JP2001526658A

JP2001526658A - 虚血の治療および／または予防を行う際の医薬組成物の使用

Info

Publication number: JP2001526658A
Application number: JP54862298A
Authority: JP
Inventors: ルマクル，ジョゼ; ミシェル，カリヌ
Original assignee: ルマクル，ジョゼ
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2001-12-18
Also published as: NO995500L; EP0981339A1; NO995500D0; AU7327298A; BE1011151A3; CA2287363A1; WO1998051291A1

Abstract

(57)【要約】本発明は虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造するための、適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーアントシアニンのエキス類、およびこれらの化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択されそして患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる医薬組成物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】虚血の治療および／または予防を行う際の医薬組成物の使用発明の目的本発明は、虚血および虚血に関連する異常の治療および／または予防を行う際の医薬組成物の治療および／または予防のための利用に関する。当該技術分野の現状と技術の背景各種の活性化合物（その大部分は植物のエキス中に存在している）が、特定の静脈瘤疾患を治療するのに用いることが提案されている。このような化合物は、特に、以下の諸文献：フランス特許願第２６９２１４５号と同第２６６８７０５号、欧州特許第０５４１８７４−Ｂ１号、国際特許願公開第ＷＯ９３／２００４６号と同第ＷＯ９３／２００４５号、欧州特許第０５６６４４５−Ｂ１号、欧州特許願第０２１０７８１−Ａ１号と同第０１１２７７０−Ａ１号に記載されている。同様に、植物エキスから単離された活性化合物は、虚血後の症状または虚血に関連する異常を治療するのに使用されている。フラボノイドの場合がそうであり、フラボノイドは、抗酸化薬として知られており、再潅流（reperfusion）中に産生されるフリーラジカルが起こす損傷を制限できる。上記のように、虚血の期間の後、再潅流を行うと、酸素由来のフリーラジカルが極めて大量に産生されることが観察されている。このフリーラジカルの産生によって、虚血の期間、特にエネルギー（ＡＴＰ）の欠乏によって弱っていた細胞の各種の要素の損傷が起こる。フリーラジカルのこのような増大した産生は、McCord J．M.が明確に立証している（N．Engl．J．Med.，312巻、159-163頁1985年）。フリーラジカル産生の増大は、キサンチンオキシダーゼが虚血の期間中に活性化されそしてこの酵素は再潅流中、活性が非常に高いために起こる。したがって、フラボノイドなどの抗酸化薬の分子は、虚血の再潅流処理に対して有益な作用を有している。というのは、抗酸化薬が、この過剰なフリーラジカルに対して組織を保護するからである（Reddy D．S.ら、Drugs of today，31巻335-349頁1995年）。しかし、多くの植物エキスは多数の複雑な巨大分子の混合物で構成されており、そして、その抗酸化特性が知られているフラボノイドタイプの構造を有するこれら巨大分子がいくつも存在しているので、固有の、すなわち再酸素化のプロセスとは独立している抗虚血活性を有するこれらエキスまたは分子の可能性が弱められている。フラボノイドの虚血に対する活性および心筋梗塞の衝撃を小さくする活性は、活性酸素誘導体を抑制するフラボノイドの活性に基づいている（Reddyら、Drug of today，31巻335-349頁1995年；ドイツ特許第３６２３２５５号、OXO Chimie GMBH，1988年）。トロキセルチンは、特に、虚血の再潅流のプロセス中、心臓を保護する抗酸化分子として使用されている（Blasug I．E.ら、Biomed．Biochim ．Acta，vol．46巻5539-5544頁1987年；ＸＰ００２０５２０７９ et Olszensk i A．J.，Atheroschlerosis，88巻97-98頁1991年）。