JP2001519664A

JP2001519664A - 植物様デンプンおよび宿主においてそれらを作成する方法

Info

Publication number: JP2001519664A
Application number: JP54294098A
Authority: JP
Inventors: グアン，ハンピン; キーリング，ピーター・エル
Original assignee: エクシード・ジェネティックス・エル・エル・シー
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2001-10-23
Also published as: EP1017270A1; CA2283719A1; AU6882898A; WO1998044780A1; EP1017270A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、デンプン経路由来の遺伝子を持つ構築物を含む宿主に関する。より典型的には、本発明は植物様デンプンを形成する細菌宿主に関する。さらに、本発明はデンプン経路由来の遺伝子を有する植物宿主に関する。本発明はさらに、前記宿主により産生されたデンプンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物様デンプンおよび宿主においてそれらを作成する方法本出願は、1997年4月4日に提出された米国仮特許出願第60/062,939号に基づき、前記仮出願の内容全体は、本明細書に援用される。発明の背景−発明の分野本発明は、デンプン経路由来の遺伝子を持つ構築物を含む宿主に関する。より具体的には、本発明は植物様デンプンを形成する細菌宿主に関する。さらに、本発明はデンプン経路由来の遺伝子を有する植物宿主に関する。本発明はさらに、前記宿主により産生されたデンプンに関する。発明の背景−先行技術の説明デンプンを用いる産業には、キャンディ生産者、接着剤および顔料の生産者、グレービー生産者、紙生産者など多様な産業が含まれる。特殊な食品および産業用途のデンプン(アミロースおよびアミロペクチンから形成される)の需要が劇的に増加しているため、デンプンを特定の食品および産業用途に適した量および品質に適合させるための努力がなされてきた。本産業は、時間をかけて、高粘度、より低い粘度、より高いゲル化強度およびより低いゲル化強度、異なる沸点などを有する多くの異なるデンプンを求めてきた。各デンプンは多くの用途に適合するように作られた。本産業は、適合させた特殊化用に、より少ないアミロペクチンを持つ突然変異デンプンおよびより多くのアミロースを持つ突然変異デンプンを利用してきた。例えば、アミロース増加デンプンはゲル化キャンディ製造領域で使用されてきた。そして、本産業は、ほとんどアミロースを含まず、そして大部分アミロペクチンを含む、wxおよびwx s u2のような突然変異体により形成されるアミロペクチン増加デンプンを、プディング、パイ、グレービー、冷凍食品およびバッター、シチュー、缶詰食品およびベビーフードなどのとろみのある（thicken）食品に使用してきた。さらに、異なるタイプの突然変異デンプンが接着剤およびサイズ剤（sizing）として有用である。適合させたデンプンに対する産業の欲求に取り組むために使用される他の方法は、デンプンの化学修飾の使用である。デンプンの誘導体化(derivation)は、デンプンを単官能試薬（monofunctional reagent）と化学的に反応させ、リン酸、酢酸、コハク酸基のような置換基を導入し、デンプンを安定させることにより産生される。不運なことに、これらの型のデンプンは、政府の規制の対象になる可能性があり、そしてさらに、デンプンのコストが増すため、一般的に受容されにくい。デンプンは生物系において炭水化物が貯蔵される主要な形式である。葉緑体中の植物デンプンは一時的なものであり、そして貯蔵デンプンは多くの植物の貯蔵器官に集積する。デンプンはほとんどのより高次の植物の、葉、茎および根および果実および胚および内胚乳を含む、すべての器官に見ることが可能である。より高次の植物のデンプンに加え、同様の多糖（グリコーゲン）が細菌で見つかっている。多くの細菌は動物で見られるグリコーゲンと似た備蓄多糖を産生する。貯蔵多糖には２つの群があると分類されており、第一群は細胞のシトソール（ cytsol）に貯蔵所を有するもの、そして第二群はプラスチド内に持つものである。大腸菌（Escherichia coli）はシトソール内に多糖を産生する。デンプン産生植物は、典型的にはデンプンをプラスチド内に貯蔵する。典型的なデンプン産生植物には、キャッサバ(cassava)、ジャガイモ(potato)、トウモロコシ(corn)、エンドウ(peas)、コメ(rice)、コムギ(wheat)、オオオムギ（barley）が含まれる。穀草穀物（cereal grain）であるトウモロコシ、コメ、コムギおよびオオムギおよびオートムギ（oat）の主要なデンプン貯蔵組織は内胚乳である。デンプンはまた、植物供給源により分類される。例えば、穀草デンプンは、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、オートムギおよびモロコシ（sorghum）などの穀草穀物由来であり；塊茎および根デンプンはジャガイモおよびヤムイモ（yam）およびキャッサバ由来である。デンプン合成経路は、よく理解されていない。一般的に、上記のように、植物由来デンプンは２つの主要な構成要素からなる。アミロースおよびアミロペクチンである。これらは植物のデンプン顆粒中で絡み合っている。アミロースはアルファ１-４結合したアンヒドログルコース単位の直鎖ポリマーであり、一方アミロペクチンは、直鎖間のアルファ１-６結合の結果生じる分枝を持つアルファ１-４結合アンヒドログルコース単位の直鎖を含む分枝ポリマーである。以前から、デンプン産生植物の突然変異遺伝子を発現することも可能であり、そしてデンプンの特性を改変することも可能であることが知られていた。突然変異体中の２つの構成要素の比率およびその構造が、デンプンの物理化学的特性を主に決定する。したがって、デンプン合成経路の明確な理解がされておらず、そして突然変異体を使用することが困難であったため、産業が、存在しそして産生可能な突然変異デンプンを使用することが制限され(突然変異デンプンを含む穀草は畑環境において非常に収穫高が落ちる)、またはデンプンに作成することが可能な化学修飾が制限された。この10年間、産業は、デンプン合成をより明確に理解する試みの中で、植物および細菌におけるいくつかのデンプン遺伝子の影響を研究してきた。80年代終盤から、植物および細菌が単離された遺伝子を含むよう形質転換（ transform）することが可能になった。これに応じ、産業はジャガイモを細菌遺伝子ＧＳで、そしてアンチセンスのデンプン可溶性シンターゼIII遺伝子で形質転換した(突然変異体を形成する)。これらのジャガイモデンプン実験の一部として、細菌をいくつかのジャガイモデンプン遺伝子で形質転換した。例えば、ジャガイモ由来のSSSIII遺伝子を、glgA 遺伝子を欠いた大腸菌に形質転換した。突然変異大腸菌におけるglgCおよび分枝酵素IおよびIIの組み合わせの影響もまた研究され、そしてグリコーゲン様産物が報告された。商業的であるデンプン産業は、細菌および動物により産生される多糖であるグリコーゲンの産生には特に興味がない(医薬品産業はこうした興味をいくらか持つかもしれない)。したがって本産業はまだ、植物遺伝子形質転換を通じて、適当な価格の適合させたデンプンを生成することが可能ではない。産業には、より低い粘度などその改変された特性のため有用である新たなデンプン、およびより高い粘度のため有用である新たなデンプンおよびこうしたデンプンを産生する新たな方法を発見する要求が残されている。大腸菌のグリコーゲン合成およびより高次の植物のデンプン合成は、ADPGlcピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ（SS）またはグリコーゲンシンターゼ(G S)および分枝酵素(BE)を含む同様の経路を有する。ADPGlcピロホスホリラーゼが、合成されるデンプンの量を制御するきわめて重要な役割を果たしており、一方デンプンシンターゼおよびデンプン分枝酵素は、主にデンプン構造を決定することが示唆されてきている。SBEおよびSSの多数の型が、トウモロコシ(maize)、コメ、エンドウおよびジャガイモを含む多くの植物で同定されてきている。顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSS）をコードするwaxy遺伝子に加え、SSの他の型をコードする３つの遺伝子がトウモロコシ内胚乳から単離されてきている。トウモロコシはSSの５つの型をコードする遺伝子が単離されている唯一の穀草穀物である。明らかに、これらの配列の多くは公表されており、そして当業者に知られている。トウモロコシSBEをコードする遺伝子もまたクローンされ、そして性質決定されている。以前の報告により、トウモロコシSBEIはSBEIIより高い率の分枝アミロースを有し、そして優先的により長い鎖を移動させる一方、SBEIIはより高い率の分枝アミロペクチンを示し、そして優先的により短い鎖を移動させることが立証された。SBEと比較して、SSの多数の型の特異性および機能については、あまり知られていない。GBSSを欠く蝋様（Waxy）トウモロコシでは、アミロペクチンのみが合成され、そしてアミロースは失われている。したがって、waxy遺伝子にコードされるGBSSは、主にアミロースの合成に責を負うとされている。クラメドモナス・レインハルディ（Chlamedomonas reinhardtii）におけるwaxy突然変異の研究により、GBSSはまたアミロペクチン合成にも関与していると示唆されている。クラメドモナス・レインハルディSSIIが、クラメドモナスにおけるアミロペクチンの中程度の大きさのグルカン合成を調節していることが報告されているが、より高次の植物におけるSSの機能に関する直接的証拠はまだ見つかっていない。ジャガイモにおけるSSの機能を研究するのにアンチセンス技術が用いられてきているが、結論は出ていない。 Hanping Guanらにより書かれた、A Maze Branching Enzyme CatalyzesSynthes is of Glycogen-like Polysaccharide in glg B-deficient Escherichia coli.と題されたProc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.92,pp.964-967,February1995 Pla nt Biologyに公表された論文で、形質転換された大腸菌由来の特定のグリコーゲン様多糖が報告された。本論文は細菌、大腸菌のトウモロコシBEIおよびBEIIによる形質転換を解説している。これらの酵素は２つの大腸菌宿主に形質転換された。細菌宿主の１つは野生型であり、そしてもう一方は突然変異体である。細菌への該突然変異は、AC71（glgB-）におけるグリコーゲンBEの活性減少であり、その結果、該突然変異体が本質的にBE活性を持たなくなるものであった。本論文は４つの異なる形質転換体から単離された脱分枝アルファグルカンを分析した。第一の宿主はglgBを含む大腸菌であり、そして第二の宿主は形質転換遺伝子をまったく持たないAC71、その後トウモロコシBEIIで形質転換したAC71、その後トウモロコシBEIで形質転換したAC71、そしてその後トウモロコシBEIおよびBEIIで形質転換したAC71であった。生じた多糖産物をHPLCにより、鎖の長さおよび相対ピーク面積により、そして鎖のモル分布により分析した。この研究から、BEIIがアミロペクチンの短鎖合成において役割を果たしている可能性があり、そしてBEI がアミロペクチンのより長い鎖に関与している可能性があることの理解につながった。本論文はまた、突然変異宿主AC71が、野生型大腸菌よりも、鎖の長さが６の鎖を多く産生することに言及した。