JP7384815B2 - 肺の修復に関する方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2018年3月22日出願の米国仮出願第62/646,493号の恩典を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる。

配列表
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、その全体を参照により本明細書に組み入れる。2019年1月24日に作成されたこのASCIIコピーは、701039-090440WOPT_SL.txtと名付けられ、87,789バイトのサイズである。

技術分野
本明細書に記載される技術は、肺組織の成長および／または修復を誘導する方法に関する。

背景
血管内皮成長因子（VEGF）は、血管新生および組織成長の鍵となる調節因子である。これまでに、可溶性VEGF受容体（sFlt1）が、循環中のVEGFを除去し、腫瘍成長の阻害および肝臓再生の阻害を提供することが示されている。しかし、本明細書に示されるように、sFlt1は、腫瘍および肝臓において以前に報告された活性とは正反対に、肺組織の成長および修復において驚くべきかつ予想外の様式で作用する。

概要
本明細書に記載されるように、本発明者らは、驚くべきことに、肺組織の成長および修復に関して、sFlt1が組織成長および修復の速度を早めるよう作用することを見出した。この活性は、それがVEGFを阻害するよう機能するという、sFlt1が他の組織において示す活性と正反対である。

任意の態様の1つの局面において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを肺組織と接触させる工程を含む、肺組織の成長および／または修復を誘導する方法が、本明細書に記載される。任意の態様の1つの局面において、治療有効量のsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象において肺組織の成長および／または修復を誘導する方法が、本明細書に記載される。

任意の局面のいくつかの態様において、肺組織の成長および／または修復は、代償性肺成長（compensatory lung growth）である。任意の局面のいくつかの態様において、対象は、重度肺形成不全、形成不全性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、気管支肺異形成、気腫、低肺胞数疾患（a disease with deficient alveolar count）、肺胞毛細血管異形成を有する対象、または肺切除術を受けた対象である。任意の局面のいくつかの態様において、対象は、炎症状態と診断されていない、または炎症状態に対する処置を必要としない。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、sFlt1ポリペプチドである。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列を含むポリペプチドである。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列と少なくとも95％同一の配列を含み、かつSEQ ID NO:2～13のポリペプチドの活性を保持しているポリペプチドである。

任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストはさらに、sFlt1ポリペプチドに結合されたFcドメインを含む。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは気道投与される。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは静脈内投与される。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは局所投与される。

任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは、約5 mcg/kg～約50 mcg/kgの用量で投与される。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは、約20 mcg/kgの用量で投与される。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、HIF1σ、HIF1βおよび／またはHIF2σのアゴニストである。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは、HIF1σ、HIF1βおよび／もしくはHIF2σポリペプチド、ならびに／または該ポリペプチドをコードする核酸である。任意の局面のいくつかの態様において、アゴニストは、HIFプロリルヒドロキシラーゼアンタゴニストである。任意の局面のいくつかの態様において、HIFプロリルヒドロキシラーゼアンタゴニストは、JTZ-951、FG-4592、GSK1278863、FG-4592またはMK-8617である。

任意の局面のいくつかの態様において、肺組織および／または対象において内因性VEGFレベルが上昇する。任意の局面のいくつかの態様において、この方法は、より大きな肺容量、最大吸気量の増加、運動能力の向上、および／または肺コンプライアンスの向上をもたらす。

sFlt1が術後第4日で肺容量を増加させることを示すグラフを示している。LV/BW：肺容量／体重。 sFlt1が肝臓（上）および脾臓（下）の器官量を変化させないことを示すグラフを示している。LW/BW：肝臓重量／体重、SW/BW：脾臓重量／体重。 sFlt1が術後第4日で最大吸気量を増加させることを示すグラフを示している。IC/BW：最大吸気量／体重。 sFlt1が術後第4日で肺エラスタンス（上）およびコンプライアンス（下）を改善することを示すグラフを示している。 シグナル伝達経路活性の概要を示している。 実験デザインの概要を示している。 sFlt1投与が肺成長を促進したことを示すグラフを示している。 用量応答実験の概要を示している。 sFlt1用量応答のグラフを示している。 20 mcg/kgのsFlt1の投与が肺機構を改善したことを示すグラフを示している。 sFlt1投与がVEGFおよびHIF-2αの両方のレベルを予想外に増加させることを示している。 HIF-2αレベルの免疫組織化学測定を示している。 低酸素誘導因子シグナル伝達の概要を示している。 HIF-2α阻害剤PT-2385の効果を調査する実験の概要を示している。 HIF-2α阻害がsFlt1の効果を鈍化させたことを示すグラフを示している。 sFlt1投与が運動耐性試験においてベースライン活性を向上させたことを示すグラフを示している。 HIF-2α阻害が、運動耐性試験におけるベースライン活性に対するsFlt1投与の効果を鈍化させたことを示すグラフを示している。

詳細な説明
本明細書に示されるように、sFlt1は肺組織の成長および／または修復を増進するよう作用し、それによって損傷した肺組織において肺容量、最大吸気量、肺エラスタンスおよび／または肺コンプライアンスを改善する。本明細書には、この効果がsFlt1-Hifシグナル伝達網を通じて機能する証拠も示されている。したがって、任意の態様の1つの局面において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを肺組織と接触させる工程を含む、肺組織の成長および／または修復を誘導する方法が、本明細書に記載される。任意の態様の1つの局面において、治療有効量のsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象において肺組織の成長および／または修復を誘導する方法が、本明細書に記載される。

肺組織の成長および／または修復の誘導は、新しい肺組織の形成の増加、既存の肺組織の成長および／もしくは拡張、または肺組織の損傷（例えば、瘢痕化、線維化、形成不全等）の程度もしくは範囲の減少を含み得る。肺組織の成長および／または修復は、組織学的にまたは、例えば本明細書の実施例に記載されるように、肺組織のパフォーマンスの1つもしくは複数の機能的尺度のアッセイによって、測定または決定され得る。任意の局面のいくつかの態様において、肺組織の成長および／または修復の増進は、より大きな肺容量、最大吸気量の増加、運動能力の向上、および／または肺コンプライアンスの向上であり得る。

本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、標的の発現および／または活性を少なくとも10％またはそれ以上、例えば、10％もしくはそれ以上、50％もしくはそれ以上、100％もしくはそれ以上、200％もしくはそれ以上、500％もしくはそれ以上、または1000％もしくはそれ以上増加させる作用物質を表す。例えばsFlt1の、アゴニストの効果、例えば、sFlt1のレベルおよび／または活性を増加させるその能力は、例えば、sFlt1の発現産物のレベルおよび／またはsFlt1の活性を測定することによって、決定され得る。特定のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定する方法は、当業者に公知である、例えば、プライマーを用いるRTPCRが、RNAのレベルを決定するために使用され得、抗体を用いるウェスタンブロットが、ポリペプチドのレベルを決定するために使用され得る。特定の標的に対する適切なプライマーは、例えば、この目的で広く利用されているソフトウェア（例えば、両方ともワールドワイドウェブ上で利用可能なPrimer3またはPrimerBank）を用いて、当業者により容易に特定される。sFlt1に対する抗体の非限定的な例は市販されており、例えば、Santa Cruz Biotechnology（Dallas, TX）社のカタログ番号sc-316である。sFlt1の活性、例えば肺組織の成長／修復のレベル、および／または遊離もしくは循環中VEGFのレベルを測定するアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。

特定のポリペプチド標的、例えばsFlt1のアゴニストの非限定的な例は、標的ポリペプチドまたはその変種もしくは機能的フラグメント、および該ポリペプチドまたはその変種もしくは機能的フラグメントをコードする核酸を含み得る。任意の局面のいくつかの態様において、Flt1のアゴニストは、sFlt1ポリペプチドまたはその変種もしくは機能的フラグメントおよび／または該ポリペプチドまたはその変種もしくは機能的フラグメントをコードする核酸である。

本明細書で使用される場合、「sFlt1」または「可溶性FMS様チロシンキナーゼ1」は、Flt1遺伝子によってコードされるVEGF受容体の可溶性変種を表す。sFlt1の配列は、多くの種、例えばヒトsFlt1（Flt1のNCBI Gene IDは2321である）mRNA配列（例えば、NM_001159920.1（SEQ ID NO: 1））およびポリペプチド配列（例えば、NP_001153392.1（SEQ ID NO: 2）およびSEQ ID NO:4）ならびにマウスsFlt1ポリペプチド配列（例えば、SEQ ID NO:3）について公知となっている。sFlt1ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、例えばFlt1膜貫通ドメインを含まない。