同様に、ジオスミン（diosmin）は、キサンチンオキシダーゼによるフリーラジカルの生成（虚血が起こった後の再潅流中に起こる）を遮断するが、虚血中に保護できるという意味で使用されている（Bouskela E.ら、45巻33-37頁1997年； Int．J．Microcirc．Clin．Exp.，15巻293-300頁1995年；DebbarreB.ら、Int．J ．Microcirc．Clin．Exp.，15suppl．I:27-33頁1995年）。ルトシド類（Rutoside）も、その抗虚血活性について試験されて成功している。つまり、ルトシド類は、動脈閉塞になっている動物の衝撃の大きさを小さくし（Zalewski A.ら、Am．J．Cardiol.，56巻974-977頁1985年）、かつ下肢の虚血が見られる患者の苦痛も和らげる（Milliken J．C.，Vasa，3巻203-206頁1974年）。ナフトキノン（Nafthoquinone）は、血小板凝集を防止する活性で知られているが、血栓症中に血栓が生成するのを阻止するのにも使用できる（欧州特許願第Ａ−０６３１７７７号）。上記活性が立証されているが、これによって抗虚血活性が立証されているわけではなく、代わりに血栓症の原因の一つすなわち血小板の凝集に対する作用が立証されている。発明の目的本発明は、虚血および／または虚血に関連する異常の治療および／または予防を行う新規な方法を提供することを目的とするものである。本発明の特別の目的は、非毒性もしくは特に毒性ではなく、副作用をほとんど示さないか全く示さず、かつ合成または生物産物、特に植物からの抽出が簡単でかつ安価である治療薬を使用する方法を達成することである。発明の特徴的要素本発明は、虚血および／または虚血に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造するための、医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド（esculoside）、エスシン（aescin）、プロシアニジンのオリゴマー類（procyanidine oligomer）、ルスクス（ruscus）とヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類（ruscoside）、コモンホリー（conunon holly）とクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーのアントシアニンエキス類およびこれらの化合物から単離された活性成分および／またはその混合物からなる群から選択される活性化合物の十分な量を含んでなる医薬組成物の使用に関する。上記の諸活性化合物は、植物および／または植物のエキスから広く単離され、各種の医薬企業が各種のブランド名で市場に出している製品である。これらの各種活性化合物を、そのブランド名とそれを市場に出している会社によって区別して下記の表１に列挙する。表１：本発明の組成物の活性化合物表２には、虚血の再潅流プロセスにおいて保護する性能を有していることがすでに発表されている、本発明の組成物の活性化合物を列挙する。表２：虚血の再潅流プロセスにおいて保護する性能を有していることがすでに発表されている本発明の組成物の活性化合物これら活性化合物とそれらの薬用量およびそれらの好ましい投与形態は、以下 harmaco Therapeutic Information)、ブリッセル、1994年；およびVidal 1997年（Du Vidal編集、33Av．de Wagram、フランス、パリ）に記載されている。 “本発明の活性化合物から単離される活性成分”は、以下に記載されているような生化学的標的に対して治療および／または予防の作用を有し、および治療および／または予防の分野で、下記の活性化合物に匹敵しおよび／または下記活性化合物より優れた特性を有している可能性がある活性部分であるとする。また、本発明の活性成分と化合物は、ミトコンドリアの内膜のタンパク質複合体に対する“保護作用”を有していることを特徴とし、すなわち本発明の活性成分と化合物は、患者のミトコンドリアの呼吸調節を示すＲＣＲ（呼吸調節比）を増大できる。ＲＣＲは、以下に説明するように、内因性基質（グルタメート／マレート）の存在下での酸素の消費量と、ＡＤＰがリン酸化されてＡＴＰになった後の消費量との間の比率を示す。本発明の製品は、患者を、虚血または虚血後の症状から保護する上記作用機構を利用する。本発明の活性化合物と成分は、したがって予防および／または治療の作用を同時にもっていることを特徴としている。