本論文はまた、トウモロコシBEおよび宿主のGSがアミロペクチン様多糖を産生しないことにも言及した。本論文は、異なる BEとのGSの協調作用が、合成される多糖の最終構造を決定するのに重要な役割を果たしている可能性があることを示唆した。Guanによる本論文は、本研究が細菌モデルシステムにおけるBEおよびSSの協調作用を研究する基礎を確立したことを示唆して終わっている。ジャガイモにおける大腸菌GS（グリコーゲンシンターゼ）の発現により、非常に分枝したデンプンの広範囲での発生が示された。この結果はShewakerらによる Plant Physiol.104,1159-1166の論文に公表された。このジャガイモはこの時点では商業的用途にそれほど用いられるようではない。本産業はいまだに、細菌から発酵過程において、そしてしたがって環境に感受性を持つ植物を繁殖させそして育てる必要がない植物様デンプンを産生するオプション；および、植物宿主を通じて、特定の適合させたデンプンを生成する植物を産生するオプションを必要とする。そして本産業は、穀草様デンプンまたは根および塊茎様デンプンである改変されたそして新たなデンプンを、大量にそして安価に、したがってデンプンの化学修飾を用いる必要を避け、必要としている。本産業は、産業の欲求に適合させた異なるデンプンを供給するため、容易に形質転換することが可能な宿主を必要としている。特に、本産業は、現在植物または細菌において作成することが不可能なものを含む、多様な異なるデンプンを供給する宿主を必要としている。目的および利点したがって、本発明のいくつかの目的および利点は、発酵過程を通じて植物様デンプンを産生するためのものである。さらなる目的および利点は、植物における新たなデンプンの産生である。さらなる目的および利点は、続く説明および付随する図表を考慮することにより明らかになるであろう。本発明の別の目的は、SS、SBEを含む植物デンプン合成酵素、細菌分枝酵素、グリコーゲンシンターゼおよび他の生物中の他の酵素により、アミロース、アミロペクチンを含む多糖を大腸菌および／または真菌および酵母において合成することである。本発明のさらに別の目的は、これらの酵素の各々または組み合わせ、または本特許で研究されている修飾酵素を使用して、植物におけるデンプン合成を含む、あらゆる生物における多糖の産生、または改善を行うことである。発明の概要本発明は、宿主が植物様多糖を産生するような、植物のデンプン経路におけるほとんどの遺伝子を含む、宿主中のDNA構築物を提供する。そして１つの態様において、非植物宿主において特定のトウモロコシ突然変異体を作成するわずかに異なる態様を含む、トウモロコシデンプンを産生する。本発明は、SSI、SSSIIa、 SSIIb、SSSIII、GBSS、BEIおよびBEIIのような遺伝子の２つまたはそれ以上の組み合わせを含む細菌宿主であり、前記組み合わせがグリコーゲン様成分を形成しない場合の、前記細菌宿主を含む。本発明は、雑種または同系交配コメ植物において、以下のトウモロコシ遺伝子のいずれかにより形質転換された植物宿主、または以下のトウモロコシ遺伝子SSI、SSIIa、 SSIIb、SSSIII、GBSS、BEIおよびBEIIの２つまたはそれ以上の組み合わせを有する植物宿主を含む。さらに、本発明は、形質転換された宿主により産生される新たな多糖を含む。野生型を有する宿主は新たな多糖を産生しない。形質転換宿主は少なくとも２つの外因性デンプン合成遺伝子を発現し、前記遺伝子はSSI、SSSIIa、SSIIb、SSII I、GBSSなどのデンプン合成遺伝子からなる、そして所望によりBEIおよびBEII遺伝子の少なくとも１つを含む群より選択され、ここで、形質転換された宿主はこうした新たな多糖を産生することが可能である。本発明はまた、新たな多糖も含み、ここで、宿主は以下の群、glgA、glgB、gl gCおよびそれらのあらゆる突然変異体の群から選択される細菌グリコーゲン誘導遺伝子からなる前記群から選択される外因性遺伝子もまた発現する。または、ここで、宿主はまた以下の群、植物顆粒結合酵素からなる群から選択される外因性遺伝子も発現する。そしてデンプン合成遺伝子がBEIおよびBEIIからなる群より選択される、新たな多糖も含む。本発明は、広く、宿主中に形質転換Glg C遺伝子および少なくとも１つのデンプン分枝酵素を、少なくとも１つの他の形質転換デンプン遺伝子との組み合わせで含む宿主を含み、ここで宿主は多糖産物を産生する。そして形質転換細菌遺伝子、および脱分枝酵素および可溶性デンプンシンターゼからなる群より選択される非デンプン分枝酵素の少なくとも１つを含む宿主を含む。発酵過程に使用することが可能な宿主を、デンプン合成酵素、またはグリコーゲン合成酵素で、宿主が非グリコーゲン様デンプンを産生するように形質転換し、そして多糖を産生する発酵過程に該宿主を使用することを含む、非グリコーゲン様である多糖を宿主中で産生する方法。宿主は細菌、または真菌または酵母である。さらに、本発明の方法はまた、glgC，glgA、glgB遺伝子を含むグリコーゲン合成遺伝子などの細菌遺伝子の使用も含む。デンプン合成酵素を産生する遺伝子に、デンプン可溶性シンターゼI、IIa、IIb、およびSSIII（dul1）をコードする遺伝子が含まれる方法。デンプン合成酵素を産生する遺伝子に、デンプン脱分枝酵素および分枝酵素をコードする遺伝子が含まれる方法。本発明はN末端が一部切除されたSSを含む修飾デンプン合成酵素を含む。言いかえると、本発明は、グリコーゲン産生に活性を持つ遺伝子、および本来の宿主において、以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つの産生に活性を持つ非デンプン分枝酵素の少なくとも１つを持つよう、形質転換された宿主を含む。宿主は単子葉または双子葉植物でもよい。宿主は穀草産生植物でもよい。または宿主は細菌でもよい。より具体的には、本発明は、以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つを本来の宿主中で産生するのに活性を持つ非デンプン分枝酵素の少なくとも１つが、デンプン可溶性デンプンシンターゼI、IIa、IIb、III遺伝子および脱分枝酵素遺伝子(sul)、GBSS遺伝子、sh2遺伝子およびbt2遺伝子からなる群より選択される宿主を含む。BEI遺伝子、BEII遺伝子のようなデンプン分枝酵素遺伝子の少なくとも１つを含む宿主。本発明はまた、ADPG産生において活性を持つ遺伝子、および以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つを本来の宿主中で産生するのに活性を持つデンプン遺伝子の少なくとも１つを持つよう形質転換された宿主であって、ここで該宿主が植物様であって、そしてグリコーゲン様でない多糖を産生する前記宿主として記載されてもよい。さらに、宿主はピロホスホリラーゼ遺伝子、およびグリコーゲンシンターゼ遺伝子を持つよう、形質転換されてもよい。本発明の範囲には、アルファ1,4グルカン合成能およびアルファ1,4-1,6分枝酵素能を欠き、植物デンプン可溶性合成遺伝子を少なくとも１つ発現するよう形質転換された宿主を含む。そして、該宿主はまた、脱分枝酵素をコードする遺伝子を少なくとも１つ、および／またはデンプン可溶性シンターゼI、可溶性シンターゼ酵素IIa、IIb、デンプン可溶性シンターゼ酵素IIIをコードする遺伝子を発現するよう形質転換されたものを含んでもよい。本宿主は、デンプン分枝酵素をコードする遺伝子を少なくとも１つ発現するよう、形質転換されたものを含んでもよい。本発明はまた、植物におけるグリコーゲン様成分の産生も含む。図により、そして表１により記載される多くのプラスミドが本明細書に添付され、これは本発明の一部でありそして本明細書中に請求される。こうした例の１つは、プラスミドがキャリアー宿主中にあり、そして該プラスミドが、N末端がGENVMNVVであるSSIIa遺伝子を含み、そして該遺伝子がおよそ長さ1561塩基対である前記プラスミドである。本発明は、例えば蝋様コメおよびジャガイモおよびトウモロコシなどの突然変異植物のような突然変異宿主、および宿主が突然変異大腸菌または真菌であるものを含む。図の簡単な説明図１は、パーセントで示した相対ピーク面積およびグリコーゲンおよびデンプン可溶性シンターゼＩ(SSI)、デンプン可溶性シンターゼIIa(SSIIa)、デンプン可溶性シンターゼIIb(SSIIb)の鎖の長さを示すグラフを示す。したがって、本図は鎖伸長におけるトウモロコシSSの特異性を示す。図２は、7661塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC およびトウモロコシデンプン分枝酵素I（MBEI）を持つプラスミドpEXSC-MBEIを示す。図３は、7461塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子IIaを持つプラスミドpEXSC3Cを示す。 pEXS3cは、MSSSIIaのN末端を含む1082bpのNdeI-EcoRI断片（pBSK中のMSSIIa由来）をpEXS3aのNde I-EcoRI部位にサブクローンし、IIA-2のN末端をより長いIIaの N末端に置き換えている。MSSIIaは成熟トウモロコシSSIIaであり、そして2090bp 長である。MSSIIc挿入物中には、以下の部位は含まれていない：ApaI、BglII、E coV、Not、Spe I、およびXba I。本プラスミドのN末端はAEAEAGGKDである。図４は、9971塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC およびトウモロコシデンプン分枝酵素I（MBEI）およびトウモロコシデンプン分枝酵素II（MBEII）を持つプラスミドpEXSC-MBEI-MBEIIを示す。図５は、7521塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC およびトウモロコシデンプン分枝酵素II（MBEII）を持つプラスミドpEXSC-MBEIIを示す。図６は、7990塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC 遺伝子およびN末端が一部切除されたトウモロコシデンプンシンターゼ遺伝子IIa （MSSIIa-2）を持つプラスミドpEXSC-3aを示す。N末端配列はGENVMNVIである。図７は、7079塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC 遺伝子およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子I（MBEI）およびN末端が一部切除されたSSIであるバージョンI-2（MSSI-2）を持つプラスミドpEXSC- 8を示す。図８は、7551塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC 遺伝子およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子IIb（SSIIb）を持つプラスミドpEXSC-9を示す。N末端配列はAAAPAGEEである。図９は、7211塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC 遺伝子および全長SSIであるトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子Iを持つプラスミドpEXSC-10を示す。N末端配列はCVAELSREGPAである。図10は、6738塩基対で、プロモーターT7およびカナマイシン遺伝子およびglgC 遺伝子およびglgA遺伝子を持つプラスミドpEXSCAを示す。図11は、7240塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびN末端が一部切除されたSSIIbであるトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子I Ib-2(トウモロコシSS IIb-2)を持つプラスミドpEXSC9aを示す。