JP2001522592A - 遺伝子発現の増大化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス遺伝子発現を増加させる方法を提供する。また薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス投与に関連した炎症応答を減少させるさまざまな方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 関連出願の相互参照 本出願は現在は放棄されている１９９７年１１月７日付け出願の米国仮特許出
願第６０／０６４，６９４号の特恵を主張する。

【０００２】 連邦基金の説明 本発明は、補助Ｎ０１−ＡＲ−６２２２４， Ｐ５０ ＡＩ２３６４９， Ｒ
０１−ＡＲ４２５４７下でNational Institute of Healthからの基金を用いて部
分的には創製された。従って、連邦政府は本発明においてある種の権利を有する
。

【０００３】 発明の分野 本発明は、一般的には、免疫学および蛋白質化学の分野に関する。さらに詳し
くは、本発明は、遺伝子治療の延長およびＴＮＦの活性を減少させる炎症の阻害
に関する。

【０００４】 関連技術の記載 アデノウイルスベクターに対する免疫応答は遺伝子治療の成功した適用におい
て限定的因子として認識されてきた。細胞性および体液性免疫応答はトランスジ
ーン発現の短化時間スパン、トランスフェクトされた細胞の根絶、およびアデノ
ウイルスの再投与する機械の妨害に関連付けられている（Yangら, 1996b;Kass-E
islerら, 1996;Yangら, 1996c;YangおよびWilson, 1995c)。シクロホスファミド
、ＦＫ５０６およびサイクロスポリンを含めた免疫抑制薬物はこの免疫応答を低
下させる（Joossら, 1996; Vilquinら, 1995)。免疫応答を制御すると報告され ている他の戦略は抗−Ｔ細胞療法（Sawchukら, 1996)および抗−ＣＤ４モノクロ
ーナル抗体（Dematteoら, 1996)によるＴ−細胞応答の低下、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ を用いる共刺激活性の低下（Gueretteら, 1996; Heら, 1996;Kayら, 1997)、お よび胸腺内寛容性の誘導（Hanら, 1996)を含む。中和抗体生産のＢ−細胞活性化
生成は、抗−ＣＤ４０（Yanら, 1996a）およびデオキシイスペルグアリン（Smit
hら, 1996)での処理の後に減少する。加えて、アデノウイルスベクターの修飾は
、免疫応答を低下させるにおいて効果的であり得る（Gaoら, 1996; Fisherら, 1
997)。

【０００５】 抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、アデノウイルスに対する特異的および非特異的免
疫応答双方において重要な役割を演じる。抗原のプロセッシング、主要組織適合
性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の意味における抗原の提示、および抗原提示細
胞によるサイトカイン生産は、アデノウイルスに対する免疫応答に寄与する（Ya
ngら, 1995a;Schowalterら, 1997)。Ｅ１９アデノウイルス遺伝子産物は、減少 したＭＨＣクラスＩ抗原発現に至り、この遺伝子産物に対する免疫応答はクラス
Ｉ突然変異体マウスで起こり、これは、ＭＨＣクラスＩ抗原発現が要求されない
ことを示す。

【０００６】 インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ
−γ）のごとき他のサイトカインは、アデノウイルス感染後早く高レベルで発現
され、これらはアデノウイルスに対するＴＨ１−タイプの応答を惹起する（Yang
ら, 1995b;Coutelierら, 1995; Dayら, 1994)。アデノウイルスに対する初期炎 症性免疫応答における抗原提示細胞によるＴＮＦ−α生産の役割はよくは理解さ
れていない（Smithら, 1994)。ＴＮＦ−αはアデノウイルスＥ３蛋白質の発現を
増加させ、これは、今度は、ＴＮＦ−αの溶解活性から細胞を保護する。これら
の知見は、生存するウイルスに対するＴＮＦ−αの中和につき中枢的役割を示す
（Deryokereら, 1995; Tufarielloら, 1994; Ranheimら, 1993; Kornerら, 1992
; Wold, 1993)。

【０００７】 ＴＮＦ−αは高親和性受容体ｐ５５ ＴＮＦ−ＲＩまたは低親和性ｐ７５ Ｔ
ＮＦ−ＲＩＬいずれかを架橋することによって作用し、ＴＮＦ−ＲＩは炎症性応
答と最も密接に関連する（Smithら, 1994)。肺の炎症を軽減するにおける、ＴＮ
Ｆ受容体（ｓＴＮＦＲ）阻害剤のごときＴＮＦ−αアンタゴニストの効果が、出
血後に頻繁に発症し、肺における増大したプロ炎症サイトカインレベルおよび大
量の好中球蓄積によって特徴付けられる急性肺損傷で示されている（Abrahamら,
1994; Suら, 1998; Rabinoviciら, 1996)。肺細胞集団内のＴＮＦ−α ｍＲＮ
Ａ発現のレベルの迅速な増大は、急性肺損傷の発生に先行する。マウスでは、ヒ
トＩｇＧ１のＰｃ領域に連結した可溶性ダイマーヒトｐ８０ＴＮＦ−Ｒよりなる
ｓＴＮＦＲ−Ｆｃでの治療は、循環および肺ＴＮＦーαレベルの出血後増加を防
止し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの増加を
減少させる（Haak-Frendschoら, 1994; Fisherら, 1996; Wooleyら, 1993; Koll
sら, 1994)。

【０００８】 組換えヒトＴＮＦ−ＲＩ可溶性受容体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−
連結ダイマーよりなり、高親和性でもってＴＮＦ−αに結合することができる新
規なＴＮＦ−結合蛋白質（ＴＮＦ−ｂｐ）が開発されている（Evansら, 1996)。
ＴＮＦ−ｂｐ ＰＥＧ−連結ダイマーの使用は、モノマーＴＮＦ−ｂｐの使用よ
りも優れた治療利点を有する。まず、ＴＮＦ−ｂｐの二量体化はＴＮＦ−αに対
する親和性を増強させ、ＴＮＦ−αトリマー内の２つの部位の結果としての動員
はＴＮＦ−α媒介シグナル導入を防止することができる。というのはＴＮＦによ
る２つのＴＮＦ−Ｒの架橋が細胞応答をトリガーするのに必要だからである（Ev
ansら, 1996)。第２に、ＰＥＧ連結ダイマーは、予測できる遅いクリアランスに
ての大きな分子量を有し、これは、比較的頻繁ではない投与を可能とする。第３
に、ＰＥＧ−連結ダイマーは、純粋な蛋白質よりも低い免疫原性を有し得る。と
いうのは、蛋白質へのＰＥＧコンジュゲーションは、低下した抗体応答に導くか
らである（Delgadoら, 1992; Katre 1990)。

