JP2001515205A - 作用物質を確認する方法および装置 - Google Patents
作用物質を確認する方法および装置Info
- Publication number
- JP2001515205A JP2001515205A JP2000508971A JP2000508971A JP2001515205A JP 2001515205 A JP2001515205 A JP 2001515205A JP 2000508971 A JP2000508971 A JP 2000508971A JP 2000508971 A JP2000508971 A JP 2000508971A JP 2001515205 A JP2001515205 A JP 2001515205A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reactants
- spectrum
- reactant
- time point
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims abstract description 48
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 9
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 4
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 4
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- -1 glutamate receptors Chemical compound 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000001845 vibrational spectrum Methods 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777301 Homo sapiens Uteroglobin Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031083 Uteroglobin Human genes 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 150000002527 isonitriles Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000005323 thioketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
- G01N21/3577—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light for analysing liquids, e.g. polluted water
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
- G01N1/14—Suction devices, e.g. pumps; Ejector devices
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N35/1095—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers
- G01N35/1097—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers characterised by the valves
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明の課題は、反応物間の複合体形成の証明を可能にする作用物質を確認する方法および装置を開発することである。この課題は、複合体に反応する少なくとも２つの反応物を互いに混合し、混合物中にまだ反応しない個々の反応物のＩＲスペクトルを第一の時点で測定し、第二の時点で少なくとも１つの他のＩＲ測定により反応物の複合体を測定し、異なる時点で測定した２つのスペクトルの差を形成し、差スペクトルがバンド構造を有する反応物を作用物質として選択する方法により解決される。さらに、２つのポンプにより２つの試料ループ弁が試薬および有機化合物で充填され、試料ループ弁は密閉空間に接続され、第三のポンプで密閉空間中で混合物が製造され、ＩＲキュベット中へ供給される装置を提案する。
Description
【０００１】 本発明は、請求項１記載の作用物質の確認方法および請求項９記載の該方法を
実施する装置に関する。
実施する装置に関する。
【０００２】 スワミー（Ｍ．Ｊ．Ｓｗａｍｙ）、ハイムブルグ（Ｔ．Ｈｅｉｍｂｕｒｇ）お
よびマーシュ（Ｄ．Ｍａｒｓｈ）は、“Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｕｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ａ
ｖｉｄｉｎ Ｓｅｃｏｕｎｄａｒｙ ｓｕｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐ
ｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｐｉ
ｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ”（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｕｒｎａｌ ７１巻
（１９９６年）８４０〜８４７ページ）中に、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩ
Ｒ）によるタンパク質アビジンとビオチンおよびビオチン−脂質の複合体の構造
を解明する研究を記載する。このために、まず重水（Ｄ2Ｏ）中でアビジンのＦ ＴＩＲスペクトルを撮影した。引き続き、アビジンとビオチンまたはビオチン−
脂質を溶媒としてのＤ2Ｏ緩衝液と混合し、室温で数時間保存し、これにより明 らかに生じるアビジン複合体のできるだけ高い収率が得られるとされる。複合体
から再度ＦＴＩＲスペクトルを撮影した。アビジンのスペクトルおよびアビジン
複合体のスペクトルから、差スペクトル（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｚｓｐｅｋｔｒｅｎ
）を形成した。この論文はアビジン複合体の構造とだけ関係するので、時間従属
スペクトルは撮影されない。記載されたＦＴＩＲスペクトルはすべての場合に平
衡状態を反映する。結合した通常水素の振動スペクトルは撮影されないで、−よ
り高い質量のためずれて−結合した重水素の振動スペクトルが撮影される。その
結果、比較的厚いキュベット（５０μｍ）を使用することができる。化合物、た
とえばタンパク質が配位位置で特定の配位子と複合体を形成できるか否かの問題
は、アビジンがビオチンと複合体を形成する事実は既に公知であったので、この
論文においては重要ではない。
よびマーシュ（Ｄ．Ｍａｒｓｈ）は、“Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｕｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ａ
ｖｉｄｉｎ Ｓｅｃｏｕｎｄａｒｙ ｓｕｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐ
ｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｐｉ
ｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ”（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｕｒｎａｌ ７１巻