任意の局面のいくつかの態様において、例えばsFlt1の、アゴニストは、sFlt1ポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドアゴニストは、改変されたおよび／または組み換えポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドアゴニストは、ポリペプチド、例えばその機能的フラグメント、をコードする核酸であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、核酸は、ベクターに含まれ得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、ヒトsFlt1ポリペプチドの配列、例えばSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4を含むポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、ヒトsFlt1ポリペプチドの配列、例えばSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4から本質的になるポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、ヒトsFlt1ポリペプチドの配列、例えばSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4からなるポリペプチドであり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4の配列を含むポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4の配列から本質的になるポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4の配列からなるポリペプチドであり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、ヒトsFlt1ポリペプチドをコードする配列、例えば、SEQ ID NO:1を含む核酸であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:2または4のポリペプチドをコードする配列を含む核酸であり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12または13の配列を含むポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12または13の配列から本質的になるポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12または13の配列からなるポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、sFlt1ポリペプチド、例えばSEQ ID No:5、6、7、8、9、10、11、12または13の配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸であり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1アゴニストは、SEQ ID NO:2～13のうちの1つと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも98％同一の配列を含み、かつSEQ ID No:2～13のうちの1つのポリペプチドのVEGF結合活性を保持するポリペプチドであり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、例えばsFlt1の、アゴニストは、sFlt1ポリペプチド、例えば外因性sFlt1ポリペプチドであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、標的細胞および／または対象は、外因性sFlt1ポリペプチドと接触させられるおよび／または外因性sFlt1ポリペプチドを投与される、例えば、sFlt1ポリペプチドがインビトロで産生および／または合成され、精製されたsFlt1ポリペプチドが標的細胞および／または対象に提供される。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1のアゴニストは、例えばそのアゴニストの半減期を延長するよう、Fcドメインポリペプチド、例えばヒトFcドメインに結合されたsFlt1ポリペプチドを含み得る。適切なFcドメイン配列は、当技術分野で公知である（例えば、ヒトIgG1のPro100～Lys330）。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1のアゴニストは、例えば担体と共にまたはそれなしで、ナノ粒子中または局所配合物中に提供され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、例えばsFlt1の、アゴニストは、sFlt1（またはその変種もしくは機能的フラグメント）の配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および／またはsFlt1（またはその変種もしくは機能的フラグメント）の配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含むベクターであり得る。ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、RNA分子、プラスミドおよび／または発現ベクターであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、mRNAであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、修飾されたmRNAであり得る。

任意の局面のいくつかの態様において、例えばsFlt1の、アゴニストは、sFlt1ポリペプチド、例えば外因性および／または異所性sFlt1ポリペプチドをコードする核酸であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、標的細胞および／または対象は、外因性および／もしくは異所性sFlt1ポリペプチドをコードする核酸と接触させられるおよび／またはそのような核酸を投与される、例えば、核酸は、標的細胞および／または対象に外因性および／または異所性sFlt1を提供するよう、接触または投与工程の後に転写および／または翻訳される。

sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、sFlt1または肺組織の成長／修復を制御する上でそれを通じてシグナル伝達する任意のHifポリペプチド、例えばHIF1σ、HIF1βおよび／またはHIF2σの発現および／または活性を増加させる作用物質である。HIF-1は、アルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む転写複合体である。

本明細書で使用される場合、「HIF1σ」または「低酸素誘導因子1アルファサブユニット」は、bHLH DNA結合ドメイン、PASヘテロ二量体化ドメイン、およびC末端動員ドメインを含む、HIF-1転写複合体のアルファサブユニットを表す。HIF1σの配列は、多くの種で公知となっている、例えば、ヒトHIF1σ（NCBI Gene IDは3091である）mRNA配列（NM_001243084.1；NM_001530.3；およびNM_181054.2）ならびにポリペプチド配列（NP_001230013.1；NP_001521.1；およびNP_851397.1）。

本明細書で使用される場合、「HIF1β」、「低酸素誘導因子1ベータサブユニット」または「ARNT」は、bHLH DNA結合ドメイン、PASヘテロ二量体化ドメイン、およびC末端動員ドメインを含む、芳香族炭化水素受容体核輸送体であるHIF-1転写複合体のベータサブユニットを表す。HIF1βの配列は、多くの種で公知となっている、例えば、ヒトHIF1β（NCBI Gene IDは405である）mRNA配列（NM_001197325.1；NM_001286035.1；NM_001286036.1；NM_001350224.1；NM_001350225.1；NM_001350226.1；NM_001668.3；およびNM_178427.2）ならびにポリペプチド配列（NP_001184254.1；NP_001272964.1；NP_001272965.1；NP_001337153.1；NP_001337154.1；NP_001337155.1；NP_001659.1；およびNP_848514.1）。

本明細書で使用される場合、「HIF2σ」、「EPAS1」または「低酸素誘導因子2アルファサブユニットは、bHLH DNA結合ドメイン、PASヘテロ二量体化ドメイン、およびC末端動員ドメインを含む、HIF-1転写複合体のアルファサブユニットを表す。HIF2σの配列は、多くの種で公知となっている、例えば、ヒトHIF2σ（NCBI Gene IDは2034である）mRNA配列（NM_001430.4）およびポリペプチド配列（NP_001421.2）。

いくつかの態様において、sFlt1のアゴニストまたはsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、低分子、例えば、HIFの分解を阻害する低分子、例えばHIFプロリルヒドロキシラーゼアンタゴニストであり得る。そのような低分子の非限定的な例は、JTZ-951（PMID：29259755）、FG-4592（PMID：29153032）、GSK1278863（PMID；28928122）、FG-4592（PMID：28371815）およびMK-8617（PMID：28002958）を含む。適切な低分子は、当技術分野で、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるGupta et al. Am J Kidney Dis 2017 69:815-826によって、さらに議論されている。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される接触または投与は、肺組織および／または対象における（例えば、対象の循環中または肺における）内因性VEGFのレベルを増加させる。VEGFレベルは、当業者によって、例えば容易に利用可能な免疫学的方法を用いて、測定され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、この方法は、肺組織を本明細書に記載される作用物質と接触させる工程を含む。肺組織との接触は、エクスビボで維持されている肺と接触させることを含み得る、または作用物質の少なくとも一部が対象の肺組織に到達するよう作用物質を対象に投与することを含み得る。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される作用物質を用いた、重度肺形成不全、形成不全性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、気管支肺異形成、気腫、低肺胞数疾患、低肺胞数、および／または肺胞毛細血管異形成を有するまたは有すると診断された対象の処置に関する。任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される作用物質を用いた、肺切除術、例えば部分または完全肺切除術を受けた対象の処置に関する。これらの状態の1つまたは複数、例えば気腫を有する対象は、現行の気腫診断方法を用いて医師により特定され得る。これらの状態を特徴づけ、かつ診断の補助となる気腫の症状および／または合併症は、当技術分野で周知であり、息切れを含むがこれに限定されない。例えば気腫の、診断を補助し得る試験は、胸部x線、CT走査および肺機能試験を含むがこれらに限定されない。気腫の家族歴または気腫の危険因子への暴露（例えば、たばこ煙暴露、大気汚染暴露、煙霧／粉塵暴露）もまた、対象が気腫を有している可能性があるかどうかを決定するのを、または気腫の診断を行うのを補助し得る。

本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、対象は、炎症疾患または状態を有さないまたは有すると診断されていない対象である。本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、対象は、炎症から生じるまたは炎症により悪化する疾患または状態を有さないまたは有すると診断されていない対象である。本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、対象は、彼らの肺組織に炎症を有さないまたは有すると診断されていない対象である。