【０００９】 先行技術は、遺伝子治療発現の延長のための効果的な手段を欠く。本発明は長
い間のこの必要性および当該分野における要望を満足する。

【００１０】 （発明の概要） 本研究はビヒクル−処理マウスと比較して、ＴＮＦ−ｂｐで処理したＡｄＣＭ
ＶｌａｃＺ−ウイルス感染マウスにおいて、大いに減少した炎症疾患および延長
された遺伝子治療発現があることを示す。これらの結果は、ＴＮＦ−αはＡｄＣ
ＭＶｌａｃＺ−ウイルス感染マウスにおいて炎症の病因における鍵となる因子で
ある。かくして、ＴＮＦ−ｂｐ ＰＥＧ−連結ダイマーは、アデノウイルス遺伝
子治療に対する炎症性応答を低下させるのに治療的に有用である。

【００１１】 アデノウイルス遺伝子治療の臨床的適用は、現在、その効果の持続を制限する
ウイルスに対する優れた宿主免疫応答によって妨害される。これらの研究は、可
溶性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ｂｐ）を用いる組換えアデノウイルスの投与後のマ
ウスの肺および肝臓におけるｌａｃＺ発現アデノウイルスの炎症応答および発現
に対するＴＮＦ−αの役割を示した。単核細胞炎症応答は、ｌａｃＺマーカー遺
伝子を発現する組換えアデノウイルスの鼻孔内または静脈内投与後に、種々の時
点で組織学的に測定された。アデノウイルスのｌａｃＺ遺伝子産物の活性の発現
。ＴＮＦ−ｂｐでの処理は、ＴＮＦ−αの循環レベルを低下させ、炎症応答を大
いに低下させ、その結果、アデノウイルスの鼻孔内または静脈内投与いずれか後
の肺および肝臓で３０日までｌａｃＺの延長された発現となった。ビヒクル処理
Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスに対するアデノウイルスの鼻孔内および静脈内投
与の結果、執拗な炎症応答および肺におけるアデノウイルスのクリアランスとな
った。しかしながら、最小炎症応答にも拘わらず、ウイルスのクリアランスも観
察された。これらの結果は、ＴＮＦ−ｂｐがそれらの効果を阻害できたので、Ｔ
ＮＦ−αが、炎症応答を駆動し、肺および肝臓においてアデノウイルス−感染細
胞の排除に至る主要因子であることを示す。

【００１２】 本発明の１つの具体例において、薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を
動物に投与する工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス
遺伝子発現を増加させる方法が提供される。

【００１３】 本発明のもう１つの具体例において、薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白
質を動物に投与する工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイ
ルス投与に関係する炎症応答を低下させる方法が提供される。

【００１４】 本発明の他のおよびさらなる態様、および利点は、開示目的で与える本発明の
現在好ましい具体例の以下の記載から明らかであろう。

【００１５】 （図面の説明） 明瞭となるであろう本発明の前記特徴、利点および他のものの事項が得られ 、理解できるように、簡単に前記したことを要約した本発明のより具体的な記載
は、添付図面に記載されたそのある具体例を参照することによって可能である。
これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図面は本発明の好
ましい具体例を説明し、その範囲を限定するものと解釈されるべきでないことに
注意されたし。

【００１６】 図１は、ＴＮＦの血清レベルに対するＴＮＦ−ｂｐ処理の効果を示す。ＥＬＩ ＳＡアッセイは正常Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスにおけるＴＮＦ−αレベルの
測定のために行った。ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス−感染ビヒクル−処理マウス
およびＴＮＦ−ｂｐで処理したＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス−感染マウス。血清
ＴＮＦレベルは標準曲線を用いて決定した。合計１０のビヒクル−対照、および
１８のＴＮＦ−ｂｐ処理ＡｄＣＭＶｌａｃＺ（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．）ウイ
ルス−感染マウスをＩ．Ｖ．感染の２４および４８時間後に分析した。

【００１７】 図２および３は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与後の肺炎症侵潤およびβ− Ｇａｌ発現を示す。ビヒクル−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウス、ＴＮＦ−ｂ
ｐで処理したＣ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスからの肺組織を、ＡｄＣＭＶｌａｃ
Ｚの鼻孔内投与（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．）の３および３０日後に調べた。組
織を固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンいずれかで染色し、β−Ｇａｌ染色
の分析のために凍結切片を調製した。図２は、ビヒクル−処理ＡｄＣＭＶｌａｃ
Ｚウイルス−感染マウスの肺が間隙における単核細胞侵潤および細気管支拡張に
よって特徴付けられる典型的な炎症を有し、他方、ＴＮＦ−ｂｐ処理ＡｄＣＭＶ
ｌａｃＺウイルス感染マウスからの肺は、正常な厚みの槽壁、正常スペースの肺
胞、および正常直径の細気管支で比較的正常であることを示す。図３はβ−Ｇａ
ｌ染色の分析のために調製された凍結切片を示す（倍率×３２０）。

【００１８】 図４および５は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後における肝臓炎症応答お よびβ−Ｇａｌ発現を示す。ビヒクル−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスおよ
びＴＮＦ−ｂｐで処理したＣ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスからの肝臓組織をＡｄ
ＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後第３日および第３０日に調べた。組織を固定し、
ヘマトキシリンおよびエオシンいずれかで染色し、あるいはβ−Ｇａｌ活性の分
析のために凍結切片を調製した。図４：ビヒクル−処理ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイ
ルス−感染マウスの肝臓は、門静脈の回りの単核細胞侵潤によって特徴付けられ
、他方、ＴＮＦ−ｂｐで処理したＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス感染マウスからの
肝臓は比較的正常であった。図５：β−Ｇａｌ染色の分析のために凍結切片を調
製した（倍率×３２０）。