（１９９６年）８４０〜８４７ページ）中に、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩ
Ｒ）によるタンパク質アビジンとビオチンおよびビオチン−脂質の複合体の構造
を解明する研究を記載する。このために、まず重水（Ｄ2Ｏ）中でアビジンのＦ ＴＩＲスペクトルを撮影した。引き続き、アビジンとビオチンまたはビオチン−
脂質を溶媒としてのＤ2Ｏ緩衝液と混合し、室温で数時間保存し、これにより明 らかに生じるアビジン複合体のできるだけ高い収率が得られるとされる。複合体
から再度ＦＴＩＲスペクトルを撮影した。アビジンのスペクトルおよびアビジン
複合体のスペクトルから、差スペクトル（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｚｓｐｅｋｔｒｅｎ
）を形成した。この論文はアビジン複合体の構造とだけ関係するので、時間従属
スペクトルは撮影されない。記載されたＦＴＩＲスペクトルはすべての場合に平
衡状態を反映する。結合した通常水素の振動スペクトルは撮影されないで、−よ
り高い質量のためずれて−結合した重水素の振動スペクトルが撮影される。その
結果、比較的厚いキュベット（５０μｍ）を使用することができる。化合物、た
とえばタンパク質が配位位置で特定の配位子と複合体を形成できるか否かの問題
は、アビジンがビオチンと複合体を形成する事実は既に公知であったので、この
論文においては重要ではない。
【０００３】 さらに、タンパク質複合体の構造特定のためのＦＴＩＲ研究は、ゴンザレス（
Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ）等：“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ
ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ”（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｐｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２巻、１７号（１９９７年）１１
２８８〜１１２９４ページ）に記載される。スペクトルは、Ｈ2Ｏ緩衝液ならび にＤ2Ｏ緩衝液を用いて撮影され、その際層厚さはＨ2Ｏの場合には６μｍであり
、Ｄ2Ｏの場合には５０μｍであった。論文の目的は、ビオチンおよびビオチン −ストレプトアビジン複合体の熱安定性の決定である。熱変性は、時間的に連続
するスペクトルに描写される。これに反し、複合体の形成は分光学的には追跡さ
れない。
Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ）等：“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ
ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ”（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｐｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２巻、１７号（１９９７年）１１
２８８〜１１２９４ページ）に記載される。スペクトルは、Ｈ2Ｏ緩衝液ならび にＤ2Ｏ緩衝液を用いて撮影され、その際層厚さはＨ2Ｏの場合には６μｍであり
、Ｄ2Ｏの場合には５０μｍであった。論文の目的は、ビオチンおよびビオチン −ストレプトアビジン複合体の熱安定性の決定である。熱変性は、時間的に連続
するスペクトルに描写される。これに反し、複合体の形成は分光学的には追跡さ
れない。
【０００４】 モス（Ｄ．Ｍｏｓｓ）、ナベドリーク（Ｅ．Ｎａｂｅｄｒｙｋ）、ブレトン（
Ｊ．Ｂｒｅｔｏｎ）およびメンテレ（Ｗ．Ｍａｅｎｔｅｌｅ）：“Ｒｅｄｏｘ−
ｌｉｎｋｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉ
ｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｔｏｔｅｉｎ ｅｌｅ
ｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ”（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１８７、５６５〜５７２ページ（１９９０年））中に、タンパク質の電気
化学的還元および引き続く再酸化によるシトクロムｃが報告される。シトクロム
ｃは、中央の赤外領域における水のＩＲ吸収を排除するために、１０〜１５μｍ
の層厚さで装入される。還元および引き続く再酸化は、ＦＴＩＲ分光学を用いて
確認された。還元され、再酸化された状態の差スペクトルが描写されている。キ
ュベットはシトクロムｃのみを含有していたので、タンパク質複合体の形成に関
しては何の言明もすることができなかった。
Ｊ．Ｂｒｅｔｏｎ）およびメンテレ（Ｗ．Ｍａｅｎｔｅｌｅ）：“Ｒｅｄｏｘ−
ｌｉｎｋｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉ
ｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｐｔｏｔｅｉｎ ｅｌｅ
ｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ”（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１８７、５６５〜５７２ページ（１９９０年））中に、タンパク質の電気
化学的還元および引き続く再酸化によるシトクロムｃが報告される。シトクロム
ｃは、中央の赤外領域における水のＩＲ吸収を排除するために、１０〜１５μｍ
の層厚さで装入される。還元および引き続く再酸化は、ＦＴＩＲ分光学を用いて
確認された。還元され、再酸化された状態の差スペクトルが描写されている。キ
ュベットはシトクロムｃのみを含有していたので、タンパク質複合体の形成に関
しては何の言明もすることができなかった。
【０００５】 ホワイト（Ａ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ）、ドラブル（Ｋ．Ｄｒａｂｂｌｅ）およびワ
ルトン（Ｃ．Ｗ．Ｗｈａｒｔｏｎ）の論文：“Ａ ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ
ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ
ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９
５年）３０６巻、８４３〜８４９ページ）は、試薬を注射器でキュベット中へ注
入して混合するいわゆる“ストップドフロー（ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ）”法
の実施装置を記載する。ＨＰＬＣ弁は、著者の言によれば必要な高い圧力および
ペプチドの高い粘度のため実証されなかった。この装置を用いて ＦＴＩＲスペ クトルを、１２Ｃ＝Ｏ−シンナモイル−キモトリプシンおよび１３Ｃ＝Ｏ−シン
ナモイル−キモトリプシンを脱アシル化剤と混合した後６．２５秒〜９６６秒の
時間的範囲内でＤ2Ｏ緩衝液中で撮影した、その際光学的層厚さは５０μｍであ る。１２Ｃ＝Ｏ−シンモイル−キモトリプシンおよび１３Ｃ＝Ｏ−シンナモイル
−キモトリプシンのスペクトルから、差スペクトルが形成される。“結論”にお
いて、（非重水素化）水の使用を許容する“ストップドフロー”ＩＲ透過キュベ
ットの構成は、１６４０ｃｍー 1における水の強い吸収が５μｍの層厚さを要求す
る（論文中では誤って５ｍｍが記載される）ので不可能である。
ルトン（Ｃ．Ｗ．Ｗｈａｒｔｏｎ）の論文：“Ａ ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ
ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ
ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９
