JP2002034588A - バクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カニやエビ等の甲殻を原料としない全く新規
で独創的なキチン・キトサン様物質の製造方法を実現す
る。 【解決手段】 本発明に係るバクテリアによるキチン・
キトサン様物質の製造方法は、培養装置２でキチン・キ
トサン様物質を産生するバクテリア、例えばシトロバク
ター属細菌ＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ Ｐ-１６７２２）
を培養し、このバクテリアによりキチン・キトサン様物
質を菌体外に産生させ、産生されたキチン・キトサン様
物質を培地中に蓄積し、この培地を分離精製装置４によ
り精製分離してキチン・キトサン様物質を抽出すること
を特徴としている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水処理分野で凝集
剤として利用されるだけでなく、医療分野では人口皮膚
・縫合糸・薬効調整剤・免疫強化剤として、農業分野で
は作物の病害防除・収量向上のために、日用品分野では
健康食品・食品添加剤・化粧品・整髪料・抗菌衣料・生
分解性プラスチックなどに、工業分野ではバイオリアク
ター・中高分子の分離精製技術など幅広い分野に利用さ
れるキチン・キトサン様物質の製造方法に関し、更に詳
細には、従来、主としてエビ・カニ等の甲殻から得てい
たキチン・キトサン様物質を、バクテリアにより製造す
る新規なキチン・キトサン様物質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、カニやエビの甲殻は不要物として
大量に廃棄されてきたが、これらの甲殻から抽出される
キチン・キトサンが、汚泥凝集作用において優れた効果
を発揮するだけでなく、生体との関係性を初めとして一
般産業分野においても優れた性質を有することが分かっ
てきたため、近年キチン・キトサンに対する需要が急激
に高まってきている。

【０００３】その理由を詳述すると、第１に、キチン・
キトサンは生体との適合性が極めて良好であり、医療分
野において人口皮膚・縫合糸・薬効調整剤・免疫強化剤
として利用が増大している。また、キチン・キトサン自
体やこれを分解して得られるキチンオリゴ糖やキトサン
オリゴ糖が生体の免疫増強作用を有することが分かり、
同時に感染微生物の増殖阻止作用も有することが分か
り、これらの作用を活用して新たな薬剤の開発が考えら
れている。

【０００４】第２に、キチン・キトサンは生体のみなら
ず植物体との適合性もよく、農業分野おいて作物の病害
防除や収量向上のために利用されつつある。マッタケや
シイタケなどのキノコやチーズ全体を蔽うカビ等の菌類
の細胞壁がキチンを主成分として形成されていることか
らも理解できる。

【０００５】第３に、食品分野では健康食品・食品添加
剤として、また日用品分野では化粧品・整髪料・抗菌衣
料・生分解性プラスチックなどに多用されつつある。こ
れらもキチン・キトサンと生体との良好な関係を証明す
るものである。また、工業分野ではバイオリアクター・
中高分子の分離精製技術などにもその利用の道を広げて
いる。

【０００６】一方、 キチン・キトサンの製法としては、
水産加工場の廃棄物として集中的かつ大量に放出される
エビ・カニなどの甲殻を化学処理する方法が主流であ
る。しかし、甲殻のキチンは炭酸カルシウムのような無
機塩類、たんぱく質及び色素を含む脂質と共存し、相互
に強く結合している。

【０００７】従って、キチン以外の成分を除去するた
め、次のような化学処理が施される。まず、甲殻を水洗
・乾燥・粉砕して甲殻粉末を作る。次に、この甲殻粉末
から無機塩類を除去するため脱灰処理が施される。即
ち、甲殻粉末を希塩酸に二昼夜浸漬して、カルシウムな
どを塩化カルシウムとして溶解除去する。

【０００８】更に、灰分を除去した甲殻粉末からたんぱ
く質を除去するためにアルカリ処理を施す。具体的に
は、甲殻粉末を薄い水酸化ナトリウム水溶液に入れ、３６
時間煮沸し続ける。最後に得られるのが粗製キチンで、
これを更に精製して精製キチンが得られる。

【０００９】次に、キトサンの従来製法について説明す
る。一般的に、キチンはＮ−アセチルグルコサミンのポ
リマーであり、キトサンはグルコサミンのポリマーであ
る。従って、キトサンを製造するには、キチン分子を構
成するＮ−アセチルグルコサミンからアセチル基を除
去、即ちキチンを脱アセチル化することが必要になる。

【００１０】キチンを脱アセチル化するには、アルカリ
処理により行う。つまり、キチンを３０〜５０％の濃い
水酸化ナトリウム水溶液中で加熱処理すると、キチン分
子中のアセチル基は水酸化ナトリウムのナトリウムイオ
ンと反応して酢酸ナトリウムになる。この酢酸ナトリウ
ムは水溶性であるから、アルカリ処理後の水洗によって
除去できる。

【００１１】どの程度アセチル基がはずれたかの度合い
を脱アセチル化度と云う。キチンのアルカリ処理におい
て用いる水酸化ナトリウムの濃度、処理時間、処理温度
を変えることによって、各種の脱アセチル化度のキトサ
ンが得られる。脱アセチル化度を大きくするには、水酸
化ナトリウムの濃度を高くし、処理時間を長くし、処理
温度を高めることが必要である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、エビ
やカニの甲殻からキチンを抽出するには、強酸や強アル
カリ処理のような扱い難い工程が必要になる。また、た
んぱく質除去処理においてキチンの純度を高めるため
に、処理液の濃度や処理温度を高めたり、処理時間を長
くすると、必然的にキチンの低分子化が起こる。産業的
には高分子キチンが必要とされる分野も多く、従来製法
の改善が要求されていた。

【００１３】また、キチンは各種の溶媒に溶解し難いた
め、化学的な加工が困難な物質である。一方、キトサン
はキチンより溶解性が優れているから、まずキチンを脱
アセチル化してキトサンを作り、 このキトサンを溶解処
理して化学的加工を施し、この中間物質をアセチル化し
てキチン誘導体を合成するというような煩雑なプロセス
を辿ることも多い。

【００１４】このように、キトサンはキチンを脱アセチ
ル化して得られるが、脱アセチル化は過酷な強アルカリ
処理によって行われるため、キトサンの低分子化を必然
的に伴う。キトサンは脱アセチル化度や分子量の違いに
よって物理的・化学的性質が微妙に異なるため、応用分
野毎にその目的に添ったグレードが求められる。従っ
て、キトサンの製造には、従来よりも脱アセチル化度や分
子量の精細な制御が要求されている。