【００１９】 図６は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後の肝臓β−Ｇａｌ発現を示す。ビ ヒクル−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスおよびＴＮＦ−ｂｐで処理したＣ５
７ＢＬ／６−＋／＋マウスからの肝臓組織を、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの投与後第０
、第３および第３０日に調べた。後記するごとく、β−Ｇａｌ活性の分析のため
に組織を調製した。

【００２０】 図７は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与後の肝臓β−Ｇａｌ発現を示す。ビ ヒクル−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスおよびＴＮＦ−ｂｐで処理したＣ５
７ＢＬ／６−＋／＋マウスからの肝臓をＡｄＣＭＶｌａｃＺの投与後第０、第３
および第３０日に調べた。後記するごとく、β−Ｇａｌ活性の分析のために組織
を調製した。

【００２１】 図８は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内（ＩＶ）および鼻孔内（ＩＮ）投与後第 ７日における肝臓および肺におけるβ−Ｇａｌ発現を示す。ビヒクル−処理Ｃ５
７ＢＬ／６マウスからのおよびＴＮＦ−ｂｐで処理したＣ５７ＢＬ／６マウスか
らの肝臓および肺組織を、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後第７日に調べた。
後記するごとく組織をβ−Ｇａｌ活性の分析のために調製した。結果は、別々に
分析した５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。星印（＊）は、対照ビヒクル−処
理マウスと比較した、ＴＮＦ−ｂｐ−処理マウスにおけるβ−Ｇａｌの発現の統
計的に有意な差異を示す。

【００２２】 図９および１０は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後の細胞毒性Ｔ細胞およ び抗−アデノウイルス抗体応答を示す。細胞毒性および抗体応答は対照マウス、
ＡｄＣＭＶｌａｃＺで処理したマウスおよびＡｄＣＭＶｌａｃＺ＋ＴＮＦ−ｂｐ
で処理したマウスで測定した。抗−アデノウイルス抗体応答については、結果は
、別々に分析した５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。図９は、ＡｄＣＭＶｌａ
ｃＺウイルス投与後第１６日に測定された抗−アデノウイルス細胞毒性Ｔ細胞応
答を示す。図１０は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス投与後第１６日および第３０
日に測定された抗−アデノウイルス応答を示す。

【００２３】 （発明の詳細な記載） 以下の省略を本明細書で用いる：ＡｄＣＭＶｌａｃＺ：サイトメガロウイルス
プロモーターによって駆動される組換えＬａｃＺを持つアデノウイルス；ＴＮＦ
−Ｒ：ＴＮＦ受容体；ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ＴＮＦ−ｂｐ：ＴＮＦ
結合蛋白質 本発明は、薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する工程を
含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス遺伝子発現を増加させ
る方法に指向される。１つの具体例において、腫瘍壊死因子結合蛋白質は腫瘍壊
死因子結合蛋白質のポリエチレングリコール−連結ダイマーである。好ましくは
、腫瘍壊死因子結合蛋白質は、約０．３ｍｇ／ｋｇないし約５．０ｍｇ／ｋｇの
用量で投与される。腫瘍壊死因子結合蛋白質はいずれの許容される方法で投与す
ることもできるが、それは好ましくは鼻孔内または静脈内投与される。腫瘍壊死
因子結合蛋白質の結果、血清腫瘍壊死因子−αが減少する。

【００２４】 本発明は、腫瘍壊死因子結合蛋白質が動物において炎症応答を阻害するように
、薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する工程を含むことを
特徴とする動物の組織においてアデノウイルス投与に関係する炎症応答を低下さ
せる方法に指向される。１つの具体例において、腫瘍壊死因子結合蛋白質は腫瘍
壊死因子結合蛋白質のポリエチレングリコール−連結ダイマーである。好ましく
は、腫瘍壊死因子結合蛋白質は、約０．３ｍｇ／ｋｇないし約５．０ｍｇ／ｋｇ
の用量で投与される。腫瘍壊死因子結合蛋白質はいずれの許容される方法で投与
することもできるが、それは好ましくは鼻孔内または静脈内投与される。腫瘍壊
死因子結合蛋白質の結果、血清腫瘍壊死因子−αが減少する。

【００２５】 医薬組成物は、腫瘍壊死因子結合蛋白質を用いて調製することができるのが特
に考えられる。かかる場合、医薬組成物は腫瘍壊死因子結合蛋白質および医薬上
許容される担体を含む。当業者であれば、過度の実験なくして、腫瘍壊死因子結
合蛋白質の投与の適当な投与量および経路を容易に決定することができるであろ
う。

【００２６】 当業者によく知られているように、腫瘍壊死因子結合蛋白質の修飾されたバー
ジョンは非常に有用であろう。腫瘍壊死因子結合蛋白質の有用なバージョンの代
表的な例は、２．６ドメインＴＮＦＲＩのごとき可溶性ＴＮＦＲＩまたはＴＮＦ
ｂｐまたは修飾されたＴＮＦＲを含む。

【００２７】 当業者によく知られているように、よく知られた遺伝子治療技術を用いて、本
発明を開発できるであろう。例えば、腫瘍壊死因子結合蛋白質、またはその修飾
は、治療遺伝子と組み合わせてアデノウイルスに連結し得る。腫瘍壊死因子結合
蛋白質を含ませると、ＴＮＦαを中和し、治療遺伝子の増強された発現の結果と
なるであろう。

