KR101150189B1 - 삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품 - Google Patents

삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼칠(삼칠근, 삼칠화) 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 삼칠의 추출물을 사용함으로써 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌부종 및 뇌경색의 크기가 유의하게 억제되며, 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 발병과 밀접한 관계가 있는 대식세포와 뇌신경교세포의 활성화와 이로 인한 염증물질 생성이 유의하게 억제되어 항염증효과와 더불어 뇌신경세포의 사멸이 억제되어 뇌신경세포가 보호되기 때문에 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료할 수 있게 된다.
뇌졸중, 약제학적 조성물, 삼칠(삼칠근, 삼칠화), 염증억제제, 뇌신경보호제, 퇴행성 뇌질환, 치매, 파킨슨씨병

Description

삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품{Concentrated extract from Panax notoginseng, and healthy functional food and pharmaceutical composition for prevention and treatment of stroke and neurodegenerative diseases including dementia}
본 발명은 삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에 관한 것이다.
2005년 통계 기준으로, 우리나라에서 60세 이상의 남녀 모두 사망원인 1위를 차지하는 뇌졸중(stroke)은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관이 막히거나 터짐으로써 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상을 일컫는 뇌혈관질환으로 단일 질환이라기보다는 다양한 원인에 의해서 발생하며 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈 등 다양한 질환이 포함되어 있다. 이와 같은 뇌졸중은 발병원인이 다양하며 세포생물학적으로 혈액공급의 저하, 신경세포의 손상, 뇌염증세포인 대식세포(macrophage)와 뇌신경교세포(microglia)로부터 분비되는 염증물질, 이로 인한 신경세포사멸이 중요하며 특히 신경교세포의 활성조절과 신경세포보호는 뇌졸중의 예방, 조절 및 치료법 개발의 핵심표적이다.
국내ㆍ외적으로 많은 연구진들이 이러한 신경세포의 사멸에 대한 기전을 연구함으로써 뇌질환을 막고자 하는 노력을 기울여 왔으나, 뇌졸중의 경우 현재 뚜렷한 치료제가 개발되어 있지 못하며, 지금까지 많은 연구진들이 흥분성 신경전달물질인 글루타민산 수용체에 대한 길항제(MK-801)나 항산화제(Edaravone)를 허혈성 뇌졸중 치료제로 개발하고자 하였으나 약효가 미미하거나 약물의 독성으로 인하여 현재 사용되지 못하고 있다. 임상적으로는 뇌혈관에 생성된 혈전을 용해하기 위하여 사용되고 있는 tPA(tissue plasminogen activator)가 유일한 약물이지만 많은 임상 의사들이 뇌출혈 등의 심각한 부작용을 우려하여 사용을 꺼리고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 삼칠의 추출물을 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로 사용할 경우, 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌부종 및 뇌경색의 크기가 유의하게 억제되며, 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 발병에 관련이 있는 대식세포와 뇌신경교세포의 활성화로 인한 염증물질 생성이 유의하게 억제되어 항염증효과와 더불어 뇌신경세포가 보호되기 때문에 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료할 수 있게 됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 부작용이 없는 천연 한약재인 삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 삼칠 추출물을 유효성분으로 하는 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품을 제공한다.
본 발명 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에서, 상기 삼칠 추출물은 삼칠근과 삼칠화를 중량기준 5:1 내지 1:5의 혼합비로 하여 추출하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 혼합비를 1:1로 하는 것이 좋다.
본 발명 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에서, 상기 삼칠 추출물은 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 5의 알코올로 추출하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 80% 메탄올로 추출하는 것이 좋다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.