好ましくは、本発明の製品、以下で説明するように、ミトコンドリアの電子伝達鎖の複合体Ｉまたは複合体IIIおよび／またはアデニントランスロカーゼのタンパク質複合体に対する保護作用を有している。本発明の好ましい活性化合物は、ヘスペリジンメチルカルコン、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類およびブルベーリーアントシアニンのエキス類であり、これらの活性化合物は、虚血、および虚血とエネルギー欠乏と老化に伴う欠陥に関連する異常を治療するのに特に有利でありかつ予想外の特性を特徴としている。 “活性成分または化合物の十分な量”とは、上記疾患に関連するヒトまたは動物の身体の症状または機能不全を治療し、緩和し、消失させまたは軽減しおよび／または上記疾患にかかるのを予防しもしくはその可能性を減らすのに十分なこれら活性成分または化合物の量であるとする。したがって、上記治療処置の実行は、前記疾患の予防処置または治療処置に関する。この活性化合物の比率は非常に広い範囲にわたって変えることが可能であり、その範囲は患者の該化合物の耐容度と許容レベルによってのみ限定される。これらの限度は、特に、投与の頻度によって決まる。その投与量は、好ましくは、以下の文献に記載されているように、静脈瘤の疾患を治療するのに一般的に使用されているこれら製品の投与量である。それらの，(Medicines used for the symptomatic treatment of peripheral venous ail )(Annexto the Folia pharmacotherapeutica，Belgian Ministry of Public Hea lth and the Environment，Transparency Commission(1994年6月))”である。実施例によって、製品エスシン［ブランド名Reparil（登録商標）で販売されている］は、医薬組成物１００ｇ中、活性化合物投与量２０ｍｇを含有する糖衣錠剤の形態で提供される。利用される医薬添加物は、選択される投与法（静脈内、筋肉内、経口など）によって変化し、コートまたは非コートの錠剤、ピル、カプセル、溶液、シロップなどの異なった形態でもよい。本発明の医薬組成物は、生薬薬剤師および薬剤師が一般に利用し、かつ毒性でないかまたは特に毒性ではないあらゆるタイプの固体、液体および／または気体の（水を含む）医薬添加物を含めることができる方法を用いて製造される。また、本発明の組成物は、上記疾患に対する治療および／または予防の作用または本発明の医薬組成物中に存在する活性化合物に関連する副作用を軽減する可能性がある特性が、当業技術者に知られているアジュバントまたは他の医薬化合物を含有していてもよい。さらに、本発明の化合物の、特に保護すべき標的組織中への可能な吸収と移動の結果としての生体内での利用可能な量は、当業技術者によく知られている包装とコーティングおよび／または薬物ターゲッティングの技術によって改善することができる。 “（部分的のまたは全体的の）虚血または虚血に関連する異常”は、心筋梗塞、脳虚血、慢性静脈不全、アテリオパシー類（atheriopathy）すなわち患者の動脈を冒すアテローム性動脈硬化症が原因の病変、血管けん縮に関連し、動脈が収縮するに至るレイノー現象、潰瘍、毛細血管の透過性の変化、毛細血管の脆弱性、創傷の治癒、皮膚の変化、虚血が原因の網膜の欠陥、虚血が原因の聴覚明瞭度の低下、高地ですごした時間に関連する疾患、短期間の冠状動脈閉塞によって発生する狭心症、肺高血圧症、肝臓虚血、パーキンソン病、筋疾患および糖尿病などの血管の問題に関連する症候群であるとする。そしてこれらの異常では高血圧と血液流の変化が下肢に出現する。これらの虚血に関連する疾患と異常は臨床家や医師にはよく知られており、そしてこれら専門家は、上記疾患に関連するヒトまたは動物の身体の症状と機能不全を治療および／または予防し、および／またはこれらの疾患に冒される可能性を予防しまたは減らすために、本発明の医薬組成物の使用を調節できる。本発明の他の側面は、各種の細胞によるエネルギーの産生が、老化に関連して減少している場合の、本発明の医薬組成物の使用に関する。このことは、高齢患者の知的欠陥、めまい症候群および代謝調節の変化が原因の遠近視覚調節の低下の症例にもあてはまる。本発明の最後の側面は、移植の分野での本発明の医薬組成物の使用に関する。前記医薬組成物は、患者に直接、使用するかまたは患者の半ビボ(ex-vivo)治療に使用できる。そしてこの場合、患者自身または他のヒトもしくは動物の患者由来の臓器、組織および生理学的液体、例えば血液または血清を、これらの本発明の前記医薬組成物を直接、添加することによって処置した後、患者に投与する。