JP2001518795A

JP2001518795A - 植物種子脂質組成の改変のためのヒマワリアルブミン５’調節領域

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Publication number: JP2001518795A
Application number: JP54314098A
Authority: JP
Inventors: トーマス，テリイ・エル; ビアマンド，フイリツプ・デイー; ナンバーグ，アンドリユー・エヌ
Original assignee: ローヌ−プーラン・アグロ
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2001-10-16
Also published as: CN1259169A; ZA983039B; EP1007710A1; CO4790115A1; WO1998045460A1; AU6963498A; BR9807966A; CA2285707A1; US5959175A; AR012398A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒマワリアルブミン遺伝子の５’調節領域を対象とする。かかる５’調節領域は、異種遺伝子のコード配列あるいは天然植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに作動可能に連結したとき、植物の種子においてコード配列あるいは相補的配列の発現を指令する。調節領域は、植物の形質転換のための発現カセットおよび発現ベクターにおいて有用である。また当該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子のような異種遺伝子あるいは天然植物遺伝子のレベルを変化させる方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】植物種子脂質組成の改変のためのヒマワリアルブミン５’調節領域発明の背景種子油の含量は伝統的に植物育種によって改変されてきた。種子油の組成を変化させるために組換えＤＮＡテクノロジーを使用することにより、この工程を加速することができ、一部の場合には、育種だけでは実現できないような方法で種子油を変化させることができる。Ｂｒａｓｓｉｃａ（アブラナ属）の油組成は、たくさんの脂質代謝遺伝子の発現を改変することによって大きく変化した。種子油組成のそのような操作は、内在性成分の脂肪酸の比率を変えることに集中してきた。たとえば、トランスジェニックナタネにおける△１２−デサチュラーゼ遺伝子のアンチセンス抑制はオレイン酸を８３％まで増加させた。Ｔｏｐｆｅｒら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：６８１−６８６。宿主植物がそれまでは合成することのできなかった脂肪酸を産生できる新しい遺伝子を導入することにより、トランスジェニック植物において種子油の組成を改変するという試みのいくつかは成功を収めている。ＶａｎｄｅＬｏｏら（１９９５Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９２：６７４３−６７４７）は、トランスジェニックタバコに △１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入して、新しい脂肪酸であるリシノール酸をその種子油に導入することができた。ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写がカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下で行われたようなコンストラクトを持つ植物においてはその蓄積はそれほど多くなかったことが報告されている。同様に、コリアンダー由来のアシル−ＡＣＰデサチュラーゼを発現することによって、低いレベルのペトロセリン酸を生産するようにタバコ植物が組換えられた(Ｃａｈｏｏｎら、１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８９：１１１８４−１１１８８)。長鎖脂肪酸（Ｃ１８以上）は、栄養的および医学的に重要な食品として、また工業製品として重要な経済的価値を持つ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ，Ｊ．Ｂ．１９９４ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：８２１−８２６）。リノール酸（１８：２ △９，１２）およびα−リノレン酸（１８：３ △９，１２，１５）は多くの種子油に認められる必須脂肪酸である。油料種子作物において、育種とバイオテクノロジーを通してこれらの脂肪酸のレベルが操作されてきた（Ｏｈｌｒｏｇｇｅら、１９９１Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０８２：１ −２６；Ｔｏｆｐｅｒら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：６８１−６８６）。さらに、種子油における新規脂肪酸の産生はヒトの保健衛生および工業適用において非常に有用となりうる。 γ−リノレン酸（ＧＬＡ）（１８：３ △６，９，１２）に富む植物油の消費は、冠状動脈心臓病への罹病性と相関する高コレステロール血症やその他の関連臨床疾患を軽減すると考えられている（ＢｒｅｎｎｅｒＲ．Ｒ．１９７６Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５−１０１）。食物ＧＬＡの治療上の有用性は、そのプロスタグランジン合成の前駆物質としての役割から生じると考えられる。（Ｗｅｅｔｅ，Ｊ．Ｄ．１９８０ｉｎＬｉｐｉｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＦｕｎｇｉａｎｄＯｔｈｅｒＯｒｇａｎｉｓｍｓ，編集ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ．５９−６２）。リノール酸（１８：２）（ＬＡ）は、△６−デサチュラーゼ酵素によってγ−リノレン酸（１８：３）（ＧＬＡ）に変換される。前駆物質であるリノレン酸の高い含量にもかかわらず、ＧＬＡを含有する種子油は少ない。これは、ほとんどの植物で△６−デサチュラーゼ活性がないことによる。たとえばルリヂシャ（Ｂｏｒａｇｏｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ）、およびスグリ（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ）はかなりの量のリノレン酸を産生する。これら３つの種のうちで、ＯｅｎｏｔｈｅｒａとルリヂシャだけがＧＬＡの商業的供給源として栽培されている。異種生物由来の△６−デサチュラーゼ遺伝子を導入することによって多量のＧＬＡを産生するように栽培種子油を改変することができれば有益であろう。また、脂肪酸合成と脂質代謝に関連する他の発現産物を、特定の発現産物の商業的生産が可能になるような高いレベルで、植物において産生することができれば有用であろう。米国特許第５，５５２，３０６号に開示されているように、最近、シアノバクテリア由来の△⁶−デサチュラーゼ遺伝子が分離された。トランスジェニックタバコにおけるこのシアノバクテリア由来の遺伝子の発現は、有意ではあるが低いレベルでのＧＬＡ蓄積を生じさせた（Ｒｅｄｄｙら、１９９６ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９−６４２）。出願者の共同審査中の米国特許願通し番号第０８，３６６，７７９号は、Ｂｏｒａｇｏｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ植物から分離した△６−デサチュラーゼ遺伝子及び、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でのタバコにおける該遺伝子の発現を開示している。そのような発現は、種子中で、有意であるが低いレベルのＧＬＡおよびオクタデカテトラエン酸（ＯＤＴＡまたはＯＴＡ）の蓄積をもたらすにすぎない。従って、植物において機能し、トランスジェニック植物種子において脂質代謝遺伝子の高いレベルの発現を一貫して指令するプロモーターが必要とされている。ヒマワリの胚芽は２つの主要な種類の貯蔵蛋白を蓄積する。これらは、１ＭＮａＣｌに可溶性の１１Ｓグロブリンと水溶性の２Ｓアルブミンである（Ｙｏｕｌｅら、１９８１ＡｍＪ．Ｂｏｔ６８：４４−４８）。２Ｓアルブミン種子蛋白の合成、プロセシングおよび蓄積は、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（Ｃｒｏｕｃｈら、１９８３Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ・２：２７３−２８４；Ｅｒｉｃｓｏｎら、１９８６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１４５７６−１４５８１）、エンドウ豆（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８６ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３７−４５）、ラディッシュ（Ｌａｒｏｃｈｅ−Ｒａｙｎａｌら、１９８６Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３２１−３２７）、ヒマ種子（ＬｏｒｄＪ．