【００１５】これらの従来欠点を根本的に解消するに
は、カニやエビ等の甲殻を原料とする従来の製造方法に
束縛されることなく、全く独創的なキチン・キトサンの
製造方法が要求される。従って、本発明の目的は、カニ
やエビ等の甲殻を原料としない全く新規で独創的なキチ
ン・キトサンの製造方法を実現することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】請求項１の発明は、キチ
ン・キトサン様物質を産生するバクテリアを培地で培養
し、このバクテリアによりキチン・キトサン様物質を菌
体外に産生させ、産生されたキチン・キトサン様物質を
培地中に蓄積し、この培地を精製分離してキチン・キト
サン様物質を抽出することを特徴とするバクテリアによ
るキチン・キトサン様物質の製造方法である。

【００１７】請求項２の発明は、前記培地が有機酸を炭
素源としている請求項１記載のバクテリアによるキチン
・キトサン様物質の製造方法である。

【００１８】請求項３の発明は、前記培地が培養液であ
り、この培養液からキチン・キトサン様物質をエタノー
ル沈殿法又は膜ろ過法により濃縮回収する請求項１記載
のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法
である。

【００１９】請求項４の発明は、 前記バクテリアがシト
ロバクター属細菌である請求項２記載のバクテリアによ
るキチン・キトサン様物質の製造方法である。

【００２０】請求項５の発明は、 前記シトロバクター属
細菌がＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ Ｐ-１６７２２）であ
る請求項４記載のバクテリアによるキチン・キトサン様
物質の製造方法である。

【００２１】請求項６の発明は、 培養温度が３０℃前後
で培養ｐＨが７〜１０である請求項５記載のバクテリア
によるキチン・キトサン様物質の製造方法である。

【００２２】請求項７の発明は、 前記キチン・キトサン
様物質のゲルろ過クロマトグラフィによる分子量の分析
の結果が０．２万〜３５０万に分布する請求項１、２、
３、４又は５記載のバクテリアによるキチン・キトサン
様物質の製造方法である。

【００２３】請求項８の発明は、前記キチン・キトサン
様物質の赤外吸収スペクトルが、少なくともＯＨ伸縮振
動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加え
て、アミド基に由来するアミド■吸収帯、アミド■吸収
帯にキチン・キトサン特有のスペクトルパターンを有す
る請求項１、２、３、４又は５記載のバクテリアによる
キチン・キトサン様物質の製造方法である。

【００２４】請求項９の発明は、前記キチン・キトサン
様物質の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペク
トルがグルコサミンと同様のマススペクトルを有する請
求項１、２、３、４又は５記載のバクテリアによるキチ
ン・キトサン様物質の製造方法である。

【００２５】請求項１０の発明は、前記キチン・キトサ
ン様物質の加水分解物の¹H-ＮＭＲ分析によるスペクト
ルが、グルコサミンと同様のスペクトルを有する請求項
１、２、３、４又は５記載のバクテリアによるキチン・
キトサン様物質の製造方法である。

【００２６】請求項１１の発明は、前記キチン・キトサ
ン様物質の加水分解物のＧＣ−ＭＳ分析のマススペクト
ルが、グルコサミンと同様のマススペクトルを有する請
求項１、２、３、４又は５記載のバクテリアによるキチ
ン・キトサン様物質の製造方法である。

【００２７】

【発明の実施の形態】本出願人等は、既に特開平１１−
２７６１６０号公報において、シトロバクタ−属細菌Ｔ
ＫＦ０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７２２）が新規な凝集
剤産生微生物であり、このバクテリアが従来とは異なる
全く新規な微生物凝集剤を産生することを見出した。ま
た、この微生物凝集剤が従来から用いられている無機凝
集剤や合成高分子凝集剤と同程度の凝集効果を発揮する
ことを発見し、しかもこの微生物凝集剤は環境を汚染し
ない安全な凝集剤であることを開示した。

【００２８】このシトロバクター属細菌ＴＫＦ０４株は
シトロバクタ−・フロインジイとの高い相同性が認めら
れたが、生理特性やＤＮＡ塩基配列において若干の相違
が認められたので、新規なバクテリアであると考え、工
業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６７
２２として寄託した。従って、工業技術院微生物工業技
術研究所から所定の手続に基づき、ＴＫＦ０４株を入手
することができる。

【００２９】前記微生物凝集剤の研究に引き続き、 本発
明者等は、このシトロバクター属細菌ＴＫＦ０４株が産
生する微生物凝集剤の具体的化学物質を特定する研究を
続行した。以後、このＴＫＦ０４株が産生する物質、即
ち微生物凝集剤をＢＦ０４と称し、このＢＦ０４の化学
物質の同定プロセスを説明する。

【００３０】まず、ＢＦ０４をゲルろ過クロマトグラフ
ィにかけて、凝集活性を有する画分の分子量を推定し
た。分子量分布は製造条件を変えるとかなり変動するこ
とが分かった。得られたサンプルの分子量分布の最大幅
は０．２万〜３５０万であった。図１はＢＦ０４のサン
プル群から選ばれた比較的低い方の分子量分布曲線の一
例である。ＢＦ０４は実線で表され、主ピークが約３２
０ｋＤａに位置し、その左右の裾野が２００ｋＤａ〜５
００ｋＤａに分布している。

【００３１】点線で表示するものは参考のために表示し
た各種の標準たんぱく質の分子量分布で、６６９ｋＤａ
はチログロブリン、４４０ｋＤａはフェリチン、２３２
ｋＤａはカタラーゼ、１４０ｋＤａは乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、６７ｋＤａは牛血清アルブミンである。

【００３２】また、成分分析により、ＢＦ０４の有機成
分にはたんぱく質や脂質はほとんど含まれておらず、主
要成分は、エルソン・モルガン反応で定量されるヘキソ
サミンであることが分かった。フェノール硫酸法により
多量の糖が含まれていることも確認され、ＢＦ０４がア
ミノ基を有した糖類であることが分かった。

【００３３】図２はＢＦ０４のフーリエ変換赤外分光分
析によるＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルである。（ａ）はＢ
Ｆ０４、（ｂ）はキチン、（ｃ）はキトサンを示してい
る。ＢＦ０４には約３５００（ｃｍ^-1）及び１０００〜
２０００（ｃｍ^-1）に特徴的な吸収スペクトルが見られ
る。これらの吸収スペクトル成分の基本構造は、（ｂ）
及び（ｃ）から分かるように、キチン或いはキトサンに
特有のＯＨ伸縮振動（３４４０〜３４８０ｃｍ^-1）、Ｃ
Ｈ伸縮振動（２８７８〜２９６０ｃｍ^-1）、ＮＨ伸縮振
動（３２６０〜３２７０ｃｍ^-1）、アミド基に由来する
アミド■吸収帯（１６５０〜１５６０ｃｍ^-1）及びアミ
ド■吸収帯（１５５０〜１５６０ｃｍ^-1）の存在を示唆
している。