この用途は、特に心臓移植の分野に関する。また、本発明は、虚血および／または虚血とエネルギー欠乏に関連する異常および老化に関連する不全、例えば高齢患者の知的欠陥、めまい症候群または患者の代謝調節の変化が原因の遠近視覚調節の低下を治療および／または予防する方法であって；本発明の医薬組成物を前記患者に投与して、上記疾患に関連するヒトまたは動物の身体の症状または機能不全を治療し、緩和し、消失させまたは軽減し、および／またはこれらの疾患に冒される可能性を予防または減らす方法に関する。この投与は、当業技術者にとって周知の方法、特に静脈瘤の疾患を治療するのに使用されている方法を用いて実施される。これらの予防および／または治療の作用を、特に、下記の実施例にて、図面を参照しながら説明する。なおこれら実施例は本発明の主題を例示するために提供するものであり本発明を限定するものではない。図面の簡単な説明図１は、内皮細胞が低酸素状態によって活性化されるカスケードおよびその結果起こる好中球の付着と活性化を図式的に示す。図２は、内皮細胞が低酸素状態によって活性化されるカスケードおよびその後の血管壁を図式的に示す。図３は、異なる活性化合物が添加されたときのミトコンドリアの呼吸活性の測定法を示す。図４は、ミトコンドリア内膜の電子伝達鎖を図式的に示す。実施例内皮細胞（ＥＣ）は、血液−組織の界面に位置しているので、血管の恒常性の維持に関与している。したがって、一連の機能全体を果たし、循環している白血球および中膜の平滑筋細胞（ＳＭＣ）と常に、相互に作用している。したがって内皮細胞の代謝が妨害されると基礎組織の機能が変化する。内皮細胞は、血液−組織の界面に位置しているので、血液流の変化、特にうっ血中に血液流が減少する変化を最初に受けて、組織への酸素と栄養の供給が低下する（Hinshawらの1988年の報告；Tsaoらの1990年の報告）。特に、かようなうっ血が原因の低酸素状態はＥＣに対して著しい活性化効果を有しており、その結果、ＥＣは炎症媒体を放出し、この媒体は好中球を活性化して、成長因子とともに、ＳＭＣに浸透させることができる。これら事象のカスケードは、最終的に、静脈壁の構造と機能を変化させる。内皮の機能に対する低酸素状態の影響酸素の供給が減少したときのＥＣの代謝の変化を研究するため、ヒトの膀静脈から単離したＥＣを、低酸素状態下、生体外でインキュベートした。これらの実験条件下で、ＥＣはインキュベーションの最初の２時間中、全く死ななかった。しかし、ＥＣの代謝にかなりの変化が見られる。すなわちＥＣは、トロンビンまたはヒスタミンによって開始される活性化と類似の方式で、低酸素状態によって強く活性化される。この活性化の最初の徴候は、サイトゾル中のカルシウム濃度の増加である（Ar nouldらの1992年の報告）。この増加はＡＴＰ濃度の低下と関連している。カルシウムは、すべての細胞の重要な第二のメッセンジャーである。ＥＣ内で、カルシウムは、特にホスホリパーゼＡ₂を活性化することができる。そしてこのホスホリパーゼＡ₂は炎症媒体の合成を行う代謝経路の最初の酵素である。この活性化によってプロスタグランジン類の合成が増加する（Michielsらの1993年の報告）。またカルシウムは、非常に強力な炎症媒体である血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成も誘発する（Arnouldらの1993年の報告）。したがって、低酸素状態はＥＣを著しく活性化させ、その結果、ＥＣはプルスタグランジン類を放出しそして大量のＰＡＦを合成する。この活性化の経路は図１に要約してある。この炎症媒体の合成は、ＥＣが接触している異なる細胞型の機能を調整することによって、血管の恒常性に対して重要な影響を与える。これらの影響がどんなものであるか、より詳細に視覚化するため、一つの特別のタイプの白血球、すなわち多形核中性白血球（ＰＭＮ）の付着について試験を行う。ＥＣは生体外で低酸素状態にされると、そのＰＭＮに対する接着性が強く増大する。この付着は、一部、低酸素状態で活性化されたＥＣによるＰＡＦの合成が原因になっている（Arnouldらの1993年の報告）。ＰＭＮが低酸素状態のＥＣに付着するようになるだけでなく、この付着はＥＣの活性化に関与している（ Arnouldらの1994年の報告）（図１）。また、ＥＣはＳＭＣの機能を調整する血管作動性分子を合成することも知られている。実験は、酸素の欠乏によって活性化されたＥＣがＳＭＣに対し有糸分裂誘発性の各種の因子（プロスタグランジンＦ_2aおよび塩基性繊維芽細胞増殖因子）を放出し、その結果、該細胞の増殖が誘発されることを示唆している（Michie lsらの1994年の報告）。