Ｍ．，１９８５Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１４６：４０３−４０９）およびブラジルナッツ(Ｓｕｎら、１９８７Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１６２：４７７−４８３)において広汎に検討されてきた。これらの試験の主要な結論は、成熟種子において認められる特徴的な低分子量のジスルフィド結合アルブミンポリペプチドは、胚形成の間に合成されるより大きな前駆物質の広汎なプロセシングから生じるということである。２Ｓアルブミン種子貯蔵蛋白を定義するさらに２つの特徴は、高いアミド含量とシステイン残基の高い出現頻度である（Ｙｏｕｌｅら、１９８１）。ヒマワリでは、２Ｓアルブミンは種子中に存在する蛋白の５０％以上を占め（Ｙｏｕｌｅら、１９８１）、約１９ｋＤａの分子量を持った２個または３個の緊密に関連するポリペプチドから成る（Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．ａ．，１９８６“Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｎｆｌｏｗｅｒ２Ｓｓｅｅｄｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓ”自然科学修士論文、ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ａｌｌｅｎら、１９８７ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ５：１６５−１７３）。ヒマワリアルブミンは、非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析したとき、見掛け分子量１４ｋＤａと速やかに泳動するが、これは分子内ジスルフィド結合によって、見掛け上コンパクトな構造に維持されているからである。還元すると、この種は１９ｋＤａポリペプチドとして泳動する（Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ａ．，１９８６）。これに対し、他の２Ｓ蛋白の大部分は単一の前駆物質から誘導され、分子間ジスルフィド結合によって結合される大小のサブユニットポリペプチドから成る（Ｃｒｏｕｃｈら、１９８３Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２７３−２８４；Ｅｒｉｃｓｏｎら、１９８６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１４５７６−１４５８１；Ｓｕｎら、１９８７Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ．１６２：４７７−４８３）。アルブミンポリペプチドは、受精後（ＤＰＦ）５日までのヒマワリ胚芽において検出でき、ヘリアンチニンの２日前まで検出可能であり、種子の成熟期間を通じて蓄積し続ける。やはり５ＤＰＦで最初に検出されるヒマワリアルブミンのｍＲＮＡは、ヒマワリ胚芽において速やかに蓄積し、１２から１５ＤＰＦの間に最大の割合に達する。この期間後、アルブミンの転写は、ヘリアンチニンのｍＲＮＡに関して認められるのと同様の動態で割合が低下する（Ａｌｌｅｎら、１９８７）。機能的ヒマワリアルブミンｍＲＮＡは乾燥種子、発芽した苗あるいは葉では検出できない（Ｃｏｈｅｎ１９８６）。多くのアルブミンｃＤＮＡおよびゲノムクローンが、ヒマワリ（Ａｌｌｅｎら、１９８７Ｍｏｌ−ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２１０：２１１−２１８）およびエンドウ豆（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６１：１１１２４−１１１３０）を含めた様々な植物種から分離されている。Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｉｓ（Ｃｒｏｕｃｈら、１９８３；Ｅｒｉｃｓｏｎら、１９８６）のような他の種類の種子蛋白におけるように、２Ｓアルブミン種子蛋白は小さな遺伝子ファミリーによってコードされている。本発明は、トランスジェニック植物において脂質代謝遺伝子の高いレベルの発現を指令する、ヒマワリアルブミン遺伝子からの５’調節配列を提供する。本発明に従えば、△６−デサチュラーゼ遺伝子のような脂質代謝遺伝子に関するコード化配列に作動可能に連結されたヒマワリアルブミン５’調節配列を含むキメラ構築物が提供される。当該キメラ構築物を含むトランスジェニック植物は、ＧＬＡをＣ１８脂肪酸の約１０％まで蓄積する。これは、ＧＬＡの主要な商業的供給源であるＯｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓに関するＧＬＡの蓄積の範囲内である。発明の要旨本発明は、ヒマワリアルブミン遺伝子の５’調節領域を対象とする。当該５’ 調節領域は、異種遺伝子のコード配列あるいは天然植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに作動可能に連結したとき、植物の種子において異種遺伝子あるいは相補的配列の発現を指令する。本発明は、それ故、異種遺伝子あるいは天然植物遺伝子に相補的な配列に作動可能に連結されたアルブミン５’調節領域を含む発現カセットおよび発現ベクターを提供する。また、当該発現カセットおよび発現ベクターを含む植物形質転換ベクター、ならびにこれらのベクターによって形質転換された植物細胞、および当該ベクターを含む植物とその子孫も提供する。本発明のひとつの具体例では、異種遺伝子若しくは相補的配列は、脂肪酸合成遺伝子あるいは脂質代謝遺伝子である。本発明のもうひとつの態様においては、高いレベルの脂肪酸合成遺伝子若しくは脂質代謝遺伝子産物を含む植物を生産するための方法が提供される。特に、アルブミン５’調節領域と脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子に関するコード配列を含む当該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、高いレベルの脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子産物を含む植物を生産するための方法が提供される。本発明のもうひとつの態様においては、アルブミン５’調節領域と脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子に関するコード配列を含む当該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、固有の脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子を共抑制するための方法が提供される。本発明のさらなる態様においては、作動可能に連結されたアルブミン５’調節領域と天然植物遺伝子に相補的な核酸配列を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成遺伝子あるいは脂質代謝遺伝子のような天然植物遺伝子の産生を低下させる方法を提供する。また、当該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子のような異種遺伝子あるいは天然植物遺伝子のレベルを変化させる方法も提供される。図の簡単な説明図１は、ルリヂシャの△６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチドと対応するアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。シトクロムｂ５のヘム結合モチーフを枠で囲み、推定上の金属結合性、ヒスチジンリッチモチーフ（ＨＲＭ）に下線を付している。プライマーによって認識されるモチーフ（ＰＣＲ分析）には点線で下線を付している。すなわち、ｔｇｇａａａｔｇｇａａｃｃａｔａａ；およびｇａｇｃａｔｃａｔｔｔｇｔｔｔｃｃである。図２は、他の膜結合デサチュラーゼとルリヂシャ△６−デサチュラーゼの類似性を示す樹状図である。ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ（Ｉｎｔｅ１ｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いてルリヂシャ△６−デサチュラーゼのアミノ酸配列を他の既知のデサチュラーゼと比較した。数値は、比較した小群間の相対的な系統発生的距離に相当する。図３Ａは、野生型タバコ「キサンチ（ｘａｎｔｈｉ）」の葉組織から誘導した脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）のガスクロマトグラフィープロフィールを示す。図３Ｂは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｐＡＮ２）の転写制御下にあるルリヂシャ△６−デサチュラーゼｃＤＮＡで形質転換したタバコ植物の葉組織から誘導したＦＡＭＥのガスクロマトグラフィープロフィールを示す。