【００３４】上述から、ＢＦ０４はキチン・キトサンに
関連する物質であると推定できる。このことを実証する
ために、キチン・キトサン様物質を構成分子にまで分解
する分解酵素をＢＦ０４に処理した。分解酵素として、
セルラーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼが選ばれた。
キチナーゼ、キトサナーゼはキチン、キトサンを分解す
る酵素である。その結果、ＢＦ０４に見られた凝集活性
が、これらの分解物には見られなくなった。つまり、酵
素分解による低分子化が凝集活性を消失させたと理解で
きる。キチン・キトサンが凝集活性を有することは以前
から知られているから、この結果よりＢＦ０４がキチン
・キトサン様物質であることが強く支持された。

【００３５】構成する単糖類を明らかにするために、Ｂ
Ｆ０４を酸で加水分解し、この加水分解物に対し薄層ク
ロマトグラフィ（ＴＬＣ分析）、ガスクロマトグラフィ
質量分析（ＧＣ−ＭＳ分析）、液体クロマトグラフィ質
量分析（ＬＣ−ＭＳ分析）及びＮＭＲ分析を行った。一
方、市販のキチン、キトサンの酸加水分解物及びそれら
の構成成分であるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンの標準品に対しも、ＴＬＣ分析、ＧＣ−ＭＳ分析、Ｌ
Ｃ−ＭＳ分析、ＮＭＲ分析を行い、ＢＦ０４加水分解物
に対する上記の分析結果と比較した。

【００３６】ＢＦ０４のＴＬＣ分析（薄層：Silica Gel
G plate／Analtec Inc., USA, 展開溶液：ｎ−ブタノ
ール：ギ酸：水＝２：３：１）では、Ｒ_f＝０．４８〜
０．４９に明確なスポットが見られたが、D-グルコサミ
ン標準品ではＲ_f＝０．４９に同様のスポットが見られ、
両者が誤差範囲内で同一物質であることを示した。真正
のキチン及びキトサンの加水分解物のＲ_fは夫々０．４
７〜０．４８及び０．４８〜０．４９であった。従っ
て、 ＢＦ０４の加水分解物がグルコサミンであり、キチ
ン及びキトサンの加水分解物とほぼ同等であることが強
く支持された。

【００３７】前述したように、キチンを構成する単糖類
はＮ−アセチルグルコサミンであるが、キチンを酸加水
分解すると、キチンは加水分解されると同時に脱アセチ
ル化も受け、その結果キチンの加水分解物はＮ−アセチ
ルグルコサミンでなくグルコサミンとなる。つまり、キ
チンとキトサンの加水分解物はグルコサミンという同一
物質になることを付記しておく。

【００３８】図３はＢＦ０４加水分解物のＬＣ−ＭＳ分
析により得られたマススペクトルである。分子量が１８
０に第１ピーク、１６２に第２ピークが特徴的に観察さ
れた。他方、 図４はグルコサミン標準品のＬＣ−ＭＳマ
ススペクトルである。分子量が１８０に第１ピーク及び
１６２に第２ピークを有することが同様に観察された。
この結果から、ＢＦ０４を構成する単糖類がグルコサミ
ンであることが分かった。

【００３９】図５はＢＦ０４加水分解物（ａ）とグルコ
サミン（ｂ）を夫々アルジトールアセチル化しそれらの
誘導体をＧＣ−ＭＳ分析することによって得られたマス
スペクトルである。両者ともスペクトルの分布が酷似し
ており、特にｍ／ｚ値が１１４に第1ピークがあり、９
６に第2ピークがあり、８４に第3ピーク及び１３９に第
4ピーク、２４１に分子イオンピークがある点で一致し
ている。

【００４０】図6はＢＦ０４加水分解物（ａ）とグルコ
サミン（ｂ）の¹Ｈ−ＮＭＲ分析図である。横軸は化学
シフトのδ値（ｐｐｍ）で、縦軸は信号強度を示す。両
者を比較すると、スペクトルの全体像が一致しているこ
とが分かる。

【００４１】以上に示すように、ゲルろ過クロマトグラ
フィ分析、ＦＴ−ＩＲ分析、分解酵素分析、ＴＬＣ分
析、ＧＣ−ＭＳ分析、ＬＣ−ＭＳ分析及び¹Ｈ−ＮＭＲ
分析の全ての結果は、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物
質であることを支持している。

【００４２】従って、ＴＫＦ０４株によって生成される
ＢＦ０４はグルコサミンのポリマー物質であるキトサン
を主成分とし、またそれらの誘導体を含むキチン・キト
サン様物質であることが明らかとなった。この研究を通
して、本発明者等はバクテリアによりキチン・キトサン
様物質を生成する事実を初めて発見し、 この発見に基づ
いてキチン・キトサン様物質をバクテリアにより製造す
る本発明方法を完成したものである。

【００４３】本発明者等により既に特開平１１−２７６
１６０号公報において開示されているように、ＴＫＦ０
４株が培地中に産生するＢＦ０４は汚泥凝集性が極めて
高く、その凝集性能はカオリン凝集性によって代表され
ることが分かっている。この前段階の研究では、ＢＦ０
４がキチン・キトサン様物質であるとは断定出来なかっ
たが、本発明の研究において、ＢＦ０４がキチン・キト
サン様物質であることが確定された。

【００４４】キチン・キトサンが凝集性能を有すること
は一般に知られているので、ＢＦ０４がキチン・キトサ
ン様物質であることは、そのカオリン凝集性能によって
判定することが可能である。また、カオリン凝集性能が
低下するとＢＦ０４自体の低分子化が生起していると判
断できる。従って、以後の実施例においては、カオリン
凝集性能が極めて高いことによりキチン・キトサン様物
質が生成されていることの証左と考える。

【００４５】

【実施例】以下に、本発明に係るキチン・キトサン様物
質を生成するＴＫＦ０４株の採集・選別方法、ＴＫＦ０
４株の培養方法及びＢＦ０４の抽出精製方法につき実施
例により詳細に説明する。

【００４６】[実施例１：ＴＫＦ０４株の採集・選別・
同定]ＴＫＦ０４株は、既に本発明者等により自然界か
ら採集・選別され、工業技術院微生物工業技術研究所に
ＦＥＲＭ Ｐ−１６７２２として寄託されており、所定
の手続に従って入手することができる。しかし、このよ
うな株分けの方法によらず一般的に自然界から入手する
方法につき以下に説明しておく。

【００４７】細菌源のサンプルは広範囲の環境領域から
得られた。具体的には、農業・森林・庭の分野から１４
種の汚泥、台所排水溝から９種の生物膜、スカムを含む
９種の活性スラッジ、４種の河水サンプル、家庭配水管
から４種の汚泥として採集された。これらのサンプルは
次に述べるＡＰ培地で培養された。