静脈の疾患の推定原因ＥＣが生体外で低酸素状態に暴露される実験モデルを用いた場合に述べた実験結果からみて、上記異常の原因は、この低酸素状態によって開始され、結局、血管系に見られる構造および機能の変化がもたらされる事象のカスケードに基づいている。図２は、この仮説を示している。静脈のうっ血は血液の循環を妨害するので、酸素の供給の減少、したがって低酸素状態を引き起こす。この低酸素状態は、ＥＣを活性化することができ、そのＥＣは静脈壁の第一層を生成する。次に、これらの細胞は、各種の炎症分子および有糸分裂誘発性分子を放出する。その炎症分子は、特定の白血球の付着を誘発できる。このことは、静脈が謄静脈（Arnould らの1995年の報告）または伏在静脈であるにかかわらず、培養中のＥＣの場合のみらず完全なヒト静脈の内皮の場合にも当てはまる。さらに、接着の過程で、好中球が活性化されて、プロテアーゼ類とフリーラジカルを放出できる。これらの分子は、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分を含む多数の生体分子を分解する能力をもっていることがわかっている。一方、低酸素状態で活性化されたＥＣはＳＭＣに対し有糸分裂誘発性であり、かつＳＭＣの増殖を誘発する因子を合成する。さらに、この増殖するＳＭＣは、正常な静脈の壁中に通常存在している収縮性表現型とは異なり、合成性表現型を有していることが知られている。ＳＭＣが合成性の場合、ＳＭＣは、細胞外マトリックスのより多くの成分を合成して、収縮性フィラメントを発現する性能を失う。細胞外マトリックスの成分の増殖および合成の増大によって、静脈壁は厚くなるが、アクチンフィラメントの損失が、静脈の全収縮性の損失を説明している。低酸素状態に暴露されたＥＣのモデルから得た実験結果に基づいて、上記異常の原因に関する新規な仮説を提案する。それは、白血球およびＳＭＣを参加させて、静脈のうっ血によるＥＣの活性化で開始され、そして結局、構造および機能の変化が観察されるようになる細胞の相互作用のカスケードである。活性化合物の作用の生化学的機構本発明の化合物を使用すると、例えば、低酸素状態で誘発されるホスホリパーゼＡ₂の活性化とＰＭＮの付着の際に、ＡＴＰ含量の減少を阻止するようになることが分かっている。また、本発明の化合物は、完全なヒト膀静脈の内皮を低酸素条件下でインキュベートするとき、ＰＭＮが該内皮に付着するのを阻止できる。これらの試験結果は、これらの化合物が、低酸素状態にさらされている内皮に対して著しい保護作用を有していることを、明確に示している。低酸素状態で誘発されるＥＣの活性化カスケードを阻害するこれら薬剤の性能は、ＡＴＰ含量の低下に対するそれら薬剤の阻害作用が原因である。この減少は、ＥＣの活性化を開始する事象である。というのはＡＴＰは、カルシウムイオンの細胞への入り口に直接、結合するからである。これらの化合物が、なぜ、低酸素状態下でＥＣ中のＡＴＰの含量を維持できるかを説明するために二つの仮説が考えられる。すなわち、これら化合物が、解糖作用を活性化するかまたはミトコンドリアの呼吸活性を保護するという仮説である。本発明の発明者らは、これらの化合物が、低酸素状態にさらされているＥＣ内の解糖作用を活性化せず、むしろ低酸素状態によって直接誘発される解糖作用の活性化を阻害することを発見したのである。これらの結果は、これらの化合物が、低酸素状態下で長期間、呼吸活性を維持することによってミトコンドリアに作用できることを示唆している。この仮説は、経口で処置したラット由来の肝臓のミトコンドリアの呼吸調節（ＲＣＲ）で表して、呼吸活性を測定することによって確認する（図３）。正常条件下の脳のミトコンドリアに対するビロバライド（bilobalide）の作用本発明の活性化合物（ビロバライド）を、異なる濃度で、ラットの脳から単離したミトコンドリアのＲＣＲについて試験した。５種の濃度：４，６，８，１０および１２ｍｇ／治療された患者（ラット）の体重１ｋｇを採用した。これらラットに、ビロバライドのこれら投与量を、１４日間、経口で投与した。そのミトコンドリアを、Nowickiらが述べた方法（J．Cerebral Blood Flow and Metaboli sm，2巻33-40頁1982年）を用いて分離した。そのミトコンドリアの呼吸を、記録装置に接続したClarkの酸素電極で測定する。そのＲＣＲは呼吸の調節を示す。ＲＣＲは、内因性気質（グルタメート／マレエート）の存在下での酸素消費量と、ＡＤＰがリン酸化されてＡＴＰになった後の酸素消費量の間の比率を示す。この方法はChanceとWilliamsが開発した（Nature，175巻1120-1121頁1955年）。