リノール酸メチル（１８：２）、γ−リノレン酸メチル（１８：３γ）、α−リノレン酸メチル（１８：３α）、およびオクタデカテトラエン酸メチル（１８：４）に相当するピークを示している。図４は、ＨａＧ５調節領域のヌクレオチド配列である。転写開始部位（＋１）を太字のＴで表している。下線を付したＢａｍＨＩ制限部位はＰＣＲによって導入した。図５は、ヒマワリアルブミンＨａＧ５調節領域／△６−デサチュラーゼ遺伝子発現ベクターの構築を示す概要図である。図６Ａは、標識ルリヂシャ△６−デサチュラーゼｃＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ルリヂシャの葉、根および１２ｄｐｐ胚芽組織から分離したＲＮＡの５μｇサンプルに関して実施したＲＮＡゲルブロット分析である。図６Ｂは、図６Ａに示した実験についてのノーザン分析結果に相当するグラフである。図７は、形質転換した油料種子ナタネの植物体におけるルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子の存在を示すＰＣＲ分析である。１、３および４のレーンは、オレオシン５’調節領域に連結したルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子で形質転換した植物からのＤＮＡに関して実施したＰＣＲ反応物を負荷した；レーン２：アルブミン５’調節領域に連結したルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子で形質転換した植物からのＤＮＡ；レーン５および６：形質転換していない植物からのＤＮＡ；レーン７：分子量マーカー（１ｋｂラダー、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；レーン８：テンプレートＤＮＡを加えていないＰＣＲ；レーン９：対照としたプラスミドｐＡＮ３とオレオシン５’調節領域に連結したルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子を含むアグロバクテリウム・タメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５からのＤＮＡ。発明の詳細な説明本発明は、ヒマワリアルブミン遺伝子からの５’調節領域をコードする分離した核酸を提供する。本発明に従えば、当該５’調節領域は、異種遺伝子のコード配列あるいは天然植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに作動可能に連結したとき、植物の種子においてコード化配列あるいは相補的配列の発現を指令する。本発明のアルブミン５’調節領域は、調節領域および３’終了配列の制御下で、５’から３’方向に当該アルブミン５’調節領域、異種遺伝子、あるいは天然植物遺伝子に相補的な配列を含む発現カセットの構築に有用である。そのような発現カセットは、発現ベクターを構築するために様々な自律的複製ベクターに組み込むことができる。本発明に従って、意外にも、当該発現ベクターで形質転換した植物がＣ１８脂肪酸の約１０％までＧＬＡを蓄積することが認められた。そのような蓄積は、ＧＬＡの主要な商業的供給源であるＯｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓに関するＧＬＡの蓄積の範囲内である。本文中で使用するとき、「カセット」の語は、ヌクレオチド配列中に存在する１個以上の調節領域に作動可能に連結するように特定の遺伝子を挿入した場合、かかる遺伝子を発現することができるヌクレオチド配列をさす。従って、たとえば、発現カセットは、植物の種子において発現されることを所望する異種コード配列を含みうる。本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、それ故、いくつもの異種遺伝子の種子特異的発現を指令するのに有用である。本文中で使用するとき「種子特異的発現」の語は、内乳や胚芽のような植物種子の様々な部分における発現をさす。ヒマワリアルブミン遺伝子由来の５’調節領域をコードする分離した核酸は次のようにして提供することができる。アルブミンｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（あるいはその部分）でヒマワリゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、アルブミンの組換えゲノムクローンを分離する。数多くの異なるアルブミンｃＤＮＡが分離されている。そのようなｃＤＮＡを分離するために使用する方法ならびに該ヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配列は公表されている。Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１１２４−１１１３０；Ａｌｌｅｎら、１９８７ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．４１５−４２４。アルブミンゲノム組換えＤＮＡを入手する上で有用と考えられる方法は、たとえばＳｈａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ、あるいは広く入手可能な組換えＤＮＡテクノロジーに関する種々様々な実験室マニュアルの中で提供されている。ヌクレオチド配列を決定するには多数の手法が使用可能であり、また当業者には既知である。たとえば、アルブミン調節領域を含む制限断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなシーケンシングベクターのポリリンカー部位にサブクローニングすることができる。その後これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔサブクローンを二本鎖ジデオキシ法によって配列決定することができる(ＣｈｅｎとＳｅｅｂｕｒｇ，１９８５，ＤＮＡ４：１６５)。好ましい具体例では、ヒマワリアルブミン調節領域は図４の８６０から＋２９までのヌクレオチド（配列番号：２のヌクレオチド１−８９５）を含む。種子特異的発現を指令する特性を保持する、配列番号：２に示すようなアルブミン調節領域の修飾は本発明の範囲内である。そのような修飾は１個以上のヌクレオチドの挿入、欠失および置換を含む。本発明の５’調節領域は、アルブミンゲノムクローンの制限エンドヌクレアーゼあるいはエキソヌクレアーゼ消化から誘導することができる。すなわち、たとえば分離したアルブミン遺伝子のコード領域のうちの既知のヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を、分離したアルブミンゲノムクローンの核酸あるいは推定アミノ酸配列上に配置し、分離アルブミンゲノムクローンの５’フランキング配列（すなわちコード領域の翻訳開始コドンから上流の配列）を定める。配列番号：２に示すようなアルブミン５’調節領域（図４のヌクレオチド−８６０から＋２９まで）は、過剰の５’フランキング配列あるいはコード配列のいずれかまたは両方を持つゲノムクローンから、エキソヌクレアーゼＩＩＩを介して除去(デリーション)することによって作製することができる。これは、適切に作製したＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）で消化しながら、時間間隔を置いてその一部を順次採取することによって実現される。生じた、徐々に小さくなるＤＮＡ断片を配列決定して、除去の正確なエンドポイントを決定することができる。そのような除去シリーズを創造するためにエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）を使用するいくつかの市販の系、たとえばＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ、「Ｅｒａｓｅ −Ａ−Ｂａｓｅ」系がある。その代わりに、当該５’調節領域を直接増幅できるようにＰＣＲプライマーを設計することもできる。同じ方法を用いて、当業者は、配列番号：２に示すようなヌクレオチド１−８９５の１個以上の除去断片を作製することができる。配列番号：２に示すヌクレオチドの隣接部分を含み、種特異的発現を指令する能力を保持するあらゆる欠失断片か本発明によって想定される。配列番号：２のヌクレオチド１−８９５およびその修飾あるいは欠失断片を含む種子特異的発現を指令するアルブミン５’調節配列の同定は、特定の配列を異種遺伝子のコード配列と転写融合して、該キメラ遺伝子を適当な宿主に転移し、異種遺伝子の発現を検出することによって達成できる。発現を検出するために使用するアッセイは異種配列の性質に依存する。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼやβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に例示されるリポーター遺伝子が、キメラ構築物の転写および翻訳受容能力を評価するために一般的に用いられる。トランスジェニック生物においてリポーター酵素を高い感受性で検出するためには、標準的なアッセイが使用できる。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子は、植物細胞における酵素の高い安定性、高等植物での内因性β−グルクロニダーゼ活性の欠如、および定量的蛍光アッセイと組織化学的位置決定法が使用しうることから、トランスジェニック植物におけるプロモーター活性のリポーターとして有用である。Ｊｅｒｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７ＥＭＢＯＪ６：３９０１）は、植物組織におけるＧＵＳ活性の生化学的および組織化学的検出のための標準手法を確立した。生化学的アッセイは、植物組織溶解産物をＧＵＳのための蛍光基質、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドと混合し、３７℃で１時間インキュベートし、その後生じた４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することによって実施する。ＧＵＳ活性の組織化学的位置決定は、植物組織サンプルを３７℃で約１８時間、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）中でインキュベートし、Ｘ−Ｇｌｕｃの染色パターンを観察して決定する。そのようなキメラ遺伝子の構築物は特異的調節配列の決定を可能にし、これらの配列が種子特異的に異種遺伝子の発現を指令しうることを明らかにする。本発明のもうひとつの態様は、調節要素が異種遺伝子によってコードされる物質の発現を制御できるように、異種遺伝子のコード配列に作動可能に連結されており、種子特異的発現を指令する、アルブミン遺伝子由来の５’調節領域を含むキメラ植物遺伝子を対象とする。異種遺伝子はアルブミン以外のいかなる遺伝子でもよい。必要に応じて、異種遺伝子によってコードされるポリペプチドが有効量産生される程度の発現を生じさせるのに十分な、付加的調節要素若しくはそれらの要素の一部がキメラ構築物に含まれる。従って、本発明は、脂質代謝酵素のような異種遺伝子をコードする配列に作動可能に連結された、種子特異的発現をもたらすアルブミン５’調節領域の配列を含むキメラ遺伝子を提供する。本発明を実施するために有用な脂質代謝および脂肪酸合成遺伝子の例は、△６−デサチュラーゼ、△１２−デサチュラーゼ、△１５−デサチュラーゼのような脂質デサチュラーゼ、ならびにステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、アシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）、チオエステラーゼ、アセチルトランスアシラーゼ、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ、ケトアシルシンターゼ、マロニルトランスアシラーゼ、およびエロンゲースのような他の関連酵素を含む。そのような脂質代謝および脂肪酸合成遺伝子は、数多くの異なる細菌および植物種から分離され、キャラクタライズされている。それらのヌクレオチドコード配列ならびにかかるコード配列を分離する方法は公表文献中に開示されており、当業者には広く入手可能である。中でも、参照により本発明に組み込まれる米国特許第５，５５２，３０６号および１９９４年１２月３０日出願の、出願者の共同審査中の米国特許願通し番号第０８／３６６，７７９号に開示されている△６−デサチュラーゼ遺伝子は、本発明の実施において特に有用な脂質代謝遺伝子として想定される。本発明のキメラ遺伝子は、アルブミンゲノムＤＮＡの５’調節領域を異種遺伝子のコード化配列に結合することによって構築される。これらの配列の近位化（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）は様々な方法で実現できる。好ましい具体例では、５’から３’までの配列の順序は、アルブミン５’調節領域（プロモーターを含む）、コード配列、そしてポリアデニル化部位を含む終止配列である。そのようなキメラ遺伝子の構築のための標準手法は当業者には周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のような参考文献中に見出すことができる。ＤＮＡ断片を結合するには様々な戦略が使用でき、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に依存する。当業者は、異種遺伝子が発現されるためには、構築物が、プロモーター要素および転写産物の効率的なポリアデニル化のためのシグナルを必要とすることを認識する。従って、ＴＡＴＡボックスとして知られるコンセンサスプロモーター配列を含むアルブミン５’調節領域は、プロモーターを含まない異種蛋白コード配列に直接結合することができる。アルブミンＴＡＴＡボックスを含む制限あるいは除去断片は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列のようなプロモーターを含まない異種遺伝子に正方向に結合される。当業者は、当該アルブミン５’調節領域が他の手段、たとえば化学あるいは酵素的合成によって提供されうることを認識する。異種コード配列の３’末端は、任意に、ノパリンシンターゼポリアデニル化部位あるいはオクトピンＴ−ＤＮＡ遺伝子７ポリアデニル化部位によって例示されるが、これらに限定されないポリアデニル化部位を含む終止配列に結合することができる。その代わりに、異種遺伝子のポリアデニル化部位を用いることもできる。本発明はまた、植物種子中の異種遺伝子のレベルを上昇させる方法も提供する。かかる方法に従えば、異種遺伝子の発現を実施するために、発現カセットおよび発現ベクターは植物に導入されることになる。たとえば、高いレベルの脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子産物を含む植物を生産する方法は、脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子に作動可能に連結したアルブミン５’調節領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換し、高いレベルの上記脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子産物を含む植物を再生させることによって提供される。本発明のもうひとつの態様は、天然植物遺伝子に相補的な核酸配列に作動可能に連結した当該アルブミン調節領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換することを含む、植物にとって在来の遺伝子の産物レベルを低下させる方法を提供する。この方法においては、アンチセンス調節として知られる機序により天然植物遺伝子の内因性産物のレベルが低下させられる。すなわち、たとえば、脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子をコードする核酸配列に相補的である核酸配列に作動可能に連結した当該アルブミン５’調節領域を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成遺伝子あるいは脂質代謝遺伝子の産物のレベルを低下させる。本発明はまた、天然植物遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結した当該アルブミン調節領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換することを含む、植物にとって在来の遺伝子を共抑制する方法を提供する。この方法においては、共抑制として知られる機序を通して天然植物遺伝子の内因性産物のレベルが低下させられる。すなわち、たとえば、植物にとって在来の脂肪酸合成あるいは脂質代謝遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結した当該アルブミン５’調節領域を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成遺伝子あるいは脂質代謝遺伝子の産物のレベルを低下させる。共抑制の厳密な機序は完全には理解されていないが、当業者は、共抑制に関連する実験条件および結果を報告した公表文献に精通している（Ｎａｐｏｌｉら、１９９０ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２７０−２８９；ＶａｎｄｅｒＫｒｏｌ１９９０ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２９１−２９９）。異種あるいは在来遺伝子の調節された発現をもたらすためには、本発明のキメラ遺伝子構築物で植物を形質転換する。遺伝子転移の方法は当該技術において周知である。キメラ遺伝子は、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９に述べられているような葉ディスク（ｌｅａｆｄｉｓｋ）形質転換−再生手法によって植物に導入することができる。プロトプラスト培養（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８４Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：４９６，ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８４ＥＭＢＯＪ．２：２１４３，Ｂａｒｔｏｎら、１９８３Ｃｅｌｌ３２：１０３３）のような他の形質転換の方法も使用でき、本発明の範囲内である。