N末端配列はMNVV VVASECAPである。図12は、6968塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびN末端が一部切除されたトウモロコシWX(トウモロコシ顆粒結合デンプンシンターゼ) を持つプラスミドpEXSWXを示す。wxのN末端配列はASAGMNVVFVGAEMAである。図13は、6980塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびwx2 と称されるN末端が一部切除されたトウモロコシWXを持つプラスミドpEXSWX2を示す。wx2のN末端配列はMNVVFVGAEMAである。図14は、7780塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子および大腸菌glgC遺伝子およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子IIb（トウモロコシSS IIb）を持つプラスミドpEXSC9を示す。図15は、7112塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子、大腸菌gl gC遺伝子およびトウモロコシSSI-3と称される、N末端が一部切除されたトウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子Iを持つプラスミドpEXSC10dを示す。トウモロコシSSI-3のN末端はMSIVFTGEASPXAである。図16は、5300塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびトウモロコシSSIと称される、全長トウモロコシデンプン可溶性シンターゼ遺伝子Iを持つプラスミドpEXS10を示す。図17は、7259塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびSSI- 2と称される、N末端が一部切除されたトウモロコシデンプンシンターゼ遺伝子I を持つプラスミドpEXS8を示す。N末端配列はCVAELSRDLGLEPEGである。図18は、5128塩基対で、プロモーターT7およびアンピシリン遺伝子およびglgA を持つプラスミドpEXSCA1を示す。pESCA1は、1551bpのglgAを含むSpel-Sac I断片（pBSK中のglgA由来）を、ウィスコンシン州マディソンのNovagenから、カタログ番号69748-1とされ、そしてET-23d（+）DNAと呼ばれる、商業的に入手可能なpET-23dのXba I-Sac I部位にサブクローンしたものである。図19は、glgCおよびglgA、およびpEXSC9、pEXSC3、pEXSC8、pEXSCwxを含む宿主により産生された産物のヨウ素・グルカン複合体のスペクトルをしめす。X軸は表示nmであり、そしてY軸は読み取られた吸光度である。図20は、glgC、BELBEII遺伝子およびglgA；glgC、BEI、BEII遺伝子およびトウモロコシSSIであるSSI-2およびglgC、BEI、BEII遺伝子およびトウモロコシSSIIb 、およびglgC、BEI、BEII遺伝子およびトウモロコシSSIIa-2、およびglgC、BEI 、BEII遺伝子を含むプラスミドで形質転換された宿主により産生された産物のヨウ素・グルカン複合体のスペクトルをしめす。X軸は表示nmであり、そしてY軸は読み取られた吸光度である。図21は、小さいビン中で宿主により産生された産物を示し、glgC、BEI、BEII 遺伝子およびトウモロコシSS遺伝子を含む宿主由来の産物を含む。（C-I-II+8）と記号化されたpEXSC8はglgC、BEI、BEIIおよびトウモロコシSSI-2 遺伝子、および（C-I-II+10）と記号化されたpEXSC10はglgC、BEI、BEIIおよびトウモロコシSSI遺伝子、および（C-I-II+9）と記号化されたpEXSC9はglgC、BEI 、BEIIおよびトウモロコシSSIIb遺伝子、および（C-I-II+3a）と記号化されたpE XSC3aはglgC、BEI、BEIIおよびトウモロコシSSIIa-2遺伝子、および（C-I-II+WX ）と記号化されたpEXSCWXはglgC、BEI、BEIIおよびトウモロコシwaxy遺伝子、および（C-I-II+A1）と記号化されたpEXSCA1はトウモロコシBEI、BEIIおよび大腸菌glgA遺伝子を含む。ジャガイモデキストリン、蝋様トウモロコシデンプン、トウモロコシアミロペクチン、コメデンプン、トウモロコシデンプン。図22は、4178塩基対で、trcプロモーターおよびアンピシリン遺伝子を持つpEx s-trcを示す。pEXS trcは突然変異誘発されたpTrc99A-Ndelである。（pTrc99A-N de Iの多重クローニング部位中のNco I部位を、プライマーEXS63およびEXS64を用いてNde Iに突然変異誘発した。）pEXS-trcはただ１つのNde I部位を含み、そしてNco I部位は持たない。以下の部位はpEXS-trcに含まれていない；Bgl II、C la I、Nco I、Not I、Sac II、SnaB I、Spe IおよびXho I。図23は、4129塩基対で、trcプロモーターおよびアンピシリン遺伝子の一部およびカナマイシン遺伝子を持つpEXS-trc3を示す。pEXS-trc3はBglI（埋め込み） −Sca Iで切断しそして再連結し、Amp遺伝子のほとんどを削除した（5'端から30 4ntが残っている）pEXS-trc1である。以下の部位はpEXS-trc3に含まれていない；Apa I、Bgl II、Eco V、Nco I、Not I、SnaB I、およびSpe I。図24は、7190塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびWaxy２遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物形質転換に適合させたプラスミドpEXS 102を示す。図25は、6607塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子およびWaxy２遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 103を示す。図26は、6979塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子およびglg B遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 101を示す。図27は、7557塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zelnプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびglg B遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 100を示す。図28は、6273塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびglg A遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 101を示す。図29は、6001塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびglg C₃遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 66を示す。図30は、6373塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシwaxy遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 65を示す。図31は、7073塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼIIa遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 64を示す。図32は、6473塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼIIa遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 63を示す。図33は、6773塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼI-2遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 62を示す。図34は、7013塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼIIb遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 61を示す。図35は、6858塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、および大腸菌glgA遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 59を示す。図36は、7658塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼIIa遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 58を示す。図37は、6586塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびglg C₃遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 56を示す。図38は、7658塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーターおよびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシSSIIa遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 54を示す。図39は、7058塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼIIa-2遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 53を示す。図40は、7358塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼI-2遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 52を示す。図41は、7398塩基対を持ち、トウモロコシ10KD zeinプロモーター、およびトウモロコシadh Iイントロン、トウモロコシデンプンシンターゼI輸送ペプチドをコードする遺伝子、およびトウモロコシデンプン可溶性シンターゼIIb遺伝子およびnosターミネーターおよびアンピシリン遺伝子を含む、植物での使用に適合させたプラスミドpEXS 51を示す。図42は、本発明を用いて産生された改変デンプンの11の産物の写真を示す。表題の記号化されたC-I-IIはglg C遺伝子およびBEIおよびBEII遺伝子であり、それに続く数字または別の呼称はpEXSおよびその数字を意味する。したがってC-I-II （+10）はglg C遺伝子およびBEIおよびBEIIおよび表１に示すN末端を有する遺伝子SSIを含むEXS-10プラスミドである。