投与量依存性の効果が得られ、８および１０ｍｇ／ｋｇの濃度の場合、対照のＲＣＲが３．７から４．６まで増加する。２４％という最大の増加が１０ｍｇ／ｋｇで得られる。これらの結果は、この製品がミトコンドリアの呼吸に対する保護作用を有していることを明確に示している。虚血状態における脳ミトコンドリアに対するビロバライドの作用対照のラット、および本発明の活性化合物（ビロバライド）で１４日間処置したラットに１５分間の虚血を行った。虚血は断頭で実施する。これらのラットはビロバライドの投与量１０ｍｇ／ｋｇで１４日間経口投与することによって処置した。１５分間の虚血の場合、グルタメート／マレートの存在下でＲＣＲを測定すると、対照の場合、ＲＣＲ３．０が観察され、一方、処置されたラットの場合ＲＣＲ３．９が観察される。したがって、この活性化合物は虚血によって誘発される呼吸活性の低下に対して保護作用を有している。この保護は、複合体Ｉおよびミトコンドリアの伝達鎖の活性によって明示される。グルタメート／マレートの存在下で測定される呼吸調節のレベルは、電子伝達鎖の複合体Ｉの活性を間接的に反映している。ミトコンドリアの複合体Ｉについて行う測定は、まず、検定基質が複合体Ｉに近づけるようにミトコンドリア全部を超音波で処理して実施する。次に５５０ｎｍで、フェリシトクロムＣの還元を追跡することによって複合体Ｉを検定する。 MgCl₂、１０μｍのシトクロムＣおよび１ｍｌ当り２．５ｍｇのウシアルブミンを含有する２５ｎＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中のミトコンドリア懸濁液を０℃で３０秒間、超音波処理する。２ｍＭのＫＣＷを添加し、次に、７．５ｍＭのＮＡＤＨを添加することによって反応を開始させる。そのミトコンドリアを３７℃でインキュベートし、フェリシアニドが還元されるのを５５０ｎｍで追跡する。複合体Iを阻害するロテノンの存在下、シトクロムＣの還元に対して修正を行う。試験結果は、１分間当り還元されたフエリシトクロムＣのμmolで表す。１ｋｇ体重当り１０ｍｇのビロバライドを１４日間経口投与して処置し次いで１５分間脳を虚血させた後のラットのミトコンドリアの複合体Iの活性を測定した。対照のラットの場合、タンパク質１ｍｇ当り３６ｍＵの活性が得られるが、一方、処置されたラット由来のミトコンドリアはタンパク質１ｍｇ当り４４ｍＵの活性を有している。したがって、ミトコンドリアの複合体Ｉの活性は、有意に保護されていることが分かる。また、複合体Ｉの類似の保護が、虚血期間がなかったラットの脳から分離されたミトコンドリアの場合にも観察される。肝臓のミトコンドリアに対するビロバライドの作用本発明の活性化合物（ビロバライド）を、患者（ラット）の体重１ｋｇ当たり８ｍｇの濃度で１４日間、ラットに経口投与した。これらのラットの肝臓のミトコンドリアをRemacleが述べた方法(J．Cell．Biol.，79巻291頁1978年)を用いて分離した。処置したラットのミトコンドリアの呼吸活性は、対象のラットの場合のＲＣＲ７．６に比べて、ＲＣＲ１３．２５を示した。０．１３７ＭのNaCl、５．４ｍＭのKCl、０．８ｍＭのMgSO₄、１１ｍＭのグルコース、０．３４ｍＭのNa₂ HPO₃、２４．４ｍＭのNaHCO₃、６．３５ｍＭのKH₂PO₄および１１当り８ｍｇのビロバライドを含有する媒体内で潅流することによって、該肝臓に対して虚血を１０分間実施した。その媒体は、まず、９５％のＮ₂と５％のＣＯ₂を含有する雰囲気下、全体の脱ガスを行う。そのミトコンドリアを分離し、その呼吸活性を測定する。対照の場合、ラットは１４日間水を与えられ、そしてその肝臓を、試験用と同じ溶液で潅流した。処置されたラットのミトコンドリアの場合、５．２４のＲＣＲが観察され、対照のラットの場合は３．７３であった。これらの試験結果は、本発明の活性化合物（ビロバライド）が、生体外（低酸素状態にさらされるＥＣ）および生体内（処置されたラットの肝臓および脳の虚血）の両者で示される抗虚血活性を有し、そしてその活性は、少なくとも一部が、ミトコンドリアが保護されていることによるものであり、その結果、ミトコンドリアの呼吸活性が増して、ミトコンドリアがＡＴＰを合成することを立証している。本発明の活性化合物は各々、ビロバライドと同様に、ミトコンドリアをこれらの薬剤の存在下、１時間、プレインキュベートすると、未処置のラットの肝臓から分離したミトコンドリアのＲＣＲを増大させる。したがって、これらの活性化合物は、ミトコンドリアに直接、作用できる。これらの実験結果に基づいて、これら薬剤を以下の２種のクラスに分離できることは非常に興味深いことである。