好ましい具体例では、Ｋｌｅｔｔら（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７に述べられているようにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ誘導ベクターで植物を形質転換する。本発明のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入するために他の周知の方法が使用できる。そのような代替方法は、バイオリスティックアプローチ（Ｋｌｅｉｎら、１９８７Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０）、電気穿孔法、化学誘起動的ＤＮＡ取込み、およびウイルスまたは花粉の、ベクターとしての使用を含む。形質転換法に必要であるときには、本発明のキメラ遺伝子を植物形質転換ベクター、たとえばＢｅｖａｎ，Ｍ．１９８４Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：８７１１８７２１に述べられているバイナリーベクターを挿入することができる。植物形質転換ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの天然遺伝子転移系を改変することによって誘導できる。天然の系は、形質転換植物に転移される、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含むラージＴｉ（腫瘍誘発）−プラスミドを含む。Ｔｉプラスミドのもう１つのセグメントであるｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ転移の役割を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域は末端反復が境界を形成する。改変されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、ｖｉｒ領域の機能を用いて、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列によって区切られている外来ＤＮＡを転移する。Ｔ領域は同時に、抗生物質耐性に関する選択可能なマーカー、および転移のための配列を挿入する多数のクローニング部位も含む。そのように設計された菌株は「ディスアームド（武装解除された）」Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株として知られ、Ｔ領域が境界を接する配列を植物の核ゲノム内に効率的に転移させる。表面滅菌した葉ディスクあるいは他の感作性組織に、外来ＤＮＡを含む「ディスアームド」Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを接種し、数日間培養して、その後抗生物質含有培地に移す。次に適当な抗生物質を含む培地に活着させたあと、形質転換した苗条を選択し、土壌に移す。トランスジェニック植物を受粉させ、これらの植物からの種子を採集し、抗生物質培地で成長させる。発育中の種子、稚苗および成熟植物における異種あるいはリポーター遺伝子の発現は、免疫、組織化学あるいは活性検定によってモニターすることができる。本文中で述べたように、キメラ遺伝子の発現に関するアッセイの選択は異種コード領域の性質に依存する。たとえば、適当なヌクレオチドプローブが入手可能であれば、ノーザン分析が転写の評価に使用できる。異種遺伝子によってコードされるポリペプチドに対する抗体が使用可能であれば、ウエスタン分析と免疫組織化学的位置決定を用いてポリペプチドの産生と局在を評価することができる。異種遺伝子に応じて、適当な生化学的アッセイが使用できる。たとえば、標準基質のアセチル化を測定することによってアセチルトランスフェラーゼが検出される。脂質デサチュラーゼ遺伝子の発現は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析によって検定できる。本発明のもうひとつの態様は、本発明のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物あるいはそれらの植物の子孫を提供する。単子葉植物と双子葉植物の両方が想定される。上述した植物形質転換法のいずれかによってキメラ遺伝子で植物細胞を形質転換する。通常はカルス栽培の形態の形質転換植物細胞、葉ディスクあるいは植物全体を（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、１９９３Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，３１６：１１９４−１１９９の真空浸透法を通して）、当該技術に周知の方法によって完全なトランスジェニック植物に再生する（例えば、Ｈｏｒｓｈら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１１２９）。好ましい具体例では、トランスジェニック植物はヒマワリ、綿、ナタネ、トウモロコシ、タバコ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、落花生あるいはダイズである。形質転換植物の子孫にはキメラ遺伝子が遺伝されるので、形質転換植物からの種子あるいは挿し木を用いてトランスジェニック系統を保持する。以下の実施例は本発明をさらに例示する。実施例１膜結合ポリソームＲＮＡの分離とルリヂシャｃＤＮＡライブラリーの構築ＬａｒｋｉｎｓとＤａｖｉｅｓ（１９７５ＰｌａｎｔＰｈｙｓ．５５：７４９−７５６）によりエンドウ豆に関して確立されたプロトコルを用いて、受粉後１２日目（１２ＤＰＰ）のルリヂシャ種子から膜結合ポリソームを分離した。Ｍｅｃｈｌｅｒ（１９８７ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２：２４１−２４８，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）が述べたようにしてポリソームからＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴＴＭビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて膜結合ポリソームＲＮＡからポリ−Ａ⁺ＲＮＡを分離した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを使用して対応するｃＤＮＡを作製した。λＺＡＰＩＩキットを用いてλＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にｃＤＮＡライブラリーを構築した。一次ライブラリーをＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージした。実施例２ルリヂシャからの△６−デサチュラーゼｃＤＮＡの分離ハイブリダイゼーションプロトコル増幅したルリヂシャｃＤＮＡライブラリーを低い密度（１５０ｍｍペトリ皿に５００ｐｆｕ）で平板培養した。対応するｃＤＮＡでスクリーニングして高度に増殖した種子貯蔵蛋白ｃＤＮＡを低減した（総ｃＤＮＡから差し引いた）。Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）が述べたようにランダムプライミングしたＤＮＡ合成を用いてルリヂシャｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブを作製し、前もって同定された豊富に発現される種子貯蔵蛋白のｃＤＮＡと対応させた。Ｇ−５０スピンカラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ）を使用して、包合されないヌクレオチドを除去した。プローブを水浴中で５分間煮沸してハイブリダイゼーションのために変性させ、その後氷上で急速に冷却した。組換えバクテリオファージが固定されたニトロセルロースフィルターを、ハイブリダイゼーション溶液［４ＸＳＥＴ（６００ｍＭＮａＣｌ、８０ｍＭトリス−ＨＣｌ）４ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）、５Ｘデンハート試薬（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、および０．１％ポリビニルピロリドン）、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌのポリアデニンおよび１０μｇ／ｍｌのポリシチジン］中で２−４時間、６０℃でプレハイブリダイズした。これを新鮮ハイブリダイゼーション液に交換し、そこに変性した放射性プローブ（２ｎｇ／ｍｌハイブリダイゼーション液）を加えた。フィルターを撹拌しながら６０℃で一晩インキュベートした。フィルターを４Ｘ、２Ｘ、および１ＸＳＥＴ（１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）中でそれぞれ１５分間ずつ６０℃で連続的に洗浄した。フィルターを風乾し、その後増感紙を用いて −８０℃で２４時間、Ｘ線フィルムに露光した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの切り取りプロトーコールと試薬を用いて、ハイブリダイズしていないプラークを切り取った。得られた細菌コロニーを使用して液体培養物に接種し、マニュアルであるいはＡＢＩ自動シーケンサーによって配列決定した。