JP2001509386A

JP2001509386A - コーヒーの貯蔵タンパク質

Info

Publication number: JP2001509386A
Application number: JP2000502184A
Authority: JP
Inventors: マルラッシニ、ピエール; ロジャーズ、ジョン
Original assignee: ソシエテデプロデユイネツスルソシエテアノニム
Priority date: 1997-07-12
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2001-07-24
Also published as: WO1999002688A1; CA2295320A1; AU756433B2; BR9811690A; EP1007683A1; AU8730998A; US6617433B1; BR9811690B1

Abstract

(57)【要約】本発明の主題はコーヒー豆から誘導されたタンパク質、およびこれらのタンパク質の少なくとも１つをコードし、そして発現を調節するＤＮＡである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の主題は、コーヒー豆から誘導されたタンパク質、およびこれらのタン
パク質の少なくとも一つをコードし、そして発現を調節するＤＮＡである。

【０００２】（従来技術）多くの植物が、その胚芽において、その塊茎において、および、特にその種子
において、その生長の間に貯蔵タンパク質を生産することができる、ことが知ら
れている。これらの貯蔵タンパク質は、特に、種子の発芽のためのアミノ酸の貯
蔵に、重要な役割を果たしている。それらはアミノ酸の構造および内容において
も、重要である。

【０００３】これらのタンパク質のいくつかは、単離されており、そして、いくつかの例に
おいては、宿主植物に発現されている。

【０００４】それゆえ、ＥＰ０，２９５，９５９は、特に、宿主植物において、２Ｓと称
される貯蔵タンパク質の少なくとも１サブユニットをコードする、Ｂｅｒｔｈｏ
ｌｌｅｔｉａｅｘｃｅｌｓａＨ．Ｂ．Ｋ．（ブラジルナッツ）から誘導され
たＤＮＡの発現を明らかにしている。

【０００５】更に、ＷＯ９１１９８０１は、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏから誘導さ
れた２つの貯蔵タンパク質、それらの前駆体、およびそれらのタンパク質をコー
ドする遺伝子の存在を明らかにしている。

【０００６】しかしながら、現在までに、コーヒー豆から誘導された貯蔵タンパク質および
これらタンパク質の転写を調節することのできる配列は知られていない。しかし
、特にコーヒー豆における貯蔵タンパク質の元々の製造を修飾するために、その
ようなタンパク質の利用可能な配列を得ることは非常に有用である。更に、特に
、コーヒー豆における、関連する遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を
させるために、そのようなタンパク質の転写を調節することができる配列を得る
ことは、また、非常に有用である。

【０００７】本発明の目的は、そのようなニーズに応えるためである。

【０００８】（発明の要旨）このような成果のために、本発明は、アミノ酸配列、配列番号２の、少なくと
も２０の連続するアミノ酸をコードする、コーヒー豆から誘導されるＤＮＡに関
するものである。

【０００９】本発明は、アミノ酸配列、配列番号２の、少なくとも２０の連続するアミノ酸
を有するコーヒー豆から誘導される貯蔵タンパク質に関する。

【００１０】本発明の別の主題は、本発明による貯蔵タンパク質の転写を調節することがで
きる、配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド１から２５０９によって範
囲を設定されたＤＮＡの全部または一部、および同様に、植物、特にコーヒーの
木で関連する遺伝子の発現を目指した、本ＤＮＡの全部または一部の使用、に関
する。

【００１１】本発明は、また、ＰＣＲを行うため、あるいは貯蔵タンパク質をコードするコ
ーヒー豆遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏで検出するための、または、ｉｎｖｉｖｏ
で不活化するためのプローブとして、少なくとも１０ｂｐの、配列番号１の核酸
配列のヌクレオチド３３から１５０８、またはその相補鎖により範囲を設定され
ているＤＮＡの全部または１部の使用、に関する。

【００１２】更に、本発明は、本発明による組換え貯蔵タンパク質を発現することができる
組換え植物細胞に関する。

【００１３】最後に、本発明は、本発明によるＤＮＡまたは組換えタンパク質の全部または
１部を含む、食品、化粧料または医薬品に関する。

【００１４】本発明は、それゆえ、コーヒー豆の貯蔵タンパク質の元々の製造を修飾するた
めに、本発明によるＤＮＡの全部または一部の使用の可能性を公開するものであ
る。それゆえ、特に、コーヒー豆の本発明によるＤＮＡの全部または一部の発現
を過剰発現または過小発現するのを予見することが可能である。

【００１５】（発明の詳細な説明）本発明の目的のために、「相同核酸配列」は、少数の塩基対の置換、欠失お
よび／または挿入においてのみ、本発明による核酸配列から相異している核酸配
列を意味すると理解される。これに関連して、遺伝暗号の縮重のために、同じタ
ンパク質をコードする２つの核酸配列は、特別に、相同であると考えられる。本
発明による核酸配列で７０％以上相同性を示すようなものは相同配列と考えられ
る。後者の場合、相同性は、相同配列の塩基対の数、および、本発明による核酸
配列の数の間の比率によって決定される。

【００１６】更に、本発明の目的のために、相同核酸配列は、また、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする配列、即ち、準特異的なハイブリダイゼーション、ま
たはそれ程安定ではないハイブリダイゼーションを避けるために、サザンブロッ
ト法によって本発明の核酸配列をハイブリダイズすることができる核酸配列、を
意味すると理解される（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＵＳＡ，１９８
９，Ｃｈａｐｔｅｒ９．３１−９．５１）。

【００１７】最後に、本発明の目的のために、「相同アミノ酸配列」は、少なくとも１つ
のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失においてのみ、本発明によるアミノ
酸配列から相異しているアミノ酸配列を意味すると理解される。また、本発明に
よるアミノ酸配列で５０％以上の相同性を示すものは相同配列と考えられる。後
者の場合、相同性は、相同配列のアミノ酸の数、および、本発明によるアミノ酸
配列の数の間の比率によって決定される。

【００１８】記載の残りの部分において、配列の配列番号は、後に記載する配列表に示され
た配列を云う。後の記載中にあげられ、そして配列表に示されている、合成オリ
ゴヌクレオチド配列番号５から配列番号１８は、ＧｅｎｓｅｔＳＡ，１ｐａ
ｓｓａｇｅＤｅｌａｕｎａｙ，７５０１１Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅにより
提供されたものである。

【００１９】貯蔵タンパク質はコーヒー豆にのみ存在し、内胚乳中に高度に発現される。熟
したコーヒー豆においては、それらは総タンパク質のおよそ５０％近くを占め、
コーヒー豆の成熟に重要な役割を演じている。これらタンパク質は、特に、コー
ヒー豆の構造および質量、ならびにそのアミノ酸含量に影響を与える。それらは
、また、豆の発育のためのアミノ酸の貯蔵に主要な役割を演じている。

【００２０】核酸配列、配列番号１および配列番号３から誘導される核酸プライマーから出
発して通常の逆ＰＣＲを実行することにより、コーヒー豆の貯蔵タンパク質をコ
ードするＤＮＡ、および発現を調節するＤＮＡを単離することが可能である。当
業者は、実際、例えば、このＰＣＲを実行するに最も適したプライマーを選択す
ることができる。

【００２１】この効果を得るために、アミノ酸配列、配列番号２の、少なくとも２０の連続
したアミノ酸をコードするＤＮＡがコーヒー豆から単離されている。

【００２２】好適には、該ＤＮＡは、アミノ酸配列、配列番号２を有する貯蔵タンパク質α
β、アミノ酸配列、配列番号２、アミノ酸１から３０４によってアミノ酸配列、
配列番号２において範囲が設定されている開裂タンパク質α、アミノ酸３０５か
ら４９２によってアミノ酸配列、配列番号２において範囲が設定されている開裂
タンパク質β、またはこれらの配列に相同な任意の核酸配列、を含む群から選択
された、コーヒー豆から誘導される少なくとも１つのタンパク質をコードする。

【００２３】本発明の利点を挙げるとすれば、本発明は、貯蔵タンパク質αβをコードする
核酸配列、配列番号１のヌクレトチド３３から１５０８によって範囲が設定され
ているＤＮＡ、あるいは、この配列に相同な任意の核酸配列に関するものである
。特に、本発明は、核酸配列、配列番号１において、開裂タンパク質αをコード
するヌクレトチド３３から９４４、および／または開裂タンパク質βをコードす
るヌクレトチド９４５から１５０８を少なくとも含むＤＮＡに関する。

【００２４】本発明は、また、ＰＣＲを実行するためのプライマーとして、あるいは少なく
とも１つの貯蔵タンパク質をコードする少なくとも１つのコーヒー豆遺伝子をｉ
ｎｖｉｔｒｏで検出するための、または該遺伝子のｉｎｖｉｖｏでの発現を
修飾するためのプローブとしての、少なくとも１０ｂｐの、核酸配列、配列番号
１のヌクレオチド３３から１５０８、あるいはその相補鎖によって範囲を設定さ
れた、ＤＮＡの全部または１部の使用に関する。

【００２５】本発明によるＤＮＡは、宿主植物または微生物において、コーヒー豆から誘導
された、少なくとも１つの組換え貯蔵タンパク質を発現するために好適に使用す
ることができる。これを効果的ならしめるために、ヌクレオチド３３から１５０
８により範囲が設定されている核酸配列、配列番号１の全部または１部を、プロ
モーターの下流、またはプロモーターおよびシグナル配列の下流、および読み枠
を保存して、ターミネーターの上流の発現ベクターに、クローニングし、そして
該ベクターを、例えば、植物、酵母または細菌に導入することができる。応用の
特別な例は後程提示される。

【００２６】更に、核酸配列、配列番号１のヌクレオチド３３から１５０８によって範囲が
設定されているＤＮＡの全部または１部は、コーヒー豆の貯蔵タンパク質の元々
の生産を修飾するため、および、かくして、コーヒー豆の官能品質を修飾するた
めに、突然変異によって修飾された形のコーヒー豆に有利に使用し得る。

【００２７】本発明は、また、アミノ酸配列、配列番号２を有する貯蔵タンパク質αβ、ア
ミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸１から３０４によって範囲が設定されている
配列を有する開裂タンパク質α、およびアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸３
０５から４９２によって範囲が設定されている配列を有する開裂タンパク質β、
またはこれらに相同である、任意のアミノ酸配列に関する。