【００４８】本発明で用いられる基本培地（以後、ＢＭ
培地と呼ぶ）は、１．０ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．０
ｇのＫ₂ＨＰＯ₄，０．０５ｇのＮａＣｌ，０．２ｇのＭ
ｇＳＯ ₄・７Ｈ₂Ｏ，１．０ｇのＣａＣｌ₂，０．０１ｇ
のＦｅＣｌ₃と０．１ｇのイーストエキスをイオン交換
水１Ｌに分散させて得られる。このＢＭ培地１Ｌに炭素
源として７．０ｇの酢酸ナトリウムと３．０ｇのプロピ
オン酸ナトリウムを混入させたものが酢酸・プロピオン
酸培地（以後、ＡＰ培地と呼ぶ）である。

【００４９】前記ＡＰ培地を構成する酢酸、プロピオン
酸は市販品でもよいが、下廃水汚泥に含まれる有機性汚
泥の嫌気性消化により得られたものでもよい。つまり有
機性汚泥を嫌気性菌で消化すると、大量の有機酸が得ら
れる。埋立地が無くなりつつある現在、汚泥の減容処理
は極めて緊急の課題であり、有機汚泥を消化して有機酸
を製造する方法は、汚泥の容積減少に役立つばかりでな
く、低価格の有機酸を提供できる点で画期的である。

【００５０】前記有機汚泥の嫌気性消化は、酸発酵細菌
である通性嫌気性菌や偏性嫌気性菌が行う有機酸発酵で
あり、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の低級脂肪酸
が生成され、特に酢酸やプロピオン酸がその中心であ
る。従って、この嫌気性消化により得られる低級脂肪酸
は本発明におけるＡＰ培地の炭素源（基質とも云う）と
して積極的に活用することが望まれる。

【００５１】従って、前記ＡＰ培地に含有される酢酸や
プロピオン酸の濃度比は、有機性汚泥の嫌気性消化液に
おけるそれらの濃度比に合致するように調整されること
が望ましい。つまり、製造原価を低くするためにＴＫＦ
０４株の採集・選別や培養を嫌気性消化液を用いること
が望ましいので、実験に用いられる酢酸やプロピオン酸
の濃度条件を汚泥消化有機酸の濃度条件に合致させるこ
とが望まれるからである。

【００５２】ＡＰ培地のｐＨは２Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）のＮ
ａＯＨまたはＨＣｌで７．２に調整された。試験管の中
に１０ｍＬのＡＰ培地を作り、このＡＰ培地中に前記サ
ンプルを植種した。この試験管を３０℃に保持して、回
転数１２０ｒｐｍの回転振とう器や往復振とう器で培養
した。バクテリアの増殖は培養液の濁度で判定され、そ
のために波長６６０ｎｍの光を用いたＯＤ₆₆₀による濁
度測定が行われた。

【００５３】サンプルのＡＰ培地での培養は３〜１０日
間行われ、所定濃度に達した培地はカオリン懸濁液に投
入され、カオリン凝集効果が測定された。カオリン凝集
活性試験は次のように行われた。カオリン粒子（３００
mesh、Kishida Chemical, Osaka）をイオン交換水に濃
度５０００ｍｇ／Ｌで懸濁させる。ＴＫＦ０４株の培養
液１ｍＬをサンプルとしてカオリン懸濁液１０ｍＬとと
もに試験管に投入し、試験管ミキサーで３０秒間攪拌し
た後、５分間静置する。この後、カオリン懸濁液のＯＤ
₅₅₀（Ａとする）をスペクトロフォトメータで測定す
る。一方、サンプルの代わりに１ｍＬのイオン交換水を
投入した試験管をコントロールとして同条件下でＯＤ
₅₅₀（Ｂとする）を測定する。凝集活性値ＧはＧ＝（Ｂ
−Ａ）／Ｂ＊１００（％）で与えられる。３回測定の平
均値を凝集活性値とする。

【００５４】所定以上のカオリン凝集活性値を示したサ
ンプルがＢＦ０４産生菌と判定された。１５６４個の菌
サンプルをＡＰ培地で培養した結果、１０４個の菌コロ
ニーがカオリン凝集活性を示した。特に、台所排水溝の
生物膜から得られたＴＫＦ０４株が最高のカオリン凝集
活性を示した。

【００５５】分類研究のために、長谷川の手法（「微生
物の分類と同定」、学会出版センター（東京）、１９８
５年）に基づいてＴＫＦ０４株の形態学的かつ生理学的
試験がなされた。ＡＰＩ２０Ｅの菌同定キット（BioMer
ieux S.A., Marcy l'Etoile, France）が予備的同定の
ために用いられた。バージイマニュアル（Bergey'smanu
al of systematic bacteriology、第１巻、Williams an
d Wilkins Co., Baltimore(1986)）に従って最終的な菌
の同定が行われた。

【００５６】その結果、ＴＫＦ０４株はグラム陰性菌
で、桿菌であり、運動性がある。また、カタラーゼ陽性
で、オキシダーゼ陰性で、嫌気性条件下でグルコースか
ら酸を生成する。前記菌同定キットでは９４．７％の確
率でＴＫＦ０４株はシトロバクタ・フロインジイと同定
できる。ＴＫＦ０４株の１６Ｓ ｒＲＮＡの６００塩基
以上の遺伝子解析の結果を、ＢＬＡＳＴを用いながらＧ
ｅｎＢａｎｋにあるシトロバクタ・フロインジイと比較
した。しかし、近似はしているものの完全な一致はみら
れず、他の生理学的試験結果を踏まえて、種まで特定す
ることはせず、ＴＫＦ０４株はシトロバクタ属の菌種で
あると判断するに留めた。

【００５７】［実施例２：ＴＫＦ０４の培養］図７は本
発明に係るバクテリアによるキチン・キトサン様物質の
製造装置の概略構成図である。培養装置２に炭素源とし
て有機酸ＣＳを投入し、また他の栄養塩類ＮＳも投入す
る。培養装置２内にはＴＫＦ０４株を混入した培養液が
充填されている。後述する所定条件でＴＫＦ０４株を培
養すると、ＴＫＦ０４株は培養液中にＢＦ０４を産生
し、培養液中のＢＦ０４濃度が増加する。一定濃度に達
した培養液を分離精製装置４に移送する。分離精製装置
４ではＢＦ０４、即ちキチン・キトサン様物質ＣＣを濃
縮精製して分離し、残留液ＳＬを排出する。

【００５８】培養装置２には培養液が内蔵される。酢酸
ナトリウムを基質（炭素源）として振とうフラスコを用
いた回分培養でＢＦ０４生産の最適化を行った結果、植
種量５％、酢酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ、酵母エキス０．
５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌの条件で構成され
た培養液に最大の凝集活性が認められた。下記に示す凝
集力価Ｈで表すと約９００になる。