本明細書に記載される組成物および方法は、本明細書に記載される状態を有するまたは有すると診断された対象に投与され得る。任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、状態の症状を緩和するよう、有効量の本明細書に記載される組成物、例えばsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを対象に投与する工程を含む。本明細書で使用される場合、「症状を緩和する」は、任意の状態または該状態に付随する症状を軽減することである。同等の未処置対照と比較して、そのような減少は、任意の標準的技術による測定で、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上のものである。本明細書に記載される組成物を対象に投与する様々な手段が、当業者に公知である。そのような方法は、経口、非経口、静脈内、筋内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、肺、皮膚、注射または局所投与を含み得るがこれらに限定されない。投与は、局所性または全身性であり得る。

「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または障害の少なくとも1つまたはそれ以上の症状を緩和するのに必要となるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの量を表し、所望の効果を提供する薬理学的組成物の十分な量に関する。「治療有効量」という用語は、したがって、典型的な対象に投与されたときに一定の成長および／または修復効果を提供するのに十分なsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの量を表す。本明細書で使用される有効量はまた、様々な文脈で、疾患の症状の発生を遅らせる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、非限定的に、疾患の症状の進行を遅くする）、または疾患の症状を好転させるのに十分な量も含むであろう。したがって、正確な「有効量」を特定することは、通常、実現可能でない。しかし、任意の与えられた例において、適当な「有効量」は、従来的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。

有効量、毒性および治療効果は、例えばLD50（集団の50％に対して致死性の用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定され得る。用量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して異なり得る。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表され得る。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算され得る。また、用量は、細胞培養物においてまたは適当な動物モデルにおいて決定されたIC50（すなわち、症状の最大半量阻害を達成するsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう動物モデルにおいて決定され得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の用量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えば、特に肺機能および／またはVEGFレベルのアッセイによって観察され得る。用量は、医師によって決定され得、必要な場合、観察される処置の効果に適合するよう調節され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト、および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関連する。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストから本質的になる。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストからなる。薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒を含む。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。薬学的に許容される担体として機能し得る物質のいくつかの非限定的な例は、（1）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（8）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤ワックス；（9）油、例えばピーナツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（10）グリコール、例えばポリエチレングリコール；（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）；（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）発熱物質非含有水；（17）等張性生理食塩水；（18）リンガー溶液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）バルク剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（23）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL；（22）C₂～C₁₂アルコール、例えばエタノール；ならびに（23）薬学的配合物において用いられる他の非毒性適合物質を含む。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、フレーバー剤、芳香剤、保存剤および抗酸化物質もまた、配合物中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等の用語は、本明細書で言い換え可能に使用される。任意の局面のいくつかの態様において、担体は、活性作用物質、例えば本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの分解を阻害する。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む薬学的組成物は、非経口投薬形態であり得る。非経口投薬形態の投与は典型的に混入物質に対する患者の自然防御を迂回するので、非経口投薬形態は好ましくは滅菌性であるかまたは患者への投与前に滅菌することができるものである。非経口投薬形態の例は、注射可能な溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁可能な乾燥物、注射可能な懸濁物および乳濁物を含むがこれらに限定されない。加えて、DUROS（登録商標）型投薬形態およびドーズ・ダンピング（dose-dumping）を含むがこれらに限定されない制御放出非経口投薬形態が、患者への投与のために調製され得る。

開示されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの非経口投薬形態を提供するために使用され得る適切なビヒクルは、当業者に周知である。例は、非限定的に、滅菌水；注射用水USP；生理食塩水溶液；グルコース溶液；水性ビヒクル、例えば、非限定的に、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液ならびに乳酸加リンガー注射液；水混和性ビヒクル、例えば、非限定的に、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、例えば、非限定的に、トウモロコシ油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルを含む。本明細書に開示されるアゴニストの薬学的に許容される塩の溶解性を変化させるまたは調整する化合物もまた、従来型および制御放出非経口投薬形態を含む本開示の非経口投薬形態に組み入れられ得る。

sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む薬学的組成物はまた、経口投与に適するよう、例えば個別の投与形態、例えば、非限定的に、錠剤（非限定的に、切り込み線入り錠剤、コーティング錠を含む）、ピル、カプレット、カプセル、チュワブル錠、粉末パケット、サシェ、トローチ、ウエハース、エアゾールスプレーまたは液体、例えば、非限定的に、シロップ、エリキシル、溶液または水性液、非水性液、水中油乳濁物もしくは油中水乳濁物中懸濁液として配合され得る。そのような組成物は、既定量の開示される化合物の薬学的に許容される塩を含み、当業者に周知の製薬法によって調製され得る。一般論として、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照のこと。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に開示されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、吸入によって、例えば蒸気もしくはエアゾール配合物として、または噴霧によって投与され得る。エアゾールとして使用する場合、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、適切なプロペラント、例えば、プロパン、ブタンまたはイソブタン等の炭化水素プロペラントおよび従来的なアジュバントと共に加圧されたエアゾール容器内に充填され得る溶液または懸濁物中に提供され得る。本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストはまた、非加圧形態で、例えば、ネブライザーまたはアトマイザーで投与され得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストはまた、例えば吸入器の使用により、乾燥粉末の形態で気道に直接投与され得る。呼吸道への送達のためのエアゾールは、当技術分野で公知である。例えば、これらすべての内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990)；Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995)；Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990)；Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) ならびにペプチドおよびタンパク質の全身送達も可能なもの(Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992))；Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995)；およびTansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994)；French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996)；Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989))；Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992)；Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988)；Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995)；Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992)；Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990)；Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994)；Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996)；Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995)；ならびにKobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)を参照のこと。

従来的な投薬形態は、一般に、配合物からの迅速または即時の薬物放出を提供する。その薬物の薬理学および薬物動態に依存して、従来型投薬形態の使用は、患者の血液および他の組織における薬物の濃度の大きな変動をもたらし得る。これらの変動は、多くのパラメータ、例えば、投薬頻度、作用発現、効果期間、治療血中レベルの維持、毒性、副作用等に影響し得る。制御放出配合物は、薬物の作用発現、作用期間、治療ウィンドウ内の血漿レベルおよびピーク血中レベルを制御するために使用できる点で有用である。特に、制御放出または延長放出投薬形態または配合物は、薬物の過少投薬（すなわち、最小治療レベル以下への降下）およびその薬物の毒性レベルの超過の両方から起こり得る、潜在的副作用および安全性の懸念を最小限に抑えつつ薬物の最大効果を達成することを確実にするために使用され得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、持続放出配合物で投与され得る。

制御放出性薬品は、それらの非制御放出対応物により達成されるよりも薬物治療を改善するという共通の目標を有する。理想的には、薬物処置における最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の時間内にその状態を治癒または制御するために用いられる最小限の薬物物質により特徴づけられる。制御放出配合物の利点は、1）薬物の活性の長期持続；2）投薬頻度の減少；3）患者のコンプライアンスの向上；4）より少ない総薬物量の使用；5）局所または全身性の副作用の減少；6）薬物蓄積の最小化；7）血中レベルの変動の減少；8）処置の効果の改善；9）薬物活性の増強または損失の減少；および10）疾患または状態の制御の速度の改善を含む。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.:2000)。

大部分の制御放出配合物は、所望の治療効果を即座に生じる量の薬物（活性成分）を最初に放出し、そして徐々にかつ継続的に、この治療または予防効果のレベルを維持する別の量の薬物を長期間にわたって放出するよう設計される。体内でこの一定の薬物レベルを維持するために、薬物は、代謝され体内から排出される薬物量と置き換わる速度で投薬形態から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水および他の生理学的条件または化合物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激され得る。

様々な公知の制御放出または延長放出投薬形態、配合物およびデバイスが、本開示の塩および組成物と共に使用するのに適合され得る。例は、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185号に記載されるものを含むがこれらに限定されない。これらの投薬形態は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性メンブレン、浸透圧システム（例えば、OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA））または様々な比率で所望の放出プロフィールを提供するそれらの組み合わせを用いた、1つまたは複数の活性成分の緩やかなまたは制御された放出を提供するために使用され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、気道投与される。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、静脈内投与される。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストは、単剤療法として投与される、例えば、本明細書に記載される状態、例えば肺の状態、のための別の処置は、対象に行われない。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法はさらに、例えば併用療法の一部として、対象に第2の作用物質を投与するおよび／または処置を行う工程を含み得る。