【００２８】コーヒー豆から誘導される貯蔵タンパク質は、２つのタンパク質、開裂タンパ
ク質αおよび開裂タンパク質βに開裂される、大きな前駆体、貯蔵タンパク質α
β、に合成される、という事実は明らかにされている。開裂タンパク質αおよび
βは、少なくとも１つのジスルフィド結合を通して重合した形で再結合すること
ができる。実際、コーヒー豆の内胚乳において、開裂タンパク質αおよび／また
はβ、あるいはそれらの相同配列の重合した形に単離することが可能になってい
る。

【００２９】これを効果ならしめるために、本発明は、組換え貯蔵タンパク質αβ、αおよ
び／またはβ、の重合した形、ならびにそれらの相同配列に関する。

【００３０】本発明の別の主題は、アミノ酸配列、配列番号２を有する貯蔵タンパク質の発
現を調節することのできる、核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１から２５０
９によって範囲が設定されているＤＮＡの全部または１部に関する。

【００３１】本発明は、また、核酸配列、配列番号１のヌクレオチド３３から１５０８によ
ってコードされる貯蔵タンパク質αβ、または関連する遺伝子によってコードさ
れるタンパク質の、コーヒー豆または異種植物における、発現が可能なために、
核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１から２５０９によって範囲が設定されて
いるＤＮＡの全部または１部の使用に関する。

【００３２】核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１から２５０９によって範囲が設定され
ているＤＮＡは、完全にまたは部分的に、読み枠を保存しつつ、関連する遺伝子
と融合することによって、そしてコーヒー豆のこの遺伝子によってコードされる
タンパク質の発現をさせるために、コーヒー中に導入される発現ベクターに全部
がクローニングされることによって、有利に使用され得る。

【００３３】本発明は、また、本発明によるＤＮＡ、または組換えタンパク質の全てまたは
１部を含む、食品、化粧料あるいは医薬品の全てを包含している。当業者は、実
際、オリゴヌクレオチドプローブにより、または適当な抗体によって、非常に低
容量でそれらの存在を検出することができる。

【００３４】本発明に従って、コーヒー豆から誘導される貯蔵タンパク質、これらタンパク
質の少なくとも１つをコードするコーヒー豆から誘導されるＤＮＡ、そしてそれ
らの転写を調節することができるＤＮＡは、以下に記載する生化学的および分子
的解析の手段によって、より詳細に特徴づけられる。

【００３５】Ｉ．コーヒー豆の貯蔵タンパク質の同定総タンパク質はＣａｔｕｒｒａ変種のＣｏｆｆｅａａｒａｂｉｃａの成熟果
実から抽出された。

【００３６】これを行うために、母系組織を、急速に液体窒素中でひいて、Ｄａｍｅｒｖａ
ｌら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ７，５２−５４，１９８６）の方
法により粉末としたコーヒータンパク質を、３％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ、８．５Ｍ
尿素、０．１５％ｗ／ｖＤＴＴおよび３％ｖ／ｖアンホライト支持体ｐＨ３−
１０を含有する溶液１００μｌ中で可溶化した、本粉末の１０ｍｇから抽出した
。

【００３７】混合物を１３，０００ｇで５分間遠心分離し、コーヒー豆の総タンパク質を含
有する上清を回収する。

【００３８】一次元電気泳動を、例えば、多孔システム（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅｓｙｓｔ
ｅｍ，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ，Ｂｊｏｒｋａｇａｔａｎ
３０，７５１８２Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ｐＨグラジエ
ントを基本として、この上清について、行った。これを行うのに、５０μｌを電
気泳動ゲル中に置いた。

【００３９】分子量に従って総タンパク質を分離するために、第２回目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動を、第１の電気泳動から誘導されたゲルで、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ装
置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２０００ＡｌｆｒｅｄＮ
ｏｂｅｌＤｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９４５４７
ＵＳＡ）を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，６８０−６
８８，１９７０）に従って、標準条件下で、実施した。そのために、一次元電
気泳動から誘導されたゲルを、６Ｍ尿素、３０％ｖ／ｖグリセロール、２％ｗ／
ｖＳＤＳ、２％ｗ／ｖＤＴＴおよび２．５％ｗ／ｖヨードアセタミド、を含有
するトリスバッファー５ｍｌ／ゲルで平衡化し、第２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動のゲル上におき、タンパク質の移動を、例えば、４０ｍＡ、および１２℃、９
分でＢｉｏ−Ｒａｄ装置で実行した。

【００４０】生成されたゲルを、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔらの方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ，１４，１３５７−１３６５，１９９３）によって、銀染色する。

【００４１】画像をスキャナー（ＳｃａｎｎｅｒＸＲＳ１２ＣＸ，Ｘ−ＲａｙＳｃａ
ｎｎｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，４０３０ＳｐｅｎｃｅｒＳｔｒｅｅｔ
，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９０５０３ＵＳＡ）および、例
えば、ＢｉｏＩｍａｇｅＰｒｏｇｒａｍｍｅ（ＢｉｏＩｍａｇｅ，７７７
ＥａｓｔＥｉｓｅｎｈｏｗｅｒＰａｒｋｗａｙ，Ｓｕｉｔｅ９５０，Ａ
ｎｎＡｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ４８１０８、ＵＳＡ）で以って解析する
。

【００４２】二次元電気泳動により分離されたタンパク質は、Ｂｉｏ−ＲａｄＴｒａｎｓ
ｂｌｏｔＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）で４２０ｍＡ、４℃、１時間
３０分に保って、ＣＡＰＳバッファー中ＰＶＤＦ膜上に転写する、そしてＡｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩ
ｎｃ．，８５０ＬｉｎｃｏｌｎＣｅｎｔｒｅＤｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９４４０４ＵＳＡ）の指示書に従って、ク
ーマシーブルーで染色する。

【００４３】転写後、膜を室温で乾燥し、プラスチック小袋に−１８℃で保存する。

【００４４】タンパク質ブロットのＮ−末端配列のマイクロシーケンスは、Ｂｅｃｋｍａｎ
ＬＦ３０００型のシーケンサーおよびＢｅｃｋｍａｎＧｏｌｄＨＰＬＣシ
ステム（ＢｅｃｋｍａｎｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．，２５０Ｈａ
ｒｂｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄＢｏｘ３１００，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ９２６３４ＵＳＡ）によって行われる。そのため、タンパ
ク質ブロットは膜外にカットし、１０％ｖ／ｖトリプシン、１００ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、１％ｖ／ｖトリトンＲＴＸおよび１０％ｖ／ｖアセトニトリルを含
む消化バッファー５０μｌ中、ｐＨ８．３でトリプシン消化にかける。

【００４５】ペプチドは、ＴＦＡ０．０５％含有水／アセトニトリルグラジエントを用い
て、Ｃ１８カラム（ＭｅｒｃｋＫＧＡＡＦｒａｎｋｆｕｒｔｅＳｔｒａｓ
ｓｅ２５０，６４９２３Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＤＥ）でＨＰＬＣにより、
分離し、ペプチド分画を濃縮し、３０％アセトニトリルおよび０．０１％ＴＦＡ
に再稀釈し、上記したようにして配列を決定した。

【００４６】成熟Ｃ．ａｒａｂｉｃａ豆の内胚乳の失活条件下において、二次元電気泳動プ
ロフィールは、特に、７０、５６、３２および２３ｋＤａのオーダーの明確な分
子量を有するタンパク質で代表される４つのグループのタンパク質であることを
示した。

【００４７】２３ｋＤａのタンパク質のグループの２つのタンパク質、および７０ｋＤａの
タンパク質のグループの２つのタンパク質は、開裂タンパク質βのＮ−末端配列
に同じＮ−末端配列を有していることが観察される。

【００４８】更に、３２ｋＤａのタンパク質のグループの３つのタンパク質および５６ｋＤ
ａのタンパク質のグループの１つのタンパク質は、開裂タンパク質αのＮ−末端
配列に同じＮ−末端配列を有するという事実が明らかにされた。

【００４９】更に、３２ｋＤａのタンパク質の１つから、５から１５アミノ酸の、７つの内
部配列を確立することが可能であった。

【００５０】更に、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｄａｔａｂａｎｋ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐ
ｕｔｅｒＧｒｏｕｐＩｎｃ．，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ５３７１１ＵＳＡ）の助力により、およびＦＡＳＴＡｐｒｏｇｒ
ａｍｍｅ（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８，１９８８）を用いて、
２３、３２、５６および７０ｋＤａのタンパク質のＮ−末端配列および３２ｋＤ
ａのタンパク質の内部配列は、例えば、大豆Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘのグリシニ
ン、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの１２ｓタンパク質、セイヨウ
アブラナＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓのｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ、イネＯｒｙｚ
ａｓａｔｉｖａのグルテリン、およびセイヨウカボチャＣｕｃｕｒｂｉｔａ
ｍａｘｉｍａの１１ｓタンパク質、のような、ある種の植物種の貯蔵タンパク質
の配列に高い相同性を有しているという事実を明らかにすることが可能であった
。

【００５１】これらの結果に照らして、コーヒー豆から誘導される貯蔵タンパク質の構造に
ついて、以下の仮説が可能となった。

【００５２】５６ｋＤａのタンパク質のグループは、２つのドメイン、αドメインおよびβ
ドメイン、を含む成熟貯蔵タンパク質αβ、である大きな前駆体を表わしている
。二次元電気泳動プロフィールは、また、３２ｋＤａにいくつかのイソ型として存
在する、開裂タンパク質αの存在、および２３ｋＤａにいくつかのイソ型として
存在する、開裂タンパク質βの存在を明らかにしている。かくして、貯蔵タンパ
ク質αβのように、開裂タンパク質αおよびβは、各種イソ型として存在し得る
。最後に、７０ｋＤａのタンパク質のグループは、開裂タンパク質βの三量体の
型で存在している。更に、１３ｋＤａの開裂タンパク質αの断片の存在が二次元電気泳動プロフィー
ルで明らかにされた。