すなわち呼吸の段階３を増大することによってＲＣＲを増大するシナガワハギのエキス、ルスクスのエキス、プロシアニジンのオリゴマー類およびヒドロキシエチルルトシド類（クラスII）ならびに呼吸の段階４を減少させることによってＲＣＲを増大するクラスＩの薬剤を構成するビロバライド、エスシン、ナフトキノンおよびジオスミンである（表３参照）。表３：ミトコンドリアの保護に対する薬剤の作用したがって、異なる作用部位が関与して、低酸素状態中、ミトコンドリアの呼吸活性が増大しＡＴＰの含量が低下する。ＡＴＰの酸化的リン酸化のプロセスは、プロトン勾配を生成する異なる酸素複合体または電子伝達体（複合体Ｉ，iiiおよびIV）、ＡＴＰの合成に直接関与しているＡＴＰシンターゼ類（複合体Ｖ）、ならびにＡＤＰを取り込みＡＴＰを放出するのに必要な伝達体であるアデニントランスロカーゼを含む複雑なプロセスである（図４）。これら薬剤の酵素標的が何であるかを立証するため、各複合体を、特定のインヒビターで阻害して、ＲＣＲを測定しながら試験を行い、これらの製剤がこの阻害を軽減できるかどうかを確認した。試験結果は、これらの薬剤のどれも複合体IVとＶに対して作用しなかったことを示している。一方、段階４を減らすことによってＲＣＲを増大させるクラスＩの薬剤は、複合体IIIを強く保護しそして複合体Ｉを保護する程度は低い（表４参照）。表４：ミトコンドリアの複合体ＩとIIIに対するクラスＩの薬剤の保護作用０．５mMのアミタール（Amytal）０．７５μMのアンチマイシンＡミトコンドリアの複合体Ｉは、０．５ｍＭアミタールの存在によって、５８％阻害された。これらの条件下で、諸分子が指定の濃度で存在すると（６０分間のインキュベーション）、阻害を保護の比率で表した場合、保護が０％とみなされる薬剤なしのミトコンドリアと比べて、阻害が著しく小さい。さらに、アデニントランスロカーゼの活性を直接測定することによって、この伝達体の活性が、段階３の呼吸を増大するクラスIIの薬剤によって増大することが立証された（表５参照）。表５：ミトコンドリアのアデニントランスロカーゼに対するクラスII の薬剤の作用ミトコンドリアのアデニントランスロカーゼに対する薬剤の作用を、（Ｃ¹⁴）ＡＤＰが４５秒間にわたってミトコンドリア中に移動する量を測定することによって確認した。さらに、シクロ３（cyclo ３）の、ミトコンドリアのＲＣＲに対する保護作用はミトコンドリアのＲＣＲの増大に関連しているが、このミトコンドリアＲＣＲの増大は、ミトコンドリアの脱共役に対するシクロ３の保護作用に基づいたものであることは確かである。したがって、シクロ３の存在下で、ミトコンドリアに、０．５と１μＭｍＣＣＰでの脱共役に対して優れた抵抗性が見られ、その保護作用が２０％のオーダであることが分かる。本発明の化合物の他の興味深い特性は、異なる標的に作用する異なる分子、例えば複合体ＩとIIIに作用する分子（この作用はミトコンドリアの呼吸の段階４での減少の際に発現する）と、アデニントランスロカーゼに作用する一種以上の分子（この作用はミトコンドリアの呼吸の段階３での増大の際に発現する）とを組み合わせることによって相乗効果を達成できることである。このようにして得られる二重の保護は、これら化合物各々が可能な最大の保護を超えるので、有利でかつ予想外の結果が得られる。本発明の活性化合物の二種の酵素標的を同定した。これら二種の標的に対して該活性化合物が作用すると、ミトコンドリアによるＡＴＰの産生が増大し、その産生の虚血状態下での減少が防止される。したがって、これらの活性化合物は、細胞をエネルギー欠乏の状態から保護する。このエネルギー欠乏は、ＥＣの場合、ＥＣを活性化し、白血球の補強、付着および活性化をうながしそしてＳＭＣを増殖させる（図２）。これらの分子はすべて、例えば虚血の期間、または年齢もしくは老化に関連する異常のためにこれらのミトコンドリアの活性が減少する期間などの生理的に正常でない状態下でも、ミトコンドリアによるＡＴＰの高レベルの産生を維持する特性をもっているので、これら各種の異常に利用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造するための、適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーアントシアニンのエキス類、およびこれらの化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択されそして患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる医薬組成物の使用。 2. 