상기 삼칠 추출물은 그 자체를 사용하거나 약제학적 제제로의 제형화 기준에 허용이 가능한 부형제, 예를 들어 미결정셀룰로오즈, 콜로이드성 이산화규소, 옥수수전분 및 붕해제, 예를 들어 옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분 및 활택제, 예를 들어 글리세릴베헤네이트 및 제피제, 예를 들어 오파드라이 등과 함께 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 한약재 추출물 및 제형화 된 제제는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강 등을 통한 유효 성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1 ㎏ 당 100 ㎎ 내지 200 mg을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 삼칠 추출물은 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 기능성식품 또는 식품첨가물로 제조될 수 있는데, 이때에는 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분이 포함될 수 있다. 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트 산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 의미한다. 그밖에 본 발명의 조성물에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육이 함유될 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 삼칠 추출 농축액의 제조
본 실시예에서 사용한 약재는 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
건조된 삼칠근(三七根) 1㎏과 삼칠화(三七花) 1㎏을 세말하고 80% 메탄올(6ℓ)를 가하여 상온에서 24시간 추출한 후 2겹 거어즈와 와트만 여과지(Whatman No. 3)로 여과한 다음 40℃에서 감압?농축하였다. 상기의 추출과정을 3회 반복 실시하였고, 이때 얻은 추출물의 수율은 21.02%였다.
본 발명의 삼칠 추출 농축액은 멸균된 생리식염수에 녹여 뇌졸중 동물과 대식세포 및 뇌신경교세포에 실험에 사용하였다.
실험예 1. 실험동물을 이용한 삼칠 추출물의 뇌졸중 예방 및 치료 효과 확인
실제로 살아있는 실험동물에 대한 삼칠 추출물의 뇌졸중의 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
가. 실험동물의 구입과 사육
실험동물은 중앙실험동물(주)로부터 구입한 웅성 스프러그 돌리(Sprage - Dawley) 계의 흰쥐(8주령, 250~300g)를 구입하여 일주일 정도 실험실 환경(온도는 22±3℃, 습도는 50±10%)에 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 각 케이지 당 3~4마리씩 넣어 두었으며, 물과 사료(고형사료: 실험동물 래트용, 중앙실험동물(주))를 자유롭게 섭식하도록 하였다.
나. 뇌졸중 동물모델 제작
상기의 흰쥐를 24시간 절식시킨 후 질소와 산소가 7:3으로 혼합된 가스에 2.5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취 하여 온목동맥과 바깥목동맥을 결찰하고, 속목동맥의 분지점으로부터 17mm의 탐침을 삽입하여 중간대외동맥의 바닥부위를 폐쇄하여 허혈을 유발시켰다. 일정시간 동안 중간대외동맥을 폐쇄한 후 속목동맥에 삽입한 탐침을 제거하여 재관류를 수행하였다.
다. 삼칠 추출물의 투여
실시예 1에서 준비한 생리식염수에 녹인 삼칠 추출 농축액을 50mg/kg의 농도로 뇌졸중 쥐에 뇌허혈 유발 30분 후 단회 복강투여 하였다. 또한 실험대조군(vehicle)의 경우 생리식염수를 동일조건으로 투여하였다.
라. 뇌부종 및 뇌경색의 측정
뇌허혈에 의해 유발되는 뇌조직 손상을 관찰하기 위해 TTC(triphenyl - tetrazolium chloride) 염색을 수행하여 뇌경색의 용적을 화상처리 소프트웨어(image processing software package)를 이용하여 측정하였다. 또한 허혈이 유발된 대뇌반구의 부종(% of edema)을 계산하였다.
부종율(%) = ( A - B ) / B × 100
A : 각 뇌조직 관상박편(coronal slice)에서 허혈이 유발된 대뇌반구(hemisphere)의 용적(mm3)
B : 각 뇌조직 관상박편(coronal slice)에서 허혈이 유발되지 않은 정상 대뇌반구의 용적(mm3)
이의 결과, 도 1에서와 같이, 생리식염수를 투여한 대조군에서는 뇌부종이 현저히 증가(41.7±5.37%, n=10)되었으며, 삼칠 추출 농축액을 투여한 군에서는 뇌부종의 크기가 유의적으로 감소(23.82±8.9%, n=10, p<0.001)된 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌졸중으로 인한 뇌부종 및 뇌경색을 억제함으로써 뇌졸중을 예방 및 치료하는 효과가 뛰어나다는 것을 의미한다.