ルリヂシャ種子１２（ＤＰＰ）膜結合ポリソームライブラリーからのｃＤＮＡのランダム配列決定ハイブリダイズしていないプラークに対応するそれぞれのｃＤＮＡを１回配列決定し、２００−３００塩基対から配列タグを作製した。配列決定はすべてサイクル配列決定（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって実施した。３００以上の発現配列タグ（ＥＳＴ）を作製した。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を使用してそれぞれの配列タグをＧｅｎＢａｎｋのデータベースと比較した。△６−デサチュラーゼを含めて多数の脂質代謝遺伝子が同定された。ＧｅｎＢａｎｋデータベースとＢＬＡＳＴＸを使用して、ｍｂｐ−６５と称されるｃＤＮＡクローンでデータベースを検索すると、これまでに分離されたＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ △６−デサチュラーゼと有意に照合した。しかし、ｍｂｐ−６５は完全な長さのｃＤＮＡではないと判定された。ｍｂｐ−６５を用いてルリヂシャ膜結合ポリソームライブラリーをスクリーニングし、完全な長さのｃＤＮＡを分離した。生じたクローンをｐＡＮ１と称し、ｐＡＮ１のｃＤＮＡ挿入部をサイクル配列決定法によって配列決定した。オープンリーディングフレームから推定したアミノ酸配列（図１、配列番号：１）を、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）の蛋白配列プログラムを使用して他の既知のデサチュラーゼと比較した。この配列は、ｐＡＮ１のｃＤＮＡ挿入部がルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子であることを示唆した。得られた樹状図（図２）は、△¹⁵−デサチュラーゼと △¹²−デサチュラーゼが２つの群を含むことを示している。新たに分離されたルリヂシャ配列とこれまでに分離されたＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ △⁶−デサチュラーゼ（米国特許第５，５５２，３０６号）が第三の別個の群を形成する。デサチュラーゼに共通し、金属結合に触媒的に関与すると思われるアミノ酸モチーフを比較すると、ルリヂシャ遺伝子によってコードされる蛋白の一般的なデサチュラーゼへの全体的類似性、そして特にＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ △⁶− デサチュラーゼへの類似性が示される（表１）。同時に、表１のモチーフを比較すると、この蛋白と他の蛋白のデサチュラーゼ間の決定的な相違が示唆される。さらに、ルリヂシャ配列はまた、シトクロムｂ₅蛋白中に保存されるヘム結合モチーフの存在によって、既知の植物膜結合脂肪酸デサチュラーゼと決定的に区別される（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：６３１−６４２）（図１）。従って、これらの結果は分離されたｃＤＮＡがルリヂシャ△⁶−デサチュラーゼ遺伝子であることを明らかに示唆したが、さらに確認が必要であった。ルリヂシャ△６−デサチュラーゼｃＤＮＡの同一性を確認するため、ｐＡＮ１からのｃＤＮＡ挿入部を安定な発現のための発現カセットにクローニングした。ＢａｍＨＩとＥｃｏＩＣＲＩ（平滑末端を残すＳａｃＩのイソシゾマー；Ｐｒｏｍｅｇａより入手可能）で消化して結合するためにベクターｐＢＩ１２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７）を作製し、３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターを無傷のまま残してＧＵＳコード領域を切り出した。ルリヂシャ△⁶−デサチュラーゼｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して組換えプラスミド（ｐＡＮ１）から切り出した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片が触媒する充填反応を行つて、ＸｈｏＩの末端を平滑化した。次のこの断片をｐＢＩ１２１．１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＩＣＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＡＮ２を生成した。表１膜結合デサチュラーゼにおける一般的なアミノ酸モチーフの比較 ^*P1−81はEST分析によって同定された完全な長さのcDNAであり、Arabidopsis△1 2デサチュラーゼ(fad2)と高い類似性を示す。実施例３トランスジェニック植物の産生と脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析発現プラスミドｐＡＮ２を使用し、最初の形質転換体を１００μｇ／ｍｌカナマイシン上で選択したことを除いては標準工程に従って(Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９−１２３１；Ｂｏｇｕｅら、１９９０Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：４９−５７)、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによってタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．ｘａｎｔｈｉ）を形質転換した。トランスジェニック植物からの組織を液体窒素中で冷凍し、一晩凍結乾燥した。Ｄａｈｍｅｒら（１９８９）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６６：５４３−５４８が述べたようにしてＦＡＭＥを調製した。一部の場合には、溶媒を再び蒸発させ、ＦＡＭＥを酢酸エチルに懸濁して、脱イオン水で１回抽出し、水溶性夾雑物を除去した。以前に述べられているように（Ｒｅｄｄｙら、１９９６ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９−６４２）Ｔｒａｃｏｒ− ５６０ガスクロマトグラフィーを用いてＦＡＭＥを分析した。図３に示すように、ルリヂシャｃＤＮＡを含むトランスジェニックタバコ葉はＧＬＡとオクタデカテトラエン酸(ＯＴＡ)（１８：４ △６，９，１２，１５）の両方を産生した。従ってこれらの結果は、分離したｃＤＮＡがルリヂシャ△６ −デサチュラーゼをコードすることを示している。実施例４ルリヂシャにおける△６−デサチュラーゼの発現 △６−デサチュラーゼの天然の発現を、ルリヂシャの組織に由来するＲＮＡのノーザン分析によって検討した。Ｃｈａｎｇら、１９９３ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１１：１１３−１１６の方法に従って発育中のルリヂシャ胚芽からＲＮＡを分離した。ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲルで電気泳動的に分離し、毛細管トランスファーによってナイロン膜にブロットして、標準プロトコル（ＢｒｏｗｎＴ．，１９９６ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，編集Ａｕｓｅｌｂｅｌら［ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ］ｐ．４．９．１−４．９．１４）に従って８０℃で３０分間焼成して固定した。５０％脱イオンホルムアミド、５Ｘデンハート試薬、５ＸＳＳＰＥ（９００ｍＭＮａＣｌ；５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７；および５ｍＭＥＤＴＡ）、０．１％ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃でフィルターをプレインキュベートした。２時間後、フィルターを同じ組成の新鮮溶液に入れ、変性放射性ハイブリダイゼーションプローブを加えた。この場合には、使用したプローブはルリヂシャレグミンｃＤＮＡ（図１６Ａ）、ルリヂシャオレオシンｃＤＮＡ（図１６Ｂ）、およびルリヂシャ△６− デサチュラーゼｃＤＮＡ（ｐＡＮ１、実施例２）（図１６Ｃ）であった。ルリヂシャのレグミンとオレオシンのｃＤＮＡはＥＳＴクローニングによって分離し、実施例２で述べたようにＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較して同定した。負荷の変動はルリヂシャＥＦ１α ｍＲＮＡのレベルを基準にして補正した。ＥＦ１α ｍＲＮＡは、実施例２で述べたＥＳＴ分析によって得られた対応するｃＤＮＡに関係づけることにより同定した。フィルターを４２℃で１２−２０時間ハイブリダイズし、その後上述したように（温度が６５℃であったことを除いて）洗浄して、風乾し、Ｘ線フィルムに露光した。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、△６−デサチュラーゼは主としてルリヂシャの種子中に発現する。ルリヂシャの種子は受粉後（ｄｐｐ）１８−２０日の間に成熟に至る。△６−デサチュラーゼｍＲＮＡの発現は採集時期全体を通じて（８−２０ｄｐｐ）起こるが、受粉後１０−１６日が最大であると思われる。