【００５３】ＩＩ．コーヒー豆に含有される貯蔵タンパク質の量およびコーヒー豆から誘導される貯蔵タンパク質の発現の特異性の推定コーヒー豆に含有される貯蔵タンパク質の量を、二次元電気泳動プロフィール
の全集積強度に関して、パーセントで、計算した。これを行うために、貯蔵タン
パク質αβ、開裂タンパク質α、開裂タンパク質β、開裂タンパク質βの三量体
および開裂タンパク質αの断片で表わされるタンパク質ブロットの集積強度を測
った。二次元電気泳動プロフィールの総集積濃度は１００％に等しいことが受け入れら
れた。コーヒー豆に含有される貯蔵タンパク質の５０％値がこのようにして得られる。

【００５４】更に、内胚乳以外のコーヒー豆の組織におけるコーヒー豆の貯蔵タンパク質の
発現を、また、二次元電気泳動によりしらべた。貯蔵タンパク質は、コーヒー豆
の内胚乳中で大量に合成されるのみで、胚においてはより低い割合で合成される
という事実が明らかにされ得た。

【００５５】ＩＩＩ．コーヒー豆の総ＲＮＡｓからポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡｓのｉｎｖｉｔｒｏでの単離および翻訳総ＲＮＡを、開花後４から４０週で収穫したコーヒー豆から、抽出する。

【００５６】そのため、母系組織を、粉末にされる前に、液体窒素中で急速にひいたコーヒ
ー豆から分離する。

【００５７】この粉末を、ｐＨ８で、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ｗ／ｖＳ
ＤＳおよび０．５％ｖ／ｖβ−メルカプトエタノール含有バッファー８ｍｌに再
懸濁させ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、を飽和したフェノール１容
量に均一化し、そして（ｉ）フェノールの当容量で１回、（ｉｉ）フェノール：
クロロホルム（１：１）の当容量で２回、および（ｉｉｉ）クロロホルムの当容
量で２回、遠心分離した水層を抽出するために、１２，０００ｇで１０分間、４
℃で遠心分離する。

【００５８】総核酸を、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、の１／１０およびエタノールの
２．５容量を水層に加えて、−２０℃で１時間沈殿させた。

【００５９】全体を１２，０００ｇ、３０分間、４℃で遠心分離し、そして、ＬｉＣｌ（最
終的に２Ｍ）およびエタノール（２．５容量）の存在下で再び核酸を沈殿する前
に、Ｈ₂Ｏ、１０ｍｌ中にペレットをとりあげた。

【００６０】遠心後、総ＲＮＡｓのペレットをＨ₂Ｏ、１ｍｌ中にとり、微量の存在するＤＮＡを除去するために、ＤＮＡａｓｅＲＱ１（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，２８００ＷｏｏｄｓＨｏｌｌｏｗＲｏａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ
，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５３７１１ＵＳＡ）で１時間、３７℃で消化した。そ
して総ＲＮＡｓを、上記したように酢酸ナトリウムの存在で沈殿させる前に、フ
ェノールおよびクロロホルムで処理することによって、脱タンパクした。

【００６１】総ＲＮＡｓを、Ｈ₂Ｏの５００μｌ中にとり、２６０ｎｍで分光光度測定により定量する。それらの量をホルムアルデヒドの存在下アガロースゲル電気泳動お
よびｉｎｖｉｔｒｏ翻訳法により分析する。

【００６２】これを行うために、ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡｓ（ｍＲＮＡ）を、Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ精製システム（ＱｉａｇｅｎＩＮＣ．，９６００ＤｅＳ
ｏｔｏＡｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９１３
１１ＵＳＡ）を用いて総ＲＮＡｓの５００μｇから精製し、そしてｍＲＮＡｓ
の品質をｉｎｖｉｔｒｏにおけるタンパク合成能により評価する。そのため、
翻訳実験をウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）の存在下にｍＲ
ＮＡの１μｇで行い、そして、かくして合成されたタンパク質を³⁵Ｓ−メチオニ
ン（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ．，Ａｍｅｒｓｈ
ａｍＰｌａｃｅ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓ
ｈｉｒｅＨＰ７９ＮＡ，ＵＫ）のとり込みにより標識する。標識されたタン
パク質は上記した二次元電気泳動により分離される。酢酸／エタノール混合物（
４０／１０）で固定した後、ゲルはＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）
の存在下にインキュベートされ、減圧下に乾燥され、そしてオートラジオグラフ
フィルムに対し−８０℃に曝される。

【００６３】一方、開花後４ないし４０週令の豆から抽出されたｍＲＮＡｓでｉｎｖｉｔ
ｒｏ翻訳の結果、分子量１から１００ｋＤａの間の種々のタンパク質の存在が明
らかにされた。

【００６４】一方、開花後１６ないし３０週の間に収穫された豆から抽出されたｍＲＮＡｓ
でｉｎｖｉｔｒｏ翻訳の結果、貯蔵タンパク質のαβ型に相当するタンパク質
の、大量の、存在が明らかにされた。一方、開裂タンパク質αおよびβに大きさ
において相当する翻訳産物は観察されない。この結果、上記した仮説が確認され
、それによると、これら２つの開裂タンパク質は大きなαβ前駆体のｉｎｖｉ
ｖｏ開裂から効果的に誘導される。

【００６５】これら貯蔵タンパク質に対するｃＤＮＡを単離するために、以下に記載するよ
うな方法で２つのライブラリーが作成された。

【００６６】ＩＶ．ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニングライブラリーの構築に必要な、ｃＤＮＡの合成は、開花後１６ないし３０週に
収穫したコーヒー豆から抽出したｍＲＮＡを使用して、「Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ
ｃＤＮＡ合成システムＭ−ＭＬＶ（Ｈ−）」キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）
に記載された推奨に従って行われる。この反応の効率は、２つのＤＮＡ鎖の合成
中に[アルファ−³²Ｐ]ｄＣＴＰを添加することによりモニターされる。

【００６７】アルカリ性のアガロースゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬｏｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９
８９）上での移動の後、新しく合成されたｃＤＮＡの大きさを０．２から４．３
ｋｂを超える範囲にわたって評価する。ＤＮＡＤｉｐｓｔｉｃｋキット（Ｉ
ｎＶｉｔｒｏｇｅｎＢＶ，ＤｅＳｃｈｅｌｐ１２，９３５１ＮＶ
Ｌｅｅｋ，オランダ）の助けを借りて定量すると、約１００ｎｇのｃＤＮＡが
１μｇのｍＲＮＡから合成されることがわかる。

【００６８】新しく合成されたｃＤＮＡ（ｓ）はＲｉｂｏＣｌｏｎｅＥｃｏＲＩＡｄａ
ｐｔａｔｏｒＬｉｇａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳ
Ａ）に記載された推奨に従って処理され、前以て制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
，１１０１１ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ，ＬａＪｏ
ｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９２０３７，ＵＳＡ）に結合され、仔ウシ小腸
アルカリ性ホスファターゼで処理することにより脱リン酸化する。

【００６９】この結合混合物の全体を、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ′株（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に転換するために使用する。組換えベクターを含
有する細菌を、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌアンピシ
リン、８０μｇ／ｍｌメチシリンを含有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
）培地の皿で、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，
１９８９）の存在下に選択した。それらをペトリ皿で培養し、およそ３００クロ
ーン／皿を得た。これらのクローンをナイロンフィルターに転写し、Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧ
ｍｂＨ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｐｏｓｔｆａｃｈ３１０１２０，Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ３１，ＤＥ）による推奨に従って処理した。

【００７０】更に、配列番号２のアミノ酸３２５から３３０からの配列を、ジゴキシゲニン
基（ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，１６２Ａ
ＳｃｉｅｎｃｅＰａｒｋ，ＭｉｌｔｏｎＲｏａｄ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＣ
Ｂ４４ＢＲ，ＵＫ）の添加により５′末端に標識した核酸配列、配列番号４を
有する、比較的少し縮重した、プローブＯＬＩＧＯ１、オリゴヌクレオチドプ
ローブを表わすことが可能であるので、開裂タンパク質βのアミノ酸配列中で選
択する。

【００７１】フィルターを、ＤＩＧオリゴヌクレオチド３′−末端標識キットプロトコール
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）で定義されるハイブリダイ
ゼーション溶液中、６５℃、４時間プレハイブリダイズし、プローブＯＬＩＧＯ
１（最終的に１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）の存在下、３７℃、１０時間ハイブリダイゼ
ーションを行う。

【００７２】ハイブリダイゼーションの後、フィルターをＷｏｏｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１５８５−１５８８，１９８５）によ
り定義されたプロトコールに従ってテトラメチルアンモニウムクロリドの存在下
に洗滌し、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（ＤＩＧ蛍光検出キット）
により提供された推奨に従って、ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，４７Ｗｉｇｇｉｎ
ｓＡｖｅｎｕｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ０１７３０
ＵＳＡ）の存在下に、免疫検出に付す。

【００７３】組換えベクターに存在する陽性クローン、記述のメモで「ｐＣＳＰ１」と云う
、を開花後１６週に行われたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングから選択す
る。このベクターは、[アルファ−³⁵Ｓ]ｄＡＴＰの存在下「Ｔ７シーケンシング
キット」のプロトコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従ってシーケ
ンスされた、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ
部位にクローンされた、ｃＤＮＡを含んでいる。このｃＤＮＡは配列番号１の最
後の８１９ヌクレオチドを含み、そして、それゆえ、貯蔵タンパク質αβをコー
ドすることができない。

【００７４】完全な貯蔵タンパク質αβをコードするｃＤＮＡを単離するために、新しい核
酸プローブ、記述のメモでＳＯ１と云う、を合成する。このために、核酸配列、
配列番号５を有する合成オリゴヌクレオチドＯＬＩＧＯ２、および核酸配列、
配列番号６を有する合成オリゴヌクレオチドＯＬＩＧＯ３を用いてＰＣＲを行
った（米国特許４，６８３，１９５号、および米国特許４，６８３，２０２号）
。