図43は、1488塩基対を有するglgAのDNA配列およびタンパク質配列を示す。図44は、2361塩基対を有するglgBのDNA配列およびタンパク質配列を示す。図45aは、2562塩基対を有するトウモロコシ（Zea mays）10-kDa zein 遺伝子のDNA配列を示す。図45bは、トウモロコシ10-kDa zein遺伝子の、本明細書に論じられるプラスミドの多くにプロモーターとして用いられた部分のDNA配列を示す。図46は、1328塩基対を有し、２つの突然変異P295D、K296Eを含む、glgC3(glgC₃ )のDNA配列およびタンパク質配列を示す。これは野生型glgC遺伝子の突然変異体である。図47は、1328塩基対を有するglgC（glgC）のDNA配列およびタンパク質配列を示す。図48は、1328塩基対を有するglgCwt（glgCwt）のDNA配列およびタンパク質配列を示す。これは天然に見られるglgC遺伝子である。図49は、本明細書中ではwxと示されるトウモロコシwaxy遺伝子のDNA配列およびタンパク質配列を示す。図50は、2423塩基対を有するトウモロコシデンプン可溶性シンターゼIIbのDNA 配列およびタンパク質配列を示す。図51は、トウモロコシデンプン可溶性シンターゼIIaのDNA配列およびタンパク質配列を示す。図52は、1749塩基対を有するトウモロコシデンプン可溶性シンターゼI-2のDNA 配列およびタンパク質配列を示す。図53は、トウモロコシ分枝酵素IIのDNA配列およびタンパク質配列を示す。図54は、トウモロコシ分枝酵素IのDNA配列およびタンパク質配列を示す。図55は、トウモロコシデンプン可溶性シンターゼIの輸送ペプチド部分のDNA配列およびタンパク質配列（153）を示す。図56、トランスジェニックコメ植物のPCR解析。コメ植物から単離したゲノムD NAを、挿入遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCR増幅した。1％アガロースゲル上で、非トランスジェニックコメ植物と比べ、特異的なバンドが同定された。図57。ヨウ素溶液を用いた再生SDS-PAGEゲル上のデンプンシンターゼの活性染色。トウモロコシSSI-2の陽性染色は、トランスジェニックコメ植物中にトウモロコシSSI-2が発現していることを示した。図58。SSI-1、SSI-2、およびSSI-3構築物略図。SSIの３つの型をpET発現系中に構築した(方法を参照されたい)。pExs10aはSSI-1、全長トウモロコシSSI（583 アミノ酸）をコードする。pExs8は、SSIのN末端からアミノ酸番号8−52が欠失した、一部切除されたSSIであるSSI-2をコードする。pExsldは、SSI-1から始めの9 3アミノ酸が欠失した、SSIが最も切除された型、SSI-3をコードする。GBSSをコードするwaxy遺伝子の図もまた、比較のため含んでいる。ADPGlcの結合部位と推定されるアミノ酸モチーフKS/TGGLは、三角形で示している。KS/TGGLモチーフは、GBSSのN末端から18アミノ酸に位置し、一方、該モチーフはトウモロコシSSIではN末端から106アミノ酸にある。図の縮尺は正しくない。図59。SSIIa-1、SSIIa-2構築物略図。SSIIaの２つの型をpET発現系中に構築した。pExs3cは全長トウモロコシSSIIaと推定されるSSIIa-1をコードする。SSIIa- 1のN末端配列は、ポリペプチド鎖がアミノ酸番号１から開始することを明らかにしており、SSIIa-1の長さは669アミノ酸である。pExs3aは、SSIIaのN末端の最初の176アミノ酸が欠失した、一部切除されたSSIIaであるSSIIa-2（全長493アミノ酸）をコードする。GBSSをコードする、waxy遺伝子の図もまた、比較のため含んでいる。ADPGlcの結合部位と推定されるアミノ酸モチーフKTGGLは、三角形で示している。KTGGLモチーフは、GBSSのN末端から18アミノ酸に位置し、一方、該モチーフはトウモロコシSSIIaではN末端から194アミノ酸にある。図60。SSIIb-1およびSSIIb-2構築物略図。SSIIbの２つの型をpET発現系中に構築した(方法を参照されたい)。pExs9は全長トウモロコシSSIIbと推定されるSSII b-1をコードする。SSIIb-1のN末端配列は、ポリペプチド鎖がアミノ酸番号１から開始することを明らかにしており、したがってSSIIb-1の長さは637アミノ酸である。pExs9aは、SSIIbのN末端の最初の144アミノ酸が欠失した、一部切除されたSSIIbであるSSIIb-2(全長492アミノ酸)をコードする。GBSSをコードするwaxy 遺伝子の図もまた、比較のため含んでいる。ADPGlcの結合部位と推定されるアミノ酸モチーフKTGGLは、三角形で示している。KTGGLモチーフは、GBSSのN末端から18アミノ酸に位置し、一方、該モチーフはトウモロコシSSIIbではN末端から15 8アミノ酸にある。図61。SSI酵素の温度曲線。酵素および[U-¹⁴C]-ADPGlcを除くすべての検定構成要素を混合し、そしてその後、酵素およびADPGlcを加える前に、各温度で３分間プレインキュベーションした。すべての検定で、[U-¹⁴C]-ADPGlcの最終濃度は３mMであり、一方、アミロペクチンは６mg/mlであった。各点は、３つの別々の測定の平均である。図62。SSIIa-1およびSSIIa-2の温度最適条件。酵素および[U-¹⁴C]-ADPGlcを除くすべての検定構成要素を混合し、そしてその後、酵素およびADPGlcを加える前に、各温度で３分間プレインキュベーションした。0.5Mクエン酸存在下の検定では、５mg/mlのアミロペクチンをプライマーとして用いた。クエン酸を含まない検定では、10mg/mlのアミロペクチンを用いた。すべての検定で、[U-¹⁴C]-ADPGlcの濃度は３mMであった。各点は、３つの別々の測定の平均である。図63。SSIIb-1およびSSIIb-2の温度最適条件。酵素および[U-¹⁴C]-ADPGlcを除くすべての検定構成要素を混合し、そしてその後、酵素およびADPGlcを加える前に、各温度で３分間プレインキュベーションした。すべての検定で、[U-¹⁴C]-AD PGlcの濃度は３mMであり、そしてグリコーゲンの濃度は40mg/mlであった。各点は、３つの別々の測定の平均である。好ましい態様−説明「遺伝子」は、宿主において望ましい活性を産生する、完全な遺伝子配列またはあらゆる突然変異またはコドンの多様性、また別に、宿主において望ましい活性を産生するのに必要な、遺伝子配列の一部分または複数の部分を意味するものとする。例えば、glgC遺伝子は、glgC₁₆、glgC₃および宿主において望ましい活性を産生する他の突然変異体を意味するものとする。デンプンシンターゼ遺伝子は、全長SS、デンプンシンターゼ活性を持つ、N末端が一部切除されたSSまたは突然変異SSを意味するものとする。「グリコーゲン様」は、天然状態の大腸菌により、そしてHanping Guanによる上述の論文に解説されるように宿主により、主要なデンプン産物として産生されるものなどの多糖成分を意味するものとする。「非グリコーゲン様」は、植物様であり、そして天然状態の大腸菌により、そしてHanping Guanによる上述の論文に解説されるように宿主により、主要なデンプン産物として産生されるものではない多糖成分を意味するものとする。「植物様デンプン」は非グリコーゲン様である。「形質転換遺伝子」は、天然以外の手段により、植物または細菌の系統（line age）のどこかにおいて、植物に導入された遺伝子を意味するものとする。したがって形質転換された宿主の子孫は、形質転換遺伝子を含みつづけるであろう。「形質転換された宿主」は、本明細書に論じられる新規プラスミドの１つまたはそれ以上および／またはデンプン合成遺伝子の新規の組み合わせを含む、あらゆる生物を意味するものとする。本出願中に、同一の遺伝子またはシンターゼを表すのに、多くの異なるプロトコルを使用している。MSS#はトウモロコシ可溶性デンプンシンターゼ、SS#は同様にデンプンシンターゼを意味するものとするが、必ずしもトウモロコシではない。STS#もまた可溶性デンプンシンターゼを意味するものとする。GBSSは顆粒結合デンプンシンターゼである。SBE#はデンプン分枝酵素、MBEはトウモロコシデンプン分枝酵素、MSBE#はトウモロコシデンプン分枝酵素、そしてBE#はデンプン分枝酵素である。本発明は、広く、非グリコーゲン様成分を産生する植物デンプン合成遺伝子を持つ細菌または植物などの形質転換宿主を含む(トウモロコシ由来のBEIおよびBE IIを含む細菌はグリコーゲン様成分を産生する)。デンプン産生植物および生物を以下、宿主と称する。本発明の主要な側面の１つは、細菌宿主からの植物様デンプンの生成および植物宿主における改変デンプンの産生である。本発明は細菌および形質転換コメ植物双方におけるものを例示する。宿主は、制限されるわけではないが、植物にglgC遺伝子（細菌遺伝子）を添加することにより、無制限の ADPG供給を含んでもよい。さらに、本発明は、細菌における使用に適合した構築物および植物における使用に適合した構築物においてトウモロコシ遺伝子および／または細菌遺伝子を含むプラスミドを含む。植物構築物におけるプラスミドは、好ましくは該植物に認識される有効なプロモーター、輸送ペプチド、および該植物中のアミロプラストへ通過する際、輸送ペプチドから該タンパク質を切断することを可能にする切断部位を含む。コメ形質転換に用いられるプラスミドは、特に、植物使用に適合した構築物中に、トウモロコシ10kd zeinプロモーター、およびトウモロコシSSI遺伝子由来の輸送ペプチドを含んだ。本発明はまた、植物のデンプン貯蔵部位または宿主細胞中に改変デンプンを産生する植物、および改変デンプン自体も含む。さらに本発明は、宿主が、異なる非グリコーゲン多糖を産生するように、宿主内で活性がある組み合わせの多くのデンプン遺伝子の組み合わせを含む。またさらに、本発明は細菌宿主において植物様デンプンを作成する方法および植物において改変植物様デンプン（該遺伝子を含む構築物を持たないとき宿主が作るデンプンの種類または量に関し改変されている）を作成する方法を含む。本発明のさらに別の目的は、デンプンを形成するのに使用される基質ADPGをコードする遺伝子の添加である。本発明は、植物での使用に適合したプロモーターおよびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼI またはその突然変異型をコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、植物宿主内に形質転換された、植物での使用に適合したプロモーター、および所望によりADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIまたはその突然変異型をコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、植物での使用に適合したプロモーターおよびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼII aまたはその突然変異型をコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、植物宿主内に形質転換された、植物での使用に適合したプロモーター、および所望によりADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、およびデンプンシンターゼIIaまたはその突然変異型をコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、植物での使用に適合したプロモーターおよびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼII bまたはその突然変異型をコードする遺伝子を有するプラスミドを含む。