この発現プロフィールは、ルリヂシャオレオシンおよび１２Ｓ種子貯蔵蛋白ｍＲＮＡ（図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃ）に関して見られるものと同様である。実施例５ヒマワリアルブミンｃＤＮＡの分離葉および１２ＤＰＦ（開花後日数）の胚芽からのｃＤＮＡプローブを使用して、ヒマワリｃＤＮＡライブラリーをディファレンシャルスクリーニングして、ヒマワリアルブミンｃＤＮＡ（Ｈａ５）を分離した。１０１１ｂｐのｃＤＮＡを得た（ＣｏｈｅｎＥ．Ａ．“Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｎｆｌｏｗｅｒ２Ｓｓｅｅｄｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓ”ＭＳ論文、ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｌｌｅｎら、１９８７ａｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ｐ．４１５−４２４）。完全な長さではなかったが、ｃＤＮＡはヒマワリ２Ｓアルブミンに関するコード配列の大部分を含んでいた。ノーザン分析およびドットブロット分析は、この遺伝子が発育中のヒマワリ種子において独占的に発現されることを示唆した。アルブミン転写産物と蛋白は５ＤＰＦ、ヘリアンチニン（１１Ｓ）よりも丸２日早く初めて検出され、１２−１５ＤＰＦ頃に最大の割合に達する（Ａｌｌｅｎら、１９８７ａ）。実施例６ヒマワリアルブミン５’調節領域の分離Ｈａ５ｃＤＮＡをプローブとして使用してヒマワリゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムクローンを分離した。４個の独立したゲノムクローンが、制限酵素消化によって同一であることが示された。それ故、より詳細な分析のために１個のクローン（ＨａＧ５）を選択した。２．３ｋｂＥｃｏＲＩ／ＤｒａＩ断片を配列決定した（Ａｌｌｅｎら、１９８７ｂＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：２１１−２１８）。ＨａＧ５アルブミン遺伝子は２個のエクソンを含む。最初のエクソン（エクソン１）は５７５ヌクレオチドの長さで、２番目のエクソン（エクソン２）は３１０ヌクレオチドの長さである。１９０ヌクレオチドのイントロンが２個のエクソンを分けている。ヌクレアーゼ保護実験は、転写開始部位が翻訳開始部位の３０ヌクレオチド上流に位置することを示した。（Ａｌｌｅｎら、１９８７ｂ、図２）。ゲノムＤＮＡのサザン分析と、網羅的なスクリーニングにおいて１個の遺伝子だけが分離されたという事実は、ＨａＧ５がヒマワリゲノムにおける単一のコピー遺伝子であることを示唆した。ＨａＧ５からいくつかの段階を経て、８８９ｂｐ上流の調節領域（図４の−８６０から＋２９まで；配列番号：２）をクローニングした。ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において１．１ｋｂＥｃｏＲＩ断片をサブクローニングしてｐＨａＧ５ＲＩを生成した。それぞれ５’末端と３’末端においてＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位によってフランキングされるアルブミン５’調節領域を与えるプライマーで、ｐＨａＧ５ＲＩに関してＰＣＲを実施した。制限断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＨａＧ５ＥＢを生成した。ＰＣＲ突然変異の可能性ならびにそれらの挿入部の方向を調べるため、個々のクローンを配列決定した。アルブミン５’調節領域の配列を図４に示す（配列番号：２）。この構築物のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片を切り出してｐＡＮ３（親ルリヂシャ△６−デサチュラーゼ含有プラスミド）にクローニングし、ｐＡＮ４を生成した。ｐＡＮ４の地図とその構築に関与した中間ベクターを図５に示す。ｐＡＮ１は実施例２に述べられている。ｐＢＩ１０１．１は（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７）の中で述べられている。実施例７ヒマワリアルブミン５’調節領域の制御下での△６−デサチュラーゼの発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子の発現をさせるために、アルブミン５’調節領域を使用した。ｐＡＮ４を用いてＢｅｃｈｔｏｌｄら、１９９３Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ３１６：１１９４−１１９９の真空浸透法によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換した。△６−デサチュラーゼ活性のレベルを、実施例３に述べた方法を用いてその反応産物であるγ−リノレン酸（ＧＬＡ）とオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ）の対応する脂肋酸メチルエステルを測定することによってモニターした。トランスジェニック種子におけるＧＬＡとＯＴＡのレベルは、それぞれＣ１８脂肪酸の１０．２％（平均４．４％）と３．６％（平均１．７％）までの範囲であった。これらの植物の葉では、ＧＬＡあるいはＯＴＡは検出されなかった。比較として、３５Ｓプロモーター／△⁶−デサチュラーゼのトランスジェニック植物は、葉においてＣ１８脂肪酸の３．１％（平均１．３％）までのＧＬＡレベルを生じ、種子では測定可能なＯＴＡを生じなかった。これらのデータを表２に要約する。表２トランスジェニック植物におけるルリヂシャ△⁶−デサチュラーゼの発現 *C₁₈脂肪酸のパーセントで表した平均値 n.d.:検出されず。実施例８ルリヂシャデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子に連結されたアルブミン５’調節領域を含む発現カセットによるナタネの形質転換Ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒのナタネを、プラスミドｐＡＮ４（すなわちヒマワリアルブミンプロモーター制御下のルリヂシャ△６−デサチュラーゼ遺伝子−実施例６））を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５株で形質転換した。Ｗｅｓｔａｒの頂生節間を、誘導したＡｇｒｏｂａｃｅｔｉｒｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ１０５（Ａｌｔ−Ｍｏｅｒｂｅら、１９８８Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：１−８；Ｊａｍｅｓら、１９９３ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：５５９−５６３）とともに２−３日間共培養し、その後再生培地（Ｂｏｕｌｔｅｒら、１９９０ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ７０：９１−９９；Ｆｒｙら、１９８７ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ６：３２１−３２５）に移した。再生した苗条を生育培地（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８３Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｍｅｎｅｔ．１９１：２４４−２５０）に移し、遺伝子の存在を評価するために葉の断片に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。Ｋ．Ｍ．Ｈａｙｍｅｒｓら（１９９６）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ，１４（３）２８０−２８４のプロトコルに従って葉からＤＮＡを分離し、リボヌクレアーゼ処理なしで水１００μｌに懸濁した。抽出物５μｌを最終容量５０μｌでＰＣＲ反応に使用した。反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイクラーにおいて次のサイクルで：１サイクル：９５℃、５分間３０サイクル：９５℃、４５秒間；５２℃、４５秒間；７２℃、１分間１サイクル：７２℃、５分間また以下のプライマー（図１、配列番号：１に示すように、金属ボックス領域付近から誘導した）を用いて実施した：５’ＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＡＡ３’ ５’ＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣ３’ ＤＮＡの増幅により予想された５４９塩基対のＰＣＲ断片の存在が明らかになった（図７）。陽性苗条を伸長培地に移し、その後発根培地（ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８９ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４−７０１）に移した。良好に発育した根系を有する苗条を温室に移した。