特定の態様において、本明細書に記載されるsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む有効用量の組成物は、患者に一度投与され得る。特定の態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む有効用量の組成物は、患者に繰り返し投与され得る。全身投与の場合、対象は、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む治療量の組成物、例えば0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kgまたはそれ以上を投与され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、約5 mcgポリペプチド/kg～約50 mcgポリペプチド/kgの用量で投与される。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、5 mcgポリペプチド/kg～50 mcgポリペプチド/kgの用量で投与される。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、約10 mcgポリペプチド/kg～約40 mcgポリペプチド/kgの用量で投与される。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、10 mcgポリペプチド/kg～40 mcgポリペプチド/kgの用量で投与される。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニスト（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、約20 mcgポリペプチド/kgの用量で投与される。

任意の局面のいくつかの態様において、初回処置レジメンの後に、処置はより低頻度で実施され得る。例えば、3ヶ月間の隔週処置の後に、処置は、6ヶ月または1年またはそれ以上の間、月に1度繰り返され得る。本明細書に記載される方法にしたがう処置は、状態のマーカーまたは症状のレベル、例えばVEGFレベルおよび／または肺機能の少なくとも1つの尺度を、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％もしくは少なくとも90％またはそれ以上、減少させ得る。

本明細書に記載される組成物の用量は、医師によって決定され得、そして必要な場合、観察される処置の効果に適するよう調節され得る。処置の期間および頻度に関して、処置がいつ治療的利益を提供するかを決定するために、および用量を増加もしくは減少させるかどうか、投与頻度を増加もしくは減少させるかどうか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうかまたはその処置レジメンに対する他の代替処置レジメンを作成するかどうかを決定するために、医師が対象を観察するのが典型的である。投薬スケジュールは、多くの臨床的因子、例えばsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストに対する対象の感受性に依存して、週に1回から毎日まで様々であり得る。所望の活性化の用量または量は、一度に投与され得、または分割量、例えば2～4分割量に分割され、一定期間にわたって、例えば一日を通じて適切な間隔でもしくは他の適当なスケジュールで投与され得る。任意の局面のいくつかの態様において、投与は、長期的、例えば数週または数ヶ月にわたる毎日の1回または複数回の投薬および／または処置であり得る。投薬および／または処置スケジュールの例は、1週、2週、3週、4週、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月もしくは6ヶ月またはそれ以上の期間にわたる、毎日、1日2回、1日3回、または1日4回もしくはそれ以上の回数の投与である。sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを含む組成物は、一定期間にわたり、例えば5分間、10分間、15分間、20分間または25分間の時間にわたり投与され得る。

本明細書に記載される方法にしたがうsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの投与の用量範囲は、例えば、該アゴニストの形態、その効能および本明細書に記載される状態の症状、マーカーまたは指標がどの程度減少することが望まれるか、例えば、例えば肺の成長および／または修復がどの程度誘導されることが望まれるか、に依存する。用量は、副作用、例えば過形成を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、用量は、患者の年齢、状態および性別によって異なり、それは当業者によって決定され得る。用量はまた、任意の合併症が発生した際に個々の医師によって調節され得る。

例えば本明細書に記載される状態の処置におけるまたは本明細書に記載される応答を誘導するsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストの効果は、医師によって決定され得る。しかし、処置は、本明細書に記載される状態の兆候または症状の1つまたは複数が有益な様式で変化する、他の臨床的に受け入れられる症状が改善もしくは軽減さえされる、または本明細書に記載される方法にしたがう処置の後に所望の応答が例えば少なくとも10％誘導される場合に、本明細書で使用される意味での「有効な処置」であるとみなされる。効果は、例えば、本明細書に記載される方法にしたがい処置される状態のマーカー、指標、症状および／もしくは発生または任意の他の測定可能な適当なパラメータ、例えばVEGFレベルおよび／または肺機能、を測定することによって評価され得る。効果はまた、入院によって評価される個人の悪化または医学的介入の必要性の欠如（すなわち、疾患の進行が停止すること）によって測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物（いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、（1）疾患の阻害、例えば、症状（例えば、疼痛もしくは炎症）の悪化の防止；または（2）疾患の重篤度の緩和、例えば、症状の後退を含む。疾患の処置のための有効量は、それを必要とする対象に投与された場合に、その疾患に対して、本明細書で定義される意味での有効な処置をもたらすのに十分である量を意味する。作用物質の効果は、状態の物理的指標または所望の応答（例えば、VEGFレベルおよび／または肺機能）を評価することによって決定され得る。そのようなパラメータの任意の1つまたはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって投与および／または処置の効果を観察することは、当業者の能力の範囲内である。効果は、本明細書に記載される状態の動物モデル、例えば、肺切除術のマウスモデルの処置、において評価され得る。実験動物モデルを使用する場合、処置の効果は、マーカー、例えば、本明細書の実施例に記載される肺機能の少なくとも1つの機能的尺度、に関して統計的に有意な変化が観察される場合に証明される。特定の用量の組み合わせの効果もまた、動物モデル、例えば肺切除術のマウスモデルにおいて評価され得る。

便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される一部の用語およびフレーズの意味を以下に提供する。それ以外のことが示されていない限り、または文脈から暗示されていない限り、以下の用語およびフレーズは、以下に提供される意味を含む。定義は、具体的実施態様の説明を補助するために提供され、特許請求の範囲に記載の発明を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって広く理解されているのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と本明細書に提供されるその定義の間に明らかな食い違いがある場合、本明細書内に提供される定義が優先される。

便宜上、本願の明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここにまとめる。

「減少（decrease）」、「減少（reduced）」、「減少（reduction）」または「阻害」という用語はすべて、統計的に有意な量の減少を意味するよう本明細書で使用される。任意の局面のいくつかの態様において、「減少（reduce）」、「減少（reduction）」または「減少（decrease）」または「阻害（inhibit）」は典型的に、参照レベル（例えば、特定の処置または作用物質の非存在）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書で使用される場合、「減少」または「阻害」は、参照レベルと比較しての完全な阻害または減少を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較しての100％阻害である。減少は好ましくは、特定の障害を有さない個体にとって正常範囲内として受け入れられるレベルへの低下であり得る。

「増加（increased）」、「増加（increase）」、「増強」または「活性化」という用語はすべて、統計的に有意な量の増加を意味するよう本明細書で使用される。任意の局面のいくつかの態様において、「増加（increased）」、「増加（increase）」、「増強」または「活性化」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは100％を含む最大100％の増加、もしくは10～100％の間の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍～10倍の間の任意の増加もしくはそれ以上を意味し得る。マーカーまたは症状との関係で、「増加」は、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯類、家畜動物または狩猟動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルを含む。げっ歯類は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、およびサカナ、例えばマス、ナマズおよびサケを含む。任意の局面のいくつかの態様において、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書において言い換え可能に使用される。

好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、本明細書に記載される状態の動物モデルに相当する対象として使用することができる利点がある。対象は、雄性または雌性であり得る。

対象は、処置を必要とする状態またはそのような状態に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されているか、あるいはそれらを患っているもしくは有すると特定されており、かつ任意で、その状態またはその状態に関係する1つもしくは複数の合併症に対する処置を既に受けた対象であり得る。あるいは、対象はまた、その状態またはその状態に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない対象であり得る。例えば、対象は、その状態またはその状態に関係する1つもしくは複数の合併症に関する1つまたは複数のリスク因子を示す対象またはリスク因子を示さない対象であり得る。

特定の状態に対する処置を「必要とする対象」は、その状態を有する対象、その状態を有すると診断された対象、またはその状態を発生させるリスクがある対象であり得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において言い換え可能に使用され、隣接する残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって相互に接続されたアミノ酸残基群を示す。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関わらず、修飾アミノ酸（例えばリン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸アナログを含むアミノ酸のポリマーを表す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的大きなポリペプチドに対して使用され、一方「ペプチド」という用語は、多くの場合、小さなポリペプチドに対して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複している。遺伝子産物およびそのフラグメントを表す場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において言い換え可能に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメント、ならびに前記の他の等価物、変種、フラグメントおよびアナログを含む。

本明細書に記載される様々な態様において、記載される特定のポリペプチドのいずれかの変種（天然に存在するもしくはそれ以外の）、対立遺伝子、ホモログ、保存的修飾変種および／または保存的置換変種が包含されることがさらに意図されている。アミノ酸配列に関して、当業者は、そのコードされる配列中の単一のアミノ酸または少ない比率のアミノ酸を変化させる核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が「保存的修飾変種」であり、その変化はアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸と置換しつつそのポリペプチドの所望の活性を維持するものであることを理解するであろう。そのような保存的修飾変種は、本開示に沿う多型変種、種間ホモログおよび対立遺伝子に加わるものであり、これらを排除するものではない。