本発明はまた、植物宿主内に形質転換された、植物での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする所望の遺伝子、およびデンプンシンターゼIIbまたはその突然変異型をコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、植物での使用に適合したプロモーターおよびピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、デンプンシンターゼIIb、DU1の少なくとも１つをコードする遺伝子を有するプラスミドを含む。本発明はまた、植物宿主内に形質転換された、植物での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、デンプンシンターゼIIbおよびD U1の少なくとも１つをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、植物での使用に適合したプロモーターおよびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIbおよびデンプンシンターゼIII（DU 1）の少なくとも１つをコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、植物宿主内に形質転換された、植物での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする所望の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIb、デンプンシンターゼIII（DU1）の少なくとも１つをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および脱分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、細菌または酵母での使用に適合したプロモーターおよび ADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIをコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは該宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、細菌または酵母宿主内に形質転換された、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、細菌または酵母での使用に適合したプロモーターおよびピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIIaをコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは該宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、細菌または酵母宿主内に形質転換された、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、および所望によりADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIIaをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびデンプンシンターゼIII（DU1）をコードするトウモロコシ遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、細菌または酵母宿主内に形質転換された、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする所望の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、およびデンプンシンターゼIIIをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIb、デンプンシンターゼIII（DU1）の少なくとも１つをコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、細菌または酵母宿主内に形質転換された、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIb、デンプンシンターゼIIIの少なくとも１つをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明は、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびADPGlcピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIb、デンプンシンターゼIIIの少なくとも１つをコードする遺伝子を有する、プラスミドまたは同一宿主内のプラスミドの組み合わせを含む。本発明はまた、細菌または酵母宿主内に形質転換された、細菌または酵母での使用に適合したプロモーター、およびピロホスホリラーゼをコードする遺伝子、好ましくは細菌遺伝子、および以下の遺伝子、デンプンシンターゼI、デンプンシンターゼIIa、IIb、デンプンシンターゼI II（DU1）の少なくとも１つをコードする遺伝子、および分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および脱分枝酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の組み合わせも含む。本発明はSSIおよびSSIIおよびSSIII遺伝子の一部切除された型で、それでもなお多糖を作るに十分なタンパク質を供給する前記型を含む。異なる組み合わせの SSおよびSBEを、GSおよびGBEが欠失している大腸菌HPG204（DE3）またはG6MD3に形質転換することにより、我々は、トウモロコシSSI、SSIIおよびSSIIIが合成されるグルカンの大きさに異なる特異性を有する最初の証拠を得た(図１を参照されたい)。本明細書中に我々は、代謝工学により、大腸菌においてSSおよびSBEを持つ宿主から、異なる多糖を産生するモデル系を提示する。我々はまた、SSの一部切除された型が異なるVmax、温度安定性および運動特性を有することを示した (表、図)。我々はまた、大腸菌にデンプンシンターゼおよび／または分枝酵素を形質転換した結果、大きさおよび構造の異なる多糖が産生されることも立証した。これらの多糖は、食品および非食品産業において、デンプン機能を置き換えおよび／または補足するのに使用することも可能である。大量のこれらの多糖を発酵技術により産生してもよい。より高次の植物におけるデンプン生合成および大腸菌におけるグリコーゲン生合成は、基質としてアデノシンニリン酸グルコース（ADPGlc）を用いる同様の反応を有する。この類似性により、植物デンプンシンターゼ（SS）およびデンプン分枝酵素（SBE）を用いて、グリコーゲンシンターゼ（GS）およびグリコーゲン分枝酵素（GBE）が欠損する大腸菌G6MD3におけるGSおよびGBEの機能を補足することも可能となる。大腸菌G6MD3への大腸菌glgC遺伝子およびトウモロコシデンプンシンターゼ遺伝子の形質転換により、アミロースに似た直鎖α1, 4グルカンが産生された。glgC、トウモロコシデンプンシンターゼおよびトウモロコシ分枝酵素の共発現により、分枝した多糖が産生された。しかし、植物デンプン分枝酵素およびデンプンシンターゼの異なる特性により、大腸菌において異なる多糖を合成することが可能になる。トウモロコシSSIは優先的に短い鎖（dp 6-15）を合成する一方、SSIIおよびSSIIIはそれぞれ優先的に長い鎖（dp＞24）および中程度の鎖（dp 16-24）を移動させる。異なるトウモロコシデンプンシンターゼ、大腸菌グリコーゲンシンターゼ（glgA）および／またはトウモロコシ分枝酵素を大腸菌HPG96または大腸菌G6MD3へ形質転換した結果、DP 500-4000の異なる大きさの多糖の合成が行われた。トウモロコシSSにより大腸菌において合成されたこれらの多糖は、植物供給源由来のデンプンおよび動物由来のグリコーゲンを含む、天然生物において合成される多糖とは異なる物理化学的特性を有する。該多糖は、食品および非食品産業において、デンプン機能を置き換えおよび／または補足するのに使用することも可能である。大量のこれらの多糖を発酵技術により産生してもよい。以下の材料は本発明の構築に使用された。開始材料のいくつかは、ウィスコンシン州マディソンのNovagenより商業的に入手可能である。カタログ番号69748-1のET-23d(+)DNAおよびカタログ番号69387-1のBL21(DE3) ；カタログ番号697401のET-21a(+)DNAである。植物宿主以下のプラスミドを、コメ植物トランスジェニック１に形質転換している。MS TSIA(pExs52)およびglgC₃(pExs66)、MSTSIIaおよびglgC₃(pExs53およびpExs56) 。コメ形質転換体の第二の群は、MSTSIIcおよびglgC₃（pExs54およびpExs56）を含む。形質転換の第三の群：トランスジェニック５はMSTSIIIおよびglgC₃(pExs61およびpExs66)；トランスジェニック６はMwx およびglgC₃（pExs65およびpExs66）を含む。一般的には、プラスミドマップに関しては図25−41、そしてプラスミドに使用された配列に関しては図43−55を参照されたい。さらに、glgAおよびglgBおよびglgCを組み合わせ、そしてコメに形質転換した。これはコメ植物デンプン経路を、ADPGをコードする遺伝子および以下の酵素、SSI、SSII、SSIII、脱分枝酵素、BEI、BEII、GBSS（wx）を少なくとも１つコードする遺伝子と組み合わせたものである。これらのプラスミドは、実質的に図に示された植物宿主のためのプラスミド中で、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、ミロ（milo）などの他の穀草に形質転換することも可能であった。プロモーターは公表されているwaxy遺伝子でもよく、他の別のzeinプロモーターも知られ、そしてプロモーターとして使用することも可能であった。本明細書に使用されるプロモーターは図 45aおよび45bに記載されている。さらにこれらのプラスミドはほとんど手を加えずに、ジャガイモ、サツマイモ (sweet potato)、タロイモ(taro)、ヤムイモ、ミヤコグサ(lotus)、キャッサバ、ピーナッツ(peanut)、エンドウ、ダイズ(soybean)、インゲン(bean)、またはヒヨコマメ（chickpea）などの双子葉植物に形質転換することも可能であった。プロモーターを選択し、特定の双子葉植物のデンプン貯蔵領域（根であるものもあり、塊茎であるものもある）を標的にすることも可能であった。単子葉植物および双子葉植物を形質転換するさまざまな方法が当産業に知られており、そして遺伝子を形質転換する方法は本発明には重要でない。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）に、Anら（1988）Binaryvectors.Pl ant Molecular Biology Manual A3中，S.B.GelvinおよびR.A.Schilperoot監修（オランダ・ドルドレヒト：Kluwer Academic Publishers）,pp.1-19の凍結融解法により、プラスミドを導入してもよい。構築物を含むアグロバクテリウムの接種原の調製および植物材料の接種、新芽（shoot）の再生、および新芽の発根は、E dwardsら（1995）Biochemical and molecular characterization of a novelsta rch synthase from patatoes.Plant J.8,283-294に記載されている。