마. 뇌신경교세포(microglia)의 활성화 검사
뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 발병과 진전에 핵심적인 역할을 하는 뇌신경교세포의 활성화에 대한 삼칠 추출물의 억제 조절작용을 조사하기 위하여 각 뇌졸중 흰쥐의 뇌를 적출하여 조직표본을 제작한 후 뇌신경교세포의 특정마커(specific marker)로 면역조직화학염색을 수행하였다. 상기 특정마커로는 이소렉틴 B4(isolectin B4), iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), NF-κB를 사용하였는데, 이소렉틴 B4는 뇌신경교세포 활성화 지표이고, iNOS와 COX-2는 활성화된 뇌신경교세포로부터 생성 및 분비되어 뇌의 염증반응을 유발하는 핵심 염증물질인 일산화질소(nitric oxide; NO)와 PGE2(prostaglandin E2)를 각각 합성하는 효소이며, NF-κB는 뇌신경교세포 활성화에 따른 염증반응을 조절하는 신호전달경로의 역할을 수행하기 때문에, 이들 단백질을 뇌신경교세포의 활성화 지표로써 사용하였다.
대조군과 각 실험군을 허혈 유발 후 진통진정제인 클로랄하이드레이트(chloral hydrate)를 복강 내 주사하여 전신 마취시킨 다음 흉곽을 열고 좌심실을 통해 방혈시킴과 동시에 주입기를 이용하여 생리식염수로 분당 10㎖ 속도로 관류하여 세척하였다. 이어서 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액으로 전신을 관류시켜 고정한 후 고정된 뇌 조직을 적출하여 30% 자당(sucrose) 용액에 침전시킨 다음 파라핀 블록을 제작하여 연속절편(3㎛)을 작성하였다. 뇌신경교세포의 활성화와 형태를 관찰하기 위하여 이소렉틴 B4, iNOS, COX-2, NF-κB에 대한 면역 조직화학염색을 시행한 다음 통상적인 탈수 및 투명과정을 거쳐 퍼마운트(permount)로 봉입하였다.
도 2의 이소렉틴 B4에 대한 면역조직화학염색 실험 결과, 삼칠 추출물을 투여한 흰쥐의 뇌조직에서는 뇌신경교세포의 숫자가 대조군에 비해 낮게 측정되었으며, 형태적으로도 활성화된 형태인 아메바 형태를 나타내지 않은 것으로 확인되었다.
도 3의 iNOS에 대한 면역조직화학염색 실험 결과, 대조군에 비해 삼칠 추출물의 처리군에서 iNOS의 발현이 유의적으로 억제된 것을 확인하였다.
도 4의 COX-2에 대한 면역조직화학염색 실험 결과, 대조군에 비해 삼칠 추출물의 처리군에서 COX-2의 발현이 유의적으로 억제된 것을 확인하였다.
도 5의 NF-κB에 대한 면역조직화학염색 실험 결과, 대조군에 비해 삼칠 추출물의 처리군에서 NF-κB의 발현이 유의적으로 억제된 것을 확인하였다.
상기 결과들은 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌염증을 유발하는 뇌신경교세포의 활성을 조절하여 염증물질합성효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시킴으로써 염증물질인 NO, PGE2의 생성과 분비를 차단하기 때문에 매우 효과적으로 항염증효능을 나타내고 있음을 의미하고, 염증신호전달경로인 NF-κB의 활성을 차단함으로써 뇌신경교세포의 활성화를 조절하여 뇌신경보호효과를 나타낸다는 것을 의미한다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌신경교세포의 활성을 조절함으로써 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료하는 효과가 뛰어나다는 것을 의미한다.
실험예 2. 뇌신경교세포를 이용한 삼칠 추출물의 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효과 확인
실험동물을 이용한 실험결과, 본 발명의 삼칠 추출물에 의한 뇌신경교세포 활성조절 효능이 탁월한 것으로 관찰되어, 이에 그 효능을 구체적으로 확인하고 작용기전을 밝히기 위해 인위적으로 배양된 뇌신경교세포를 이용하여 실험하였다.