【００７５】ＰＣＲ反応は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８
、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ各オリゴヌクレオチド（ＯＬＩＧＯ２およびＯＬＩＧＯ^*３）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）３単位を
含む最終容量５０μｌ中に、ベクターｐＣＳＰ１０．１ｎｇの存在下に行った
。反応混合物をミネラルオイル５０μｌでカバーし、３０サイクル（９４℃−３
０秒、４２℃−３０秒、７２℃−２分）、次いで最終延長７２℃、７分、インキ
ュベートした。増幅後得られた断片をＭｉｃｒｏｃｏｎ１００カートリッジ（
ＡｍｉｃｏｎＩＮＣ，７２ＣｈｅｒｒｙＨｉｌｌＤｒｉｖｅ，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ０１９１５ＵＳＡ）で精製し、この断
片５０ｎｇを、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に従って
[アルファ−³²Ｐ]ｄＣＴＰ５０μＣｉでランダムプライマー伸長により標識した
。

【００７６】更に、プローブＯＬＩＧＯ１でスクリーニングする間に使ったナイロンフィ
ルターを、０．２Ｎ−ＮａＯＨ−０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の存在下、１５分、
３７℃、２回洗滌により脱ハイブリダイズし、６ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｔ
（０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ＢＳＡ画分
ＩＶ）および変性サケ精子ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌを含む溶液中で、４時間、６５
℃にて、プレハイブリダイズした。次いで、標識プローブＳＯ１の全体と同じ溶
液中で１０時間、６５℃にてハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ、
１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳの存在下に
、継続して、３０分、６５℃にて３回洗滌した。

【００７７】組換えベクターに存在する陽性クローン、記述のメモでｐＣＳＰ２と云う、を
開花後３０週に行われたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングから選択する。
このベクターは、アミノ酸配列、配列番号２および理論分子量５４９９９Ｄａを
有する、完全な貯蔵タンパク質αβをコードするｃＤＮＡに相当する、１７０６
ｂｐの配列番号１を含む。配列番号２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔｄａｔａｂａｎｋ
で検索すると、このコーヒータンパク質はタイプ１１ｓ植物貯蔵タンパク質のフ
ァミリーに属することが確認された。

【００７８】前駆体の開裂部位は、他のタイプ１１ｓ植物タンパク質（Ｂｏｒｒｏｔｏａ
ｎｄＤｕｒｅ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，１１３−１３１，１
９８７）の全てに見られるように、アミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸３０４
および３０５の間に位置している。このことは、また、上記した開裂タンパク質
βのＮ末端シーケンシングによっても確認される。従って、開裂タンパク質αは
アミノ酸配列、配列番号２の最初の３０４アミノ酸に相当しているのに対し、開
裂タンパク質βはこの配列の最後の１８８アミノ酸に相当している。αおよびβ
の理論分子量は、それぞれ、３４１２５Ｄａおよび２０８９２Ｄａであり、「コ
ーヒー豆の貯蔵タンパク質の同定」で、上記したのと一致している。

【００７９】上記で解析した開裂タンパク質αおよびβのＮ末端配列は、２、３のアミノ酸
を除き、アミノ酸配列、配列番号２に見出される。これらの相異は、多分、２、
３のアミノ酸によりそれぞれ異なっている、それらのタンパク質のいくつかのイ
ソ型の存在により、説明される（Ｓｈｉｒｓａｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ
ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ＧｒｉｅｒｓｏｎＥｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａ
ｌｌＮＹ，１５３−１８１，１９９１）。

【００８０】Ｖ．Ｃｏｆｆｅａａｒａｂｉｃａ豆の発生中の貯蔵タンパク質αβをコードする遺伝子の発現発生の種々の段階において収穫したコーヒー豆における、貯蔵タンパク質αβ
をコードする遺伝子の発現（開花後、９、１２、１６、３０および３５週）をモ
ニターする。

【００８１】これを行うため、これらコーヒー豆の総ＲＮＡｓ１０μｇを、ホルムアミド（
５０％）およびホルムアルデヒド（最終濃度０．６６Ｍ）の存在下、１ｘＭＯＰ
Ｓバッファー（２０ｍＭＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ
、ｐＨ７）中で、１５分、６５℃にて失活させた。

【００８２】それらを、最終濃度として２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１．２％アガ
ロースゲル上で、１ｘＭＯＰＳバッファーの存在下、６時間、２．５Ｖ／ｃｍで
、電気泳動にて分離した。

【００８３】移動後、ＲＮＡｓをＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に従ってエチジウムブロミ
ド（ＢＥＴ）で染色する、それにより、１６ｓおよび２３ｓのリボソームＲＮＡ
ｓの蛍光強度からゲル上に沈着した量の標準化が可能となる。

【００８４】総ＲＮＡｓを、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）により提供された推奨に従って、正に荷電した
ナイロン膜に転写し固定する。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイ
ゼーションを、上記ＩＶ章に記載した条件に従って行う。

【００８５】貯蔵タンパク質αβをコードするｍＲＮＡｓは、開花後９週間までに収穫され
た豆から、完全に欠けている。それらは、開花後１２週間に収穫された豆におい
て非常に弱く検出され始め、そして開花後１６および３０週の間に収穫された豆
において非常に豊富になり、再び成熟コーヒー豆（開花後３５週間）において非
常に弱く出現しはじめる。全ての場合において、プローブＳＯ１は、推定サイズ
約１．８ｋｂ付近が核酸配列、配列番号１のそれに近いｍＲＮＡの１クラスのみ
とハイブリダイズする。

【００８６】ｍＲＮＡの蓄積の速度論は、貯蔵タンパク質の遺伝子の大部分に観察されたも
のと類似している（Ｓｈｉｒｓａｔ，１９９１）。コーヒー豆の熟成期間中に行
われた組織実験によると、開花後１２および１６週間の間のｍＲＮＡの量の増加
は内胚乳による周乳の吸収の時と同じに起こることが観察された。二次元電気泳
動により上記で行われた解析と比較して、豆の熟成期間中のタンパク質の蓄積に
おいて、ｍＲＮＡの蓄積の速度論と貯蔵タンパク質のそれは完全な重ねあわせで
あることが見出された。成熟段階において、相当するメッセンジャーＲＮＡｓが
存在しないのに貯蔵タンパク質が残存するのは、ｉｎｖｉｖｏにおけるこれら
タンパク質の高い安定性により説明される。これらの観察によると、そして他の
植物種において示されたように（Ｓｈｉｒｓａｔ，１９９１）、貯蔵タンパク質
αβをコードする遺伝子の発現は、コーヒー豆の内胚乳中に特異的に発現される
、遺伝子の転写を調節することのできる配列、プロモーターにより必須的に制御
されていることが明らかである。

【００８７】ＶＩ．コーヒー豆の貯蔵タンパク質αβをコードする遺伝子のプロモーターの単離Ｃｏｆｆｅａａｒａｂｉｃａの貯蔵タンパク質αβをコードする遺伝子のプ
ロモーターはＯｃｈｍａｎら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２０，６２１−６２３，
１９８８）の方法に従っていくつかの逆ＰＣＲｓにより単離された。

【００８８】これを行うため、Ｒｏｇｅｒｓ及びＢｅｎｄｉｃｈ（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｍａｎｕａｌ，Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ及びＶｅｒｍ
ａ編、ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＤｏｒｄｒｅ
ｃｈｔ，オランダ，Ａ６，１−１１，１９９３）により記載されたプロトコルに
従って、Ｃ．ａｒａｂｉｃａ，Ｃａｔｕｒｒａ変種の若い葉から、コーヒーの核
ＤＮＡを単離する。

【００８９】このＤＮＡの０．５から１μｇを、例えばＤｒａＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＮｄ
ｅＩのような、いくつかの制限酵素で消化し、フェノール：クロロホルム（１：
１）で処理し、そして酢酸ナトリウム最終濃度０．３Ｍおよびエタノール（２．
５容量）の存在下、１２時間、−２０℃にて沈殿させた。

【００９０】１０，０００ｇ、１５分間、４℃にて遠心分離後、ＤＮＡを３０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴおよび０．５ｍＭｒＡＴＰを含有する連結反応バッファー約５００μｌ中にとり、そして
約１ないし２ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度を得た。連結反応は０．０２Ｗｅｉｓ
ｓｕ／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、１２時間、１４℃にて行い、自己
結合ゲノムＤＮＡを上記したようにして沈殿させ、ＤＮＡＤｉｐｓｔｉｃｋ
キット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で定量する前に、Ｈ ₂ Ｏ、２０μｌにとる。

【００９１】ａ）逆ＰＣＲ反応１この第１の反応は、核酸配列、配列番号７を有する合成オリゴヌクレトチドＳ
Ｏ１０、および核酸配列、配列番号８を有する合成オリゴヌクレトチドＳＯ１１
、を使用して行う。

【００９２】この逆ＰＣＲ反応は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．８、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ各オリゴヌクレオチド（ＳＯ１０およびＳＯ１１）および
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ３単位（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を含有す
る最終容量５０μｌ中の結合ゲノムＤＮＡ５０ｎｇの存在下で行う。次に、反応
混合物を、ミネラルオイル５０μｌでカバーし、３０サイクル（９４℃−３０秒
、５６℃−３０秒、７２℃−３分）、次いで最終延長サイクル７２℃、７分、イ
ンキュベートした。

【００９３】増幅したＤＮＡ断片は、分子ハイブリダイゼーションにより解析し（Ｊ．Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７，１９７５）、１
％ゲル上で電気泳動により分離し、エチジウムブロミドで染色して、正荷電ナイ
ロン膜（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）上に０．４ＮＮａ
ＯＨの存在下、１２時間転移する。

【００９４】転移後、膜を１５分間、１２０℃にて焼き、「ＤＩＧオリゴヌクレオチド３′
−末端標識キット」のプロトコール（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
，ＤＥ）で定義されたハイブリダイゼーション溶液中で６５℃、４時間、プレハ
イブリダイズする。

【００９５】膜は、核酸配列、配列番号９を有し、ジゴキシゲニン基で５′−末端を標識し
た合成オリゴヌクレオチドＳＯ１２（１０ｐモル／ｍｌ）の存在下、３７℃、１
０時間ハイブリダイズする。

【００９６】ハイブリダイゼーションの後、フィルターをＷｏｏｄら、１９８５、により定
義されたプロトコールに従いテトラメチルアンモニウムクロリドの存在下に洗滌
し、ＤＩＧ蛍光検出キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）
に記載の推奨に従い、ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，ＵＳＡ）の存在下に免疫検出に
付す。