【００２８】 アデノウイルス−ＬａｃＺ遺伝子治療後における、炎症の阻害およびＬａｃＺ
発現の延長におけるｓＴＮＦＲＩでのＴＮＦ−αの中和の効果を調べた。ｓＴＮ
ＦＲＩはアデノウイルス投与後に血清ＴＮＦ−αを検出できないレベルまで低下
させ、肺および肝臓炎症反応を減少させ、ＬａｃＺ遺伝子の発現を増強させた。
これらの結果は、遺伝子治療の間のｓＴＮＦＲＩでの治療が、炎症応答を最小化
させることにおいて、および遺伝子治療効果を増加させることにおいて効果的で
あり得ることを示す。

【００２９】 以下の実施例は、本発明の種々の具体例を説明する目的で与えられ、断じて本
発明を限定することを意図しない。

【００３０】 実施例１ マウス Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスはJackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から 購入した。ケージ、ベッディング、水および食料を滅菌し、マウスは無菌手袋で
扱った。実験の持続の間、マウスをケージ当たり３−４匹マウスの群で収容した
。雌マウスを８週齢で使用した。

【００３１】 実施例２ 複製−欠陥ＡｄＣＭＶｌａｃＺ組換えウイルスの調製および投与 ＣＭＶプロモーターによって駆動される組換えアデノウイルス−ＬａｃＺ（Ａ
ｄＣＭＶｌａｃＺ）は、記載されている（GrahamおよびPrevec, 1995)２つのプ ラスミドの組換えを使用して創製された。略言すれば、ｐｃＤＮＡ_３Ｈｉｓ（In
vitrogen)からのＰＣＲ−増幅Escherichia coli ＬａｃＺ遺伝子は、アデノウイ
ルスシャトルベクターｐＣＡ１３（Microbix, Inc., カナダ国）に方向性をもっ
て挿入され、その結果、ｐＣＡ１３ ＬａｃＺが得られた。次いで、製造業者の
マニュアル（Gibco, BRL）に記載されているように、ｐＣＡ１３ ｌａｃＺ遺伝
子を、ｐＪＭ１７（Microbiz, Inc., カナダ国）で２９３細胞にトランスフェク
トした。ｘ−ｇａｌでの染色の後、組換えウイルスを拾い、続いて３ラウンドプ
ラーク精製した。ＡｄＣＭＶｌａｃＺ組換えウイルス（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ
．）を従前に記載されているごとくに鼻孔内または静脈内投与した。アデノウイ
ルスの静脈内投与は、肝臓および肺に対する高い向性をもって広い散在性の結果
となることが示された。鼻孔内投与（Ｌ．Ｎ．）は、１５ ｍｌ ＰＳＢ中の０
．５×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．のアデノウイルスをマウスの各外鼻孔に入れること
によって行った。マウスをＡｄＣＭＶｌａｃＺ組換えウイルスの投与後０、３、
７、２１および３０日に調べた。

【００３２】 実施例３ ＴＮＦ−結合蛋白質の投与 遺伝子治療投与に対して−１、＋１および＋３日にマウスを３用量のＴＮＦ−
結合蛋白質（５ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内、一日置き）で処理した。ＴＮＦ−ｂｐ
は、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ：Ｆｅについてのその解離定数（１０^−７のＫ_ｄ）と比較
して、１０^−９の解離定数Ｋ_ｄでもってトリマーＴＮＦ−αにしっかりと結合す
るペグル化されたダイマーである。ＴＮＦは、ＴＮＦ−ｂｐによって機能的にか
つ免疫原性的に隔離される。従って、ＴＮＦ−ｂｐでのＴＮＦ−αに対する解離
半減期は２．５日であり、他方、ｓＴＮＦ−ＲＩＩでのＴＮＦ解離についてのオ
ンオフ速度はほぼ１８分である。本実験で記載されるように、ＴＮＦ−ｂｐの結
合後、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によってＴＮＦ−αはも
はや検出できない。従って、血清中で、いずれかの遊離ＴＮＦは、ＴＮＦ−ｂｐ
に結合することが予測され、従って、ＥＬＩＳＡによって検出できず、また、生
理学的サイトカインとして利用できないであろう。

【００３３】 実施例４ 組織学的分析 頸脱臼によって犠牲にしたマウスから肺および肝臓を切開した。組織を１０％
ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。パラフィン−包埋組織試料か
ら切片（４．０μｍ）が得られ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。マ
ウス当たり肺および肝臓組織の１０切片を調べ、スケール０（存在せず）ないし
４＋（最大重症度）で単核細胞侵潤につき等級付けした。細胞性侵潤スケールは
、両単核細胞（ＰＭＮ）を含み、これは第３日に１０％未満の侵潤を表し、アデ
ノウイルスの鼻孔内または静脈内投与後第３０日にＰＭＮは見えなかった。

【００３４】 実施例５ β−ｇａｌ発現の測定 ｌａｃＺ遺伝子発現のイン・ビボ持続は、記載されているごとくに（Wrightら
, 1997)、固定された組織切片の組織学的評価によって測定した。肺および肝臓 を液体窒素中でスナップ−凍結し、続いて系列的横方向切片化した（１０．０μ
ｍ）。次いで、切片をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で０．５％グルタルアルデヒドで
固定し、続いて、３７℃にて２時間、ｘ−ｇａｌ溶液中で染色した。切片を顕微
鏡で調べ、以下のスケール：０＝＜１％、１^＋＝＜５％、２^＋＝＜１０％、３^＋ ＝＜２５％および４^＋＝＞５０％を用い、β−Ｇａｌを発現する細胞のパーセン
テージにつきスコア採りした。

【００３５】 実施例６ 肝臓におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の定量 β−ガラクトシダーゼ活性は記載されているごとくに（Youngら, 1993)測定し
た。新たに単離した肝臓および肺組織を、β−ｇａｌ緩衝液（Tropix, Inc., Be
dford MA)１ｍｌ中にてテシュマイザーで２０秒間ホモゲナイズした。ホモジネ ートを４℃で１０分間１２，５００×ｇで遠心し、上清を４８℃で６０分間加熱
して、内因性真核生物β−ガラクトシダーゼ活性を不活化した。次いで、試料を
１２，５００×ｇで５分間遠心し、Galacto-lightＴＭ（Tropix, Ic., Bedford
MA)ケミルミネセンスレポーターアッセイを用い、１０μｌの上清をβ−ガラク トシダーゼ活性につきアッセイした。反応は、室温（ＲＴ）で１０分間行い、β
−ガラクトシダーゼ活性をルミノミター（Monolight 500)を用いてアッセイした
。蛋白質濃度はBradfordアッセイによって測定した。活性は、肝臓または肺にお
いて、相対的光単位／分／全蛋白質ｍｇとして表す。

