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 8 tcctcatcgc gggtcacgag accaccacca acttcatcgg caacgccgcc ctggccctcc 60 tacggcaccc ggagtcgctc gcgcacctga gggccgagcc gcaactcctc ggcggcgcac 120 tggacgagtt gctgcgctac gactcgcccg tcgggatcgc gacgttccgc ttcagcaccg 180 aggcgctcac gctcggcggc accgagatcc ccgaaggcgt accggtcctc atcgcacccg 240 gcgccgccaa tcgcgacccg gaccgcttcc ccgaccccga ccgcctggac ctcacccgcg 300 gcgccaccgg tcacctggcc ttcggcttcg gcatgcacca ctgc 344

【００７３】 <210> 9 <211> 350 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 9 tcctcatcgc ggggcacgag accaccgcca cgatgatcag cctcggcacg ctcgccctgt 60 tcgagcaccc cgaccaactc gccgtgctgc gcgacaccga ggaccccaag gtcgtcgcgg 120 gcgccgtcga cgagctgctg cgctacctct ccatcgtgca ctccggcctg cgccgggtcg 180 ccaagggcga catcgagatc gacggccggc tcatccgcaa gggcgacggc ctcctcttcg 240 acctccagac cgccaactgg gacccgaacg ccttcccggg ggccgagcgt ctggacctcg 300 cccgccccgc ccgccagcac aatgccttcg ggttcggcac gcaccagtgc 350

【００７４】 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate forward primer 1 for amplification of P450 gene <400> 10 tsctsatcgc sggncacgas acg 23

【００７５】 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate forward primer 2 for amplification of P450 gene <400> 11 tsctsatcgc sggncacgas acc 23

【００７６】 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate reverse primer 3 for amplification of P450 gene <400> 12 gcasyggtgs rygccgwrgc cg 22

【００７７】 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate reverse primer 4 for amplification of P450 gene <400> 13 gcasyggtgs rygccgwrcc cg 22

【００７８】 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 5 for amplification of type A or type B P450 gene <400> 14 tcctcatcgc gggtcacgag acc 23

【００７９】 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 6 for amplification of type C P450 gene <400> 15 tcctcatcgc ggggcacgag acc 23

【００８０】 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 7 for amplification of type A P450 gene <400> 16 gcaccggtgc gtgccgaagc cg 22

【００８１】 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 8 for amplification of type B P450 gene <400> 17 gcagtggtgc atgccgaagc cg 22

【００８２】 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 9 for amplification of type C P450 gene <400> 18 gcactggtgc gtgccgaacc cg 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｐ 17/18 //(Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA67 BA80 CA03 DA08 EA04 EA06 GA11 HA01 HA12 4B050 CC01 CC04 DD02 LL05 4B063 QA01 QA13 QQ06 QQ22 QQ44 QR32 QR56 QR62 QR75 QS25 QS34 4B064 AE58 AG01 CA03 CA19 CC24 DA05 4B065 AA50X AA50Y AB01 AC14 BA02 CA18 CA28 CA44 4C086 AA04 CB22 GA17 NA20 ZB26 ZC20

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２、４および６記載のアミノ酸
   配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含む
   チトクロームP450。
2. 【請求項２】 配列番号２、４および６記載のアミノ酸
   配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列におい
   て、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したア
   ミノ酸配列を含み、かつモノオキシゲナーゼ活性を有す
   るチトクロームP450。
3. 【請求項３】 配列番号２、４および６記載のアミノ酸
   配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列と80％
   以上の相同性を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を有
   するチトクロームP450。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のチ
   トクロームP450をコードするDNA。
5. 【請求項５】 配列番号１、３および５記載の塩基配列
   からなる群から選ばれる一つの塩基配列からなる請求項
   ４記載のDNA。
6. 【請求項６】 請求項５記載のDNAとストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズし、かつモノオキシゲナーゼ
   活性を有するチトクロームP450をコードするDNA。
7. 【請求項７】 請求項４〜６のいずれか１項に記載のチ
   トクロームP450をコードするDNAとベクターとからなる
   組換え体DNA。
8. 【請求項８】 請求項７記載の組換え体DNAを宿主細胞
   に導入して得られる形質転換体。
9. 【請求項９】 宿主細胞がストレプトミセス属に属する
   微生物である請求項８記載の形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項７記載の組換え体DNAを、UCN-0
    1を生産するストレプトミセス属に属する微生物に導入
    することにより、該微生物のUCN-01の生産性を向上させ
    る方法。
11. 【請求項１１】 請求項８または９記載の形質転換体を
    培地に培養し、培養物中にUCN-01を生成、蓄積させ、該
    培養物からUCN-01を採取することを特徴とするUCN-01の
    製造法。
12. 【請求項１２】 スタウロスポリンを含む媒体中、請求
    項８記載の形質転換体の培養液または培養液の処理物を
    スタウロスポリンと接触させ、スタウロスポリンをUCN-
    01に変換し、媒体中からUCN-01を採取することを特徴と
    するUCN-01の製造法。