５年）３０６巻、８４３〜８４９ページ）は、試薬を注射器でキュベット中へ注
入して混合するいわゆる“ストップドフロー（ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ）”法
の実施装置を記載する。ＨＰＬＣ弁は、著者の言によれば必要な高い圧力および
ペプチドの高い粘度のため実証されなかった。この装置を用いて ＦＴＩＲスペ クトルを、１２Ｃ＝Ｏ−シンナモイル−キモトリプシンおよび１３Ｃ＝Ｏ−シン
ナモイル−キモトリプシンを脱アシル化剤と混合した後６．２５秒〜９６６秒の
時間的範囲内でＤ2Ｏ緩衝液中で撮影した、その際光学的層厚さは５０μｍであ る。１２Ｃ＝Ｏ−シンモイル−キモトリプシンおよび１３Ｃ＝Ｏ−シンナモイル
−キモトリプシンのスペクトルから、差スペクトルが形成される。“結論”にお
いて、（非重水素化）水の使用を許容する“ストップドフロー”ＩＲ透過キュベ
ットの構成は、１６４０ｃｍー 1における水の強い吸収が５μｍの層厚さを要求す
る（論文中では誤って５ｍｍが記載される）ので不可能である。
【０００６】 “ストップド−フロー”法の詳細な記載は、ギブソン（Ｑ．Ｈ．Ｇｉｂｓｏｎ
）およびミルネス（Ｌ．Ｍｉｌｎｅｓ）：“Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｒａ
ｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ”
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９６４年）９１巻、１６１〜１７１ページ）におい
て存在する。
）およびミルネス（Ｌ．Ｍｉｌｎｅｓ）：“Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｒａ
ｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ”
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９６４年）９１巻、１６１〜１７１ページ）におい
て存在する。
【０００７】 “ストップドフロー”の一般的な欠点は、注入を使用するため装置の高い死体
積に認められる。殊に、各４００μｌの凹み９６個を有する微量滴定板は自動化
方法の標準パターンであるために、このような装置は実施することができない；
これについてはブローチ（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ）およびトルナー（Ｊ．Ｔｈｏ
ｒｎｅｒ）：マススクリーニング法に関する概観を伝える“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏ
ｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”
（Ｎａｔｕｒ ３８４巻増補版（１９９６年１１月７日））参照。ブローチおよ
びトルナーは、ペプチドのレセプターにおける配位子の結合力の確認に関する方
法を引用し、その際Ｅｕ2+は配位子におよびアロフィコシアニンはレセプターに
共有結合する。レセプター−配位子複合体の形成により、Ｅｕ2+はアロフィコシ
アニンに非常に接近し、これにより蛍光信号として検出できるエネルギー移動が
生じる。
積に認められる。殊に、各４００μｌの凹み９６個を有する微量滴定板は自動化
方法の標準パターンであるために、このような装置は実施することができない；
これについてはブローチ（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ）およびトルナー（Ｊ．Ｔｈｏ
ｒｎｅｒ）：マススクリーニング法に関する概観を伝える“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏ
ｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”
（Ｎａｔｕｒ ３８４巻増補版（１９９６年１１月７日））参照。ブローチおよ
びトルナーは、ペプチドのレセプターにおける配位子の結合力の確認に関する方
法を引用し、その際Ｅｕ2+は配位子におよびアロフィコシアニンはレセプターに
共有結合する。レセプター−配位子複合体の形成により、Ｅｕ2+はアロフィコシ
アニンに非常に接近し、これにより蛍光信号として検出できるエネルギー移動が
生じる。
【０００８】 本発明の課題は、反応物間に複合体が形成する証明をできるだけ小さい体積で
、廉価にフレキシブルおよび迅速に、再現可能な結果を有して可能にする、作用
物質の確認方法を開発することである。さらに、この方法は自動化に適している
べきである。さらに、該方法を実施する装置を提案すべきである。
、廉価にフレキシブルおよび迅速に、再現可能な結果を有して可能にする、作用
物質の確認方法を開発することである。さらに、この方法は自動化に適している
べきである。さらに、該方法を実施する装置を提案すべきである。
【０００９】 この課題は、請求項１に記載された方法および請求項９に記載された装置によ
って解決される。従属請求項には、方法の好ましい構成が記載される。
って解決される。従属請求項には、方法の好ましい構成が記載される。
【００１０】 本発明により作用物質は、反応物、たとえば配位子の、少なくとも１つの他の
反応物、たとえばタンパク質における結合力を調べることにより確認される。反
応物から混合物を製造し、少なくとも２つの異なる時点で混合物のＩＲスペクト
ルまたはＦＴＩＲスペクトルを撮影する。配位子の測定は水溶液中で行われ、そ
の際慣例の重水素化溶液、たとえば重水素化水または重水素化緩衝液の使用は必
ずしも必要でない。反応物の粘度および物理化学的性質に応じ、場合により他の
または別の溶媒の使用が指示され；重水素化緩衝液または重水素化溶媒の使用は
断念することができる。
反応物、たとえばタンパク質における結合力を調べることにより確認される。反
応物から混合物を製造し、少なくとも２つの異なる時点で混合物のＩＲスペクト
ルまたはＦＴＩＲスペクトルを撮影する。配位子の測定は水溶液中で行われ、そ
の際慣例の重水素化溶液、たとえば重水素化水または重水素化緩衝液の使用は必
ずしも必要でない。反応物の粘度および物理化学的性質に応じ、場合により他の
または別の溶媒の使用が指示され；重水素化緩衝液または重水素化溶媒の使用は
断念することができる。
【００１１】 混合物は、引用された技術水準に応じて製造することができる。しかし、高圧
ポンプ（約４００ｂａｒまで）およびＨＰＬＣ技術から公知の試料ループ弁の使
用が好まれる。
ポンプ（約４００ｂａｒまで）およびＨＰＬＣ技術から公知の試料ループ弁の使
用が好まれる。
【００１２】 混合物は、好ましくは１〜２５μｍ、とくに好ましくは８〜１５μｍの層厚さ
で装入すべきである。有利には、混合物は相応する光学的厚さを有するＩＲキュ
ベットへの途中でおよび／またはキュベット中で製造される。
で装入すべきである。有利には、混合物は相応する光学的厚さを有するＩＲキュ
ベットへの途中でおよび／またはキュベット中で製造される。
【００１３】 通例、有機化合物および試薬から完全な混合物を製造すべく努力される。有機
化合物の反応はたいてい緩慢に進行するので、最適な混合物を製造するためおよ
び第一のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルの撮影に必要な時間は一般に
十分に短い。しかし反応物間の反応速度が高い場合には、この時点まで既に主要
な反応転化率が生じるのを阻止するため、第一のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲ
スペクトルは不完全な混合物で撮影することを推奨することができる。
化合物の反応はたいてい緩慢に進行するので、最適な混合物を製造するためおよ
び第一のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルの撮影に必要な時間は一般に
十分に短い。しかし反応物間の反応速度が高い場合には、この時点まで既に主要
な反応転化率が生じるのを阻止するため、第一のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲ
スペクトルは不完全な混合物で撮影することを推奨することができる。
【００１４】 第一のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルの撮影の場合、反応物は少な
くとも部分的になお未反応の形で存在しなければならず、それで複合体の形成は
第二のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルによるかまたは別のＩＲスペク
トルまたはＦＴＩＲスペクトルによって把握することができる。理想的には、反
応物の反応は混合後まだ開始してはならない。これは、非常に迅速な反応におい
ては、ＩＲキュベットの前および／またはキュベットへの途中で混合することに
よっては不可能であり、それで反応物の一部は既に互いに反応している。本発明
による方法では、反応物の部分的反応は、反応物がなお十分に互いに反応するこ
とができおよび測定信号を得ることができる限り妨害されない。第一のＩＲスペ
クトルまたはＦＴＩＲスペクトルの撮影の際に反応物の僅少分量が未反応の形で
存在する場合、もはや十分な相違を有しないスペクトルしか撮影することができ
ない。このような場合には、差スペクトルは零位線を示す。
くとも部分的になお未反応の形で存在しなければならず、それで複合体の形成は
第二のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルによるかまたは別のＩＲスペク
トルまたはＦＴＩＲスペクトルによって把握することができる。理想的には、反
応物の反応は混合後まだ開始してはならない。これは、非常に迅速な反応におい
ては、ＩＲキュベットの前および／またはキュベットへの途中で混合することに
よっては不可能であり、それで反応物の一部は既に互いに反応している。本発明
による方法では、反応物の部分的反応は、反応物がなお十分に互いに反応するこ
とができおよび測定信号を得ることができる限り妨害されない。第一のＩＲスペ
クトルまたはＦＴＩＲスペクトルの撮影の際に反応物の僅少分量が未反応の形で
存在する場合、もはや十分な相違を有しないスペクトルしか撮影することができ
ない。このような場合には、差スペクトルは零位線を示す。
【００１５】 好ましくは、混合物の製造後即座に第一のＦＴＩＲスペクトルが撮影される（
時点ｔ0）。“即座に”は、スペクトルが技術的に可能である限り迅速に撮影さ れることを意味する。反応速度は反応物を互いに接触させる直後に最高であるの
で、第一のスペクトルの撮影の際に反応速度がなお十分に高く、引き続き初めて
反応物の主要部が反応することが、方法の迅速性および正確性にとり極めて重要
である。とくに緩慢な反応の場合には、反応物の反応速度が引き続きなお、測定
技術的に把握するのに十分に大きい限り、第一のスペクトルの撮影までに暫く待
つことができる。しかし有利には、第一のスペクトルは反応物の混合後１〜１０
００ミリ秒内に撮影される。
時点ｔ0）。“即座に”は、スペクトルが技術的に可能である限り迅速に撮影さ れることを意味する。反応速度は反応物を互いに接触させる直後に最高であるの
で、第一のスペクトルの撮影の際に反応速度がなお十分に高く、引き続き初めて
反応物の主要部が反応することが、方法の迅速性および正確性にとり極めて重要
である。とくに緩慢な反応の場合には、反応物の反応速度が引き続きなお、測定
技術的に把握するのに十分に大きい限り、第一のスペクトルの撮影までに暫く待
つことができる。しかし有利には、第一のスペクトルは反応物の混合後１〜１０
００ミリ秒内に撮影される。
【００１６】 本発明による方法においては、作用物質の確認のため任意の時点で撮影した２
つのスペクトルから差スペクトルを形成することができる。とくに、差スペクト
ルは反応物を混合した直後に撮影したスペクトル（測定時点ｔ0）で形成される 。第二のスペクトルとして好ましくは、このスペクトルに対し大きい時間的間隔
を有するスペクトルが選択される。２よりも多い反応物を測定に使用する場合、
反応はとくに、調べるべき複合体形成を生じる反応物の添加により開始される。
つのスペクトルから差スペクトルを形成することができる。とくに、差スペクト
ルは反応物を混合した直後に撮影したスペクトル（測定時点ｔ0）で形成される 。第二のスペクトルとして好ましくは、このスペクトルに対し大きい時間的間隔
を有するスペクトルが選択される。２よりも多い反応物を測定に使用する場合、
反応はとくに、調べるべき複合体形成を生じる反応物の添加により開始される。
【００１７】 反応物としては、その薬剤作用または植物保護作用が推測されおよび詳細に調
べるべき物質が使用される。反応物はたとえば、複合体を形成することのできる
潜在医薬、潜在除草剤、駆カビ剤、または殺虫剤であってもよい。
べるべき物質が使用される。反応物はたとえば、複合体を形成することのできる
潜在医薬、潜在除草剤、駆カビ剤、または殺虫剤であってもよい。
【００１８】 とくに、本発明による方法における作用物質は、たとえばホルモン、ビタミン
、酵素、薬物または有害生物駆除剤のような植物体、動物体または人体において
生理作用を発揮する物質と理解される。作用物質としては、タンパク質、たとえ
ばＥＣＥまたはＡＣＥのような酵素、グルタミン酸レセプターのようなレセプタ
ー、抗体、ＰＡＩのようなタンパク質阻害剤、メジエーター、たとえばγ−イン
ターフェロンのようなインターフェロン、インターロイキン−２またはインター
ロイキン−６のようなインターロイキン、Ｓｐ１のような転写因子、調節タンパ
ク質、トランスロケーターまたはチャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）が模範的に
挙げられる。
、酵素、薬物または有害生物駆除剤のような植物体、動物体または人体において
生理作用を発揮する物質と理解される。作用物質としては、タンパク質、たとえ
ばＥＣＥまたはＡＣＥのような酵素、グルタミン酸レセプターのようなレセプタ
ー、抗体、ＰＡＩのようなタンパク質阻害剤、メジエーター、たとえばγ−イン
ターフェロンのようなインターフェロン、インターロイキン−２またはインター
ロイキン−６のようなインターロイキン、Ｓｐ１のような転写因子、調節タンパ
ク質、トランスロケーターまたはチャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）が模範的に
挙げられる。
【００１９】 ここで、１００〜１００００ドルトン（＝ｄ）の好ましい分子量範囲内、とく
に好ましくは１００〜１０００ｄの範囲内に平均分子量を有する低分子量物質も
挙げられる。低分子量物質は、たとえば場合により置換された脂肪族または芳香
族の複素環化合物、芳香族化合物、飽和または不飽和の脂肪族化合物、アミン、
ケトン、チオケトン、アルコール、チオール、エステル、アミド、エーテル、チ
オエーテル、ニトリル、イソニトリル、アルデヒドまたはそれらの誘導体を包含
する有機化合物と理解される。
に好ましくは１００〜１０００ｄの範囲内に平均分子量を有する低分子量物質も
挙げられる。低分子量物質は、たとえば場合により置換された脂肪族または芳香
族の複素環化合物、芳香族化合物、飽和または不飽和の脂肪族化合物、アミン、
ケトン、チオケトン、アルコール、チオール、エステル、アミド、エーテル、チ
オエーテル、ニトリル、イソニトリル、アルデヒドまたはそれらの誘導体を包含
する有機化合物と理解される。
【００２０】 配位子を遊離し、これが反応物として結局反応物または別の反応物と複合体を
形成する作用物質も、本発明による方法で把握することができる。
形成する作用物質も、本発明による方法で把握することができる。
【００２１】 本発明による方法においては、タンパク質間の複合体形成の確認はあまり好ま
しくない、それというのもタンパク質はたとえば作用物質として経口的に投与す
ることができず、屡々アレルギー反応を生じるからである。好ましくは、本発明
による方法ではタンパク質、ＤＮＳまたはＲＮＳおよび低分子量物質間の複合体
形成が調べられる。反応物の少なくとも１つは、本発明による方法ではタンパク
質またはＤＮＳであってもよく；少なくとも１つの別の反応物は低分子量物質で
あるべきである。長鎖および短鎖のＤＮＳまたはＲＮＳ間の相互作用も把握する