天然に存在するポリペプチドおよび核酸（またはそれらのフラグメント）が本明細書に記載される場合、その参照ポリペプチドおよび／または核酸の天然に存在するホモログ、オルソログおよび対立遺伝子が代替の態様において使用され得ることが、本明細書で意図されている。そのようなホモログ、オルソログおよび対立遺伝子の配列は、配列相同性検索または、例えばNCBIによって管理されているような、データベースへの問い合わせによって容易に入手される。

アミノ酸は、類似の生理化学的特性を有する残基によって、例えば、1つの脂肪族残基を別の脂肪族残基で（例えばIle、Val、LeuまたはAlaを相互に）置換することによって、または1つの極性残基と別の極性残基の置換（例えば、LysとArg；GluとAsp；またはGlnとAsnの間の置換）によって、置き換えられ得る。他のそのような保存的置換、例えば類似の疎水性特性を有する領域全体の置換、は周知である。保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドは、所望の活性、例えばネイティブまたは参照ポリペプチドのVEGF結合活性および特異性が維持されていることを確認するために、本明細書に記載されるアッセイのいずれか1つにおいて試験され得る。

アミノ酸は、（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)における）それらの側鎖の特性の類似性にしたがいグループ分けされ得る：（1）非極性：Ala（A)、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P)、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性：Gly（G)、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q)；（3）酸性：Asp（D)、Glu（E）；（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づきグループに分類され得る：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の配向に影響する残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を伴うものである。具体的な保存的置換は、例えば、AlaからGlyもしくはSerへ；ArgからLysへ；AsnからGlnもしくはHisへ；AspからGluへ；CysからSerへ；GlnからAsnへ；GluからAspへ；GlyからAlaもしくはProへ；HisからAsnもしくはGlnへ；IleからLeuもしくはValへ；LeuからIleもしくはValへ；LysからArg、GlnもしくはGluへ；MetからLeu、TyrもしくはIleへ；PheからMet、LeuもしくはTyrへ；SerからThrへ；ThrからSerへ；TrpからTyr；TyrからTrpへ；および／またはPheからVal、IleもしくはLeuへ、を含む。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のうち1つの、機能的フラグメントであり得る。本明細書で使用される場合、「機能的フラグメント」は、本明細書中以下に記載されるアッセイにしたがい野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持するポリペプチドのフラグメントまたはセグメントである。機能的フラグメントは、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載される配列の変種であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、変種は、保存的修飾変種である。保存的置換変種は、例えば、ネイティブヌクレオチド配列の変異によって取得され得る。「変種」は、本明細書で言及される場合、ネイティブまたは参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入または置換によりネイティブまたは参照ポリペプチドのそれと相違するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種ポリペプチドをコードするDNA配列は、ネイティブまたは参照DNA配列と比較して1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換を含むが、活性を保持している変種タンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む。幅広い様々なPCRベースの部位特異的変異誘発アプローチが、当技術分野で公知となっており、当業者によって適用され得る。

変種アミノ酸またはDNA配列は、ネイティブまたは参照配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上同一であり得る。ネイティブ配列と変異配列の間の相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、この目的で一般的に用いられるワールドワイドウェブ上で自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を用いて2つの配列を比較することによって、決定され得る。

本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドは、参照配列分子と同じタイプの活性、例えばVEGF結合活性、肺組織または修復増強活性等を示す、本明細書に提供される野生型参照配列（またはその関連遺伝子／タンパク質の別の既知の野生型参照配列）のうち1つと、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一の配列を有するポリペプチドであり得る。

ネイティブアミノ酸配列の変更は、当業者に公知の任意の多くの技術によって達成され得る。変異は、例えば、ネイティブ配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣接して変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の座に導入され得る。連結後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、必要とされる置換、欠失または挿入により変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供するために、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発手順が用いられ得る。そのような変更を行う技術は、十分に確立されており、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に開示されるものを含む。また、そのポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、その分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常セリンで、置換され得る。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するためまたはオリゴマー化を促進するために、そのポリペプチドに付加され得る。

本明細書に記載されるポリペプチドはさらに、標的指向を向上または改善する手段を提供するよう修飾され得る、例えばカウンターリガンド分子、例えば、非限定的に、肺上皮を標的指向し、そのポリペプチドを組織特異的にする分子に連結され得る。

1つの態様において、ポリペプチドは、そのバイオアベイラビリティを増強する担体に連結され得る。そのような担体は、当技術分野で公知であり、それらに結合されたタンパク質のインビボ半減期を延長することができるポリ（アルキル）グリコール、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはメトキシプロピレングリコール（mPEG）を含む。ペプチドのPEG化方法は、当業者に周知であり、例えば、どのくらい大きなPEGポリマーを使用するかを考慮して行われる。任意の局面のいくつかの態様において、ペプチドは、治療ポリペプチドおよびペプチドの血清中半減期を延長するよう血清アルブミンに融合され得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、例えば安定性を向上させるためにまたは特定の細胞型への標的指向のために、第2の物質に結合され得る。任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体もしくは変種は、第1の融合パートナー（すなわち、IgG1 Fc）に結合され得る。結合は、非共有結合的または、例えば化学的架橋もしくは結合による、共有結合的相互作用であり得る。本明細書で議論されているように、任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドは、そのポリペプチドの血清中半減期を延長するよう血清アルブミンに融合される。

任意の局面のいくつかの態様において、ポリペプチドはまた、第2の融合パートナー、例えばその生成物を所望の部位に標的指向するポリペプチドまたは、例えば、それが望まれる場合、その精製を容易にするタグに、融合され得る。タグおよび融合パートナーは、それが望まれる場合、切断可能なように設計され得る。具体的に想定されている別の修飾は、ポリマーへの付加、例えば共有結合的付加である。1つの局面において、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはメトキシポリエチレングリコール（mPEG）は、それらに結合したタンパク質のインビボ半減期を延長し得る。ポリペプチド作用物質のPEG化方法は、当業者に周知であり、例えば、どのくらい大きなPEGポリマーを使用するかを考慮して行われる。

本明細書で使用される場合、「結合する」または「結合」は、2つまたはそれ以上の物体を付加し1つの物体を形成することを表す。例えば、本発明の方法は、ペプチドまたはそのフラグメント、誘導体もしくは変種と、別の物体、例えばそのポリペプチドを安定化する第1の融合パートナー等の部分、例えばIg担体粒子、例えばIgG1 Fcとの結合を提供する。付加は、リンカー、化学的修飾、ペプチドリンカー、化学リンカー、共有結合もしくは非共有結合、またはタンパク質融合もしくは当業者に公知の任意の手段によるものであり得る。接続は、恒久的または可逆的であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、結合体中の各リンカーおよび各タンパク質の所望の特性を利用するために様々なリンカーが含まれ得る。フレキシブルリンカーおよび結合体の溶解度を増大させるリンカーは、単独使用または本明細書に開示される他のリンカーとの併用が意図されている。ペプチドリンカーは、そのリンカーをコードするDNAを発現させることによって、結合体中の1つまたは複数のタンパク質に連結され得る。リンカーは、酸切断性、光切断性および熱感受性リンカーであり得る。結合方法は、当業者に周知であり、本発明における使用のために包含される。本発明にしたがい、ペプチドまたはそのフラグメント、誘導体もしくは変種は、当業者に公知の任意の適切な手段を通じて第1の融合パートナーに連結され得る、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,625,014号、同第 5,057,301号および同第5, 514,363号を参照のこと。例えば、ポリペプチドは、直接または1つもしくは複数のリンカーを通じてのいずれかで、IgG1 Fcに共有結合され得る。1つの態様において、本明細書に開示されるポリペプチドは、第1の融合パートナー（例えば、Fc）に直接結合され、代替の態様において、本明細書に開示されるポリペプチドは、リンカー、例えば輸送増強リンカーを通じて第1の融合パートナー（例えば、IgG1 Fc）に結合され得る。