【００９７】オートラジオグラフィの後、プローブＳＯ１２に結合した、制限酵素Ｈｉｎｃ
ＩＩで最初消化したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応から誘導された、約１．７ｋｂ
のＤＮＡ断片の存在を検出する。

【００９８】このＤＮＡを、ベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，ＵＳＡ）にクローニングする。そのために、逆ＰＣＲ反応の１０μｌを滅
菌水１００μｌと混合し、混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎ１００カートリッジ（Ａｍ
ｉｃｏｎ，ＵＳＡ）中、１０分、３０００ｇで遠心分離する。

【００９９】かくして精製したＤＮＡ３μｌを、その付着末端を平滑末端に変換するため、
天然のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）の存在下
に処理する。この反応を、１０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２
ｍＭＭｇＣｌ₂、各ｄＮＴＰの１ｍＭ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡを含有する最終容量１０μｌ中で行い、反応混合物を５０μｌミネラルオイルでカバーし、３
０分、７２℃にてインキュベートし、次いで、この反応混合物の１μｌをベクタ
ー、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）と結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応に直接
使用する。

【０１００】この結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）混合物（１０μｌ）の全部を、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ′株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に転移するの
に使用する。組換えベクターを含む細菌を、アンピシリン２０μｇ／ｍｌ、メチ
シリン８０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地およびＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌ（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）の存在下、皿上で選択する。

【０１０１】形質転換の最後に、約１００クローンを得、それらをナイロンフィルター上に
転移し、下記文献に記載された条件に従って、プローブＳＯ１２で、分子コロニ
ーハイブリダイゼーション（ＧｒｕｎｓｔｅｉｎａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２，３９６１−３９６５，
１９７５）により、解析する。このスクリーニングで、組換えベクターｐＣＳ
ＰＰ１に存在する陽性クローンを単離することが可能である。このベクターは、
ベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）のＳｆｒＩ部位にクローンされ、オー
トラジオグラフィにより検出されるゲノムＤＮＡ断片を含有する。このＤＮＡは
、[アルファ−³⁵Ｓ]ｄＡＴＰの存在下、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｔ７シーケンシン
グキット）により定義されたプロトコールに従って、配列を決定する。それは、
ＨｉｎｃＩＩ制限部位により各末端が縁取られた、核酸配列、配列番号３の最後
の１７１７塩基対を含む。それは、貯蔵タンパク質αβをコードする遺伝子の翻
訳開始のためのコドンの上流に７５０塩基対およびこの核遺伝子の最初の９６８
塩基対を含有している。この遺伝子は多重遺伝子族に属するという事実から、以
下ＣＳＰ１と称する。

【０１０２】ＣＳＰ１遺伝子の部分配列は、同じサイズ（１１１ｂｐ）の２つのイントロン
の存在が示され、第１のものは、核酸配列、配列番号３のヌクレオチド２８１１
−２９２１の間に、第２のものは、ヌクレオチド３２３９−３３４９の間にそれ
ぞれ位置している。これら２つのイントロンは、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓｔｈａｌｉａｎａにおいて観察されたものよりは小さなサイズを有するが、
一方で、この植物において見られたのと同じ場所に位置している（Ｐａｎｇら、
ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，８０５−８２０）。

【０１０３】ｂ）逆ＰＣＲ反応２：一次スクリーニング核酸配列、配列番号３のＨｉｎｃＩＩ部位（位置１７６３）の上流に位置する
核酸配列を得るために、今回、プラスミドｐＣＳＰＰ１に前以てクローニングし
た配列から推理し、そして核酸配列、配列番号１０および配列番号１１をそれぞ
れ有する、合成オリゴヌクレオチドＳＯ１６およびＳＯ１７を使用して、別の逆
ＰＣＲ反応を行う。

【０１０４】この逆ＰＣＲ反応は、以下のパラメーター：オリゴヌクレオチドの付着は５７
℃で行い、３５重合化サイクルを行った、ことを除き、逆ＰＣＲ反応１で記載さ
れたのと同じ条件下で行う。

【０１０５】上記で定義したように、このＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動ゲル
上で分離された後、分子ハイブリダイゼーションにより解析され、そしてナイロ
ン膜上に転移される。この膜を、６ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｔ（０．２％Ｆ
ｉｃｏｌｌ、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ＢＳＡ分画ＩＶ）および
変性サケ精子ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌを含む溶液中で４時間、６５℃でプレハイブ
リダイズし、次いでプローブＳＯ１０１６と共に同じ溶液中で１０時間、６５℃
にてハイブリダイズする。

【０１０６】このプローブは、ベクターｐＣＳＰＰ１の０．１ｎｇの存在下、５０ｍＭＫ
Ｃｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ各オリゴヌクレ
オチド（ＳＯ１０およびＳＯ１６）、およびＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，ＵＳＡ）３単位を含む最終容量５０μｌ中で、上記した合成オリゴヌ
クレオチドＳＯ１０およびＳＯ１６を使用してＰＣＲにより実際合成される。反
応混合物をミネラルオイル５０μｌでカバーし、３０サイクル（９４℃−３０秒
、４６℃−３０秒、７２℃−２分）、次いで最終延長サイクル７２℃、７分、イ
ンキュベートする。増幅後得られた断片（６９８ｂｐ）は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ
１００カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ）で精製し、この断片５０ｎｇを、
Ｍｅｇａｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）プロトコールに従って、
[アルファ−³²Ｐ]ｄＣＴＰの５０μＣｉと共に、ランダムプライマー伸長法によ
り標識する。

【０１０７】ハイブリダイゼーションの後、膜を２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ、１ｘＳＳＣ
−０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳの存在下、連続して、
３０分、６５℃にて、３回洗滌し、オートラジオグラフィにより解析して、プロ
ーブＳＯ１０１６に結合する約１ｋｂのＤＮＡ断片を検出する。

【０１０８】制限酵素ＮｄｅＩで最初消化されたゲノムＤＮＡで、逆ＰＣＲ反応から誘導さ
れたこのＤＮＡは、次いで、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで処理され、上記した
ように、ベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）に結合する。この結合体は、
Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ′に形質転換するのに使用され、形質
転換体を選択し、上記した条件に従ってプローブＳＯ１０１６との分子ハイブリ
ダイゼーションにより解析する。このスクリーニングで、ベクターｐＣＳＰＰ２
を有する陽性クローンが単離される。期待したように、このベクターは、ハイブ
リダイゼーションにより前以て同定されたＤＮＡ断片のベクターｐＣＲ−Ｓｃｒ
ｉｐｔ（ＳＫ＋）のＳｆｒＩ部位にクローニングされている。ＮｄｅＩ制限部位
により各末端が縁取られている、核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１５１４
および２５２３の間のＤＮＡセグメントに相当し、そして、従って、ベクターｐ
ＣＳＰＰ１にクローニングされたゲノムＤＮＡ断片の上流に加わった２５０ｂｐ
を含んでいる、後者が配列決定される。

【０１０９】ｃ）逆ＰＣＲ反応２：二次スクリーニング核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１から１５１３をクローニングするため
、別の分子ハイブリダイゼーションを、逆ＰＣＲ反応２から誘導されたＤＮＡ断
片で行う。

【０１１０】これを行うために、ＳＯ１７２０という、使用するプローブを、ベクターｐＣ
ＳＰＰ２にクローニングしたコーヒー核ＤＮＡの配列から推測し、上記したオリ
ゴヌクレオチドＳＯ１７および核酸配列、配列番号１２を有するオリゴヌクレオ
チドＳＯ２０を使用し、ＰＣＲにより合成する。この反応を、プローブＳＯ１０
１６の合成で使われたと同じ条件下、但しオリゴヌクレオチドの付着温度は５０
℃で行う、においてベクターｐＣＳＰＰ２の０．１ｎｇで行う。増幅後に得た断
片（２６２ｂｐ）を上記により標識し、それを逆ＰＣＲ反応２をテストするプロ
ーブとして使用する。

【０１１１】プローブＳＯ１０１６と共に、逆ＰＣＲ反応２の産物のスクリーニングの間に
使用したナイロン膜は、０．２ＮＮａＯＨ−０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の存在
下、１５分間、３７℃にて２度洗滌して脱ハイブリダイズし、プレハイブリダイ
ズし、プローブＳＯ１７２０と、上記したようにしてハイブリダイズする。

【０１１２】このハイブリダイゼーションの終わりに、制限酵素ＤｒａＩで最初消化したゲ
ノムＤＮＡで逆ＰＣＲ反応２から誘導された、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片が検出
される。上記したように、このＤＮＡはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで処理され、
ベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）に結合し、そして完全な結合体をＥ．
ｃｏｌｉＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ′株に形質転換する。

【０１１３】形質転換体を、選択し、プローブＳＯ１７２０と共に分子ハイブリダイゼーシ
ョンによりスクリーニングする。かくして、ハイブリダイゼーションによって前
以て同定されたＤＮＡ断片のベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋）のＳｆｒ
Ｉ部位にクローニングされたベクターｐＣＳＰＰ３中に存在している陽性クロー
ンを単離することが可能である。ＤｒａＩ制限部位により各末端が縁取られた、
核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１および１８８６の間のＤＮＡセグメント
に相当する、後者が配列決定される。それは、それゆえ、ベクターｐＣＳＰＰ２
にクローニングされたゲノムＤＮＡ断片の上流に加えて１５１３塩基対を含んで
いる。

【０１１４】ｄ）ゲノムＤＮＡ断片のクローニング逆ＰＣＲ実験で、ゲノム中の非連続性ＤＮＡ断片を互いに結合することにより
、キメラリニア分子を形成する（Ｏｃｈｍａｎｅｔａｌ．，１９８８）。更
に、突然変異頻度の測定の結果、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼよりも約１２倍正確であり、ＰＣＲ増幅中の点突然変異の可能性を減
じることを示している（Ｌｕｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１０８，
１−６，１９９１）。