【００５９】凝集力価Ｈは２種の異なる試料量（ａ１、
ａ２）で活性測定を行い、得られた凝集活性値（Ｇ１、
Ｇ２）により次式で算出する。試料量（ａ１、ａ２）は
凝集試験で添加する１ｍＬ中の量を希釈を考慮して求め
る。H=(10/a1)−[10(G1-50)(a2-a1)｝／[a1・a2(G1-G2)]
この凝集力価Ｈは、試料１ｍＬが何ｍＬのカオリン懸濁
液の凝集活性を５０％とできるかを示す。この凝集力価
Ｈは、凝集活性値Ｇと同様に、培養液の凝集力の強さ、
換言すれば培養液中のキチン・キトサン様物質の濃度を
反映し、凝集力価が大である程キチン・キトサン様物質
濃度も大と判断できる。

【００６０】前記最良培養条件を得る前に、培養条件は
種々に変更され、最適の培養条件が探索された。まず、
ＴＫＦ０４株の炭素源依存性が調べられた。結果は表１
に示されている。 ＜表１ ＢＦ０４生産に関する炭素源の効果＞ ＜炭素源＞ ＜ＴＫＦ０４増殖＞ ＜凝集活性値Ｇ(％)＞ 酢酸 ++ ９５．６ プロピオン酸 ＋ ９８．４ 酪酸 + no activity 乳酸 + １３．６ オレイン酸 ++ １８．５ ヘキサデカン + no activity メタノール − no activity エタノール − no activity グルコース ++ １２．９ ラクトース ++ ３７．０ （−：no growth、 +：ＯＤ₆₆₀=0.1 〜0.5、 ++：ＯＤ₆₆₀=0.5〜1.5）

【００６１】この結果から分かるように、酢酸或いはプ
ロピオン酸を基質とした場合にのみ高いカオリン凝集活
性を示したが、他に増殖に利用できた乳酸、酪酸、オレ
イン酸、ヘキサデカン、グルコース、ラクトース等では
凝集活性を示さなかった。つまり、ＴＫＦ０４株が凝集
活性を示すＢＦ０４、即ちキチン・キトサン様物質を産
生するには、酢酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸で培
養することが必要であることが分かる。

【００６２】窒素源の種類による培養効果を調べるため
に、酢酸培地又はプロピオン酸培地に各種の窒素源を投
入して、ＴＫＦ０４株の菌体増殖と産生されたＢＦ０４
の凝集活性が調べられた。培地として酢酸培地とプロピ
オン酸培地の2種類が用いられ、それぞれの培地に対し
て結果を表2に示す。ここで、酢酸培地はＢＭ培地に酢
酸を７．０ｇ／Ｌ添加し、プロピオン酸培地はＢＭ培地
にプロピオン酸を３．０ｇ／Ｌ添加したものである。 ＜表２ ＢＦ０４生産に関する窒素源の効果＞ ＜窒素源＞ ＜酢酸培地＞ ＜プロピオン酸培地＞ ＜菌体増殖＞ ＜凝集活性＞ ＜菌体増殖＞ ＜凝集活性＞ ＮａＮＯ₃ ＋ 20.0 ＋ 12.0 ＮＨ₄Ｃｌ ++ 96.6 ++ 96.8 ＮＨ₄ＮＯ₃ + 96.8 ++ 96.9 ウレア + 89.4 + 95.2 ペプトン ++ 93.8 + 86.2 肉エキス + 50.6 + 44.4 （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ++ 95.0 ++ 97.6 （+：ＯＤ₆₆₀=0.1 〜0.5、 ++：ＯＤ₆₆₀=0.5〜1.5）

【００６３】表２から分かるように、ＮａＮＯ₃は効果
が小さく、また肉エキスの効果も他と比べると低い。し
かし、これら以外の窒素源は共通して効果がある。つま
り、窒素源に関しては各種の窒素化合物を幅広く利用す
ることが可能である。

【００６４】次に、ＴＫＦ０４株の菌体増殖とＢＦ０４
の凝集活性に関して、ＡＰ培地の培養温度条件を調べ
た。図８はＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培養温度の
効果を示している。培養温度は３段階に分けられ、▲は
２０℃、■は３０℃、●は３７℃の場合を示す。１００
時間の培養試験で、常に３７℃のときに最大の菌体増殖
を示した。つまり、ＴＫＦ０４の繁殖率は３７℃で最大
になる。

【００６５】図９はＢＦ０４のカオリン凝集活性に関す
る培養温度の効果を示している。図６と同様に、培養温
度は３段階に分けられ、▲は２０℃、■は３０℃、●は
３７℃の場合を示す。ＴＫＦ０４を３０℃で培養したと
きに産生されるＢＦ０４が常に最大の凝集活性を示すこ
とが分かった。この結果は菌体増殖の場合と異なる。

【００６６】以上をまとめると、凝集活性は温度にかな
り依存しており、最良温度は３０℃である。一方、菌体
増殖に関する最良温度は３７℃であり、両者間には７℃
の開きがあった。しかし、キチン・キトサン様物質の最
大生成量は凝集活性により決められるから、キチン・キ
トサン様物質の生成には３０℃の温度条件が好適である
と結論できる。しかも、培養後２０〜８０時間の間に産
生されたＢＦ０４の凝集活性が極めて大きい。この間
に、大分子量のキチン・キトサン様物質を得ることがで
きることを示す。

【００６７】また、図８及び図９から次のようなことが
分かる。ＴＫＦ０４の菌体増殖とＢＦ０４の凝集活性と
は並行して増加して行き、特に、ＡＰ培地中での対数成
長期に凝集活性が増加する。その後も菌体増殖が続いて
いる間は、凝集活性の大きいＢＦ０４の産出が行なわれ
ているが、一定時間後に菌体が減少するようになると、
それにともない凝集活性の大きいＢＦ０４の産出も減少
してゆく。

【００６８】更に、ＴＫＦ０４株の菌体増殖とＢＦ０４
の凝集活性に関して、ＡＰ培地の培養ｐＨ条件を調べ
た。図１０はＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培地の初
期ｐＨの効果を示している。初期ｐＨは７段階に分けら
れ、●はｐＨ５．０、▲はｐＨ６．０、■はｐＨ７．
０、○はｐＨ７．２、△はｐＨ８．０、□はｐＨ９．０
及び◇はｐＨ１０．０である。酸性側を示す●と▲では
菌体増殖はゼロであるが、塩基性では、つまりｐＨが
７．２〜１０．０では高い菌体増殖を示している。