本明細書に開示されるポリペプチドを第1の融合パートナー（例えば、Fc）に結合する多くの様々な方法が当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるHermanson (1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press)、米国特許第6,180,084号および同第6,264,914号に記載されており、例えば、ハプテンを応用免疫学において一般的に使用される担体タンパク質に連結する方法を含む（Harlow and Lane, 1988, "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。いくつかの例において、ポリペプチドは、例えば、利用される結合手順または化学基に依存して、結合により効果または機能を喪失し得ることが理解されている。しかし、多くの様々な結合方法があるため、当業者は、その物体、例えば結合したいポリペプチドの効果または機能に影響しないまたは最小限の影響しか及ぼさない結合方法を見出すことができる。本明細書に開示されるポリペプチドを第1の融合パートナー（例えば、Fc）に結合するのに適した方法は、例えば、カルボジイミド結合（Bauminger and Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70: 151-159）を含む。あるいは、部分は、各々参照により本明細書に組み入れられるNagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7269-7273 (1996)およびNagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1794-1799 (1998)に記載される標的指向物質に連結され得る。利用することができる別の結合方法は、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム酸化、その後の適切な反応物の還元的アルキル化およびグルタルアルデヒド架橋である。

本明細書に開示されるポリペプチドを第1の融合パートナー（例えば、Fc）と結合するために様々な異なるリンカー、例えば、非限定的に、アミノカプロン酸セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）またはヘテロ二官能性（heterobiofunctional）架橋剤、例えばカルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性架橋剤が使用され得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、通常、2または3工程プロセスでタンパク質およびその他の高分子上の2つの異なる機能標的に連結され得る2つの反応性基を含み、それによってしばしばホモ二官能性架橋剤の使用に付随する重合の程度を制限することができる。そのような多工程プロトコルは、結合体のサイズおよび成分のモル比の高度の制御を提供し得る。「リンカー」という用語は、2つまたはそれ以上の物体、例えば、本明細書に開示されるポリペプチドと第1の融合パートナー（例えば、Fc）を接続する任意の手段を表す。リンカーは、共有結合性リンカーまたは非共有結合性リンカーであり得る。共有結合性リンカーの例は、共有結合性結合または連結したいタンパク質の1つまたは複数に共有結合により付加されるリンカー部分を含む。リンカーはまた、非共有結合性結合、例えば、金属中心、例えば白金原子を通じたオルガノ金属結合であり得る。共有結合的連結においては、様々な官能基、例えば、炭酸誘導体、エーテル、有機および無機エステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素等を含むアミド基が使用され得る。連結を提供するために、エフェクター分子および／またはプローブは、連結のための部位を提供するよう、酸化、ヒドロキシル化、置換、還元等によって修飾され得る。本明細書に開示されるポリペプチドまたは第1の融合パートナー（例えば、Fc）の機能を有意に低下させない修飾が好ましいことが理解されるであろう。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、20種の天然アミノ酸と一般的に称される20種のアミノ酸以外の、1つまたは複数のアミノ酸を含むよう修飾され得る。

任意の局面のいくつかの態様において、その末端アミノ酸を含む、本明細書に記載されるポリペプチドの任意のアミノ酸は、自然プロセス、例えばグリコシル化および他の翻訳後修飾によって、または当技術分野で周知の化学修飾技術によって、のいずれかで、修飾され得る。自然界でポリペプチドに起こる一般的修飾だけでさえ、本明細書で完全に列挙するには多すぎるが、それらは基本書およびより詳細なモノグラフに、ならびに分厚い研究文献に十分記載されており、かつそれらは当業者に周知である。本発明のポリペプチドに存在し得る既知の修飾は、例示すると、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、糖化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化である。

そのような修飾は、当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP-リボシル化、が、最も基本的な文献、例えば、l. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1993に記載されている。この話題に関して多くの詳細なレビュー、例えばWold, F., in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1 -12, 1983; Sifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990およびRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992が利用可能である。

任意の局面のいくつかの態様において、固相ペプチド合成において、従来的なアミノ酸がN-メチルおよびヒドロキシ-アミノ酸で置換され得る。しかし、少ないペプチド結合を有するポリマーの生成は、少ないペプチド結合を含むアミノ酸の二量体の合成を必要とする。そのような二量体は、標準的な固相合成手順を用いてポリマーに組み込まれる。他の合成手順も当技術分野で周知である。

したがって、本明細書に記載されるポリペプチドの機能的誘導体は、本明細書に開示される方法および組成物における使用に包含されるポリペプチドのアミノ酸の修飾によって調製され得る。修飾は、ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド配列またはその機能的誘導ポリペプチドのあらゆる部位で行われ得る。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、他の機能的部分の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、グリコホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含み得る。例えば、E. Creighton Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993); B. C. Johnson, Post Translational Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York, (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626- 646 (1990); Rattan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)を参照のこと。これらの修飾された誘導体の調製は、例えば、そのポリペプチドの直接投与が意図されている場合に有用である。

周知のようにかつ上記のように、ペプチドおよびポリペプチドは常に全体が直鎖状とは限らないことも理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、それらは、通常、天然プロセス現象および自然界では発生しない人の操作によりもたらされる現象を含む翻訳後現象の結果として、分枝を含むまたは含まない環状であり得る。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的自然プロセスによりおよび完全合成法により合成され得る。

修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる部位で行われ得る。実際、共有結合的修飾によるポリペプチド内のアミノもしくはカルボキシル基のブロック、またはその両方は、自然界で多くみられ、合成性ポリペプチドおよびそのような修飾も、本発明のポリペプチド内に存在し得る。例えば、タンパク質分解プロセシング前の大腸菌（E.coli）で生成されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど常に、N-ホルミルメチオニンであろう。

ポリペプチド内で行われる修飾は、しばしば、その生成過程の関数であろう。クローン化された遺伝子を宿主内で発現させることによって生成されるポリペプチドの場合、例えば、修飾の性質および規模は、大部分が、その宿主細胞の翻訳後修飾能およびそのポリペプチドのアミノ酸配列内に存在する修飾シグナルによって決定されるであろう。例えば、周知のように、グリコシル化は、しばしば、細菌宿主、例えば大腸菌においては起こらない。したがって、グリコシル化が望まれる場合、ポリペプチドは、グリコシル化宿主、通常真核生物細胞において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳細胞動物と同じ翻訳後グリコシル化を行い、この理由から、特にネイティブパターンのグリコシル化を有する哺乳動物タンパク質を効果的に発現する昆虫細胞発現システムが開発された。同様の考え方が、他の修飾にも適用される。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、sFlt1ポリペプチド）は、非内因性宿主、例えば、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞において生産されるポリペプチドである。

同じタイプの修飾は、特定のポリペプチド内の様々な部位に同程度または異なる程度で存在し得ることが理解されるであろう。また、特定のペプチドまたはポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含み得る。

本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそのアナログのユニットが組み込まれた任意の分子、好ましくはポリマー分子を表す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性された二本鎖DNAの一方の核酸鎖であり得る。あるいは、それは、任意の二本鎖DNA由来でない一本鎖核酸であり得る。1つの局面において、核酸は、DNAであり得る。別の局面において、核酸はRNAであり得る。適当なDNAは、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含み得る。適当なRNAは、例えば、mRNAを含み得る。

任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストをコードする核酸は、DNAまたはmRNAであり得る。任意の局面のいくつかの態様において、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストをコードする核酸は、修飾された、例えば安定性またはその他の有益な特徴を増強するよう化学修飾された、DNAまたはmRNAであり得る。本明細書に記載される核酸は、当技術分野で十分に確立されている方法、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載される方法、によって合成および／または修飾され得る。修飾は、例えば、（a）末端修飾、例えば、5’末端修飾（リン酸化、結合、逆連結（inverted linkages）等）、3’末端修飾（結合、DNAヌクレオチド、逆連結等）、（b）塩基修飾、例えば、安定化塩基、脱安定化塩基もしくは拡張されたパートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基との置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合塩基（conjugated base）、（c）糖修飾（例えば、2’位もしくは4’位における）または糖の置換、および（d）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む、骨格修飾を含む。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、sFlt1ポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターに含まれる。本明細書に記載される局面のいくつかにおいて、本明細書に記載される特定のポリペプチドをコードする核酸配列またはその任意のモジュールは、ベクターに機能的に連結される。「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への送達用または異なる宿主細胞間の移動用に設計された核酸構築物を表す。本明細書で使用される場合、ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であり得る。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントに結合されたときに複製することができ、かつ遺伝子配列を細胞に移入することができる、任意の遺伝的エレメントを包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を含み得るがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を誘導するベクターを表す。発現される配列は、しばしば、しかし必ずそうと言うことではないが、その細胞に対して異種であろう。発現ベクターは、追加のエレメントを含み得る、例えば、発現ベクターは、2つの生物において、例えば発現のためにヒト細胞においてならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されるよう、2つの複製系を有し得る。「発現」という用語は、適当な場合、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳ならびにタンパク質のフォールディング、修飾およびプロセシングを含むがこれらに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生ならびに適当な場合、タンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを表す。「発現産物」は、遺伝子から転写されるRNAおよび遺伝子から転写されるmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適当な調節配列に機能的に連結されている場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写される（DNA）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば5’非翻訳（5'UTR）または「リーダー」配列および3’UTRまたは「トレイラー」配列ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む場合または含まない場合がある。