【０１１５】このような理由から、ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの存在下に
、Ｃ．ａｒａｂｉｃａ、Ｃａｔｕｒｒａ変種の天然ゲノムＤＮＡで行われる。こ
の反応は、１０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＴｒｉｓ− ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭＭｇＣｌ ₂ 、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭオリゴヌクレオチド、上記したＳＯ１０およびＳＯ２０およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ３
単位を含む最終容量５０μｌ中で、ゲノムＤＮＡ１０ｎｇの存在下で実行される
。オリゴヌクレオチドＳＯ１０は、ヌクレオチド２５１２および２５３４の間の
核酸配列、配列番号３のアンチセンス鎖に位置し、オリゴヌクレオチドＳＯ２０
は、ヌクレオチド１５６５および１５８４の間の核酸配列、配列番号３のセンス
鎖に位置する。反応混合物をミネラルオイル５０μｌでカバーし、４５サイクル
（９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−３分）、次いで最終延長サイクル
７２℃で７分間、インキュベートする。

【０１１６】このＰＣＲに続いて、単一断片が得られ、それをベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐ
ｔ（ＳＫ＋）にクローニングし、ベクターｐＣＳＰＰ４を得る。配列決定によっ
て、このゲノムＤＮＡ断片はオリゴヌクレオチドＳＯ１０とＳＯ２０の間の配列
に相当することが示される。このＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡは、以下に記載
する、ベクターの構築に使用する。

【０１１７】ＶＩＩ．Ｃｏｆｆｅａａｒａｂｉｃａの貯蔵タンパク質αβをコードする遺伝子のプロモーターの機能的解析に必要な遺伝的形質転換ベクターの構築核酸配列、配列番号３の２５１０に存在する、翻訳開始部位の上流に位置する
配列を、形質転換植物の豆において、レポーター遺伝子ｕｉｄＡの発現を調節す
る能力をテストするために、解析する。

【０１１８】これを行うため、バイナリー形質転換ベクター（ｂｉｎａｒｙｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）ｐＢＩ１０１（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，１０２０ＥａｓｔＭｅａｄｏｗＣｉｒｃｌ
ｅ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９４３０３−４２３０ＵＳ
Ａ）で、いくつかの構築を行った。このベクターは、β−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）をコードするレポーター遺伝子ｕｉｄＡ、およびネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼをコードする細菌の遺伝子ｎｐｔＩＩを有している。後者は、形
質転換植物においてカナマイシンに対する抵抗性を付与する。これら２つの遺伝
子は、この細菌に感染した植物のゲノムに伝達されることのできるＤＮＡ領域を
決定するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのプラスミドｐ
ＴｉＴ３７（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，８７１１−
８７２１，１９８４）のＴ−ＤＮＡの右端および左端により縁取られている。

【０１１９】ベクターｐＢＩ１０１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、供給者により決められ
たプロトコールに従い仔ウシアルカリ性ホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳ
Ａ）処理により脱リン酸化する。

【０１２０】次に、ベクターｐＣＳＰＰ４の存在下ＰＣＲにより得た異なったサイズのＤＮ
Ａ断片、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ断片、および核酸配列、配列番号
１３の５′末端に含まれる２つの合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ断片、をベク
ターｐＢＩ１０１にクローニングする。この配列は、ＰＣＲ産物をベクターｐＢ
Ｉ１０１に同じ酵素で直線化してクローニングさせるＢａｍＨＩ制限部位を含む
。

【０１２１】一方では、プロモーターに結合できる合成オリゴヌクレオチド、他方では、核
酸配列、配列番号１４を有するオリゴヌクレオチドＢＡＧＵＳを使用する。後者
の使用は、制限酵素ＢａｍＨＩでＰＣＲ産物を消化した後、コーヒー豆の貯蔵タ
ンパク質αβの初めの５アミノ酸と得られるβ−グルクロニダーゼのＮ末端の間
を翻訳融合を可能にする。

【０１２２】ａ）ｐＣＳＰＰ５の構築ＰＣＲ反応を、１０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、核酸配列、配列番号１５を有する０．２５μＭオリゴヌクレオチドＵＰ２１０、および核酸配列
、配列番号１４を有するＢＡＧＵＳ、およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ３単位を
含む容量５０μｌ中で、プラスミドｐＣＳＰＰ４の５ｎｇと共に行う。反応混合
物を、ミネラルオイル５０μｌでカバーし、３０サイクル（９４℃−３０秒、５
５℃−３０秒、７２℃−２分）、次に最終延長サイクルを７２℃で７分間インキ
ュベートする。

【０１２３】約９５０ｂｐのＰＣＲ断片を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００カートリッジ（Ａｍ
ｉｃｏｎ，ＵＳＡ）で精製し、ＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）で１２時
間、３７℃にて消化し、供給者により提供された推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）の存在下、直線化ベクターｐＢＩ１０１に結合
する。次に、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ′株を完全な連結反応混
合物（ｌｉｇａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅ）と共に形質転換する。プラスミドを
、いくつかの形質転換体から個別に抽出し、バイナリーベクターにおいてＰＣＲ
断片の配位を決定するために配列決定する。この解析で、プラスミドｐＣＰＰ５
を選択することが可能となる。

【０１２４】ｂ）ｐＣＳＰＰ６の構築このベクターの構築は、オリゴヌクレオチドＵＰ２１０を、核酸配列、配列番
号１６を有するオリゴヌクレオチドＵＰ２１１で置換する他は、ベクターｐＣＳ
ＰＰ５について記載したと同様にして行う。ベクターｐＢＩ１０１に正確に配位
している、ＰＣＲ産物（約７００ｂｐ）のクローニングは、ベクターｐＣＳＰＰ
６を与える。

【０１２５】ｃ）ｐＣＳＰＰ７の構築このベクターの構築は、オリゴヌクレオチドＵＰ２１０を、核酸配列、配列番
号１７を有するオリゴヌクレオチドＵＰ２１２で置換する他は、ベクターｐＣＳ
ＰＰ５について記載したと同様にして行う。ベクターｐＢＩ１０１に正確に配位
している、ＰＣＲ産物（４５０ｂｐ）のクローニングは、ベクターｐＣＳＰＰ７
を与える。

【０１２６】ｄ）ｐＣＳＰＰ８の構築このベクターの構築は、オリゴヌクレオチドＵＰ２１０を、核酸配列、配列番
号１８を有するオリゴヌクレオチドＵＰ２１３で置換する他は、ベクターｐＣＳ
ＰＰ５について記載したと同様にして行う。ベクターｐＢＩ１０１に正確に配位
している、ＰＣＲ産物（２５０ｂｐ）のクローニングは、ベクターｐＣＳＰＰ８
を与える。

【０１２７】ＶＩＩＩ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの形質転換上記のベクター（ｐＣＳＰＰ５−８）、ならびにプラスミドｐＢＩ１０１およ
びｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、個別に、Ａｎら（ＰｌａｎｔＭｏｌ
．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕｅｌ，Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔａｎｄ
ＶｅｒｍａＥｄｓ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓＤｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，Ａ３，１−１９，１９
９３）によって記載された、直接形質転換法に従って、無処置の（ｄｉｓａｒｍ
ｅｄ）ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＣ５８ｐＭＰ９
１０株（Ｋｏｎｃｚ及びＳｃｈｅｌｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４，
３８３−３９６，１９８６）に導入する。各形質転換に対して、組換えＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓクローンを、カナマイシン（５０
μｇ／ｍｌ）およびリファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地で選
択する。

【０１２８】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに導入されたプラスミ
ドの構造をチェックするため、Ａｎら（１９９３）により記載された急速ミニ調
製技術により抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ′株に逆形質転
換（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の後、制限地図法（ｒｅ
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇ）により解析する。

【０１２９】プラスミドｐＢＩ１０１においては、プロモーターを欠いているので遺伝子ｕ
ｉｄＡは沈黙している。対照的に、この同じ遺伝子が、ベクターｐＢＩ１２１で
形質転換された植物においては発現する、なぜなら構成ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．ＥＭＢＯ，６，３９０１
−３９０７，１９８７）の制御下にあるからである。これらの２つのプラスミ
ドはレポーター遺伝子ｕｉｄＡの発現の陰性および陽性対照としてそれぞれ使用
された。

【０１３０】ＩＸ．Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍの形質転換および再生Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｖａｒ．ＸＨＦＤ８の形質転換は、
Ｈｏｒｓｃｈら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕｅｌ，Ｇｅｌｖｉｎ
，ＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔａｎｄＶｅｒｍａＥｄｓ，ＫｌｕｗｅｒＡ
ｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＤｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ，Ａ５，１−９，１９９３）により記載されたプロトコールに従
って、上に記したベクター（ｐＣＳＰＰ５−８、ｐＢＩ１０１およびｐＢＩ１２
１）で行う。

【０１３１】これを行うため、ｉｎｖｉｔｒｏで発芽した苗木の葉のディスクを、６００
ｎｍでＯＤ測定値が０．２と０．３の間に得られるようにした、０．９％ＮａＣ
ｌ溶液で稀釈したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの形質
転換定常期培養で約２分間インキュベートする。３ＭＭペーパー（Ｗｈａｔｍａ
ｎｎ）で乾燥し、選択圧をかけないで、ＭＳ−ｓｔｅｍ培地（ＭＳ塩４．３ｇ／
ｌ、しょ糖３０ｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／ｌ、チア
ミン１０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１ｍｇ／ｌ、ピリドキシン１ｍｇ／ｌ、ナフタレ
ン酢酸（ＮＡＡ）０．１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン（ＢＡ）１ｍｇ／ｌ）（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ１５，
４７３−４９７，１９６２）で培養箱中でインキュベートする。

【０１３２】３日後、ディスクを、カルスを得るように、形質転換細胞を繁殖させるため、
カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびセフォタキシム（４００μｇ／ｍｌ）
を補充したＭＳ培地に移す。これらディスクを毎週新鮮な「ＭＳ−ｓｔｅｍ」培
地で継代培養する。

【０１３３】２１から２８日後に、発芽した芽をカルスから切り出し、標準ＭＳ培地、即ち
植物ホルモン不含有、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびセフォタキシム
（２００μｇ／ｍｌ）を補充したＭＳ培地、で継代培養する。ペトリ皿に発根し
た後、苗木をピートおよびコンポストからなる培養基の陶製ポットに移植し、温
度２５℃、光周期１６時間で温室で生育させる。各形質転換実験で、３０苗木（
Ｒ０世代）を選択する。これら全ての苗木は、形態的に正常であり、繁殖力があ
ることが証明された。それらは自家受粉し種子を与えた（Ｒ１世代）。