ことができる。
しくない、それというのもタンパク質はたとえば作用物質として経口的に投与す
ることができず、屡々アレルギー反応を生じるからである。好ましくは、本発明
による方法ではタンパク質、ＤＮＳまたはＲＮＳおよび低分子量物質間の複合体
形成が調べられる。反応物の少なくとも１つは、本発明による方法ではタンパク
質またはＤＮＳであってもよく；少なくとも１つの別の反応物は低分子量物質で
あるべきである。長鎖および短鎖のＤＮＳまたはＲＮＳ間の相互作用も把握する
ことができる。
【００２２】 就中タンパク質の複合体形成およびタンパク質との複合体形成の場合、多数の
他の有機化合物の場合でも、とくに２５００および１２５００ｎｍの間の平均的
ＩＲ領域が使用される。
他の有機化合物の場合でも、とくに２５００および１２５００ｎｍの間の平均的
ＩＲ領域が使用される。
【００２３】 待ち時間後、引き続き第二のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルが撮影
される（時点ｔn）。待ち時間（＝ｘ）は、反応成分の反応速度により調節され る。待ち時間は、１ミリ秒および１日の間、好ましくは１０ミリ秒および１２０
分の間、より好ましくは１０ミリ秒および１０分の間である。反応物がタンパク
質である場合、５〜３０秒の範囲内、たとえば２０秒の待ち時間が好適である。
たとえばアビジン／ビオチン複合体を調べるためには、たとえば１０〜１００ｍ
秒の範囲内の著しく短い待ち時間が必要である。多くの抗体の反応およびＤＮＳ
のハイブリッド形成においては、分の範囲内の待ち時間を適用すべきである。
される（時点ｔn）。待ち時間（＝ｘ）は、反応成分の反応速度により調節され る。待ち時間は、１ミリ秒および１日の間、好ましくは１０ミリ秒および１２０
分の間、より好ましくは１０ミリ秒および１０分の間である。反応物がタンパク
質である場合、５〜３０秒の範囲内、たとえば２０秒の待ち時間が好適である。
たとえばアビジン／ビオチン複合体を調べるためには、たとえば１０〜１００ｍ
秒の範囲内の著しく短い待ち時間が必要である。多くの抗体の反応およびＤＮＳ
のハイブリッド形成においては、分の範囲内の待ち時間を適用すべきである。
【００２４】 第二のＩＲスペクトルまたはＦＴＩＲスペクトルには、この時点までに行われ
た反応転化率が記録される。この反応転化率は、たとえばｔ0における第一のス ペクトルおよびｔnにおける第二のスペクトルから差スペクトルを形成すること により描写できる。差スペクトルは、△Ａν＝10ｌｏｇ（Ｉ1 ν／Ｉ2 ν）によっ
て生じる、ここでＩ1 νおよびＩ2 νは第一のスペクトルないしは第二のスペクト
ルにおける周波数νにおいて測定された強さである。
た反応転化率が記録される。この反応転化率は、たとえばｔ0における第一のス ペクトルおよびｔnにおける第二のスペクトルから差スペクトルを形成すること により描写できる。差スペクトルは、△Ａν＝10ｌｏｇ（Ｉ1 ν／Ｉ2 ν）によっ
て生じる、ここでＩ1 νおよびＩ2 νは第一のスペクトルないしは第二のスペクト
ルにおける周波数νにおいて測定された強さである。
【００２５】 差スペクトルが大体において直線からなる場合、この場合には反応成分の濃度 が変化しないので、反応は起きなかった。従って、反応物の結合はバンド構造を
有する差スペクトルに現れる。
有する差スペクトルに現れる。
【００２６】 本発明による方法における複合体は、すべての共有結合または非共有結合反応
物またはその部分と理解される。ここで非共有結合としては、たとえばファンデ
ルワールス力、水素橋形成またはイオン結合による結合が挙げられる。本発明に
より、非共有結合反応物またはその部分が好まれる。
物またはその部分と理解される。ここで非共有結合としては、たとえばファンデ
ルワールス力、水素橋形成またはイオン結合による結合が挙げられる。本発明に
より、非共有結合反応物またはその部分が好まれる。
【００２７】 本発明方法の重要な利点は、方法の経過を自動化することができ、それで反応
物複合体の形成は迅速に順次にまたは平行に行うことができることである。いわ
ゆるマススクリーニング法は、殊に新しい医薬を開発する場合に重要である。こ
のために、たとえば疾患の病徴と結合しているタンパク質が確認される。ところ
でこの課題は、いわゆる標的タンパク質を抑制する適当な薬物を見出すことであ
る。標的タンパク質は、相応する生物学的材料から大量にかつ高い純度で製出す
ることができる。その薬学的有効性が推測される多数の試薬は、それが求める抑
制作用を有するか否かがテストされる。テストすべき試薬の数は一般に非常に大
きく；５桁、６桁またはむしろ７桁であってもよいので、迅速な自動的スクリー
ニング法の使用が決定的に経済的に重要である。
物複合体の形成は迅速に順次にまたは平行に行うことができることである。いわ
ゆるマススクリーニング法は、殊に新しい医薬を開発する場合に重要である。こ
のために、たとえば疾患の病徴と結合しているタンパク質が確認される。ところ
でこの課題は、いわゆる標的タンパク質を抑制する適当な薬物を見出すことであ
る。標的タンパク質は、相応する生物学的材料から大量にかつ高い純度で製出す
ることができる。その薬学的有効性が推測される多数の試薬は、それが求める抑
制作用を有するか否かがテストされる。テストすべき試薬の数は一般に非常に大
きく；５桁、６桁またはむしろ７桁であってもよいので、迅速な自動的スクリー
ニング法の使用が決定的に経済的に重要である。
【００２８】 本発明による方法は、この課題を引き受けることができる。最近のＦＴＩＲ分
光計の高い走査速度および本発明による方法に必要な僅かな需要時間のため、多
数の試薬をテストするための前提条件が創造されている。方法のもう１つの重要
な利点は、普通に使用される標準微量滴定板（Ｓｔａｎｄａｒｄ−Ｍｉｋｒｏｔ
ｉｔｅｒｐｌａｔｔｅｎ）を問題なく使用することができることである。傾向は
再び約３８４個またはむしろ８６４個の、再び約１００μｌないしは約５０μｌ
の僅かな体積を有する細孔を備えるより小さい微量滴定板に向っているので、本
発明による方法および本発明による装置の場合、必要な試料の僅かな量がとくに
重要である。他の重要な利点および方法マススクリーニング法の適性の基礎は、
重水素化水を使用する必要がないことおよび装置は構造的変更なしに多数の調査
に使用することができることである。
光計の高い走査速度および本発明による方法に必要な僅かな需要時間のため、多
数の試薬をテストするための前提条件が創造されている。方法のもう１つの重要
な利点は、普通に使用される標準微量滴定板（Ｓｔａｎｄａｒｄ−Ｍｉｋｒｏｔ
ｉｔｅｒｐｌａｔｔｅｎ）を問題なく使用することができることである。傾向は
再び約３８４個またはむしろ８６４個の、再び約１００μｌないしは約５０μｌ
の僅かな体積を有する細孔を備えるより小さい微量滴定板に向っているので、本
発明による方法および本発明による装置の場合、必要な試料の僅かな量がとくに
重要である。他の重要な利点および方法マススクリーニング法の適性の基礎は、
重水素化水を使用する必要がないことおよび装置は構造的変更なしに多数の調査
に使用することができることである。
【００２９】 次に、本発明による方法を実施する装置を図につき記載する。
【００３０】 図１は、装置を弁３および４が試験物質ないしは標的タンパク質で充填される
第一の運転状態で示す。試験物質は、標準微量滴定板１１中でｘｙｚ位置決めテ
ーブル上に装入され、標的タンパク質は貯蔵容器９中に装入される。弁３および
４は、ＨＰＬＣ技術から公知の回転弁（Ｖａｌｃｏ社）であり；該弁は図示位置
においては、両方の低圧ポンプ６および７を用い標準微量滴定板１１からの試験
物質ないしは貯蔵容器９からの標的タンパク質を充填することができるように接
続されている。不時の過剰量は、双方の場合に排水システム（図示せず）中へ導
入される。
第一の運転状態で示す。試験物質は、標準微量滴定板１１中でｘｙｚ位置決めテ
ーブル上に装入され、標的タンパク質は貯蔵容器９中に装入される。弁３および
４は、ＨＰＬＣ技術から公知の回転弁（Ｖａｌｃｏ社）であり；該弁は図示位置
においては、両方の低圧ポンプ６および７を用い標準微量滴定板１１からの試験
物質ないしは貯蔵容器９からの標的タンパク質を充填することができるように接