【００３６】 実施例７ 血清ＴＮＦ−αの測定および統計的解析 後眼科窩洞穿刺によってマウスから得られた血清試料中のＴＮＦαの濃度は、
供給業者（Endogen, Cambridge, MA）によって推奨される手法に従ってＥＬＩＳ
Ａアッセイキットを用いて測定した。

【００３７】 ２つの異なる群の試料を比較する場合には、スチューデントのｔ−検定を統計
的解析で用いた。０．０５未満のｐ値は統計的に有意であると考えられた。

【００３８】 実施例８ 抗−アデノウイルス抗体生産についてのＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレートをモルモットポリクローナル抗−アデノウイルス（Ａｄ）
抗体でコートした。生きたＡｄＣＭＶｌａｃＺ（１０^９ＰＦＵ）を４℃で３０分
間添加し、プレートを３回洗浄した。血清試料を１：１０００希釈し、４℃で３
０分間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド抗
−マウスＩｇＧ（Southern Biotechnology Associates, Birmingham AL）を添加
し、続いて洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Sigma, St. Louis, MO
）基質で発色させた。光学密度（ＯＤ）はマイクロプレートリーダー（Emas; Mo
lecular Devices, Menlo Park CA）にて４０５ｎｍで測定した。各試料を二連で
アッセイし、次いで、各試料の二連からの平均光学密度の読みを得た。少なくと
も３匹のマウスを各群でテストした。

【００３９】 実施例９ 抗−アデノウイルス細胞毒性Ｔ−細胞の分析 細胞毒性Ｔ細胞活性は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ−感染Ｃ５７ＢＬ／６抗原提示標
的細胞の細胞毒性を誘導するテスト細胞の能力を測定することによって評価した
。ＡｄＣＭＶｌａｃＺ−感染Ｃ５７ＢＬ／６−ｌｐｒ／ｌｐｒマクロファージ細
胞系を７００μＣｉのＮａ^５１ＣｒＯ_２（Amersham, Arlington Heights, IL） で３７℃にて１時間標識した。次いで、細胞を、透析した１０％胎児ウシ血清（
ＰＣＳ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で３回洗浄した。異なるエフェクタ
ー−対−標的比率にて、９６ウェルプレート中、第１６日ＡｄＣＭＶｌａｃＺ−
感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの精製された脾臓Ｔ細胞に標的細胞を添加した。
２４時間後に上清を収集し、放出された^５１Ｃｒの量をカウンターを用いて測定
した。^５１Ｃｒの自然放出は、培地単独と共に^５１Ｃｒ−標識標的細胞をインキ
ュベートすることによって測定し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．０
５％の最終濃度まで添加することによって最大放出を測定した。特異的^５１Ｃｒ
放出のパーセンテージを以下のごとくに計算した：

【数１】 実施例１０ ＴＮＦ−ｂｐでの処理はＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス−感染マウスにおいて血
清ＴＮＦ−αレベルを低下させる。

【００４０】 ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．、Ｉ．Ｖ．）をＴＮ
Ｆｂｐまたは対照処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスに投与した。対照マウスに
おいて２４時間および４８時間にＴＮＦの血清レベルに有意な減少があった（図
１）。ＴＮＦ−ｂｐ（５ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内、１日置き）でＡｄＣＭＶｌａ
ｃＺ−ウイルス感染Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスの処理の結果、ＡｄＣＭＶｌ
ａｃＺ投与２４時間後に、ＴＮＦ−ｂｐ−処理マウスの血清中のＴＮＦ−αのレ
ベルが低下した（１０ｐｇ／ｍｌ未満）（図１）。かくして、ＴＮＦ−αはアデ
ノウイルスによって迅速に誘導され、これは、ＴＮＦ−ｂｐ処理によって中和さ
れる。

【００４１】 実施例１１ ＴＮＦ−ｂｐでの処理は肝臓および肺細胞侵潤を減少させ、鼻孔内および静脈
内投与後のＡｄＣＭＶｌａｃＺの発現を延長する。

【００４２】 ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．）後における肺
およびウイルスクリアランスの侵潤に対するＴＮＦ−ｂｐでの処理の効果を評価
した。鼻孔内投与３日後に、対照（ＣＴ）−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウス
の肺において中程度の炎症性侵潤があり、これは第７日にピークとなり、第３０
日までにほとんど分解した（図２：表１）。対照的に、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ投与
の３日後に、ＴＮＦｂｐ処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスの肺に炎症性侵潤の
証拠はなく、侵潤の最小の証拠のみが第３日ないし第３０日まで観察された。

【００４３】 鼻孔内投与後の肝臓および肺双方にｌａｃＺの高発現があった（図８）。Ａｄ
ＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与（１×１０^１０ＰＦＵ）後に、肝臓においてｌａｃ
Ｚの発現の増大があり、肺において５％未満のｌａｃＺ発現があった。ＴＮＦ−
ｂｐの投与の結果、肝臓および肺の双方においてｌａｃＺ発現のほぼ５−ないし
１０−倍の増加となった。従って、鼻孔内投与はＡｄＣＭＶｌａｃＺを肝臓およ
び肺に効果的に送達し、静脈内投与はＡｄＣＭＶｌａｃＺおよび肺に送達するの
に効果的な方法ではなく、ＴＮＦ−ｂｐは投与後に肝臓および肺双方における発
現を増大させた。