【０１３４】Ｘ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換したタバコ植物のゲノムＤＮＡの解析トランスジェニックタバコ植物のゲノムＤＮＡを、ＲｏｇｅｒｓａｎｄＢ
ｅｎｄｉｃｈ（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕｅｌ，Ｇｅｌｖｉｎ，
ＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔａｎｄＶｅｒｍａＥｄｓ，ＫｌｕｗｅｒＡｃ
ａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＤｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓ，Ａ６，１−１１，１９９３）により記載されたプロトコールに従
って、葉から抽出し、そしてＰＣＲおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ−Ｂｌｏｔ技術に従
って分子ハイブリダイゼーションによって解析する。

【０１３５】ＰＣＲ反応は、50ｍM KCｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ３単位、後の配列表に記載される配列番号１９を有す
る、オリゴヌクレオチドＢＩ１０４の０．２５μＭ、および後の配列表に記載さ
れる配列番号２０を有する、オリゴヌクレオチドＢＩ１０５の０．２５μＭ、を
含有する５０μｌの最終容量中のＤＮＡ１０ｎｇで行う。オリゴヌクレオチドＢ
Ｉ１０４はプラスミドｐＢＩ１０１のＢａｍＨＩ部位の２７ｂｐ下流に位置し、
オリゴヌクレオチドＢＩ１０５はプラスミドｐＢＩ１０１のＢａｍＨＩ部位の７
３ｂｐ上流に位置している。ＰＣＲ反応は、３０サイクル（９４℃−３０秒、５
４℃−３０秒、７２℃−２分）まで、次いで７分、７２℃（最終延長）で行う。

【０１３６】プラスミドｐＢＩ１０１（陰性対照）、ｐＢＩ１２１（陽性対照）、ｐＣＳＰ
Ｐ５、ｐＣＳＰＰ６、ｐＣＳＰＰ７およびｐＣＳＰＰ８で形質転換したトランス
ジェニックタバコ植物から増幅したＤＮＡ断片は、それぞれ、分子量、約２８０
ｂｐ、１０３０ｂｐ、１２３０ｂｐ、９８０ｂｐ、７３０ｂｐおよび４３０ｂｐ
を有している。全ての場合において、レポーター遺伝子ｕｉｄＡの上流に最初に
クローニングした断片は無傷であることが結論づけられる。

【０１３７】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共に形質転換したタ
バコ植物からのＤＮＡ１０μｇをＢａｍＨＩで消化する。次に、得られた制限断
片を、アガロースゲル（１％）で電気泳動により分離し、ＤＮＡを、プローブｕ
ｉｄＡおよびプローブｎｐｔＩＩで個別にハイブリダイズする前に、ナイロンフ
ィルター上に転移する。

【０１３８】プローブｕｉｄＡは、後の配列表に記載する配列番号２１を有する、合成オリ
ゴヌクレオチドＧＭＰ１、および後の配列表に記載する配列番号２２を有する、
合成オリゴヌクレオチドＧＭＰ２を用いて、ベクターｐＢＩ１０１の０．１ｎｇ
の存在下で、50ｍM KCｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ各オリゴヌクレオチドおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，ＵＳＡ）３単位、を含有する最終容量５０μｌで、ＰＣＲにより合成
される。反応混合物を、ミネラルオイル５０μｌでカバーし、３０サイクル（９
４℃−３０秒、４６℃−３０秒、７２℃−２分）、次いで７２℃で７分間、１サ
イクル、インキュベートする。

【０１３９】プローブｎｐｔＩＩは、後の配列表に記載する配列番号２３を有する、合成オ
リゴヌクレオチドＮＰＴＩＩ−１、および後の配列表に記載する配列番号２４を
有する、合成オリゴヌクレオチドＮＰＴＩＩ−２を用いて、ベクターｐＢＩ１０
１の０．１ｎｇの存在下で、50ｍM KCｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ各オリゴヌクレオチドおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）３単位、を含有する最終容量５０μｌで、Ｐ
ＣＲにより合成される。反応混合物を、ミネラルオイル５０μｌでカバーし、３
０サイクル（９４℃−３０秒、４６℃−３０秒、７２℃−２分）、次いで７２℃
で７分間、１サイクル、インキュベートする。

【０１４０】これらの２つのプローブを精製し、テストＶＩに前記したようにして標識する
。

【０１４１】各プローブについて得られたハイブリダイゼーションプロフィールを、Ｔ−Ｄ
ＤＮＡの一重非再配列コピーであるゲノムに集積されている、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共に形質転換したタバコ植物を選択する
ために、比較する。これら植物の選択は、また、これら植物のＲ１種子が標準Ｍ
Ｓ培地においてｉｎｖｉｔｒｏで発芽した後、カナマイシン抵抗性の性質の分
離を解析した結果により確認される。実際、この場合、カナマイシン抵抗性々状
の３／４−１／４の分離が観察され、このことは、核ＤＮＡの単一座におけるＴ
−ＤＮＡの集積に適合している。

【０１４２】ＸＩ．コーヒープロモーターの機能的性質およびトランスジェニックタバコ植物におけるその誘導体の研究本研究はＲ０世代植物およびＲ１世代成熟種子で実施される。

【０１４３】ＧＵＳ活性の測定は、それゆえ、基質としてＭＵＧ（メチル−ウンベリフェリ
ル−グルクロニド）を用い、蛍光定量法により、ＭＵ（メチルウンベリフェロン
）の出現を測定することにより、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）により記載
された方法に従って、葉および種子で実施する。これを行うため、葉の外植片（
１０ｍｇ）および種子（約４０）を、抽出バッファー（５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄ 、ｐＨ７．０、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）３
００μｌ中で、滅菌砂で粉末化する。細胞の砕片を１５分間、４℃で遠心分離に
より除き、上清中の可溶性タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ（ＵＳＡ）により定義さ
れたプロトコールに従い標準としてＢＳＡを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４，１９７６）により定量する
。ＧＵＳ活性の測定は、反応バッファー（１ｍＭＭＵＧ含有抽出バッファー）
１５０μｌ中可溶性タンパク質１μｇを用いて、３７℃にてインキュベートして
、マイクロプレートで実施する。タンパク質のｐモルＭＵ／分／ｍｇで表わされ
る蛍光測定は、励起波長３６５ｎｍおよび発光波長４５５ｎｍ（Ｆｌｕｏｒｏｓ
ｋａｎＩＩ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）で行う。

【０１４４】後の図１に示したように、ＧＵＳ活性の測定結果は、プラスミドｐＢＩ１０１
のＴ−ＤＮＡを含む植物の葉および種子には、酵素活性は見出されないことを示
している。別の形質転換実験のおいて、同じ遺伝子構造で形質転換されたトラン
スジェニック植物の各々の間で観察されるＧＵＳ活性の相異は、ゲノムへのＴ−
ＤＮＡのランダム集積による位置効果により説明することができる（Ｊｏｎｅｓ
ら、Ｊ．ＥＭＢＯ，４，２４１１−２４１８，１９８５）。構造ｐＢＩ１２
１を含有する植物は、タンパク質のＭＵ／分／ｍｇの１５００と２０，０００ｐ
ｍｏｌの間のグルクロニダーゼ活性を有している。これら同じ植物に対して、種
子および葉を使用して行われたＧＵＳ比活性の測定値間で、有意な差は見られな
かった。これらの観察結果は、植物におけるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの構
成的特性を確認するものである（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ３１３，８１
０−８１２，１９８５）。

【０１４５】結果の解析は、プラスミド構成、ｐＣＳＰＰ５、ｐＣＳＰＰ６、ｐＣＳＰＰ７
およびｐＣＳＰＰ８のＴ−ＤＮＡを個々に含有する植物の葉で測定されたＧＵＳ
活性は零であることを示している。一方、ｐＣＳＰＰ５、ｐＣＳＰＰ６、ｐＣＳ
ＰＰ７およびｐＣＳＰＰ８のＴ−ＤＮＡを個々に含有するこれら同じ植物の種子
で測定されたＧＵＳ活性は、プラスミドｐＢＩ１２１で形質転換された植物の種
子で測定された平均ＧＵＳ活性よりも、それぞれ、６０、６０、３０および１２
倍高い。ｕｉｄＡ遺伝子の最大発現がベクターｐＣＳＰＰ５およびｐＣＳＰＰ６
で得られ、タンパク質のＭＵ／分／ｍｇの平均４６５ｎｍｏｌに達する値が観察
されている。この観察結果から、配列番号３のヌクレオチド１５７２（配列番号
１５の５′末端）および１８１５（配列番号１６の５′末端）の間のＤＮＡ断片
は、コーヒープロモーターの機能において臨界的な配列を含んでいない、ことが
結論される。

【０１４６】プロモーター（ベクターｐＣＳＰＰ７およびｐＣＳＰＰ８に相当する）におい
て起こる最も本質的な欠失は、結論として、より大きな、より本質的な欠失であ
る、ｕｉｄＡレポーター遺伝子の発現レベルにおける減少である。一方、解析さ
れた全てのトランスジェニック植物において、ｕｉｄＡレポーター遺伝子は種子
中で特異的に発現し続けているので、それらの欠失はいずれの場合においても、
プロモーターの発現の特異性の喪失を導くことはない。

【０１４７】ＧＵＳ活性の測定は、後の配列表に記載される配列番号３のヌクレオチド１５
７２と２５２４の間のコーヒーＤＮＡ配列は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターと
比較してタバコ種子中の非常に強いプロモーターのように機能するプロモーター
を、効果的に含んでいることを示している。また、この同じＤＮＡ配列、および
それから誘導される欠失を含めた配列は、トランスジェニックタバコ植物の種子
中のｕｉｄＡレポーター遺伝子の発現を、全ての場合においてレファレンスプロ
モーターＣａＭＶ３５Ｓにより付与されるよりも大きなレベルで、指示するに必
要かつ充分である情報を含んでいることが観察された。