さらに、異なる双子葉植物のためのプロモーター、特に35sCaMVが知られており、そしてMonsantoもまた、パタチン（patatin）プロモーターと呼ばれるジャガイモで有用なプロモーターを公表している。多くの単子葉植物もまたデンプン産生植物であるが、約10年前まで単子葉植物は形質転換体を成長させるのが困難であった。現在、単子葉植物で用いられている形質転換の最も傑出した方法は、植物への微小突起物の撃ち込み（gunning）またはアグロバクテリウムを用いてそして続いて形質転換された材料から植物を再生させるものである。現在、単子葉宿主のさまざまな組織および細胞をプラスミドで形質転換することが可能である。実際、少なくとも５年前からカルスだけでなく子葉（cotyledon）を形質転換する方法の解説もある。植物を形質転換し、そして形質転換体を選択可能またはスクリーニング可能マーカーで選択する方法もまた、よく知られている。同一プラスミド内でのマーカーの使用および宿主に共形質転換される別個のプラスミドでのマーカーの使用が、一般的な当業者によく知られている。プラスミドを形成し、そして植物を形質転換するバイオテクノロジー法が、JOHNWILEY & Sons,Incにより１９９５年に出版されたA Short Pr otocols InMolecular Biolory,3^rdedと題される書籍に列挙されている。さらに、撃ち込み（gun）およびプロトプラストを用いた形質転換法がDekalbおよびAgr acetusおよびCibaに発行された多くの特許に解説されている。好ましい態様−運用実施例１大腸菌発現ベクターの構築発現ベクターpExs2はpET-23d（Novagen）およびpGP1-2（15）由来であった。発現ベクターpExs-trcおよびpExs-trc3はpTrc99a（Pharmacia）およびpGP1-2由来であった。pBR322複製起点を含むBglII/PstI断片（2192bp）をpET-23dから削除し、そしてpGP1-2由来の起点p15Aおよびカナマイシン耐性遺伝子を含むBamHI/Pst I断片（３kb）と置き換えた。この過程により、アンピシリンおよびカナマイシン耐性遺伝子を両方含むプラスミドpEXS1が生成された。アンピシリン耐性遺伝子は、ScaI/BglI断片を削除(360 bp、BglI端を埋め込み、そしてScaI端と平滑末端連結)することにより不活性化した。pEXS1中のアンピシリン耐性遺伝子の不活性化により、T7プロモーター、T 7ターミネーター、カナマイシン耐性遺伝子およびp15A複製起点を含む発現プラスミドpEXS2が生成された。プラスミドpTrc99aをNdeIで消化し、クレノウ断片で埋め込み、そしてNdeI部位を削除するため、平滑末端連結した。突然変異誘発によりNcoI部位にNdeI部位を導入し、プラスミドpExs-trcを生成した。pBR322複製起点を含む、pExs-trc中のBglIおよびPvuII断片（2.48kb）を、pGP1-2由来の起点p15Aおよびカナマイシン耐性遺伝子を含むBglI/BamHI（クレノウ断片で埋め込み）断片（３kb）と置き換え、pExs-trc2を生成した。アンピシリン耐性遺伝子を、ScaI/BglI断片を削除（360bp、BglI端を埋め込み、そしてScaI端と平滑末端連結）することにより不活性化した。pExs-trc2中のアンピシリン耐性遺伝子の不活性化により、発現プラスミドpExs-trc3が生成された。トウモロコシSSのための発現ベクター構築。大腸菌においてトウモロコシSSを発現するため、PCR法を用い、以下のヌクレオチドを用いてトウモロコシSSのN末端を修飾した：プライマーExs4（5'-CAAGAATGCTGCGGGAGTC-3’）、プライマーEx s23(5'-AAGTCGACATATGTGCGTCGCGGAGCTGAGCAG-3')、プライマーExs57(5'-GGGCCCC ATATGAGCATTGTCTTTGTAACCGG-3')、プライマーExs1(5'-CTCGGGCCCATATGGGGGAGAAT GTTATGAA-3')、プライマーExs2(5'-GAGGCATCAATGAACACAAAGTCG-3')、プライマー Exs33(5'-GAAGGGCCCCATATGGCTGAGGCTGAGGCCGGGGGCAAG-3')、プライマーExs16(5' -TTGGATCCATATGGGAGCTGCGGTTGCATTGGG-3')、およびプライマーExs17(5'-CCTGCGG GCTCTGGCTTCACC-3')、プライマーExs55(5'-TTGGATCCATATGAACGTCGTCGTGGTGGCTTC -3')、プライマー56(5-GCATACCATGGAACCTCAACAGC-3')、プライマー53(5'-GGTACC ATATGAACGTCGTCTTCGGCG-3')、プライマーExs54(5'-GACAGGCCCGTAGATCTTCTCC-3') 、プライマーExs-wx(5-TTGGTACCATATGGCCAGCGCCGCCGGCATGAACG-3')。それぞれプライマーExs23およびExs57と対合したプライマーExs4は、トウモロコシSSSI 遺伝子のN末端を修飾し、pExs-10およびpExs-1dを生成するためのものであった。個々にプライマーExs33およびExs1と対合したプライマーExs2は、トウモロコシSSSIIのN末端を修飾し、pExs3cおよびpExs3aを生成するためのものであった。個々にプライマーExs16およびExs55と対合したプライマーExs17は、トウモロコシSSSIIIのN末端を修飾し、pExs-9およびpExs-9aを生成するためのものであった。個々にプライマーExs-wxおよびExs53と対合したプライマーExs54は、トウモロコシGBSSのN末端を修飾し、pExs-wxおよびpExs-wx2を生成するためのものであった。修飾されたN末端はpBluescript SKプラスミド中で残りのSS遺伝子と再結合させた。再構築トウモロコシSSをpBluescript SKから、発現ベクターpET-21a(No vagen)、pExs-trc、pExs-trc3のNdeI/NotI部位にサブクローンした(マップは付随しており、表１はSSSのN末端配列を示す)。実施例２大腸菌ADPGlcピロホスホリラーゼ、BEおよびトウモロコシSBEのための発現プラスミドの構築大腸菌glgB遺伝子はプラスミドpOP12（16）より切除した。glgBリボソーム結合部位および全長glgB遺伝子を含むBstX1(埋め込み)/HindII断片を、pBluescript SK-（Stratagene）のSmaI部位にクローンした。pBluescriptSK-中のglgB遺伝子を続いてpEXS2のXbaI/SalI部位にクローンし、プラスミドpEXSBを生成した。プラスミドpOP12由来のADPGlcピロホスホリラーゼをコードする大腸菌glgC遺伝子をPCRするのに、プライマーG（5'-GAAGATCTGGCAGGGACCTGCACAC-3'）およびプライマーH（5'-GGACTAGTGCATTATCGCTCCTGTTTAT-3'）を用いた。PCRによりそれぞれ N末端およびC末端部位に導入したBglII部位およびSpeI部位を用い、PCR産物をpB luescript SK-のBamHIおよびSpeI部位にクローンした。自身のリボソーム結合部位を含むglgC遺伝子を発現プラスミドpEXS2のXbaI(クレノウ断片を用い埋め込み )およびNotI部位にサブクローンし、プラスミドpEXScを生成した。リボソーム結合部位と共に成熟トウモロコシSBEIおよびSBEIIをコードする遺伝子を、プラスミドpET- 23d-SBEIおよびpET-23d-SBEIIからプラスミドpEXScのSpeI部位にサブクローンし、プラスミドpEXSc-SBEIおよびpEXSc-SBEIIを形成した。リボソーム結合部位を含む成熟トウモロコシSBEIIをコードする遺伝子をpEXSc-SBEIのXbaI/NotI部位にクローンし、プラスミドpEXSc-SBEI-SBEIIを形成した。大腸菌glgc遺伝子およびトウモロコシSBEIおよびSBEIIをコードする遺伝子もまた、それぞれプラスミドp Exs-trcおよびpExs-trc3にクローンし、そして共にpExs2として記載した。実施例３ GBEおよびGS活性を欠損する大腸菌HPG204の単離株構築には相同的組換えを用いた。これはHamiltonらにより記載された方法（ Journal of Bacteriology,1989,171:4617-4622）にしたがい、行った。選択を容易にするため、温度感受性pSC101レプリコンを用いた。スペクチノマイシン・アデニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpOP12のPvuII部位に導入し、スペクチノマイシン耐性を有し、そしてglgB遺伝子のC末端およびglgA 遺伝子のN末端が削除されたプラスミドHPG9を形成した。スペクチノマイシン耐性遺伝子が、一部切除されたglgBおよびglgAの間に挿入されたDNA断片B=SA=を、温度感受性レプリコン（Hamiltonら,Journal of Bacteriology,1989,171:4617-4 622）を含むプラスミドpMAK705のXbaI部位にサブクローンし、プラスミドpMak70 5B=SA=を形成した。プラスミドpMak705B=SA=をTG1細胞に形質転換した。形質転換細胞を100mg/mlのスペクチノマイシンを含む３mlのLB中で室温で一晩培養した後、細胞を100mg/mlのスペクチノマイシンを含むLB寒天プレートにまき、そして 44℃で一晩インキュベーションした。単一コロニーを100mg/mlのスペクチノマイシンおよび0.2％グルコースを含むLB寒天プレートに接種し、そして44℃および3 7℃で一晩インキュベーションした。37℃のコロニーはヨウ素で染色した。染色を示さなかったコロニーを選択し、100mlのLB中で、37℃で一晩増殖させた。細胞を採取し、そしてグリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素活性を検定するため、抽出緩衝液中でホモジェナイズした。glgAおよびglgB活性を欠く細胞はHPG204[F=traD3 6 LacI^qD(glgBXCA)D(LacZ)M15proA⁺B⁺/SupED (hsdM-mcrB)5(r_k ^-m_k ^-McrB^-)th iD(lac-proAB)，Spectinomycin^R,Chloramphenicol^R]と名付けられた。IDE3プロファージの大腸菌HPG204への部位特異的組込みにNovagenのIDE3溶原化キットを用い、大腸菌HPG204（DE3）を形成した。溶菌液をP1vlrを用いて調製し、およびその大腸菌 BL21(DE3) [F=traD36 LacI^qD(glgBXCA)D(Lac Z)M15proA⁺B⁺/SupED (hsdM-mcrB)5(r_k ^-m_k ^-McrB^-)thiD(lac-proAB),Spectinom ycin^R,Chloramphenicol^R]への形質導入。実施例４トウモロコシSSおよびSBEの大腸菌における発現プラスミドpExs-2およびpExs-trc3はカナマイシン耐性およびp15A複製起点を有する。これはpBR322起点を含むプラスミドpET21a、pExs-trc、pTrc99Aと共存可能である。発現プラスミドpExs-2およびpET-21aを用い、大腸菌HPG204(DE3)においてSSおよびSBEを発現させた。大腸菌G6MD3での発現には、発現プラスミドpE xs-trcおよびpExs-trc3を用いた。これにより、GSおよびGBE活性を欠く大腸菌HP G204（DE3）またはG6MD3において、異なる組み合わせのトウモロコシSSおよびSB Eの形質転換が可能になった。トウモロコシSSおよびSBEで形質転換した細胞の一晩培養を、0.2％グルコース、100mg/mlのアンピシリンおよび50mg/mlのカナマイシンを含む新しいLBで1:20（v/v）に希釈した。細胞を37℃で約２時間、A600nm= 0.6になるまで増殖させた後、イソプロピルb-D-チオガラクトシドを0.5mMまで添加することにより、トウモロコシSBEおよび／またはSSの発現を誘導した。25℃ で４時間増殖させた後、細胞を冷蔵遠心分離により採取した。実施例５大腸菌からの非常に分枝したa-グルカンの単離細胞沈澱（30g）を10mM EDTAおよび５mM DTTを含む150mlの50mM tris-酢酸緩衝液（pH7.5）に再懸濁し、そして超音波により溶解した。ホモジェネートの一部をSTSおよびSBE活性の検定のために取り分けた後、ホモジェネートを20,000g で4℃、50分遠心分離した。上清を回収した後、沈澱を150mlの水に再懸濁し、そして時々攪拌しながら15分沸騰させた。再懸濁物を室温で20,000g、30分遠心分離した。上清を回収した後、沈澱を上記のように100mlの水で再び洗浄した。集めた分画に0.1体積の50％トリクロロ酢酸（TCA）を加えた。氷上で30分間置いた後、沈澱を15,000gで20分回転して落とし、その後30mlの5％TCAで洗浄し、そして上記のように遠心分離した。上清および洗浄液を集め、そして１体積の無水エタノールを加えた。氷上に30分置いた後、15,000gで15分遠心分離することにより多糖を回収した。多糖を水に再溶解し、そしてエタノールで沈澱させた。この段階は２回繰り返した。沈澱をメタノールで２回、アセトンで２回洗浄し、そして室温でシリカゲル上で乾燥させた。実施例６大腸菌からの直鎖a1,4多糖の単離 50グラムの細胞沈澱を、10mM EDTAおよび5mM DTTを含む50mMTris酢酸緩衝液、 pH7.5の250mlに再懸濁する。３分間超音波処理する(１回45秒、出力#8、30秒の間隔をおいて４回)。ホモジェネートを12,000rpm（SA1500）で50分遠心分離する。上清をヨウ素染色でチェックし、そして捨てる。１mlのホモジェネートおよび１mlの上清を酵素検定のために取り分ける。沈澱を再懸濁し、そして100ml DMSO で抽出する。多糖を、沸騰水槽中で15分加熱および攪拌することにより抽出する。40℃以下まで冷まし、そして室温で12,000rpm、30分遠心分離する。上清を集める。沈澱をもう２回、100ml DMSOで抽出する。集めた上清に同体積の無水エタノールを加え、混合し、そして氷上に30分置く。4℃で、12,000rpm、30分遠心分離する。沈澱を、沸騰水槽中で加熱することにより20ml DMSOに再溶解する。80m lの水を加え、そしてよく混合する。10mlのブタノールを溶液に加えた後、溶液を混合し、そして0℃で１時間置く(時々混合する)。4℃ で、12,000rpm、30分遠心分離する。この段階をもう１度繰り返す。沈澱を、沸騰水槽中で加熱することにより90mlの熱い水に再溶解する。溶解しない成分をすぐに室温で遠心分離することにより除く。上清に10mlのブタノールを加え、0℃ で１時間置き、そして4℃で、12,000rpm、30分遠心分離する。この段階をもう１度繰り返す。アミロース沈澱を加熱により90mlの熱い水に再溶解し、そして10ml のブタノールを溶液に加える。氷上で40℃に１時間置いた後、4℃で30分遠心分離する。この段階をもう１度繰り返す。沈澱を加熱により100mlの10％ブタノールに再溶解する。アミロースを0℃に置き、そして4℃で、12,000rpm、30分遠心分離することにより沈澱させる。沈澱を25mlのメタノールで３回、アセトンで１回洗浄する。シリカゲル上で乾燥させる。実施例７酵素検定上清５mlを用い、以前記載されたもの（Preiss）に重要でない修飾を加え、ST SおよびSBE活性を検定した。STSの反応混合物は、100mMビシン緩衝液、10mg/ml グリコーゲン、0.5mg/ml BSA、0.5Mクエン酸ナトリウム、25mM酢酸カリウム、10 mM GSH、3mM[14C]ADPGlc（500dpm/nmol）および酵素を含み、最終体積は0.1mlであった。反応は25℃で15分行い、そして２分間の沸騰により終結させた。取りこまれなかった[14C]ADPGlcをDowex陰イオン交換カラム（200-400メッシュ、Sigma Chemical Co.）で分離した。活性の１単位は、25℃で１分間にa-グルカンに取りこまれた１nmol Glcとして定義する。SBE活性はホスホリラーゼ刺激検定により測定した。活性の１単位は、30℃で１分間にa-グルカンに取りこまれた１mmol Glcとして定義する。実施例８酵素精製組換えSS精製のため、細胞沈澱を超音波緩衝液(50mM Tris酢酸、pH7.5、10mM EDTA、および5mM DTT；細胞重量１グラム当たり緩衝液７ml) に再懸濁し、そしてFisher 550超音波破砕機を30秒間隔をおいて１分間ずつ５回バーストさせて細胞を溶解した。ホモジェネートを9600gで30分遠心分離した。その後、中性化飽和硫酸アンモニウムをゆっくり40％飽和まで加えることにより、上清中のSSIを沈澱させた。氷上でさらに50分攪拌した後、12700gで45分遠心分離することによりタンパク質を回収した。その後、タンパク質沈澱を0.1M KCl を含む緩衝液A（50mM Tris、pH7.5、１mM EDTA、および５mM DTT）に再溶解し、そして同じ緩衝液に対し、緩衝液を１度交換して透析した。透析の後、試料を13 000gで20分遠心分離して溶解しない成分を除いた。生じた上清を透析緩衝液であらかじめ平衡化したアミロースアフィニティカラムに装填し、そして流出物を回収した。カラムを10カラム体積の0.1M KClを含む緩衝液Aで洗浄し、そしてその後0.5M KClおよび0.5Mマルトースを含む緩衝液Aで洗浄した。両方の洗浄中の分画を回収した。活性分画を集め、そして緩衝液Aに対し、緩衝液を１度交換して一晩透析した。翌日アミロースカラム試料をろ過し、そしてmono Q5/5 FPLCカラム（Pharmacia）に適用した。緩衝液Aで洗浄した後、20mlの0-0.4M KCl勾配を使用した。活性分画を8％SDS-PAGEゲル（31）上で電気泳動し、これら分画中のSSI 純度を測定した；均質と思われる分画を集め、そしてCentricon-30スピンカラム（Amicon）を用いて濃縮した。１単位活性は、5mg/mlグリコーゲンをプライマーとして用い、25℃で１分間に a-1,4グルカンに取りこまれる1μmolグルコースと定義する。注：精製の途中に行われた検定は、10mg/mlグリコーゲンおよび３mM[U-¹⁴C]-ADP Glcを含んだ。検定は室温で0.5Mクエン酸の存在下で行った。１単位は１分間に移しかえられる1μmol[U-¹⁴C]−グルコースである。注：検定は、材料および方法に記載されたように、37℃で行った。データは、３つの独立した測定の平均として、標準偏差と共に示している。K_mはμg/mlプライマーとして示し、そしてV_maxはμmol/分/mgタンパク質で示している。ADPGlcはすべての検定で3mMである。^a 飽和グリコーゲン濃度は得ることが不可能であったため、標準の20mg/mlグリコーゲンを使用し、このプライマーに対する酵素速度を比較した。 ^aはN末端が一部切除された型のSSを示し、一方SS-1と示されたSSはすべて、該SS の全長型である。 ^*N1：STSI N末端伸長部； N2：STSIIa N末端伸長部； N3：STSIIb N末端伸長部； WX2：WX2 C末端触媒ドメイン； C2：STSIIa C末端触媒ドメイン； C3：STSIIb C末端触媒ドメイン。^* (+)：N末端伸長部を同じ方向でC末端触媒ドメインの前方に挿入した； (−)：N末端伸長部を逆の方向でC末端触媒ドメインの前方に挿入した。^* デンプンシンターゼ酵素活性：nmol/分/mgタンパク質^* BL21（DE3）の残留グリコーゲンシンターゼ活性は2.6nmol/分/mgタンパク質である。^* NRA―組換え体が得られない。図42および21に記載された写真は、当業者に知られるものに比較し、該デンプンに存在する視覚的相違を示すことを試みている。デンプンの説明トウモロコシデンプンは、乳白色の、やや濃厚な（thick）ゲルで、流動性があるとしてもわずかである。コメデンプンは、２つの水平面を形成する。上層は濃厚なシロップ状の粘度で、トウモロコシデンプンより流動性があり(トウモロコシデンプンより濃厚でない)、不透明な乳白色(この層ではトウモロコシデンプンより光を通す)、そして下層は非常に白い塊（glob）で物質のこの層はそれほど光を通さない。この下層は非常に濃厚な塊として形成され、そして流動性があるようではない。トウモロコシアミロペクチンは、コメデンプンの上層より白くなく、そして非常にかすかに不透明な乳白色で（トウモロコシデンプンより光を通す）コメ上層より流動性がわずかに低い。ジャガイモデキストリンは、最も光を通し、ほとんど透明に見えるが、それでも不透明な白色で、そして非常に流動性が高く、水よりやや流動性が低い程度である。蝋様トウモロコシデンプンは、非常にゆっくりと流れ、そして蜂蜜の粘度を有する。色は非常に不透明で、光をほとんど通さず、そして色はトウモロコシデンプンよりわずかに明るい程度である。プラスミドpExs-8から作られるSSI デンプンは、２つの異なる水平面を有する。上層は、透明に見え、そして水の流動性よりわずかに濃厚である。下層は沈澱のように見える。本試料は小さい像および雪片に似たプラスチック片を含む装飾品に似ている。これらの装飾品のように、試料をさかさまにすると雪が降るように見える。しかし、本試料中の薄片は、わずかに粘着性で、そして層を混合した瞬間に不透明な白い液体を形成するように見える。以下の２つのプラスミド、pExsC BEI BEIIおよびpExs8を含む宿主から作られるSSI デンプンは、pExs-8の上層ほど透明でなく、そしてpExs-8よりわずかに濃厚でないようである。ジャガイモデキストリンよりさらにより流動性が高い。以下の２つのプラスミド、pExsC BEI BEIIおよびpExs-9を含む宿主から作られるSSIIb デンプンは、pExs-8の上層ほど透明でなく、そしてpExs-8よりわずかに濃厚でないようである。ジャガイモデキストリンよりさらにより流動性が高い。以下の２つのプラスミド、pExsC BEI BEIIおよびpExs-wxを含む宿主から作られる蝋様デンプンは、pExs-8の上層ほど透明でないが、底に沈むいくつかの小さい糸のような鎖を有するようであり、そして混合すると物質はわずかに白さを増し、そしてpExs-8よりわずかに濃厚でないようである。ジャガイモデキストリンよりさらにより流動性が高い。以下の２つのプラスミド、pExsC BEI BEIIおよびpExs-3aを含む宿主から作られるSSII デンプンは、トウモロコシデンプンの色を持ち、そしておそらくわずかに白さが増しているがpExs-8の下層ほど白くなく、そして明確により多くの光を通し、そして混合するとpExs-8の流動特性を持つ。 glgA デンプンは、非常にわずかな沈澱を有するように見え、トウモロコシアミロースペクチンおよびExsC BEI BEIIおよびpExs-wxと匹敵する色である。そして流動性はトウモロコシアミロースとpExsC BEI BEII pExs-wxの間である。上記記載の多糖試料は、一般的に色にしたがい、以下の群を形成する：蝋様トウモロコシデンプンおよびトウモロコシデンプンおよびpExsC BEI BEII pExs3a およびpExsc8が最も白い群である。本群の流動特性は、かなり多様である。トウモロコシデンプンは塊であり、そして蝋様トウモロコシデンプンはわずかに流動性がある程度で、そしてpExsC BEI BEIIおよびpExs3aおよびpExsc8は、シロップよりずっと水に似ている。第二群は、トウモロコシアミロペクチンおよびpExsC BEI BEII pExs-wxおよびpExsC BEI BEIIおよびpExs-A1を含み、より白くなくそしてより透明である。トウモロコシアミロペクチンの流動性は本群中の他の２つのメンバーより劣るが、それでも同様である。最後の群は、最も白くなくそしてしたがってもっとも透明である。