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも1つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージされる能力を有する核酸ベクター構築物を表す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の位置に、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで核酸を細胞に移入する目的で利用され得る。多くの形態のウイルスベクターが、当技術分野で公知である。

「組み換えベクター」は、インビボで発現することができる異種核酸配列または「トランスジーン」を含むベクターを意味する。本明細書に記載されるベクターは、任意の局面のいくつかの態様において、他の適切な組成物および治療と組み合わされ得ることが理解されるべきである。任意の局面のいくつかの態様において、ベクターは、エピソーム性である。適切なエピソーム性ベクターの使用は、対象において関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNAとして維持し、それによって染色体組み込みの潜在的影響を排除する手段を提供する。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド、例えばsFlt1ポリペプチドをコードする核酸は、非内因性プロモーター（例えば、非ヒトプロモーター）に機能的に連結される。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸または細胞は、改変され得る。本明細書で使用される場合、「改変」は、人の手によって操作されたという局面を表す。例えば、ポリペプチドは、そのポリペプチドの少なくとも1つの局面、例えばその配列が、それが自然界で存在するときの局面と相違するよう人の手によって操作された場合、「改変された」とみなされる。一般的な実務であり、当業者によって理解されているように、改変された細胞の子孫は、典型的に、実際の操作が以前の細胞に対して行われていたとしても、「改変された」と称される。

「外因性」という用語は、その天然供給源以外の細胞に存在する物質を表す。「外因性」という用語は、本明細書で使用される場合、人の手が関与するプロセスによって、生物学的システム、例えばそれが通常見いだされずかつそのような細胞または生物に核酸またはポリペプチドを導入することが望まされる細胞または生物に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを表し得る。あるいは、「外因性」は、例えば異所性発現またはレベルが確立されるよう、人の手が関与するプロセスによって、生物学的システム、例えばそれが比較的少量で見いだされかつその細胞または生物内の核酸またはポリペプチドの量を増加させることが望まされる細胞または生物に導入された核酸またはポリペプチドを表し得る。これに対して、「内因性」という用語は、その生物学的システムまたは細胞にとって生来的である物質を表す。本明細書で使用される場合、「異所性」は、通常でない場所および／または量で見いだされる物質を表す。異所性物質は、特定の細胞において通常見いだされるが、それはかなり少量であるおよび／または異なる時点で見いだされるものであり得る。異所性はまた、特定の細胞においてその自然環境で本来的に見いだされないまたは発現されない物質、例えばポリペプチドまたは核酸を含む。

本明細書で使用される場合、「処置（treat）」、「処置(treatment)」、「処置（treating）」または「軽減」という用語は、その目的が疾患または障害に関連する状態の進行または重篤度を好転させる、緩和する、軽減する、阻害する、鈍化させるまたは停止させることである治療的処置を表す。「処置（treating）」という用語は、状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害な作用または症状の減少または緩和を含む。処置は、通常、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少する場合に「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低下または停止する場合に「有効」である。すなわち、「処置（treatment）」は、処置の非存在下で予想されるものと比較しての、症状またはマーカーの改善だけでなく、症状の進行または悪化の停止または少なくとも鈍化も含む。有益または望ましい臨床結果は、検出可能か検出不可能かによらず、1つもしくは複数の症状の緩和、疾患の規模の縮小、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは鈍化、疾患状態の軽減もしくは緩和、寛解（部分的か完全かによらず）、および／または死亡率の低下を含むがこれらに限定されない。疾患の「処置」という用語はまた、（緩和処置を含む）その疾患の症状または副作用からの解放の提供を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界において広く使用されている担体と組み合わされた活性物質を表す。「薬学的に許容される」というフレーズは、本明細書において、妥当な医学的判断の範囲で、合理的な利益／リスク比の下、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適している化合物、物質、組成物および／または投薬形態を表すために使用される。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、クリーム、乳濁物、ジェル、リポソーム、ナノ粒子および／または軟膏であり得る。任意の局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、人工または改変担体、例えば、自然界ではその中に活性成分が見いだされないであろう担体であり得る。

本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、所望の部位への作用物質の少なくとも部分的な送達を達成する方法または経路による対象への本明細書に開示される化合物の投入を表す。本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適当な経路によって投与され得る。

「統計的に有意」または「有意」という用語は、統計的有意性を表し、通常、2標準偏差（2SD）またはそれ以上の差を意味する。

実施例を実施する以外では、またはそうでないことが示されていない限り、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、±1％を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、存在する定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包括を示している。

「からなる」という用語は、その態様の説明の中で言及されていないあらゆる要素に対して排他的である、本明細書に記載される組成物、方法およびそれらの各要素を表す。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、特定の態様に必要とされる要素を表す。この用語は、本発明の態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響しない追加の要素の存在を許容する。

単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。同様に、「または、もしくは」という単語は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、「および、ならびに」を含むことが意図されている。本開示を実施または試験する際には本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適切な方法および材料が記載されている。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書で非限定的な例を示すために使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。

本明細書に開示される発明の択一的要素または態様のグループ化は、限定をなすものではない。各グループのメンバーは、個別にまたはグループの他のメンバーもしくは本明細書で見いだされる他の要素との任意の組み合わせで参照され、特許請求され得る。グループの1つまたは複数のメンバーは、便宜上および／または特許性の理由から、1つのグループに包含され、またはグループから排除され得る。いかなるそのような包含または排除が行われたとしても、本明細書は、変更されたグループを含んでいる、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面上の説明をなしているものとみなされる。

本明細書でそれ以外の定義がなされていない限り、本願と関連して使用される科学および技術用語は、本開示の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されている意味を有する。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、したがってそれらは変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明する目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明の範囲はもっぱら特許請求の範囲によって定義されるものである。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005;ならびにCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)において見いだされ得、これらの内容はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

任意の局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される本開示は、ヒトをクローン化するプロセス、ヒトの生殖系の遺伝的同一性を変更するプロセス、工業的もしくは商業的目的でのヒト胚の使用またはヒトもしくは動物への実質的な医学的利益なしではそれらを苦しませる可能性のある動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、およびそのようなプロセスから得られる動物に関するものではない。

他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で、本明細書で定義されている。

本願を通じて引用されている、参考文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む、すべての特許およびその他の刊行物は、明示的に、例えば本明細書に記載される技術と関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を、説明および開示する目的で、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、それらの開示が本願の出願日より以前にあったために提供されるにすぎない。これに関するいかなる事情も、本発明者らが、それが先行発明であるためまたは任意のその他の理由によりそのような開示よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認とみなされるべきではない。これらの書類の日付に関する言及または内容に関する表示はすべて、出願人が入手し得た情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確性に関する承認とはならない。

本開示の態様の説明は、排他的であることまたは本開示を開示された正確な形態に限定することを意図していない。本開示の個々の態様および実施例は例示目的で本明細書に記載されるにすぎず、関連技術分野の当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な等価な変更が可能である。例えば、方法の工程または機能はある順で示されているが、代替の態様は異なる順で機能を実施し得、または機能は実質的に同時に実施され得る。本明細書に提供される開示の技術は、適当な場合、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な態様は、さらなる態様を提供するよう組み合わせることができる。本開示の局面は、必要に応じて、本開示のなおさらなる態様を提供するために、上記参考文献および出願の組成、機能およびコンセプトを利用するよう変更され得る。さらに、生物学的機能の等価性を考慮して、種類および量の面でその生物学的または化学的作用に影響を与えずに、様々な変更がタンパク質構造に関してなされ得る。これらおよびその他の変更は、詳細な説明に照らして本開示に対してなされ得る。すべてのそのような変更は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。