【０１４８】ＸＩＩ．大腸菌におけるコーヒー１１ｓ貯蔵タンパク質の発現大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるコーヒー１１ｓタンパ
ク質を過剰発現および精製するために、配列番号１のヌクレオチド１０８と１５
１７の間のＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を、配列番号２５を有する、オリゴヌクレオ
チドＴＡＧ１および配列番号２６を有する、オリゴヌクレオチドＴＡＧ２、の助
けを借りて行う。これら２つの配列は後の配列表に記載されている。これら２つ
のオリゴヌクレオチドは、独特なＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位を、ＰＣＲで増
幅されたコーヒー配列中に導入することができる。それらは、また、コーヒー貯
蔵タンパク質をコードするコーヒーＤＮＡ配列であるが、しかし、配列番号２の
アミノ酸１と２６の間の「シグナルペプチド」と呼ばれている、細胞のアドレス
を決める配列を欠いている、配列を増幅することを可能ならしめる。この戦略は
、非常に疎水性の配列を含んでいるタンパク質の、大腸菌における過剰発現によ
る毒性効果を限定するために行われた。

【０１４９】この反応は、ベクターｐＣＳＰ２の５０ｎｇの存在下、ＰｗｏＤＮＡポリメ
ラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）１．５単位、１０ＸＰｗ
ｏＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
）１０μｌ、各ｄＮＴＰの０．１ｍＭおよび各オリゴヌクレオチド、ＴＡＧ１お
よびＴＡＧ２、の２ｎＭ、を含む最終容量１００μｌで実行される。反応混合物
は、３０サイクル（９４℃−３０秒、４０℃−６０秒、７２℃−２分）、次いで
最終延長サイクルを、７２℃で７分間、インキュベートする。ＰＣＲ混合物の３
０μｌを、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＵＳＡ）により提供された推奨に従って制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化する。

【０１５０】ＰＣＲで増幅したコーヒーＤＮＡ断片（１４００ｂｐ）を、０．８％アガロー
スゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ
Ｉｎｃ，９６００ＤｅＳｏｔｏＡｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ９１３１１，ＵＳＡ）の推奨に従って精製した。それを、前以て、酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、仔ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ処理によ
り脱リン酸化した、発現ベクターｐＱＥ３１（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）に結合し
た。発現ベクターｐＱＥ３１の使用は、コーヒー１１ｓ貯蔵タンパク質のＮ−末
端の相に６つのヒスチジン（６Ｈｉｓｔａｇ）を導入することを可能ならし
め、Ｎｉ²⁺イオンを有するＮｉ−ＮＴＡ樹脂のカラムを通して、この組換えタン
パク質の精製を容易にする（Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ，４１１，１７７−１８４，１９８７）。

【０１５１】連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）混合物は、Ｑｉａｇｅｎ（ＵＳＡ）により提供
された推奨に従って大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）株のコンピテント細胞に形質転
換するのに使用され、そして組換え細菌はカナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地で皿上において選択される。

【０１５２】大腸菌で、コーヒー１１ｓ貯蔵タンパク質の発現をテストするために、上記に
指示した抗生物質を補充した液体ＬＢ培地５０ｍｌで、ＯＤ６００ｎｍ＝１が得
られるまで、細菌を培養する。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるよう培地に加え
て誘導を行い、培養サンプルを毎３０分ごとに採取する。細菌を溶解し、可溶性
タンパク質を変性条件下で大腸菌から抽出する。これらのタンパク質を、Ｑｕｉ
ａｇｅｎにより決められたプロトコールに従ってＮｉ−ＮＴＡ樹脂カラムで分離
する（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｓｙｓｔｅｍ）。連続的に溶出するタンパク質分
画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析する。Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合する
ことができるタンパク質だけが、コーヒー１１ｓ組換えタンパク質に相当するこ
とが示された。このタンパク質は、およその分子量５５ｋＤａで、大腸菌におい
て発現され、それは前駆体の形で貯蔵タンパク質としてコーヒー豆中に見出され
、発現ベクターの構築中に行われたタンパク質配列の修飾を考慮すると、一致し
ている。

【０１５３】配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：ソシエテデプロデユイネツスル（Ｂ）街：ネッスル通り５５（Ｃ）市：ヴェヴェイ（Ｄ）州：ヴォード（Ｅ）国：スイス（Ｆ）郵便番号：１８００（Ｇ）電話番号：０２１／９２４３４２０（Ｈ）テレファックス：０２１／９２４２８８０（ｉｉ）発明の名称：コーヒータンパク質（ｉｉｉ）配列の数：２６（ｉｖ）コンピューター読みとり形式（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．３０（ＥＰＯ）

【０１５４】（２）配列番号：１に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１７０６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３３．．１５０８（ｘｉ）配列：配列番号：１：

【化１】

【化２】

【化３】

【０１５５】（２）配列番号：２に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：４９２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号：２：

【化４】

【化５】

【０１５６】（２）配列番号：３に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３４７７塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：プロモーター（Ｂ）存在位置：１．．２５０９（ｘｉ）配列：配列番号：３：

【化６】

【化７】

【０１５７】（２）配列番号：４に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「ヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：４： GCNGAYGTNT TYAAYCC 17

【０１５８】（２）配列番号：５に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：５： AAACATTGGC CTCCCCC 17

【０１５９】（２）配列番号：６に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１９塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：６： ccaaacatca aacttctcg 19

【０１６０】（２）配列番号：７に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：７： GAGAAATCAT ATGAGAGTGA GCC 23

【０１６１】（２）配列番号：８に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：８： TTCTTTTGTT CCTCGGCTGT TTG 23

【０１６２】（２）配列番号：９に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：９： GTGAGCCATT CTCTGAC 17

【０１６３】（２）配列番号：１０に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１０： AGTTTGATCC AACATGGATT GGC 23

【０１６４】（２）配列番号：１１に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１１： GCAAGAAACC TAATAATGAC ATGG 24

【０１６５】（２）配列番号：１２に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１２： CCTCTTTTCT TTTGGAGTAC 20

【０１６６】（２）配列番号：１３に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１２塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１３： cgcggatccg cg 12

【０１６７】（２）配列番号：１４に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３３塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１４： CGCGGATCCG CGATGAGAGT GAGCCATTCT CTG 33

【０１６８】（２）配列番号：１５に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３５塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１５： CGCGGATCCG CGCCTCTTTT CTTTTGGAGT ACAAG 35

【０１６９】（２）配列番号：１６に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１６： CGCGGATCCG CGTAGGTTTC TTGCTCTATC TTTTAG 36

【０１７０】（２）配列番号：１７に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１７： CGCGGATCCG CGGTGCTAGA AACTTAAAAG CAGAAG 36

【０１７１】（２）配列番号：１８に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１８： CGCGGATCCG CGACAAAAGA TTGAACAATA CATGTC 36

【０１７２】（２）配列番号：１９に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：１９： TTTGATTTCA CGGGTTGGGG TTTCTACAGG 30

【０１７３】（２）配列番号：２０に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２０： GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG 30

【０１７４】（２）配列番号：２１に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２１： ATGTTACGTC CTGTAGAA 18

【０１７５】（２）配列番号：２２に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２２： GCAAAGTCCC GCTAGTGC 18

【０１７６】（２）配列番号：２３に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２３： CTGGATCGTT TCGCATG 17

【０１７７】（２）配列番号：２４に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：１６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２４： CCAGAGTCCC GCTCAG 16

【０１７８】（２）配列番号：２５に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２５： ACTAGGGGAT CCACAGCCAA GGCTCAGGGG 30

【０１７９】（２）配列番号：２６に関する情報（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：その他の核酸（Ａ）種類：／記載＝「オリゴヌクレオチド」（ｘｉ）配列：配列番号：２６： GTACTCTGCA GACATAATTA GCTCAAGCAA CTTCCC 36

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＴＲ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列番号２の少なくとも２０の連続したアミノ酸を
コードする、コーヒー豆から誘導されたＤＮＡ。
【請求項２】アミノ酸配列、配列番号２を有する貯蔵タンパク質αβ、ア
ミノ酸１から３０４によって、アミノ酸配列、配列番号２において範囲を設定さ
れた開裂タンパク質α、およびアミノ酸３０５から４９２によって、アミノ酸配
列、配列番号２において範囲を設定された開裂タンパク質β、を含む群から選択
された、少なくとも１つのタンパク質をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】核酸配列、配列番号１のヌクレオチド３３から１５０８、３
３から９４４および／または９４５から１５０８により範囲を設定された配列、
あるいはこれらの配列に相同な任意の核酸配列、である請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】アミノ酸配列、配列番号２の少なくとも２０の連続したアミ
ノ酸を有する、コーヒー豆から誘導された組換え貯蔵タンパク質。
【請求項５】アミノ酸配列、配列番号２（貯蔵タンパク質αβ）、配列番
号２のアミノ酸１から３０４によって範囲を設定された配列（貯蔵タンパク質α
）、配列番号２のアミノ酸３０５から４９２によって範囲を設定された配列（貯
蔵タンパク質β）、またはこれらの配列に相同な任意のアミノ酸配列、を有する
請求項４記載の貯蔵タンパク質。
【請求項６】それらが、独立して、あるいは互いに重合していることを特
徴とする、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】請求項５記載の貯蔵タンパク質の転写を調節することができ
る、核酸配列、配列番号３のヌクレオチド１から２５０９によって範囲を設定さ
れたＤＮＡの全部または１部。
【請求項８】植物に関係した遺伝子の発現を指示する、請求項７記載のＤ
ＮＡの全部または１部の使用。
【請求項９】ＰＣＲを実行するためのプライマーとしての、あるいは少な
くとも１つの貯蔵タンパク質をコードする少なくとも１つのコーヒー豆遺伝子を
ｉｎｖｉｔｒｏで検出するための、またはｉｎｖｉｖｏで修飾するためのプ
ローブとしての、少なくとも１０ｂｐの、配列番号１のヌクレオチド３３から１
５０８、もしくはその相補鎖によって範囲を設定されたＤＮＡの全部または１部
の使用。
【請求項１０】請求項５記載の組換え貯蔵タンパク質を発現することがで
きる組換え植物細胞。
【請求項１１】請求項１０記載の植物細胞からなる植物または種子。
【請求項１２】請求項１から３の１項に記載のＤＮＡ、または請求項４か
ら６の１項に記載の組換えタンパク質を含む、食品、化粧料または医薬品組成物
。