植物が十分に発育したときに葉を採集し、遺伝子コピー数を評価するためサザン分析を実施した。Ｂｏｕｃｈｅｚら（１９９６）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ１４：１１５−１２３の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢｇｌＩおよび／あるいはＣｌａＩで消化して、アガロースゲル上で電気泳動的に分離し（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ／ＮＹ）、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移すために製造者の指示に従って調製した。次に２０ＸＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）を用いて毛細管作用により一晩ＤＮＡを膜に転移させた。転移後、膜をＵＶ(Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ)により３０秒間架橋させ、ハイブリダイゼーションオーブン（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）において、ガラスバイアルに入れた６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび２．２５％ｗ／ｗ乾燥脱脂乳を含む溶液１５ｍｌ中６５℃で１時間プレハイブリダイズした。ランダムプライマー法（ＰｈａｒｍａｃｉａからのＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏキットを用いて）により³²Ｐで１０⁸ｃｐｍ／μｇの比活性に放射標識した変性ハイブリダイゼーションプローブを含む同じ溶液中で、膜を一晩ハイブリダイズした。プローブはルリヂシャデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子のＰＣＲ断片（上記に詳述した条件とプライマーを用いて得られた）を示す。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で15分間、およびＯ．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、６５℃で洗浄した。次に膜をサランラップで包み、耐光性カセット中−７０℃で増感紙を用いてコダックＸＡＲフィルムに露光した。露光期間は一般に３日間である。得られた結果により遺伝子の存在が確認された。遺伝子構築物に従って、ＢｇｌＩあるいはＣｌａＩによって消化したＤＮＡの各レーンのバンドの数は、植物のゲノムＤＮＡ中に存在するデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子の数を表す。ＢｇｌＩとＣｌａＩの組合せによる消化は３０５８ｂｐの断片を生成する。「含む」あるいは「含んでいる」の語は、請求の範囲において言及されているような陳述された特徴、整数、段階、あるいは成分の存在を規定するものと定義されるが、１つまたはそれ以上の他の特徴、整数、段階、成分、あるいはそのグループの存在あるいは付加を排除するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ナンバーグ，アンドリユー・エヌアメリカ合衆国、ミズーリ・63043、メリイランド・ハイツ、エンカント・レイン・ 12215―ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２に示すヌクレオチド配列、１個以上のヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換を有する配列番号：２に示すヌクレオチド配列、および配列番号：２に示すヌクレオチド配列の隣接断片を有する配列番号：２に示すヌクレオチド配列から成る群から選択される、種子特異的発現を指令する、アルブミン５’ 調節領域をコードする分離された核酸。２．異種遺伝子に作動可能に連結された請求項１に記載のアルブミン５’調節領域を含む発現カセット。３．異種遺伝子が脂肪酸合成遺伝子若しくは脂質代謝遺伝子の少なくとも１つである、請求項２に記載の発現カセット。４．異種遺伝子が脂質デサチュラーゼ遺伝子、アシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）遺伝子、チオエステラーゼ遺伝子、アセチルトランスアシラーゼ遺伝子、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、ケトアシルシンターゼ遺伝子、マロニルトランスアシラーゼ遺伝子若しくはエロンゲース遺伝子から成る群から選択される、請求項３に記載の発現カセット。５．脂質デサチュラーゼ遺伝子が△６−デサチュラーゼ遺伝子、 △１２−デサチュラーゼ遺伝子および△１５−デサチュラーゼ遺伝子から成る群から選択される、請求項４に記載の発現カセット。６．請求項２〜５のいずれか一項に記載の発現カセットを含む発現ベクター。７．請求項２〜５のいずれか一項に記載の発現カセットを含む細胞。８．請求項６に記載の発現ベクターを含む細胞。９．当該細胞が細菌細胞あるいは植物細胞である、請求項７に記載の細胞。１０．当該細胞が細菌細胞若しくは植物細胞である、請求項８に記載の細胞。１１．請求項２〜５のいずれか一項に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物。１２．請求項６に記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。１３．請求項９に記載の植物細胞から再生された植物。１４．請求項１０に記載の植物細胞から再生された植物。１５．当該植物がヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、綿、タバコ、落花生、ナタネ若しくはＡｒａｂｉｄｏｐｉｓｉｓ植物の少なくとも１つである、請求項１２または１３に記載の植物。１６．請求項１１または１２に記載の植物の子孫。１７．請求項１１または１２に記載の植物からの種子。１８．（ａ）脂肪酸合成遺伝子若しくは脂質代謝遺伝子をコードする分離された核酸の少なくとも１個に作動可能に連結された請求項１に記載の分離された核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換すること；および（ｂ）当該植物細胞から高いレベルの当該脂肋酸合成遺伝子若しくは当該脂質代謝遺伝子の産物を有する植物を再生すること；を含む、高いレベルの脂質代謝遺伝子産物を有する植物を生産する方法。１９．（ａ）△６−デサチュラーゼ遺伝子に、作動可能に連結された請求項１に記載の分離された核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換すること；および（ｂ）当該植物細胞から高いレベルのγリノレン酸（ＧＬＡ）を有する植物を再生すること；を含む高いレベルのＧＬＡ含量を有する植物を生産する方法。２０．当該△６−デサチュラーゼ遺伝子がシアノバクテリア由来△６−デサチュラーゼ遺伝子若しくはルリヂシャ由来△６−デサチュラーゼ遺伝子の少なくとも１つである、請求項１９に記載の方法。２１．当該植物がヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、タバコ、綿、落花生、ナタネ若しくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物である、請求項１８または１９に記載の方法。２２．当該脂肪酸合成遺伝子あるいは当該脂質代謝遺伝子が、脂質デサチュラーゼ遺伝子、アシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）遺伝子、チオエステラーゼ遺伝子、エロンゲース遺伝子、アセチルトランスアシラーゼ遺伝子、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、ケトアシルシンターゼ遺伝子、あるいはマロニルトランスアシラーゼ遺伝子の少なくとも１つである、請求項１８に記載の方法。２３．△６−デサチュラーゼ遺伝子に作動可能に連結された請求項１に記載の分離された核酸を含む発現ベクターで当該植物を形質転換し、高いレベルのγリノレン酸（ＧＬＡ）若しくはオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ）の少なくとも１つを有する植物を再生することを含む、ＧＬＡ欠乏若しくはＧＬＡ欠損植物においてＧＬＡ若しくはＯＴＡの産生を誘導する方法。２４．（ａ）脂肪酸合成若しくは脂質代謝遺伝子に相補的な核酸配列に作動可能に連結された請求項１に記載の分離された核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換すること；および（ｂ）当該脂肪酸合成若しくは当該脂質代謝遺伝子の産生が低い植物を再生すること；を含む、植物において脂肪酸合成若しくは脂質代謝遺伝子の産生を低下させる方法。２５．（ａ）該植物に在来の脂肪酸合成若しくは脂質代謝遺伝子をコードする核酸配列に、作動可能に連結された請求項１に記載の分離された核酸を含む発現ベクターで植物の細胞を形質転換すること；および（ｂ）当該脂肪酸合成若しくは当該脂質代謝遺伝子の産生が低い植物を再生すること；を含む、植物において固有の脂肪酸合成若しくは脂質代謝遺伝子を共抑制する方法。