続されている。不時の過剰量は、双方の場合に排水システム（図示せず）中へ導
入される。
【００３１】 図２に図示した運転状態においては、弁３および４は切り替えられている。試
験物質および標的タンパク質は、蒸留水貯蔵容器１０に接続されている高圧ポン
プ８を用いて混合され、ＦＴＩＲ分光計１中のＩＲキュベット２中へ運搬される
。
験物質および標的タンパク質は、蒸留水貯蔵容器１０に接続されている高圧ポン
プ８を用いて混合され、ＦＴＩＲ分光計１中のＩＲキュベット２中へ運搬される
。
【００３２】 図３には、第一のＦＴＩＲスペクトル（ｔ0）および待ち時間後に第二のＦＴ ＩＲスペクトル（ｔn）が撮影される運転状態が図示されている。この場合、弁 ５が切り替えられていて、それで試験物質および標的タンパク質は密閉された導
管装置中に単離されている。
管装置中に単離されている。
【００３３】 スペクトルの撮影後、測定セルはサイクルが新たに連続するに先立ち蒸留水で
洗浄される。
洗浄される。
【００３４】 装置は、大体においてＨＰＬＣ部材から構成されている。高圧ポンプ８は、連
続高圧運転に耐えられるＨＰＬＣポンプ（Ａｌｌｔｅｃｈ社）である。すべての
液体導管および接続管は、４００ｂａｒまで負荷可能なＨＰＬＣ部材から構成さ
れている。ＨＰＬＣポンプを保護するために、たんに蒸留水がポンプで圧送され
る。ＨＰＬＣ回転弁３、４および５の選択された配置は、マススクリーニングに
重要な、装置の能率的掃除ならびに減少した試料消費量の付加的利点をもたらす
。回転弁５を用い、貯蔵容器１０から高圧ポンプ８を通過する蒸留水の流れを止
める代わりに迂回させて、ＩＲキュベットを通過する流れを止める。これにより
、ポンプは保護され、迅速な応答時間が生じる。さらに、これによりＩＲキュベ
ットの入口管および出口管が短絡され、このため過圧は迅速に補償され、層厚さ
の変化はＩＲキュベットのアーチ形のため除去される。
続高圧運転に耐えられるＨＰＬＣポンプ（Ａｌｌｔｅｃｈ社）である。すべての
液体導管および接続管は、４００ｂａｒまで負荷可能なＨＰＬＣ部材から構成さ
れている。ＨＰＬＣポンプを保護するために、たんに蒸留水がポンプで圧送され
る。ＨＰＬＣ回転弁３、４および５の選択された配置は、マススクリーニングに
重要な、装置の能率的掃除ならびに減少した試料消費量の付加的利点をもたらす
。回転弁５を用い、貯蔵容器１０から高圧ポンプ８を通過する蒸留水の流れを止
める代わりに迂回させて、ＩＲキュベットを通過する流れを止める。これにより
、ポンプは保護され、迅速な応答時間が生じる。さらに、これによりＩＲキュベ
ットの入口管および出口管が短絡され、このため過圧は迅速に補償され、層厚さ
の変化はＩＲキュベットのアーチ形のため除去される。
【００３５】 図示された装置を用い、４０ｍｌ／ｍｉｎまでの流出速度を実現することがで
き、これはＩＲキュベット内容物の１５分内の交換に相当する。その際、約１５
０ｂａｒまでの圧力が記録される。弁５を用いて液体流れを迂回させるのは、２
０ミリ秒で行われる。ＦＴＩＲスペクトルの撮影には、標的タンパク質および試
験物質各１００μｌで十分であり、その際最適化により試料必要量を３分の１か
ら５分の１だけ減らすことができる。
き、これはＩＲキュベット内容物の１５分内の交換に相当する。その際、約１５
０ｂａｒまでの圧力が記録される。弁５を用いて液体流れを迂回させるのは、２
０ミリ秒で行われる。ＦＴＩＲスペクトルの撮影には、標的タンパク質および試
験物質各１００μｌで十分であり、その際最適化により試料必要量を３分の１か
ら５分の１だけ減らすことができる。
【図１】 第一の運転状態における装置の実施形を示す系統図である。
【図２】 第二の運転状態における装置の実施形を示す系統図である。
【図３】 第三の運転状態における装置の実施形を示す系統図である。
１ ＦＴＩＲ分光計 ２ ＩＲキュベット ３、４、５ 回転弁 ６、７ 低圧ポンプ ８ 高圧ポンプ ９、１０ 貯蔵容器 １１ 微量滴定板
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイヴィッド モス ドイツ連邦共和国 ヴァルトブロン フィ ヒテンヴェーク 25 (72)発明者 ヘルベルト プラッチュ ドイツ連邦共和国 ダルムシュタット ヴ ェー−ラーテナウス−シュトラーセ ６ (72)発明者 カトリン フュクスレ ドイツ連邦共和国 カールスルーエ ライ ヒェンバッハシュトラーセ ４ (72)発明者 ラルフ マズーフ ドイツ連邦共和国 カールスルーエ シラ ーシュトラーセ 37 Ｆターム(参考） 2G059 AA01 AA05 AA06 BB04 BB12 CC12 CC16 DD03 DD12 EE10 EE12 FF04 FF12 HH01 JJ01
Claims (9)
- 【請求項１】 複合体を形成する少なくとも２つの反応物を互いに混合し、
混合物中のまだ反応しない個々の反応物のＩＲスペクトルを第一の時点で撮影し
、第二の時点で少なくとも１つの他のＩＲスペクトルで反応物の複合体を把握し
、異なる時点で撮影した２つのＩＲスペクトルから差スペクトルを形成し、その
差スペクトルがバンド構造を有する反応物を作用物質として選択する、作用物質
の確認方法。 - 【請求項２】 第一の時点として反応物を混合した直後の時点を選択する、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 反応物の少なくとも１つが低分子量化合物である、請求項１
または２記載の方法。 - 【請求項４】 反応物の少なくとも１つがタンパク質である、請求項１から
３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 反応物の少なくとも１つがＤＮＳ分子である、請求項１から
４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 第一の時点および第二の時点の間に１ミリ秒から１日までの
範囲の待ち時間が存在する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 方法を順次にまたは平行に多数の反応物を用いて実施し、そ
の際反応物は微量滴定板中に存在する、請求項１から６までのいずれか１項記載
の方法。 - 【請求項８】 ＩＲスペクトルの測定を１〜２５μｍの層厚さで行う、請求
項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１記載の方法を実施する装置において、 −第一のポンプ（６）で第一の試料ループ弁（３）が第一の反応物で充填可能で
ありおよび −第二のポンプ（７）で第二の試料ループ弁（４）が少なくとも１つの第二の反
応物で充填可能であり、 −試料ループ弁（３、４）は、有機化合物および試薬が密閉空間中に包含できる
ように互いに接続可能であり、および −有機化合物および試薬は第三のポンプ（８）で混合し、密閉空間からＩＲキュ
ベット（２）中へ供給させる、作用物質の確認装置。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19738566A DE19738566C2 (de) | 1997-09-04 | 1997-09-04 | Verfahren und Vorrichtung zur Identifizierung von Wirkstoffen |
| DE19738566.4 | 1997-09-04 | ||
| PCT/EP1998/005328 WO1999012017A1 (de) | 1997-09-04 | 1998-08-21 | Verfahren und vorrichtung zur identifizierung von wirkstoffen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001515205A true JP2001515205A (ja) | 2001-09-18 |
| JP3357350B2 JP3357350B2 (ja) | 2002-12-16 |
Family