虚血に関連する異常が、心筋梗塞、脳虚血、慢性静脈不全、アテリオパシ一類すなわち患者の動脈を冒すアテローム性動脈硬化症が原因の病変、血管けん縮に関連し動脈が収縮するに至るレイノー現象、虚血が原因の網膜の欠陥、虚血が原因の聴覚明瞭度の低下、高地ですごした期間に関連する疾患、潰瘍、毛細血管の透過性の変化、毛細血管の脆弱性、創傷の治癒、皮膚の変化、短期間の冠状動脈閉塞によって発生する狭心症、肺高血圧症、肝臓虚血、パーキンソン病、糖尿病および／または心臓移植からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲１に記載の使用。 3. 患者、好ましくはヒトの患者を半ビボで治療する方法であって；適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーアントシアニンのエキス類、およびこれらの化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択され、かつ患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる医薬組成物を、前記患者または他のヒトもしくは動物の患者由来の臓器、組織および／または生理学的液体に、それらを患者に移植する前に添加することによって、それらを処置する方法。 4. 患者、好ましくはヒトの患者の虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防する方法であって；適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーのアントシアニンエキス類およびこれらの化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択されそして患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる、虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造するための医薬組成物を前記患者に投与することを特徴とする方法。 5. 虚血に関連する異常が、心筋梗塞、脳虚血、慢性静脈不全、アテリオパシー類すなわち患者の動脈を冒すアテローム性動脈硬化症が原因の病変、血管けん縮に関連し動脈が収縮するに至るレイノー現象、虚血が原因の網膜の欠陥、虚血が原因の聴覚明瞭度の低下、高地ですごした期間に関連する疾患、潰瘍、毛細血管の透過性の変化、毛細血管の脆弱性、創傷の治癒、皮膚の変化、短期間の冠状動脈閉塞によって発生する狭心症、肺高血圧症、肝臓虚血、パーキンソン病、糖尿病および／または心臓移植からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。 6. 虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造しかつ高齢患者の知的欠陥などの老化に関連する不全、めまい症候群、または代謝調節の変化が原因の遠近視覚調整の低下を治療および／または予防するのを目的とする薬剤を製造するための、適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーアントシアニンのエキス類、およびこれらの化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択されそして患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる医薬組成物の使用。 7. 高齢者患者の知的欠陥などの患者特にヒトの患者の老化に関連する不全、めまい症候群、または代謝調節の変化が原因の遠近視覚調節の低下を治療および／または予防する方法であって；適切な医薬品添加物、ならびにシトロフラボノイド類、ニンニク−ルトシド、トロキセルチン、クマリン、ジオスミン、ｏ−（ヒドロキシエチル）ルトシド類、シナガワハギとルトシドのエキス類、トリベノシド、ヘスペリジンメチルカルコン、セイヨウトチノキのエキス、ナフタゾン、エスクロシド、エスシン、プロシアニジンのオリゴマー類、ルスクスとヘスペリジンメチルカルコンのエキス類、ルスコシド類、コモンホリーとクロフサスグリのエキス類およびブルーベリーアントシアニンのエキス類およびこれら化合物の活性成分および／またはその混合物からなる群から選択されそして患者のミトコンドリア内膜のタンパク質複合体に作用する活性化合物を含んでなる、虚血および／または虚血もしくはエネルギー欠乏に関連する異常を治療および／または予防することを目的とする薬剤を製造するための医薬組成物を前記患者に投与することを特徴とする方法。