가. 뇌신경교세포의 분리 및 배양
생후 1일 된 흰쥐로부터 뇌를 적출하고 shaking-off 방법을 이용하여 직접 뇌신경교세포(primary microglia)를 분리하였고, 분리한 일차 신경교세포와 ATCC(The Global Bioresources CenterTM, VA, USA)로부터 구입한 뇌신경교세포주(microglial line)인 BV2 세포를 10% 우태혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제(penicillin/ streptomycin, GibcoBRL)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37℃와 5% CO₂조건으로 배양하였다.
나. 활성질소종(일산화질소; nitric oxide; NO)의 측정
뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 발병과 진전에 핵심적인 역할을 하는 뇌신경교세포의 활성화에 대한 삼칠 추출물의 억제 조절작용을 조사하기 위하여 삼칠 추출물 처리 후 뇌신경교세포로부터 생성되는 염증유발물질인 NO의 양을 측정하였다.
뇌신경교세포로부터 생성되는 활성질소종인 NO의 양을 세포 배양액 중 존재 하는 NO2 -의 형태로 그리즈(Griess) 시약 반응방법을 이용하여 측정하였다. 먼저 각 세포(2×105 cells/㎖)를 24-웰 플레이트에서 하룻밤 배양하고 다양한 농도의 삼칠 추출물을 처리한 다음 30분간 배양하였다. 여기에 세균의 외피단백질인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 1㎍/㎖을 처리한 후 24시간 배양함으로써 세포의 활성화(activation)를 유도하였다. 각 세포로부터 생성된 NO의 양을 측정하기 위해 세포배양액을 수거한 다음, 배양액 100㎕에 그리즈 시약(0.1% NED /1% sulfanilamide in 5% H3PO4) 100㎕를 넣어 잘 섞은 후 15분간 암반응시켰다. 마이크로플레이트리더(microplate reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 배양액 내 NO의 농도(μM)는 NaNO2 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
이의 결과, 도 6의 A에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 뇌신경교세포들로부터 생성, 분비되는 NO가 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌신경교세포의 NO 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
다. 프로스타글란딘(prostaglandin E 2 ; PGE 2 )의 측정
PGE2 역시 상기 NO와 같은 염증유발물질이므로 같은 목적으로 PGE2의 양을 측정하였다.
활성화된 대식세포와 뇌신경교세포로부터 생성되는 염증매개물질인 PGE2의 양을 세포 배양액으로 부터 효소면역반응법(enzyme immunoassay)을 이용하여 측정하였다. 먼저, 각 세포(2×105 cells/㎖)를 24-웰 플레이트에서 하룻밤 배양하고 다양한 농도의 약물을 처리하여 30분간 배양한 후 자극원으로 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 16시간 배양하였다. 각 세포의 배양액을 수거한 다음, 배양액 내에 존재하는 PGE2의 양을 PGE2 효소면역계측 진단 키트(PGE2 enzyme immunometric assay kit)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액 내 존재하는 PGE2의 농도(pg/㎖)는 PGE2 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
이의 결과, 도 6의 B에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 뇌신경교세포들로부터 생성, 분비되는 PGE2가 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌신경교세포의 PGE2 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
라. 역전사효소 연쇄중합반응(reverse transcriptase-ploymerase chain reaction; RT-PCR)
상기 NO와 PGE2를 측정하는 실험을 통해 본 발명의 삼칠 추출물이 이들 염증유발물질의 생성을 억제한다는 것을 확인하였다. 이에 본 실험에서는 삼칠 추출물이 NO와 PGE2의 생성과 관련된 유전자의 발현 특히 유전자의 전사(transcription)과정에는 어떤 영향을 미치는지 알아보기로 하였다.