ID=7841101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000508971A Expired - Fee Related JP3357350B2 (ja) | 1997-09-04 | 1998-08-21 | 作用物質を確認する方法および装置 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6429015B1 (ja) |
| EP (1) | EP1009999B1 (ja) |
| JP (1) | JP3357350B2 (ja) |
| AT (1) | ATE208896T1 (ja) |
| CA (1) | CA2302791C (ja) |
| DE (3) | DE19738566C2 (ja) |
| DK (1) | DK1009999T3 (ja) |
| ES (1) | ES2163890T3 (ja) |
| WO (1) | WO1999012017A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5804436A (en) | 1996-08-02 | 1998-09-08 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Apparatus and method for real-time measurement of cellular response |
| US6280967B1 (en) * | 1996-08-02 | 2001-08-28 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Cell flow apparatus and method for real-time of cellular responses |
| US6558916B2 (en) | 1996-08-02 | 2003-05-06 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Cell flow apparatus and method for real-time measurements of patient cellular responses |
| US6054711A (en) * | 1997-11-12 | 2000-04-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for identifying biological macromolecule interactions with compounds, particularly in complex mixtures |
| WO2000039562A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-06 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Near infrared spectroscopic analysis of vitamins |
| DE19909692C1 (de) * | 1999-03-05 | 2000-03-16 | Karlsruhe Forschzent | Durchflußmeßzelle zur Untersuchung einer schnell ablaufenden chemischen Reaktion |
| US6907351B2 (en) | 2001-08-01 | 2005-06-14 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Customer-based prediction method and system using near infrared reflectance spectra of materials |
| EP1384988B1 (en) * | 2002-07-22 | 2007-03-07 | The Automation Partnership (Cambridge) Limited | IR analysis system |
| WO2005091454A1 (ja) | 2004-03-18 | 2005-09-29 | Sanyo Electric Co., Ltd. | 半導体レーザ素子及びその製造方法 |
| DE102004062166B4 (de) * | 2004-12-20 | 2007-03-22 | Anatox Gmbh & Co. Kg | Vorrichtung zur Probenentnahme und zum Probentransfer |
| US20060205082A1 (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Middleton John S | Reaction rate determination |
| AR073364A1 (es) * | 2008-09-05 | 2010-11-03 | Basf Se | Metodo para ensayar sustancias o mezclas de sustancias y el uso del mismo en el campo de los productos agroquimicos |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56155835A (en) * | 1980-05-02 | 1981-12-02 | Olympus Optical Co Ltd | Component analyzing method |
| FI75675C (fi) | 1984-03-23 | 1988-07-11 | Saehkoeliikkeiden Oy | Foerfarande foer bestaemning av kolvaetehalter i vaetskor innehaollande dessa. |
| DD231649A1 (de) * | 1984-12-17 | 1986-01-02 | Akad Wissenschaften Ddr | Einrichtung zur messung von differenzspektren geloester stoffe |
| US4722830A (en) * | 1986-05-05 | 1988-02-02 | General Electric Company | Automated multiple stream analysis system |
| JPH05222178A (ja) | 1992-02-14 | 1993-08-31 | Fuji Photo Film Co Ltd | 反応制御方法 |
| US5519220A (en) * | 1994-06-28 | 1996-05-21 | Janos Technology Inc. | FTIR chemical reaction monitor |
| GB2310717B (en) | 1994-12-09 | 1999-04-07 | United Utilities Plc | Quantitative detection of chemical species |
| US5677191A (en) * | 1995-09-05 | 1997-10-14 | Janos Technology Inc. | Organic chemical compound test papers and method of using same |
| US6054711A (en) * | 1997-11-12 | 2000-04-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for identifying biological macromolecule interactions with compounds, particularly in complex mixtures |
-
1997