本群には、pExsC BEI BEIIおよびpExs-8、ジャガイモデキストリン、pExsC BEI BEIIおよびpExs-10、pExsC BEI BEIIおよび pExs-9が含まれる。本群の流動性もまた互いに同様である。植物宿主以下のプラスミドをコメ植物に形質転換している。突然変異glgC遺伝子の配列は図46に示している。プラスミドは実質的に、細菌プラスミドの産生について上述したのと同様の方式で作成する。図25−41に示したプラスミドマップおよび本出願および記載された短いプロトコルにより、明らかに、一般の当業者が本プラスミドを作成することが可能である。以下の組み合わせのプラスミドをコメ植物に形質転換した。さらに、トウモロコシ遺伝子SSI、SSII、SSII、BEI、BEII、およびGBSSをすべて含む組み合わせを含む、プラスミドの組み合わせを、１つの宿主中に形成し、また別に２つの宿主中に形成し、そしてその後交配させ上方制御されたデンプン遺伝子の完全な補足物を有するハイブリッドを形成している。明らかに一般の当業者は、トウモロコシ遺伝子が一部相同なコメ遺伝子を下方制御するであろう程度まで、これらの遺伝子を下方制御するために該配列をアンチセンス位に置くことが可能であろう。トランスジェニックの第一の群は、MSTSI-2 （pExs52）およびglgC₃(pExs66)、MSTSIIa-2およびglgC₃（pExs53およびpExs56 ）を含むコメ形質転換体（微小突起衝撃により形質転換）を含む。コメ形質転換体の第二の群はMSTSIIaおよびglgC₃（pExs54およびpExs56）を含む。形質転換の第三の群は：トランスジェニック５はMSTSIIbおよびglgC₃ (pExs61およびpExs66)；トランスジェニック６はトウモロコシwxおよびglgC₃（p Exs65およびpExs66）を含む。さらに、glgAおよびglgBおよびglgCを組み合わせ、そしてコメに形質転換する。この最後の形質転換体は、コメ植物デンプン経路をADPGピロホスホリラーゼおよび細菌遺伝子をコードする遺伝子と組み合わせている。以下の酵素、SSLSSIIa、SSIIb、SSIII、脱分枝酵素、BEI、BEII、GBSS（w x）の少なくとも１つ、および細菌デンプン遺伝子のいくつかまたはすべてをコードするプラスミドの組み合わせもまた、有用である。現在、300を越える形質転換体が温室にある。T1トランスジェニックコメ植物をスクリーニングし、そして性質決定した(図56、57)。12の植物がコメ種子中にトウモロコシSSI-2を発現することに成功している。21の植物がコメ種子中にトウモロコシSSIIbを発現することに成功している。我々は現在、共抑制によりコメSS発現を下方制御されたコメ植物をスクリーニングしており、そして400のT2植物が温室にある。トウモロコシデンプンシンターゼおよびその突然変異型トウモロコシデンプンシンターゼの多様な型を性質決定するため、全長SSおよびそのN末端が一部切除された型をコードする遺伝子を大腸菌で発現させた。組換え酵素を精製し、そして動力学的に性質決定した。我々は、異なるアイソフォームおよびその一部切除された型がすべて異なる特性を持つことを立証した(表6 −14、図58−63)。精製トウモロコシSSI-1、SSI-2、およびSSI-3の比活性（Vmax ）は、それぞれ、22.5、33.4および26.3mol glc/分/タンパク質mgだった。我々の結果は明らかに、SSIの触媒中心はそのN末端伸長部にないことを示している。しかし、N末端一部切除によりアミロペクチンに対する酵素親和性が減少した。一部切除されたSSI-3のアミロペクチンに対するK_mは全長SSI-1より約60％から90 ％高かった。SSIIaのN末端一部切除の影響は、用いた検定条件に依存した。SSII a-1およびSSIIa-2の両方に関し、各酵素のV_maxは、検定温度を27℃から37℃に上げると、２倍増加した(表IIおよびIII)。しかしADPGlc親和性への温度の影響は、SSIIa-1およびSSIIa-2では異なっていた。一部切除されたSSIIa-2に関しては、ADPGlcに対するK_mは温度を上げることにより影響を受けなかった。対照的に、全長と推定されるSSIIa-1のK_mは、温度を27℃から37℃に上げることにより２倍増加した(表III)。興味深いことに、一部切除されたSSIIa-2は、本研究に用いられたすべての検定条件でADPGlcに対しSSIIa-1より低いK_mを示した。但し、27℃ でグリコーゲンをプライマーとして用いた際には、これらはADPGlcに対し同様の K_m値を示した。SSIIaのN末端一部切除は、ほとんどの検定条件下でADPGlcに対するK_mを下げるようであるが、一部切除されたSSIIa-2の最大速度は、SSIIa-1に比べ約2−4倍減少することもまた、注目しなくてはならない。クエン酸の存在下で、一部切除されたSSIIb-2はより長いSSIIb-1より、より温度安定性であることが発見された一方、それらのpH活性プロフィールにはほとんど違いが見られなかった。全長と推定されるSSIIb-1は、アミロペクチンまたはグリコーゲンをプライマーとして用いても同様のV_maxを示したが、N末端が一部切除されたS SIIb-2はアミロペクチンをプライマーとして用いたのに比べ、グリコーゲンを用いると、V_maxが40％増加した。SSIIbのN末端一部切除により、アミロペクチンをプライマーとして用いると、V_maxは25％増加した。我々はまた、トウモロコシデンプンシンターゼのキメラ酵素（SSのC末端ドメインを異なるSSのN末端配列または関連のない配列と組み合わせると、SS活性および改変された特性を持つ機能する酵素を産生するであろう）も例示した(表15)。結論、派生物（ramification）および範囲したがって、本発明にしたがい、デンプン遺伝子が新たなそして改変されたデンプンを、植物または細菌どちらの宿主でも産生することが可能であることが理解されるであろう。さらに、トウモロコシデンプンと非常によく似た多糖を細菌宿主において産生することも可能である。上記の記載は多くの各論を含むが、これらが本発明の範囲を限定するものではなく、単に、本発明の現在好ましい態様のいくつかの例示を提供するとして解釈しなければならない。さまざまな他の態様および派生物もまた、本発明の範囲中にある可能性がある。例えば、有用植物および有用穀物および有用多糖産生のための、どちらかの宿主におけるプラスミドの異なる組み合わせである。したがって、本発明の範囲は、既定の実施例によるより、添付の請求項およびそれらの法的同等物により決定されなければならない。本明細書に引用されたすべての参考文献は本明細書にすべて援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/04 ＺＣ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 宿主において非グリコーゲン様である多糖を産生する方法であって： a．発酵過程に使用することが可能な宿主を、デンプン合成酵素、グリコーゲン合成酵素を産生する群より選択される遺伝子で、該宿主が非グリコーゲン様デンプンを産生するように形質転換し、そして b．発酵過程が多糖を産生するように、宿主を該発酵過程に使用する：ことを含む、前記方法。 2. 前記宿主が細菌である、請求項１の方法。 3. グリコーゲン産生に活性を有する遺伝子、および以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つの、本来の宿主における産生において活性を有する少なくとも１つの非デンプン分枝遺伝子を持つよう形質転換された宿主。 4. 宿主が単子葉植物である、請求項３の宿主。 5. 宿主が双子葉植物である、請求項３の宿主。 6. 宿主が植物である、請求項３の宿主。 7. 宿主が細菌である、請求項３の宿主。 8. 宿主が穀草産生植物である、請求項３の宿主。 9. 細菌遺伝子がglgC遺伝子、glgA遺伝子、glgB遺伝子からなる群より選択される、請求項３の宿主。 10．以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つの、本来の宿主における産生において活性を有する少なくとも１つの非デンプン分枝遺伝子が、デンプン可溶性デンプンシンターゼI、II、III遺伝子および脱分枝酵素遺伝子(sul)、GBSS遺伝子、sh2遺伝子およびbt2遺伝子からなる群より選択される、請求項３の宿主。 11．デンプン分枝酵素遺伝子を少なくとも１つ含む、請求項３の宿主。 12．デンプン分枝酵素遺伝子BEI遺伝子を含む、請求項11の宿主。 13．デンプン分枝酵素遺伝子BEII遺伝子を含む、請求項11の宿主。 14．デンプン分枝酵素遺伝子BEII遺伝子を含む、請求項12の宿主。 15． ADPG産生に活性を有する遺伝子、および以下の多糖、アミロペクチンおよびアミロースの少なくとも１つの、本来の宿主における産生において活性を有する少なくとも１つのデンプン遺伝子を持つよう形質転換された宿主であって、該宿主が植物様デンプンであって、そしてグリコーゲン様でない多糖を産生する、前期宿主。 16．ピロホスファターゼ遺伝子、グリコーゲンシンターゼ遺伝子を持つよう形質転換された宿主。 17．グリコーゲン産生に活性を有する遺伝子が細菌遺伝子である、請求項１の宿主。 18．アルファ1,4グルカン合成能およびアルファ1,4-1,6分枝酵素能を欠き、少なくとも１つの植物デンプン可溶性合成遺伝子を発現するよう形質転換された宿主。 19．脱分枝酵素をコードする遺伝子を少なくとも１つ発現するよう形質転換されたことを含む、請求項18の宿主。 20．前記遺伝子がデンプン可溶性シンターゼ酵素Iをコードする、請求項18の宿主。 21．前記遺伝子がデンプン可溶性シンターゼ酵素IIをコードする、請求項18の宿主。 22．前記遺伝子がデンプン可溶性シンターゼ酵素IIIをコードする、請求項18 の宿主。 23．デンプン分枝酵素をコードする遺伝子を少なくとも１つ発現するよう形質転換されたことを含む、請求項18の宿主。 24．デンプン分枝酵素がBEIである、請求項23の宿主。 25．デンプン分枝酵素がBEIIである、請求項23の宿主。 26．プラスミドがキャリアー宿主中にあり、そして前記プラスミドがN末端GEN VMNVVであるSSII遺伝子を含み、該遺伝子が長さおよそ1561塩基対である、前記プラスミド。 27．前記宿主が細菌宿主である、請求項１のプラスミド。 28．宿主が野生型大腸菌である、請求項２の方法。 29．形質転換された宿主により産生される新規多糖であって：前記宿主が野生型を有し、前記宿主の前記野生型が前記の新規多糖を産生せず、前記の形質転換された宿主が少なくとも２つの外因性デンプン合成遺伝子を発現し、前記遺伝子がSSI、SSII、SSIIIのような可溶性デンプン合成遺伝子からなる群より選択され、形質転換された宿主がこうした新規多糖を産生することが可能であることを含む、前記新規多糖。 30．前記宿主がまた、以下の群、細菌グリコーゲン誘導遺伝子からなる群より選択される外因性遺伝子も発現する、請求項29の新規多糖。 31．前記宿主がまた、以下の群、植物顆粒結合酵素からなる群より選択される外因性遺伝子も発現する、請求項29の新規多糖。 32．宿主が真菌である、請求項１の方法。 33．宿主が酵母である、請求項32の方法。 34．前記グリコーゲン合成遺伝子がglgC、glgA、glgB遺伝子を含む、請求項１の方法。 35．デンプン合成酵素を産生する前記遺伝子が、デンプン可溶性シンターゼI 、II、IIIをコードする遺伝子を含む、請求項１の方法。 36．デンプン合成酵素を産生する前記遺伝子が、脱分枝酵素および分枝酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１の方法。 37．前記細菌グリコーゲン誘導遺伝子が、glgC、glgA、glgBからなる群より選択される、請求項30の新規多糖。 38．前記デンプン合成遺伝子が、BEIおよびBEIIからなる群より選択される、請求項29の新規多糖。