뇌신경교세포에서 발현되는 NO 합성효소인 iNOS와 PGE2 합성효소인 COX-2의 유전자 발현에 대한 삼칠 추출물의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 먼저, 각 세포를 3㎝ 배양기에서 하룻밤 배양한 다음, 다양한 농도의 삼칠 추출물을 첨가하여 30분 동안 배양하였다. 여기에 LPS(1㎍/㎖) 또는 PMA(50mM/㎖)/A23187(1μM)을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 5,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포를 수거한 후 트리졸(TRIzol) 시약(InvitrogenTM)을 이용하여 세포내 총 RNA를 분리하였다. 분리된 mRNA와 올리고 프라이머(oligo-(dT) primer)와 역전사효소(Improm-IITM reverse transcriptase; Promega)를 이용하여 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분 조건으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 각 세포의 mRNA로부터 합성된 cDNA 1㎍에 표적 특이적 프라이머(target-specific primers; 10 pmol) 1㎕ 및 10×buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 1U Tag 중합효소(polymerase) 등을 혼합한 후 DNA의 변성(denaturation)을 위해 94℃에서 30초, 프라이머의 결합(annealing)을 위해 55-60℃에서 30초 및 DNA의 합성(extension)을 위해 70℃에서 60초 조건에서 30 ~ 35 회 반복 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구(internal house keeping gene)로 GAPDHs를 사용하였다.
이의 결과, 도 7에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 뇌신경교세포들의 iNOS와 COX-2 유전자 발현이 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌신경교세포의 iNOS와 COX-2 유전 자의 발현을 억제함으로써 염증유발물질인 NO와 PGE2의 생성을 줄이고 따라서, 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
마. 단백질발현 측정(웨스턴 블롯; western blot)
삼칠 추출물이 NO와 PGE2의 생성과 관련된 유전자의 최종 발현에는 어떤 영향을 미치는지 그리고, 염증관련 신호전달분자인 NF-κB의 발현에는 어떠한 영향을 미치는지를 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인하였다.
NF-κB는 활성화됨으로써 세포가 살아가는데 필요한 유전자들을 유도하여 세포가 활성을 유지하며 생존할 수 있도록 하는데, 주로 염증사이토카인들의 발현을 조절하게 된다. 일반적으로 활성화된 NF-κB는 세포질에서 핵으로 이동하게 되며, 이는 세포질 내 NF-κB/I-κBα 결합구조(complex)가 NF-κB의 활성화에 의해 NF-κB의 음성 조절인자(negative regulator)인 I-κBα의 분해를 통해 분리됨으로써 이루어지게 된다.
각 세포를 30㎝ 배양기에서 하룻밤 배양한 후 다양한 농도의 삼칠 추출물을 처리하여 30분간 더 배양한 다음, LPS(1㎍/㎖) 또는 PMA(50mM/㎖)/A23187(1μM)을 처리하여 NF-κB를 위해서는 30분, iNOS와 COX-2 발현을 위해서는 12시간과 24시간 동안 각각 배양하였다. 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 각 세포를 수거한 다음 HBSS 용액으로 2회 세척하고 용해완충액(lysis buffer; 50mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% deoxycholate, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1㎍/ml aprotinin) 0.1㎖로 용해시켜 얼음 위에서 30분간 유지시켰다. 분리된 단백질을 브레드포드 측정 시 약(Bradford's assay solution)으로 정량한 다음, 20㎍의 단백질을 2×샘플완충액(sample buffer; 100mM Tris-HCl, pH 6.8, 200mM dithithreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)와 섞어 100℃에서 3분 끓인 후 10~15% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 전기영동 후 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 4℃, 30V로 16시간 동안 전이(transfer)시켰다. 단백질이 전이된 막은 10% 탈지유(skim milk)로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였으며, 표적단백질 및 β-actin에 대한 일차항체를 0.05% 트윈(Tween)이 함유된 TBS-T로 희석하여(1:500~1000) 실온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 막을 TBS-T로 3회 세척한 다음, 이차항체인 항-IgG 결합(anti-IgG conjugated) HRP 항체(1:1,000)와 1시간 동안 실온에서 반응시키고 ECL 키트(enhanced chemiluminescence kit; Amersham)를 이용하여 엑스레이 필름(x-ray film)에 감광시켰다.