【００６９】図１１はＢＦ０４の凝集活性に関する培地
の初期ｐＨの効果を示している。図１０と同様の各種ｐ
Ｈに関して凝集活性が調べられた。酸性側を示す●及び
▲では凝集活性は低いが、ｐＨが７．２〜１０．０では
培養時間にかかわらず高い凝集活性を示した。また、ｐ
Ｈ７．０の中性では、高凝集活性を示す培養時期が塩基
性側よりもやや狭くなることが分かった。この傾向は図
１０と同様である。

【００７０】以上から、ｐＨ条件をまとめると、ＴＫＦ
０４株は培地の初期ｐＨが７．２〜１０．０の範囲で増
殖できることが分かった。しかも、このｐＨ範囲内で
は、初期ｐＨの違いはＢＦ０４の凝集活性にほとんど影
響を与えないことも分かった。従って、培養条件として
はかなり広いｐＨを利用することができる。

【００７１】また、ジャーファーメンターを用いたスケ
ールアップ試験を行ったが、回分培養では前述と同様の
培地を用いた場合にも凝集力価は１００程度にとどまっ
た。しかし、培養系のｐＨを８に維持するために、酢酸
と酢酸アンモニウムを３．５：１〜５．５：１で混合し
た溶液を適宜流下するfed-batch 培養を行ったところ、
菌体濃度は約２日後に２０ｇ／Ｌに達し、凝集力価は２
０００〜２５００にも達した。

【００７２】［実施例３：ＢＦ０４の精製・分離］ＴＫ
Ｆ０４株の産生するＢＦ０４の活性は主に細胞外に認め
られたため、培養液から遠心分離により細胞を除去し、
その上清からＢＦ０４の回収を試みた。培養液からの生
産物回収の常法である硫安沈殿、ヘキサン等を用いた溶
媒抽出、酸性沈殿、アルカリ沈殿、エタノール等を用い
た溶媒沈殿などを検討した結果、培養上清のｐＨをＮａ
ＯＨで１２〜１３に調整し、沸騰浴中に１０分程度保つ
アルカリ沈殿法、及び培養上清の２倍容の冷エタノール
を添加し、―２０℃で１０〜２０分静置するエタノール
沈殿法で、カオリン凝集活性を有するＢＦ０４の沈殿を
回収することができた。

【００７３】アルカリ沈殿法では得られたＢＦ０４に凝
集活性の多少のロスが認められたが、エタノール沈殿法
では安定してほぼ１００％の凝集活性を有するＢＦ０４
の回収が可能であった。従って、このエタノール沈殿法
を本発明の標準法として採用することにした。

【００７４】分離回収されたＢＦ０４は乾重量ベースで
灰分を約５０％含んでおり、水に対して難溶であった
が、ｐＨ２〜３の塩酸溶液に溶解し、透析することで脱
塩され、凍結乾燥後の有機成分が８０％以上の若干水溶
性が高い白色粉末の粗精製物を得ることができた。この
粗精製法によれば、フラスコ回分培養及びジャーファー
メンター流下培養によって得られた培養液上清から、そ
れぞれ２００ｍｇ／Ｌ及び５００ｍｇ／Ｌ程度のＢＦ０
４が得られた。このＢＦ０４が本発明が最終目的物とす
るキチン・キトサン様物質である。

【００７５】エタノール沈殿法は工業レベルでの適用で
は経済的とはいえないため、より効率的な方法として、
膜ろ過によるＢＦ０４の濃縮について検討した。分画分
子量５００００の限外ろ過を培養液上清に施した濃縮で
は、ほぼ１００％の凝集活性の回収が認められ、約１０
倍程度にまで濃縮が可能となった。ただ、この濃縮品に
は分子量が５００００以下の培地成分が濃縮されて混入
することがある。

【００７６】従って、より分画分子量の大きなろ過膜を
適用して、不純物の混入が少ない濃縮法を行うことがで
きる。また、エタノール沈殿で培養液に加えるエタノー
ル量を２倍容から等容に減少させた場合でも、一晩保持
すればほぼ完全に凝集活性を有するＢＦ０４の沈殿物を
回収できることが明らかとなった。従って、エタノール
沈殿法を膜ろ過法と組み合わせればより効率的でコスト
削減できる濃縮法を提供できる。これはアルカリ沈殿法
と膜ろ過法の組み合わせでも同様である。

【００７７】［実施例４：ＢＦ０４の物質分析と凝集効
果］次に、培養・濃縮・分離されたＢＦ０４がキチン・
キトサン様物質であることが種々の科学的方法により決
定された。第１に、ゲルろ過クロマトグラフィにより、
多種類のＢＦ０４の分子量は１０万〜３５０万に広く分
布することが分かった。これはＢＦ０４の製造条件によ
り分子量分布がかなり変動し、種々の分子量分布を有し
たＢＦ０４の製造が可能になることを示している。

【００７８】第２に、ＢＦ０４の成分分析が行われ、そ
の結果は表３に与えられている。グルコサミンが最大成
分であった。タンパク質は含まれず、有機窒素はグルコ
サミンとＮ−アセチルグルコサミンで説明できる。 ＜表３ ＢＦ０４の成分分析の結果＞ 灰分 １１．３０％ グルコサミン ７１．８１％ Ｎ−アセチルグルコサミン １６．８９％ タンパク質 ＜０．０１％ ＜元素＞ 炭素 ４６．４２％ 窒素 ８．４４％ リン ０．９２％

【００７９】第３に、ＦＴ−ＩＲ分析は、ＢＦ０４がキ
チン・キトサンに類似した透過パターンであることを示
している。第４に、ＴＬＣ分析は、ＢＦ０４の加水分解
物の主要成分がグルコサミンであることを示し、しかも
このグルコサミンはキチン・キトサンの加水分解物と同
じ成分である。

【００８０】第５に、ＢＦ０４は２時間のキチナーゼ処
理によって凝集活性を完全に消失し、また２時間のキト
サナーゼとセルラーゼ処理によって凝集活性がかなり減
少することが分かった。詳細は表４に掲載されている。
酵素処理の前後における凝集活性値に格段の変化が生じ
ていることが分かる。 ＜表４ 分解酵素処理を受けたＢＦ０４の残留凝集活性＞ ＜酵素処理＞ ＜セルラーゼ＞ ＜キチナーゼ＞ ＜キトサナーゼ＞ 前 ９７．４％ ９４．５％ ９４．８％ 後 ５３．７％ ７．８％ ３８．１％

【００８１】以上の全ての結果は、ＢＦ０４がキチン又
はキチン誘導体（例えば、キトサン）に類似した構造を
持つことを示している。

【００８２】従って、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物
質であることが判明した。キチン・キトサンが凝集活性
を有することは従来から知られており、ＢＦ０４が強い
凝集活性を有する事実もこのことから理解できる。次
に、ＢＦ０４の凝集力について検討してみる。