【００４４】

【表１】 ｌａｃＺアデノウイルス遺伝子−治療産物の発現を測定した（図３）。結果は
、対照−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスにおけるβ−ｇａｌの発現が第７日
までにその最高レベルに達したが、第２１日までにはかなり低下し、３０日まで
低レベルで止まったことを示す（図３、表１）。ＴＮＦ−ｂｐ−処理Ｃ５７ＢＬ
／６−＋マウスにおけるβ−ｇａｌの発現もまた第７日にピークとなったが、対
照−処理マウスとは対照的に、β−ｇａｌの発現は第３０日まで肺において高い
ままであった。

【００４５】 実施例１２ ＴＮＦ−ｂｐでの処理は、肝臓侵潤を低下させ、静脈内投与後にＡｄＣＭＶｌ
ａｃＺの発現を延長する。

【００４６】 静脈内投与３日後に、ビヒクル−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスの肝臓に
おいて中程度の炎症侵潤があり、これは第７日にピークとなり、第３０日までに
ほとんど分解した（図４；表１）。対照−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスの
炎症性侵潤は、門静脈の回り、三管の回り、および血管に関係しない実質内の小
クラスターの単核細胞よりなるようであった。第７日まで中程度の数の炎症細胞
の小さなフォーカスが観察され、これらは２１日までに分解した。対照的に、ア
デノウイルス投与３日後にＴＮＦｂｐ処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスの肝臓
において炎症侵潤の証拠はなく、第３から第３０日に観察された侵潤の最小証拠
のみがあった。ｌａｃＺアデノウイルス遺伝子−治療産物の発現についての肝臓
組織切片の調査は、対照−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスにおけるβ−ｇａ
ｌの発現が第７まで最大であったが、第２１日および第３０日までに低下したこ
とを示す（図５、表１）。ＴＮＦ−ｂｐ−処理Ｃ５７ＢＬ／６−＋／＋マウスは
第３０までβ−ガラクトシダーゼの最大発現を呈した。

【００４７】 実施例１３ ＴＮＦ−ｂｐでの処理の結果、静脈内および鼻孔内投与後にＡｄＣＭＶｌａｃ
Ｚの増大した発現となった。

【００４８】 ウイルスのクリアランスの阻害を定量的に評価し、ＴＮＦｂｐによるＬａｃＺ
発現を延長させるために、各々、静脈内（ｉ．ｖ．）および鼻孔内（ｉ．ｎ．）
投与後第０日、第３日および第３０日に肝臓組織を評価した。新たに摘出した肝
臓組織をホモゲナイズし、ケミルミネセンスレポーターアッセイを用い、上清を
β−ガラクトシダーゼにつきアッセイした。活性は肝臓中の相対的光単位／分／
全蛋白質ｍｇとして表す。ＴＮＦｂｐ処理は、静脈内および鼻孔内投与双方後に
アデノウイルスＬａｃＺ遺伝子の発現を延長した（図６、７）（ｐ＜０．０５）
。ＴＮＦ−ｂｐ処理と組み合わせた鼻孔内投与の結果、炎症が最適低下し、β−
ｇａｌが最大発現された。

【００４９】 アデノウイルスの鼻孔内投与が、肝臓組織に対してアデノウイルスの最大レベ
ルの向性を依然として惹起しつつ、肝臓において温和な炎症応答を誘発するかを
判断するために、組換えＡｄＣＭＶｌａｃＺ（１×１０^１０ｐ．ｆ．ｕ．）を鼻
孔内投与した。ｉ．ｖ．投与と比較して、ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルスの鼻孔内
投与に対する炎症応答は、鼻孔内投与後第３および７日に、ビヒクル−処理Ｃ５
７ＢＬ／６−＋／＋マウスの肝臓において低く、第７日および第３０日の間に検
出できなかった（表１）。

【００５０】 実施例１４ ＴＮＦ−ｂｐでの処理は、静脈内投与後に、肺細胞侵潤を低下させ、ＡｄＣＭ
ＶｌａｃＺの発現を延長した。

【００５１】 ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与の結果、対照およびＴＮＦ−ｂｐ処理マウス 双方において、第３日および第７日に、ウイルスの最大向性およびＬａｃＺの発
現となった（表１）。ＴＮＦ−ｂｐおよび対照マウス双方において、ＡｄＣＭＶ
ｌａｃＺの静脈内投与の結果、投与後第２１日および第３０日に、鼻孔内投与と
比較して、より低い炎症となった。ＴＮＦ−ｂｐ処理マウスにおいて、これは、
鼻孔内ＡｄＣＭＶｌａｃＺを摂取し、ＴＮＦ−ｂｐで処理したマウスで観察され
たものに対して同等のＬａｃＺの最大発現の結果となった（表１）。

【００５２】 実施例１５ ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後の細胞毒性Ｔ細胞応答および抗−アデノ ウイルス抗体 ＴＮＦ−ｂｐ処理の有り無しにての、ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス感染マウ スの抗−アデノウイルス細胞毒性Ｔ細胞および抗体応答を測定した。ＡｄＣＭＶ
ｌａｃＺの注射後第１６日に、対照マウスと比較して、ＴＮＦ−ｂｐ処理マウス
において細胞毒性Ｔ細胞応答の間に有意な差異はなかった（図９）。ＴＮＦ−ｂ
ｐ処理後第１６日に抗体応答に減少があったが、ＴＮＦ−ｂｐ処理マウスを対照
処理マウスと比較すると、アデノウイルスに対する抗体応答に有意な差異はなか
った（図１０）。

【００５３】 この実験は、ＴＮＦ−ｂｐでの処理は炎症を有意に低下させ、遺伝子治療を 延長させることを確立する。この効果はＡｄＣＭＶｌａｃＺ組換えウイルスの鼻
孔内および静脈内投与後に肺および肝臓双方において起こった。ＴＮＦ−ｂｐ治
療は、肺および肝臓においてＬａｃＺのアデノウイルス発現を４週間延長し、こ
れは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αをブロックすること
に向けられた他の抗−サイトカイン治療に匹敵し、またはそれよりも長い（Yang
ら, 1995b;Kass-Eislerら, 1996; Yangら, 1996b;YangおよびWilson、1995c)。