이의 결과, 도 8에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 뇌신경교세포들의 iNOS와 COX-2 단백질 생성이 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 도 9에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 뇌신경교세포의 핵에서 NF-κB의 이동과 활성화가 유의적이고 농도에 의존적으로 억제되었다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 뇌신경교세포의 iNOS와 COX-2 최종 단백질 생성을 억제함으로써 염증유발물질인 NO와 PGE2의 생성을 줄이고 따라서, 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미하며, 또한 NF-κB의 활성을 통한 뇌신경교세포의 활성화 를 조절함으로써 뇌신경보호효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
실험예 3. 대식세포를 이용한 삼칠 추출물의 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효과 확인
대식세포(macrophage)는 동물체내 모든 조직에 분포하는 선천적 면역반응을 조절하는 면역세포로써, 외부로부터 침입하는 이물질이나 세균, 바이러스, 노화세포 등을 포식하고 소화하는 식균작용과 함께 다양한 염증매개물질들을 분비함으로써 초기 염증반응에서 핵심적인 역할을 한다. 또한 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 발병 시 손상 받은 뇌 조직 안으로 침투하여(infilteration) 뇌신경교세포와 더불어 염증발달을 가속화시키게 된다. 따라서 본 연구에서는 뇌 염증발달에 기여하는 대식세포 활성화에 대한 삼칠 추출물의 염증반응 조절효과를 확인하였다.
가. 대식세포 배양
쥐의 대식세포주(mouse peritoneal macrophage line)인 RAW264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였고, 10% 불활성화 우태혈청(inactivated fetal bovine serum)과 1% 항생제(penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
나. 대식세포의 NO와 PGE 2 생성과 관련된 효과
대식세포의 NO와 PGE2 생성, NO 합성효소인 iNOS와 PGE2 합성효소인 COX-2 관련 유전자 발현에 대한 삼칠 추출물의 효과를 확인하기 위하여 NO와 PGE2의 측정, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 실험을 상기 실험예 2에 기재한 방법과 동일한 방법으로 실시하였다.
이의 결과, 도 10과 11에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 대식세포의 NO와 PGE2 생성, iNOS와 COX-2 유전자의 전사 및 iNOS와 COX-2 최종 단백질의 생성 모두가 유의적이고 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 대식세포로부터 염증유발물질인 NO와 PGE2 생성에 관련된 유전자를 전사 단계부터 조절함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
다. 대식세포의 염증사이토카인 생성에 대한 효과
활성화된 대식세포로부터 염증사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 생성 및 분비에 대한 억제정도를 ELISA 방법으로 조사하고, 이들의 유전자 발현을 RT-PCR 방법으로 조사하였다.
대식세포로부터 생성되는 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 TNF-α, IL-1β의 양을 각각 듀오셋 ELISA 개발 시스템 키트(DuoSet ELISA Development System kits; R&D Systems)를 이용하여 측정하였다.
먼저, 세포에 다양한 농도의 삼칠 추출물을 30분간 전처리하고, LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 ELISA를 수행하였다. 사이토카인 측정을 위해 1×PBS(phosphate buffered saline; pH 7.2-7.4)에 720㎍/㎖의 포획용 단일클론 항체(capture monoclonal antibody; mAb)를 희석(1:250)하여 100㎕씩 96-웰 플레이트(96-well coating plate; Nunc coating plate)의 각 웰에 넣어 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이를 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 포함된 1×PBS(PBS-T)로 3번 세척한 다음 1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)이 포함된 블로킹 용액을 넣어 실온에서 1시간 반응시킴으로써 포획용 단일클론 항체가 흡착되지 않은 부분을 블로킹 하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, 세포 배양액과 각 사이토카인에 대한 표준단백질을 100㎕씩 넣은 후 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 5번 1×PBS-T로 세척한 다음 100㎍/㎖의 감지용 단일클론 항체 100㎕를 넣어 1시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 1×PBS-T로 다시 3회 세척한 후 스트렙타비딘(Strepavidin)-HRP mAb를 넣고 30분간 실온에서 암반응시켰다. 이를 다시 1×PBS-T 용액으로 3회 세척한 다음 테트라메틸벤시딘(tetramethylbensidine; TMB) 기질용액(substrate)을 넣어 15분 동안 교반기(orvital shaker) 위에서 암반응 시켰다. 반응을 종료시키기 위해 1M 인산 용액을 50㎕ 첨가한 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내 사이토카인의 농도는 표준단백질의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
RT-PCR은 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 실행하였다.