【００８３】ＢＦ０４のカオリン凝集性能がカチオンの
添加によってどのように変化するかが検討された。カオ
リン懸濁液の中に０．１ｍＬのカチオン溶液を添加し
た。Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｆ
ｅ³⁺のカチオン源としてＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ₂
・２Ｈ₂Ｏ、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＦｅＣｌ₂、ＡｌＣｌ
₃・６Ｈ₂Ｏ、ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏが選ばれた。

【００８４】図１２は１価のカチオン添加による凝集活
性の変化図である。●は無添加、▲はＫＣｌ添加、■は
ＮａＣｌ添加を表す。ＢＦ０４だけの無添加の場合
（●）が広範囲のカチオン濃度に対して凝集活性が一番
高いことが分かる。

【００８５】図１３は２価のカチオン添加による凝集活
性の変化図である。●は無添加、▲はＣａＣｌ₂添加、
■はＭｇＣｌ₂添加、◆はＦｅＣｌ₂添加を表す。図１０
と同様に、ＢＦ０４だけの無添加の場合（●）がカチオ
ン濃度の全領域に対して凝集活性が一番高い。

【００８６】図１４は３価のカチオン添加による凝集活
性の変化図である。●は無添加、▲はＡｌＣｌ₃添加、
■はＦｅＣｌ₃添加を表す。無添加（●）とＡｌＣｌ
₃（▲）は同程度にカチオン濃度の全領域に対して凝集
活性が高い。ＦｅＣｌ₃は高濃度側で凝集活性が低下す
る。

【００８７】以上から、ＢＦ０４は単独で使用されたと
きに最も高い凝集活性を示すことが分かる。つまり、カ
チオンを一切添加する必要がないので、低価格で最高度
の凝集効果を発揮できることを意味する。本発明で用い
られるＢＦ０４はバクテリア産生のキチン・キトサン様
物質であり、従来の甲殻から得られるキチン・キトサン
よりも強力な凝集力を有するものと理解される。

【００８８】従来、頻繁に使用されている合成高分子系
凝集剤の典型はＰＡＡ（ポリアクリルアミド）であり、
無機系凝集剤の典型はＰＡＣ（ポリアルミニウムクロラ
イド）であった。ＢＦ０４のカオリンに対する凝集力は
ＰＡＡより僅かに小さく、ＰＡＣよりかなり大きいこと
が分かった。従って、従来の高分子系凝集剤や無機系凝
集剤に替えてＢＦ０４を使用できる。また、ＢＦ０４は
ｐＨが２〜１１の範囲内でもカオリン凝集性能を有し、
しかも３〜９５℃の範囲で有効に凝集効果を発揮できる
良好な特性を有している。

【００８９】前述したように、キチン・キトサンは、水
処理分野では凝集剤として、医療分野では人口皮膚・縫
合糸・薬効調整剤・免疫強化剤として、農業分野では作
物の病害防除・収量向上のために、日用品分野では健康
食品・食品添加剤・化粧品・整髪料・抗菌衣料・生分解
性プラスチックなどに、工業分野ではバイオリアクター
・中高分子の分離精製技術などの幅広い分野に利用され
る。従って、キチン・キトサン様物質であるＢＦ０４も
これらの分野に多角的に利用展開することができる。本
発明では主に凝集剤としての側面を取り上げて説明して
きた。しかし、凝集剤に限定されるものではなく、キチ
ン・キトサンが利用できる全分野に利用できることは当
然である。

【００９０】本発明者等は、ＴＫＦ０４株の培養条件を
種々に変更しながら、産生されるキチン・キトサン様物
質の分子量分布を測定したが、平均分子量や分布幅がか
なり変動することを見出した。キチン・キトサンの有す
る凝集活性などの性質はその分子量に依存する面があ
り、従って培養条件の変更によって性質の異なるキチン
・キトサン様物質を自在に製造することが可能となっ
た。

【００９１】本発明では、キチン・キトサン様物質を産
生するバクテリアとしてＴＫＦ０４株に注目し、このＴ
ＫＦ０４株の培養条件を各方面から検討して、本発明を
なすに到った。しかし、本発明の方法は、キチン・キト
サン様物質を産生するバクテリアであれば、基本的に適
用できるものであり、他のこの種バクテリアを用いたキ
チン・キトサン様物質の製造方法も本発明に包含される
ものである。

【００９２】本発明は上記実施例に限定されるものでは
なく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲における種
々の変形例、設計変更などをその技術的範囲内に包含す
るものである。

【００９３】

【発明の効果】請求項１の発明によれば、バクテリアを
培養してキチン・キトサン様物質を培地に産生・蓄積さ
せ、この培地を精製分離してキチン・キトサン様物質を
抽出分離できるから、全く新しいキチン・キトサン様物
質の製造方法を完成したものであり、培養条件を種々変
更することによって、各種の性状を有したキチン・キト
サン様物質を自在に製造することができる。

【００９４】請求項２の発明によれば、有機酸を炭素源
とする培地でバクテリアによりキチン・キトサン様物質
を製造できるから、市販の有機酸を利用するだけでな
く、家庭や産業から排出される下廃水中の有機汚泥を嫌
気性消化して酢酸・プロピオン酸などの有機酸を作れ
ば、原料コストを極めて低くでき、しかも汚泥の減容処
理に貢献することができる。

【００９５】請求項３の発明によれば、培養液から高速
かつ大量に濃縮したキチン・キトサン様物質を回収する
ことができる。

【００９６】請求項４の発明によれば、自然環境に幅広
く生息するシトロバクター属細菌を用いてキチン・キト
サン様物質を製造することができる。

【００９７】請求項５の発明によれば、シトロバクター
属細菌の中のＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ Ｐ-１６７２
２）を用いてキチン・キトサン様物質を製造でき、この
菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
るから、簡単に株分けを行うことができ、しかも直ちに
実施できる利点がある。

【００９８】請求項６の発明によれば、培養温度を３０
℃前後、培養ｐＨを７〜１０に設定してキチン・キトサ
ン様物質を製造でき、極めて制御しやすい温度条件・ｐ
Ｈ条件であるため培養を効率よく行うことができる。

【００９９】請求項７の発明によれば、平均分子量が
０．２万〜３５０万のキチン・キトサン様物質を製造で
き、平均分子量や分子量分布の異なる各種のキチン・キ
トサン様物質を製造できる。従って分子量に依存する各
種物性を有したキチン・キトサン様物質を製造すること
ができる。

【０１００】請求項8の発明によれば、赤外吸収スペク
トルが、少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ
伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由来するア
ミド■吸収帯、アミド■吸収帯にキチン・キトサン特有
のスペクトルパターンを有するキチン・キトサン様物質
を製造することができる。

【０１０１】請求項９の発明によれば、キチン・キトサ
ン様物質の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペ
クトルがグルコサミンと同様のマススペクトルを有する
キチン・キトサン様物質を製造できる。