【００５４】 炎症の軽減およびアデノウイルスの発現の延長におけるＴＮＦ−ｂｐの効果 は、炎症におけるＴＮＦ−ｂｐの役割を直接的に反映することができる。ＴＮＦ
−αはマクロファージによって主として生産され、他方、ＩＬ−６、ＩＬ−１０
およびＩＦＮ−γはＴ細胞によって主として生産される。マクロファージは、ア
デノウイルスのクリアランスおよびＴ細胞に対するプロセッシングされたアデノ
ウイルスの提示に関与する最初の細胞型である。ＴＮＦ−αはマクロファージに
よって生産される最も初期のサイトカインであり、続いてＩＬ−１およびＩＬ−
１２であり、非特異的炎症応答ならびに後の特異的Ｔ−細胞免疫応答を共に増強
する。

【００５５】 効果的ｓＴＮＦＲ分子および所望の遺伝子治療産物を生産するデュアル作用 を持つアデノウイルス遺伝子治療を生じさせることができるはずである。ＴＮＦ
およびリンホトキシンに結合し、それを中和することができるキメラ蛋白質を生
産するＡｄ／ＴＮＦＲベクターはマウスで発現されている（Kollsら, 1994）。 組換えアデノウイルスは、ヒト５５−ｋＤａ ＴＮＦ受容体細胞外ドメインおよ
びマウスＩｇＧ重鎖ドメインよりなる融合蛋白質を含有する（Ａｄ／ＴＮＦＲＩ
）。１×１０^９感染性粒子の注射後３日以内に、ＴＮＦ阻害剤濃度は１ｍｇ／ｍ
ｌの血漿を超えた；発現のこのレベルは少なくとも４週間維持された。Ａｄ／Ｔ
ＮＦ−ＲＩ（１０^９ｐ．ｆ．ｕ．， ｉ．ｖ．）は、Ｄ−ガラクトサミンを含む
または含まないリポ多糖での致死的攻撃に対して有意な保護を与えた（Kollsら,
1995）。ｓＴＮＦＲは肺で容易に検出でき、各々、気管内リポ多糖またはPseud
omonas aeruginosa後の低下した好中球漸増および細菌死滅に関係していた。 ＴＮＦ−αの阻害は組換えＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルスにおいてβ−ｇａｌの
発現を延長したが、アデノウイルスに対する体液性応答を阻害しなかった（デー
タは示さず）。というのは、アデノウイルスに対する応答の初期非特異的炎症成
分は抗−ウイルス抗体生産を阻害しないだろうからである。抗−ウイルス抗体の
生産は単一用量の投与後にアデノウイルスのクリアランスにおいて重要な因子で
はないが、それは、引き続いての投与に際してアデノウイルスのクリアランスで
重要な役割を演じる。ほとんどの遺伝子治療は、効果的な応答の誘導のために複
数用量の投与を必要とする。従って、Ｂ−細胞応答を制限する戦略を抗−ＴＮＦ
治療と共に取り込んで、アデノウイルス遺伝子治療の反復された投与を可能とす
る必要があろう。

【００５６】 アデノウイルスの投与経路は、遺伝子治療送達の効率および免疫原性に影響 することが示されている（Gahery-Segardら, 1997；Van Ginkelら, 1995）。ア デノウイルスに対する経口寛容性の結果、免疫原性が減少する（Ilanら, 1997) 。静脈内、腹腔内、鼻孔内および胆管内経路の結果、送達および免疫応答に差異
が生じる（Gahery-Segardら, 1997; Van Ginkelら, 1995)。アデノウイルスの静
脈内投与の結果、鼻孔内治療と比較して、肺においてより高い力価およびより長
い治療となる。鼻孔内投与は、粘膜免疫系の活性化によってより効果的な肺免疫
応答を惹起し、他方、アデノウイルスの静脈内投与および引き続いての肺への向
性は炎症応答を最小化する可能性がある。これらの結果は、アデノウイルスの非
天然投与経路が炎症応答を最小化し、アデノウイルス遺伝子治療を延長すること
を示す。