이의 결과, 도 12에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 대식세포의 염증사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 생성 및 이들의 유전자 발현이 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 활성화된 대식세포의 TNF-α와 IL-1β의 생성을 유전자의 전사 단계부터 조절함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
라. 대식세포에서 염증반응경로에 대한 효과
활성화된 대식세포로부터 염증물질의 생성과 분비를 조절하는 신호전달경로인 MAPK(mitogen activated protein kinase)의 인산화에 대한 억제정도를 확인하고, 또한 염증물질들의 전사를 조절하는 핵심인자인 NF-κB의 활성화에 대한 억제정도를 확인하기 위해 실험예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 시행하였다.
MAPK 신호전달(ERK1/2, JNK, p38 MAPK)은 세포핵에서 다양한 전사인자들을 발현시켜 세포의 증식, 분화 및 생존을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 조절하며, 특히 외부 감염에 의해 활성화되면 다양한 염증매개물질들의 생성을 유도함으로써 염증반응을 유발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이의 결과, 도 13에서와 같이, 삼칠 추출물에 의해 LPS로 활성화된 대식세포에서 MAPK 신호전달 물질인 ERK1/2, JNK 및 p38 MAPK의 인산화가 유의적이고 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였고, 또한 도 14에서와 같이, NF-κB의 활성 역시 감소되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 삼칠 추출물이 세포질 내에서 MAPK 신호전달 물질들의 인산화를 억제하여 염증반응경로를 차단하고, 염증물질들의 전사 조절인자인 NF-κB의 핵 내로의 이동을 통한 활성을 억제하여 NF-κB 경로의 차단을 통해 염증물질들의 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
실험예 4. 세포독성 검정
본 발명 삼칠 추출물의 세포독성을 검정하기 위해 삼칠 추출물 처리 후 세포의 생존여부를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay) 시약을 이용한 진단 방법를 사용하여 확인하였다.
대식세포를 96-웰 플레이트에서 100㎕ DMEM 배지와 함께 하룻밤 배양한 다음, 여러 농도의 삼칠 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 각 웰에 5㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 50㎕ 씩 넣고 4시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도한 다음, 10㎕의 DMSO 용액을 첨가하여 보라색의 포마잔(formazan) 결정을 완전히 용해하였다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 세포만 배양한 무처리구(control)에서의 100% 생존도를 기준으로 약물 처리군의 상대적인 세포생존도(cell viability; %)로 계산하였다.
이의 결과, 도 15에서와 같이, 삼칠 추출물의 처리 농도 10, 20, 50, 100, 200 및 500 ㎍/㎖에서 세포 생존도는 각각 100.4±1.845%(mean±SD), 98.47±0.52%, 99.33±0.82%, 94.56±0.21%, 61.04±1.41% 및 22.97±0.60%로 측정되어, 삼칠 추출물 100 ㎍/㎖ 농도까지 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 삼칠(삼칠근, 삼칠화)의 추출물을 사용함으로써 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌부종 및 뇌경색의 크기가 유의하게 억제되며, 뇌졸중의 발병과 밀접한 관계가 있는 대식세포와 뇌신경교세포의 활성화와 이로 인한 염증물질 생성이 유의하게 억제되어 항염증효과와 더불어 뇌신경세포가 보호되기 때문에 뇌졸중과 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료할 수 있게 된다.
도 1의 A는 뇌허혈 흰쥐의 뇌조직을 TTC 염색한 사진이며(Vehicle : 대조군, PN : 삼칠 추출물 처리군), B는 TTC 염색 후 뇌경색의 용적을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2의 A, C 및 D는 뇌졸중 흰쥐의 뇌 조직표본을 이소렉틴-B4에 대한 면역조직화학염색한 사진이며, B는 면역조직화학염색으로 관찰된 뇌신경교세포의 숫자를 나타낸 그래프이다.
도 3의 A ~ H는 뇌졸중 흰쥐의 뇌 조직표본을 iNOS에 대한 면역조직화학염색한 사진이며(CD11b : 뇌신경교세포 염색, DAPI : 핵 염색), I는 iNOS에 대한 웨스턴 블롯의 사진과 그래프이다.