【０１０２】請求項１０の発明によれば、キチン・キト
サン様物質の加水分解物の¹Ｈ−ＮＭＲ分析によるスペ
クトルが、グルコサミンと同様のスペクトルを有するキ
チン・キトサン様物質を製造することができる。

【０１０３】請求項１１の発明によれば、加水分解物の
アルジトールアセチル誘導体化後のＧＣ−ＭＳ分析のマ
ススペクトルが、グルコサミンと同様のマススペクトル
を有するキチン・キトサン様物質を製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＦ０４の分子量分布曲線の内、比較的低い方
の分子量分布図である。

【図２】ＢＦ０４、キチン、キトサンのフーリエ変換赤
外分光分析によるＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルである。

【図３】ＢＦ０４加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析により得
られたマススペクトルである。

【図４】グルコサミン標準品のＬＣ−ＭＳマススペクト
ルである。

【図５】（ａ）ＢＦ０４加水分解物と（ｂ）グルコサミ
ンのアルジトールアセチル誘導体化後のＧＣ−ＭＳマス
スペクトルである。

【図６】（ａ）ＢＦ０４加水分解物と（ｂ）グルコサミ
ンの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図７】本発明に係るバクテリアによるキチン・キトサ
ン様物質の製造装置の概略構成図である。

【図８】ＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培養温度の効
果図である。

【図９】ＢＦ０４のカオリン凝集活性に関する培養温度
の効果図である。

【図１０】ＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培地の初期
ｐＨの効果図である。

【図１１】ＢＦ０４の凝集活性に関する培地の初期ｐＨ
の効果図である。

【図１２】１価のカチオン添加による凝集活性の変化図
である。

【図１３】２価のカチオン添加による凝集活性の変化図
である。

【図１４】３価のカチオン添加による凝集活性の変化図
である。

【符号の説明】

２は培養装置、４は分離精製装置、ＣＳは有機酸、ＮＳ
は栄養塩類、ＣＣはキチン・キトサン様物質、ＳＬは残
留液。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年８月２日（２０００．８．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項８

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】請求項８の発明は、前記キチン・キトサン
様物質の赤外吸収スペクトルが、少なくともＯＨ伸縮振
動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加え
て、アミド基に由来するアミドI吸収帯、アミドII吸収
帯にキチン・キトサン特有のスペクトルパターンを有す
る請求項１、２、３、４又は５記載のバクテリアによる
キチン・キトサン様物質の製造方法である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】図２はＢＦ０４のフーリエ変換赤外分光分
析によるＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルである。（ａ）はＢ
Ｆ０４、（ｂ）はキチン、（ｃ）はキトサンを示してい
る。ＢＦ０４には約３５００（ｃｍ^-1）及び１０００〜
２０００（ｃｍ^-1）に特徴的な吸収スペクトルが見られ
る。これらの吸収スペクトル成分の基本構造は、（ｂ）
及び（ｃ）から分かるように、キチン或いはキトサンに
特有のＯＨ伸縮振動（３４４０〜３４８０ｃｍ^-1）、Ｃ
Ｈ伸縮振動（２８７８〜２９６０ｃｍ^-1）、ＮＨ伸縮振
動（３２６０〜３２７０ｃｍ^-1）、アミド基に由来する
アミドI吸収帯（１６５０〜１５６０ｃｍ^-1）及びアミ
ドII吸収帯（１５５０〜１５６０ｃｍ^-1）の存在を示唆
している。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１００

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１００】請求項8の発明によれば、赤外吸収スペク
トルが、少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ
伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由来するア
ミドI吸収帯、アミドII吸収帯にキチン・キトサン特有
のスペクトルパターンを有するキチン・キトサン様物質
を製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平尾 知彦 兵庫県尼崎市金楽寺町２丁目２番33号 株 式会社タクマ内 (72)発明者 井上 智代 兵庫県尼崎市金楽寺町２丁目２番33号 株 式会社タクマ内 Ｆターム(参考） 4B064 AF21 BA10 BA11 BA12 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BH02 BH04 BH07 BJ10 CA02 CC03 CC06 CC07 CD07 CE03 CE06 CE07

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 培地でキチン・キトサン様物質を産生す
   るバクテリアを培養し、このバクテリアによりキチン・
   キトサン様物質を菌体外に産生させ、産生されたキチン
   ・キトサン様物質を培地中に蓄積し、この培地を精製分
   離してキチン・キトサン様物質を抽出することを特徴と
   するバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方
   法。
2. 【請求項２】 前記培地が有機酸を炭素源としている請
   求項１記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質
   の製造方法。
3. 【請求項３】 前記培地が培養液であり、この培養液か
   らキチン・キトサン様物質をエタノール沈殿法又は膜ろ
   過法により濃縮回収する請求項１記載のバクテリアによ
   るキチン・キトサン様物質の製造方法。
4. 【請求項４】 前記バクテリアがシトロバクター属細菌
   である請求項２記載のバクテリアによるキチン・キトサ
   ン様物質の製造方法。
5. 【請求項５】 前記シトロバクター属細菌がＴＫＦ０４
   株（ＦＥＲＭ Ｐ-１６７２２）である請求項４記載の
   バクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
6. 【請求項６】 培養温度が３０℃前後で培養ｐＨが７〜
   １０である請求項５記載のバクテリアによるキチン・キ
   トサン様物質の製造方法。
7. 【請求項７】 前記キチン・キトサン様物質のゲルろ
   過クロマトグラフィによる分子量分析の結果が０．２万
   〜３５０万に分布する請求項１、２、３、４又は５記載
   のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方
   法。
8. 【請求項８】 前記キチン・キトサン様物質の赤外吸収
   スペクトルが、少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振
   動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由
   来するアミド■吸収帯、アミド■吸収帯にキチン・キト
   サン特有のスペクトルパターンを有する請求項１、２、
   ３、４又は５記載のバクテリアによるキチン・キトサン
   様物質の製造方法。
9. 【請求項９】 前記キチン・キトサン様物質の加水分解
   物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペクトルがグルコサミ
   ンと同様のマススペクトルを有する請求項１、２、３、
   ４又は５記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物
   質の製造方法。
10. 【請求項１０】 前記キチン・キトサン様物質の加水分
    解物の¹H-ＮＭＲ分析によるスペクトルが、グルコサミ
    ンと同様のスペクトルを有する請求項１、２、３、４又
    は５記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の
    製造方法。
11. 【請求項１１】 前記キチン・キトサン様物質の加水分
    解物のＧＣ−ＭＳ分析によるマススペクトルがグルコサ
    ミンと同様のマススペクトルを有する請求項１、２、
    ３、４又は５記載のバクテリアによるキチン・キトサン
    様物質の製造方法。