【００５７】 以下の文献を本明細書で引用した： ＡＢＲＡＨＡＭら（1994), Clin. Exp. Immunol. 98, 29-34 ＣＯＵＴＥＬＩＥＲら， (1995), J. of Virology, 69:1955-1958 ＤＡＹら，(1994), Cell. Immunl. 157, 223-238 ＤＥＬＧＡＤＯら, (1992), Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrie
r Systems 9:249-304 ＤＥＭＡＴＴＥＯら, (1996), Gene Therapy, 3:4-12 ＤＥＲＹＣＫＥＲＥら，(1995), Immuno. Biol. 193, 186-192 ＥＮＧＬＥＭＡＮＮら, (1990) J. Bio Chem 265:14497-14504 ＥＶＡＮＳら， (1996), Arthritis Rheum 39 (suppl. 9)：Ｓ２８４ ＦＩＳＨＥＲら, (1996), Treatment of septic shock with the tumor necr
osis factor receptor: Fc fusion protein, The Soluble TNF Receptor Sepsis
Study Group, New Engl. J. Med., 334, 1697-1702 ＦＩＳＨＥＲら, (1997), Neture Medicine, 3:306-312 ＧＡＨＥＲＹ−ＳＥＧＡＲＤら，(1997), Eur. J. of Immunology, 27:653-6
59 ＧＡＯ， Ｇ．Ｐ．ら, (1996), J. of Virology, 70:8934-8943 ＧＲＡＨＤＭら, (1995) Mol. Biotechnology 3:207-220 ＧＵＥＲＥＴＴＥら, (1996), Human Gene Therapy, 7:1455-1463 ＨＡＡＫ−ＦＲＥＮＤＳＣＨＯら， (1994), J. Immunol. 152, 1347-1353 ＨＥら, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7274-7278 ＩＬＡＮら, J. Clin. Invest. 98:2640-7, 1996 ＩＬＡＮら, (1997), J. Clinical Investigation, 99:1098-1106 ＪＯＯＳＳら, (1996), Hum. Gene Therapy, 7:1555-1566 ＫＡＳＳ−ＢＩＳＬＥＲら, (1996), Gene Therapy, 3:154-162 ＫＡＴＲＥ，Ｎ．Ｖ．，(1990), J. Immunol 144:209-213 ＫＡＹら, (1997), P.N.A.S., 94:4686-4691 ＫＯＬＬＳら，(1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 ＫＯＬＬＳら，(1995) J. Int. Dis. 171, 570-575 ＫＯＲＮＥＲら，(1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11857-11861 ＲＡＢＩＮＯＶＩＣＩら, (1996), Circ. Res., 78, 329-336 ＲＡＮＨＥＩＭら, J. Virol. 67, 2159-2167 ＳＡＷＣＨＵＣＫら，(1996), Hum. Gene Therapy, 7, 499-506 ＳＣＨＯＷＡＬＴＥＲら，(1997), Gene Therapy, 4:351-360 ＳＭＩＴＨら，(1994), Cell 76, 959-962 ＳＭＩＴＨら，(1996), Gene Therapy, 3:496-502 ＴＵＦＡＲＩＥＬＬＯ，Ｊ．ら,(1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1
0987-10991 ＶＡＮ ＧＩＮＫＥＬら, (1995), Hum. Gene Therapy, 6, 895-903 ＶＩＬＱＵＩＮら，(1995), Hum. Gene Therapy, 6:1391-1401 ＷＯＬＤ，Ｗ．Ｓ．, (1993), J. Cell. Biochem. 53, 329-335 ＷＯＯＬＥＹら, (1993), J. Immunol., 151, 6602-6607 ＷＲＩＧＨＴら，(1997) Gene Therapy, 4:317-322 ＳＵら，(1998), Arthritis Rheum, 41:(In Press) ＹＡＮＧら, (1995a): Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:7257-7261 ＹＡＮＧら, (1995b), Nature Med. 1, 890-893 ＹＡＮＧら, (1995c) J. of Immunology, 155:2564-2570 ＹＡＮＧら，(1996a) J. of Virology, 70:6370-6377 ＹＡＮＧら，(1996b) Gene Therapy, 3:412-420 ＹＡＮＧら，(1996c), J. of Virol. 70:7209-7212 ＹＡＮＧら，(1996d), Gene Therapy, 3:137-144 ＹＯＵＮＧら，(1993), Anal. Biochem. 215:24-30 本明細書中で言及したいずれの特許または刊行物も、本発明が属する当業者 のレベルを示す。これらの特許および刊行物をここに引用して、各個々の刊行物
が引用により具体的にかつ個々に一体化されることを示すように同一程度一体化
させる。

【００５８】 当業者であれば、本発明が、対象を実施し、言及された目的および利点、な らびに固有のものを得るのによく適合されているのを容易に認識するであろう。
本明細書に記載された方法、手法、処理、分子および具体的化合物と共に本実施
例は、現在、好ましい具体例の代表的なものであり、例示的であり、本発明の範
囲を限定する意図ではない。ここにおける変形および他の使用が当業者に起こり
、これは請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＴＮＦの血清レベルに対するＴＮＦ−ｂｐ処理の効果を示す。

【図２】 図２は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与後の肺炎症侵潤を示す。

【図３】 図３は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与後のβ−Ｇａｌ発現を示す。

【図４】 図４は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後における肝臓炎症応答を示す。

【図５】 図５は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後におけるβ−Ｇａｌ発現を示す。

【図６】 図６は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内投与後の肝臓β−Ｇａｌ発現を示す。

【図７】 図７は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの鼻孔内投与後の肝臓β−Ｇａｌ発現を示す。

【図８】 図８は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺの静脈内（ＩＶ）および鼻孔内（ＩＮ）投与後第 ７日における肝臓および肺におけるβ−Ｇａｌ発現を示す。

【図９】 図９は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス投与後第１６日に測定された抗−アデノ ウイルス細胞毒性Ｔ細胞応答を示す。

【図１０】 図１０は、ＡｄＣＭＶｌａｃＺウイルス投与後第１６日および第３０日に測定 された抗−アデノウイルス応答を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，Ｂ Ｙ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，Ａ Ｍ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ザング，ハング−ジー アメリカ合衆国 アラバマ州 35216 バ ーミンガム ティロル ロード 3240 (72)発明者 ゾウ，トング アメリカ合衆国 アラバマ州 35226 バ ーミンガム ウェスト ストーンブルック プレイス 332 (72)発明者 エドワーズ，カール ケー アメリカ合衆国 コロラド州 80027 ス ーペリア ピットキン アヴェニュー 1620 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 CA04 DA03 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA17 4C084 AA02 AA03 AA13 BA42 BA44 DA25 MA59 MA66 NA14 ZB112 4C087 AA01 AA02 BC83 MA59 MA66 NA14 ZB11 4H045 AA30 DA14 EA22

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する
   工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス遺伝子発現を増
   加させる方法。
2. 【請求項２】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が腫瘍壊死因子結合蛋白質のポ
   リエチレングリコール−連結ダイマーであることを特徴とする請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が約０．３ｍｇ／ｋｇないし約
   ５．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が鼻孔内投与されることを特徴
   とする請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が静脈内投与されることを特徴
   とする請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質の結果、血清腫瘍壊死因子−α
   が減少することを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 薬理学上有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白質を動物に投与する
   工程を含むことを特徴とする動物の組織においてアデノウイルス投与に関連した
   炎症応答を減少させる方法。
8. 【請求項８】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が腫瘍壊死因子結合蛋白質のポ
   リエチレングリコール−連結ダイマーであることを特徴とする請求項７記載の方
   法。
9. 【請求項９】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が約０．３ｍｇ／ｋｇないし約
   ５．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする請求項７記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が鼻孔内投与されることを特
    徴とする請求項７記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質が静脈内投与されることを特
    徴とする請求項７記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記腫瘍壊死因子結合蛋白質の結果、血清腫瘍壊死因子−
    αが減少することを特徴とする請求項７記載の方法。