도 4의 A ~ H는 뇌졸중 흰쥐의 뇌 조직표본을 COX-2에 대한 면역조직화학염색한 사진이며, I는 COX-2에 대한 웨스턴 블롯의 사진과 그래프이다.
도 5의 A ~ F는 뇌졸중 흰쥐의 뇌 조직표본을 NF-κB에 대한 면역조직화학염색한 사진이며, G는 면역조직화학염색으로 관찰된 허혈이 유발된 대뇌반구의 뇌신경교세포 내 핵에 분포하는 NF-κB를 나타낸 그래프이다.
도 6의 A는 뇌신경교세포(BV-2 : 뇌신경교세포주, primary microglia : 흰쥐로부터 직접 분리한 일차 뇌신경교세포)의 NO 생성을 Griess 시약 반응방법으로 측정한 그래프이며, B는 PGE2 생성을 효소면역반응법으로 측정한 그래프이다.
도 7은 뇌신경교세포의 mRNA를 이용한 RT-PCR 결과로, A는 iNOS, B는 COX-2에 대한 RT-PCR 사진과 그래프이다.
도 8은 뇌신경교세포의 단백질을 이용한 웨스턴 블롯 결과로, A는 iNOS, B는 COX-2에 대한 웨스턴 블롯 사진과 그래프이다.
도 9는 뇌신경교세포의 단백질을 이용한 NF-κB에 대한 웨스턴 블롯 사진과 그래프이다.
도 10의 A는 대식세포의 NO 생성을 Griess 시약 반응방법으로 측정한 그래프이며, B는 대식세포의 mRNA를 이용한 iNOS에 대한 RT-PCR 사진이고, C는 대식세포의 단백질을 이용한 iNOS에 대한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 11의 A는 대식세포의 PGE2 생성을 효소면역반응법으로 측정한 그래프이며, B는 대식세포의 mRNA를 이용한 COX-2에 대한 RT-PCR 사진이고, C는 대식세포의 단백질을 이용한 COX-2에 대한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 12의 A와 B는 대식세포에서 TNF-α와 IL-1β의 발현을 효소면역반응법으로 측정한 그래프이며, C는 대식세포의 mRNA를 이용한 TNF-α와 IL-1β에 대한 RT-PCR 사진이다.
도 13은 대식세포의 단백질을 이용한 인산화된 MAPK 신호전달 단백질(ERK1/2, JNK, p38 MAPK)에 대한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 14의 A는 대식세포의 세포질 내 존재하는 인산화 된 I-κB(p65) 및 모든 I-κB(I-κBα)에 대한 웨스턴 블롯 사진이며, B는 대식세포의 핵 내 존재하는 NF-κB p65 서브유닛(subunit)에 대한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 15는 본 발명의 삼칠 추출물의 세포 독성을 검정하기 위하여 삼칠 추출물의 농도별 처리 후 MTT 시약 방법을 이용하여 측정한 결과의 그래프이다.

Claims (10)

  1. 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 5의 알코올로 추출한 삼칠(Panax notoginseng) 추출물을 유효성분으로 하며, 허혈 손상에 따른 뇌경색 발생을 줄이고, 신경교세포 활성의 제어를 통해 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 삼칠 추출물은 삼칠근과 삼칠화를 중량기준 5:1 내지 1:5의 혼합비로 하여 추출된 것임을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 혼합비는 1:1인 것임을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 알코올은 80% 메탄올인 것을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  6. 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 5의 알코올로 추출한 삼칠(Panax notoginseng) 추출물을 유효성분으로 하며, 허혈 손상에 따른 뇌경색 발생을 줄이고, 신경교세포 활성의 제어를 통해 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 개선용 기능성식품.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 삼칠 추출물은 삼칠근과 삼칠화를 중량기준 5:1 내지 1:5의 혼합비로 하여 추출된 것임을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 개선용 기능성식품.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 혼합비는 1:1인 것임을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 개선용 기능성식품.
  9. 삭제
  10. 제 6항에 있어서, 상기 알코올은 80% 메탄올인 것을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 및 개선용 기능성식품.
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