上記態様のいずれかの個々の要素は、他の態様の要素と組み合わせることができまた他の態様の要素で置き換えることができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点は、これらの態様との関係で記載されているが、他の態様もまたそのような利点を示し得、そしてすべての態様が本開示の範囲に包含されるためにそのような利点を示すことを必要とするものではない。

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに例証されるが、これらはいかなる事情によってもさらなる限定とみなされるべきでない。

本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付された項のいずれかにしたがい定義することができる。
１．
肺組織の成長および／または修復を誘導する方法であって、sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを肺組織と接触させる工程を含む、方法。
２．
それを必要とする対象において肺組織の成長および／または修復を誘導する方法であって、治療有効量のsFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストを該対象に投与する工程を含む、方法。
３．
肺組織の成長および／または修復が、代償性肺成長である、項2記載の方法。
４．
対象が、重度肺形成不全、形成不全性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、気管支肺異形成、気腫、低肺胞数疾患、肺胞毛細血管異形成を有する対象、または肺切除術を受けた対象である、項2～3のいずれかに記載の方法。
５．
対象が、炎症状態と診断されていない、または炎症状態に対する処置を必要としない、項2～4のいずれかに記載の方法。
６．
sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストが、sFlt1ポリペプチドである、項1～5のいずれかに記載の方法。
７．
sFlt1ポリペプチドが、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列を含むポリペプチドである、項6記載の方法。
８．
sFlt1ポリペプチドが、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列と少なくとも95％同一の配列を含み、かつSEQ ID NO:2～13のポリペプチドの活性を保持しているポリペプチドである、項6記載の方法。
９．
アゴニストが、sFlt1ポリペプチドに結合されたFcドメインをさらに含む、項6～8のいずれかに記載の方法。
１０．
アゴニストが気道投与される、項6～9のいずれかに記載の方法。
１１．
アゴニストが静脈内投与される、項6～9のいずれかに記載の方法。
１２．
アゴニストが局所投与される、項6～9のいずれかに記載の方法。
１３．
アゴニストが、約5 mcg/kg～約50 mcg/kgの用量で投与される、項6～12のいずれかに記載の方法。
１４．
アゴニストが、約20 mcg/kgの用量で投与される、項6～12のいずれかに記載の方法。
１５．
sFlt1-Hifシグナル伝達のアゴニストが、HIF1σ、HIF1βおよび／またはHIF2σのアゴニストである、項1～5のいずれかに記載の方法。
１６．
アゴニストが、HIF1σ、HIF1βおよび／もしくはHIF2σポリペプチド、ならびに／または該ポリペプチドをコードする核酸である、項15記載の方法。
１７．
アゴニストが、HIFプロリルヒドロキシラーゼアンタゴニストである、項15記載の方法。
１８．
HIFプロリルヒドロキシラーゼアンタゴニストが、JTZ-951、FG-4592、GSK1278863、FG-4592またはMK-8617である、項17記載の方法。
１９．
肺組織および／または対象において内因性VEGFレベルが上昇する、項1～18のいずれかに記載の方法。
２０．
より大きな肺容量、最大吸気量の増加、運動能力の向上、および／または肺コンプライアンスの向上をもたらす、項1～19のいずれかに記載の方法。

実施例1
C57Bl6マウスを、左肺切除後に、生理食塩水または20 mcg/kgの用量の可溶性fms様チロシンキナーゼ1（sFlt1）のいずれかの毎日の腹腔内注射を受けるよう無作為化した。術後第4日に、マウスを肺機能検査に供し、その後に肺容量測定のために安楽死させた。肺容量は、水置換法により決定した。sFlt1処置を受けたマウスは、有意に大きな肺容量（p<0.01）、最大吸気量（p=0.01）ならびに改善された肺エラスタンス（p=0.04）およびコンプライアンス（p=0.04）を示した（図1～4）。この治療には、重度の肺形成不全を患った患者において肺成長および肺機能を改善することができる可能性がある。

可溶性VEGF受容体は、(sFlt1)VEGFに結合し、循環中のVEGF分子を除去する。このsFlt1分子は、腫瘍および肝臓の再生を阻害することが示されている。しかし、予想外の発見は、この可溶性VEGF受容体が肺切除術後の代償性肺成長を促進したことである。これは、形成不全性肺疾患、例えば先天性横隔膜ヘルニアを有する子供に関して注目される。

実施例2
sFlt1を、図6に示される実験デザインにしたがい、マウスに投与した。その結果は、sFlt1投与が、予想に反して、肺成長を増進することを示している（図10）。sFlt1に関する用量応答を調査し（図8）、マウスにおいては、20 mcg/kg sFlt1が最適な投薬レジメンであった（図9）。sFlt1の投与はまた、肺コンプライアンスおよび最大吸気量を改善することが示され、これは肺容量データと符合するものである（図10）。

さらなる調査は、sFlt1投与がVEGFおよびHIF-2αの両方のレベルを予想外に増加させることを明らかにし（図11、12）、このことは、sFlt1がHIF-2αを上方調節することによりVEGFの内因性産生を増加させることを示している。sFlt1投与に対するHIF-2α阻害剤PT-2385の効果を決定し（図14）、HIF-2αの阻害が、肺成長（図15）および対象の運動耐性（図16、17）に対するsFlt1の効果を鈍化させることが示された。

実施例3
マウスを70％部分肺切除術に供し、腹腔内注射を通じて生理食塩水（対照）または3種の用量のFlt1（10、20または50 ug/kg）のうちの1つを受けるよう無作為化した。処置を毎日行い、術後（POD）第4日に臓器収集のためにマウスを安楽死させた。肝臓サンプルを秤量し、体重に対して正規化した。4つの実験グループ間の正規化された肝臓重量の比較を、分散分析（ANOVA）を用いて行った。POD4では、実験グループ間で、肝臓重量に差がみられなかった。

Claims (15)

1. sFlt1ポリペプチドを含み、肺組織と接触させて使用するための、肺組織の成長および／または修復を誘導するための薬学的組成物。
2. 治療有効量のsFlt1ポリペプチドを含む、それを必要とする対象において肺組織の成長および／または修復を誘導するための薬学的組成物。
3. 肺組織の成長および／または修復が、代償性肺成長である、請求項2記載の薬学的組成物。
4. 対象が、重度肺形成不全、形成不全性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、気管支肺異形成、気腫、低肺胞数疾患、肺胞毛細血管異形成を有する対象、または肺切除術を受けた対象である、請求項2～3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
5. 対象が、炎症状態と診断されていない、または炎症状態に対する処置を必要としない、請求項2～4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
6. sFlt1ポリペプチドが、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列を含むポリペプチドである、請求項1～5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
7. sFlt1ポリペプチドが、SEQ ID NO:2～13のうちの1つの配列と少なくとも95％同一の配列を含み、かつSEQ ID NO:2～13のポリペプチドの活性を保持しているポリペプチドである、請求項1～5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
8. sFlt1ポリペプチドが、sFlt1ポリペプチドに結合されたFcドメインをさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
9. 気道投与用である、請求項1～8のいずれか一項記載の薬学的組成物。
10. 静脈内投与用である、請求項1～8のいずれか一項記載の薬学的組成物。
11. 局所投与用である、請求項1～8のいずれか一項記載の薬学的組成物。
12. sFlt1ポリペプチドが、約5 mcg/kg～約50 mcg/kgの用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項1～11のいずれか一項記載の薬学的組成物。
13. sFlt1ポリペプチドが、約20 mcg/kgの用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項1～12のいずれか一項記載の薬学的組成物。
14. 肺組織および／または対象において内因性VEGFレベルを上昇させる、請求項1～13のいずれか一項記載の薬学的組成物。
15. より大きな肺容量、最大吸気量の増加、運動能力の向上、および／または肺コンプライアンスの向上をもたらす、請求項1～14のいずれか一項記載の薬学的組成物。

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