- 1997-09-04 DE DE19738566A patent/DE19738566C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-05-28 DE DE29809591U patent/DE29809591U1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-21 US US09/508,416 patent/US6429015B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-21 ES ES98946404T patent/ES2163890T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-21 CA CA2302791A patent/CA2302791C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-21 JP JP2000508971A patent/JP3357350B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-21 WO PCT/EP1998/005328 patent/WO1999012017A1/de active IP Right Grant
- 1998-08-21 DE DE59802164T patent/DE59802164D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-21 DK DK98946404T patent/DK1009999T3/da active
- 1998-08-21 AT AT98946404T patent/ATE208896T1/de active
- 1998-08-21 EP EP98946404A patent/EP1009999B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2163890T3 (es) | 2002-02-01 |
| EP1009999A1 (de) | 2000-06-21 |
| DE19738566A1 (de) | 1999-03-18 |
| DK1009999T3 (da) | 2002-03-25 |
| DE59802164D1 (de) | 2001-12-20 |
| DE29809591U1 (de) | 1998-09-24 |
| JP3357350B2 (ja) | 2002-12-16 |
| ATE208896T1 (de) | 2001-11-15 |
| CA2302791A1 (en) | 1999-03-11 |
| WO1999012017A1 (de) | 1999-03-11 |
| US6429015B1 (en) | 2002-08-06 |
| EP1009999B1 (de) | 2001-11-14 |
| CA2302791C (en) | 2010-07-13 |
| DE19738566C2 (de) | 1999-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3357350B2 (ja) | 作用物質を確認する方法および装置 | |
| JP2002303629A (ja) | 免疫クロマトデバイス及びそれを用いた被検物質測定方法 | |
| Liu et al. | Method for quantitative proteomics research by using metal element chelated tags coupled with mass spectrometry | |
| Teerlink | Determination of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethylarginine in biological samples by HPLC | |
| JPS63258491A (ja) | サイクロスポリンａ誘導体およびそれを用いたサイクロスポリンａまたはその代謝産物の蛍光偏光イムノアッセイ法 | |
| US20220291223A1 (en) | Chemiluminescent compounds for multiplexing | |
| Levy | Preparation of photo-affinity probes for the insulin receptor site in adipose and liver cell membranes | |
| JP4213029B2 (ja) | 特異的標識化方法 | |
| JP2005031029A (ja) | 競合法によるサイロシン類のイムノクロマトグラフィー検出法及びテストキット | |
| JP3360174B2 (ja) | 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬 | |
| JPH0737986B2 (ja) | 免疫的検出方法 | |
| Adegoke et al. | New spectrophotometric method for the determination of gabapentin in bulk and dosage forms using p-dimethylaminobenzaldehyde | |
| Toribara et al. | Infrared identification in paper chromatography | |
| JPH09507026A (ja) | 自動鉛アッセイ | |
| Li et al. | Labeling of prenylated proteins via Ene-ligation using naturally-occurring citronellol | |
| Qvit et al. | Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates | |
| JPS61501047A (ja) | 固定化したリポ−タ−グル−プ類の測定方法 | |
| JP3177964B2 (ja) | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 | |
| CN109180507A (zh) | 酮洛芬半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和用途 | |
| US5234836A (en) | Method for amino acid sequence analysis | |
| JPS61217765A (ja) | 免疫性蛋白質の定量方法および定量装置 | |
| JPH06504851A (ja) | 分析物の免疫学的検出装置 | |
| JPS6189557A (ja) | 硫黄−３５による有機分子の標識化 | |
| CN111830006B (zh) | 一种光谱分析方法和装置 | |
| JP2591089B2 (ja) | 免疫的検出用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20020828 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081004 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091004 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091004 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101004 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111004 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121004 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131004 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |