JP2001507703A - 細胞にインプリンティングの正常パターンを復元するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インプリンティングに関連した疾病の診断および治療のための組成物および方法が提供される。このような組成物および方法は、細胞へのインプリンティングの正常パターンを復元するのに有用である。この組成物は、インプリンティングに関与する薬剤を含む、細胞へのインプリンティングの正常パターンを復元するための予防的および治療的方法に用いることができる。このような薬剤は、細胞へのインプリンティングの正常パターンを復元することができる。本発明のさらなる方法は、異常にインプリントされた染色体および遺伝子に対して、正常なインプリンティングを復元させることによりその作用を発揮する薬剤化合物を同定するための手段を含む。さらに、本発明は、根元的に異常なインプリンティングを示す疾病組織への正常なインプリンティングの復元によりその作用を発揮する新規の化合物を同定するためにも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞にインプリンティングの正常パターンを復元するための 組成物および方法 連邦政府支援による研究開発 本発明は、米国国立衛生研究所からの認可の下で政府の援助を受けて成された 。政府は本発明に対して一定の権利を有する。 発明の分野 本発明は、親由来の特異的染色体または遺伝子変化に関連したヒト疾患、特に インプリンティングの異常パターンに関連した疾患を診断し、防止し、そして治 療する組成物および方法に関する。本発明は、細胞のインプリンティングパター ンに影響を及ぼす薬剤、特に異常にインプリントされた細胞に対してインプリン ティングの正常パターンを復元し得る薬剤の発見方法にも関する。 発明の背景 ゲノムインプリンティングは、子孫の体細胞中の遺伝子の２つの対立遺伝子の 単一対立遺伝子の発現または特異的な遺伝子発現を引き起こす配偶子または接合 子における特定の親染色体の後成的な修飾である。インプリンティングは、細胞 間シグナル化、ＲＮＡプロセッシング、細胞周期制御、そして細胞分裂および成 長の促進または阻止を含めた種々の不可欠な細胞および発生過程に影響を及ぼす 。 単一の遺伝子レベルでのインプリンティングの第一の結論は、父系遺伝による その発現の依存関係を示すトランスジェニックＣ−ｍｙｃ遺伝子に関係していた 。サイレント母系遺伝コピーはメチル化された(Swain et al．(1987)Cell 50: 719-727)。 ノックアウト実験におけるインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ２）遺伝子の破 壊は、ＩＧＦ２が通常は父系対立遺伝子からのみインプリントされ、発現される ことを、そしてＩＧＦ２は２つの神経組織、即ち脈絡叢および軟髄膜において両 親由来 的に発現されることを示した(DeChiara et al．(1991)Cell 64:849-859)。これ らの画期的な研究は、ゲノムインプリンティングが正常な内在性遺伝子に影響を 及ぼし、そしてインプリンティングは組織特異的な調節を示すということを示し た。 新規にインプリントされた遺伝子を同定するために開発された直接的アプロー チを以下に挙げる：他の既知のインプリントされた遺伝子付近のインプリントさ れた遺伝子を同定するポジショナルクローニング(Barlow et al．(1991)Nature 349:84-87)；単為生殖胚と正常胚との遺伝子発現の比較(Kuroiwa et al.(1996 )Nat．Genet 12:186-190)；および制限ランドマークゲノムスキャニング(Naqai et al.(1995)Biochem．Bionhys．Res．Commun．213:258-265)。最後のアプロー チは、ヘテロ接合性多形性部位の近くのＤＮＡメチル化を査定することにより、 腫瘍におけるクローン性の分析を包含する(Vogelstein et al.(1985)Science 227:642-645)。 単一の遺伝子の異常は、近位ゲノム領域のインプリンティングに影響を及ぼし 、突然変異化遺伝子の親由来の表現型である多数の疾患を引き起こす遺伝子を破 壊し得る。極めて接近したインプリントされたヒト疾患遺伝子座の２つの例は、 第１５染色体上にある。これらの遺伝子座のインプリンティング破壊は、精神遅 滞を伴うプラダー−ヴィリ症候群（ＰＷＳ）およびアンジェルマン症候群（ＡＳ ）の原因の１つである。ＰＷＳは肥満も引き起こし、そしてＡＳは肉眼的運動障 害を伴う。各障害は、親由来の特異的片親性二染色体（Nicholls et al．(198 9)Nature 342:281-285;Knoll et al．(1990)Am．J．Hum．Genet．47:149-155） または染色体欠失(Knoll et al．(1989)Am．J．Hum．Genet．47:149-155;Mattei et al．(1984)Hum．Genet．66:313-334)により引き起こされ得る。ＡＳ遺伝子 は、今日まで単離されていない。ＰＷＳは小核リボ核タンパク質ポリペプチドＮ （ＳＮＲＰＮ）遺伝子における突然変異または欠失のためであると考えられる(N icholls et al．(1993)Curr．Opin．Genet．Dev．3:445-446で再検討されている )。ＳＮＲＰＮの翻訳されていない上流エキソンのスプライシングに影響を及ぼ す突然変異も、他の遺伝子座の異常インプリンティングと同様に、ＡＳを引き起 こし得る(Dittrich et al．(1996)Nat．Genet．14:163-170)。 特定の染色体に関するＵＰＤはしばしば多先天性異常に関連するため、さらに 多数の別のインプリントされたヒト疾患遺伝子座が同定されると思われる(Ledbe tter，D.H．and Enge1，E．（1995）Hum．Mol．Genet．4:1757-1764)。この現象 を示すと思われる染色体としては、第２、６、７、１１、１４、１５、１６、２ ０およびＸ染色体が挙げられる(Ledbetter，D.H．and Enge1，E．（1995）Hum． Mol．Genet．4:1757-1764)。 癌におけるゲノムインプリンティングの関係は、２つの胚芽腫瘍、即ち胞状奇 胎および完全卵巣奇形腫の研究から得られたが、これらは正常な胚を作るために は４６本の染色体が必要なだけでなく、母系と父系の染色体の均衡も必要である ことを示した。相対的不均衡は腫瘍性増殖を引き起こし、新生物の型は母系また は父系遺伝的過剰が存在するか否かによっている。 明らかにインプリンティングに関連した別の腫瘍は、よく知られているパラガ ングリオンまたは糸球腫瘍である。すべての場合において、伝達親は父親である (Vander Mey et al.（1989）Lancet 2:1291-1294)。その遺伝子は近年、１１ｑ ２２．３−ｑ２３に限局された(Heutink et al．(1994)Eur．J．Hum．Genet．2: 148-158)。 小児期ウィルムス腫瘍におけるヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）は第１１染色体 上で起こり、特定的関与領域は１１ｐ１５である(Reeve et al．(1989)Mol．Cel l Biol.9:1799-1803)。Schroeder等（1987，Am．J．Hum．Genet．40:413-420)は 、５例のＬＯＨのうちの５例において、損失されたのは母系対立遺伝子であるこ とに注目した。この観察は、胚芽起源の他の腫瘍、例えば胚芽細胞腫および横紋 筋肉腫にまで及んだ(Scrable et al．(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:74 80-7484)。 第２染色体上のＮ−ｍｙｃ遺伝子は神経芽細胞腫における父系対立遺伝子の選 択的増幅を示す(Cheng et al．(1993)Nature Genet．4:187−190)。Ｎ−ｍｙｃ 増幅を示す進行神経芽細胞腫も、母系第１染色体の選択的ＬＯＨを示すが、一方 、Ｎ−ｍｙｃ増幅を伴わない初期段階の腫瘍は示さない(Caron et al.(1995)Hum .Mol．Genet．4:535-539)。したがって、所定の癌の種類におけるインプリント された遺伝子に関与する遺伝的障害は、多染色体を同時に伴う場合がある。 Naumova等（1994，Am．J．Hum．Genet．54:274-281）は、網膜芽細胞腫における 同一親由来の伝達比の歪曲、１３ｑ損失の一致および第６同腕染色体を見出した が、これは癌の危険性の増大につながる胚形成におけるインプリンティングの全 身性障害のメカニズムと一致する。 ベックウィズ−ヴィーデマン症候群（ＢＷＳ）は、出生前過剰増殖および癌の 障害で、常染色体優性形質として伝達されるか、または散発的に生じる。ゲノム インプリンティングに関する役割に対する手掛かりは、ＢＷＳが母親から遺伝さ れる場合、疾患浸透度の増大である(Viljoen，D．and Ramesar，R．(1992)J．Me d．Genet．29:221-225)。小児の腫瘍は、母系１１ｐ１５の選択的損失を示し(Sc hroeder et al．(1987)Am．J．Hum．Genet．40:413-420;Scrable et al.（1989 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:7480-7484)、これはインプリントされた遺伝 子座がＢＷＳを引き起こし得ること、そして散発性腫瘍にも関与し得ることを示 唆する。遺伝子連鎖の分析は、ＢＷＳが広汎性破壊というこの考え方に一致して １１ｐ１５に局限し、ＷＴ１遺伝子が限局された１１ｐ１３には局所限定されな い、ということを示した(Pinq et al．（1989）Am．J．Hum．Genet．44:720-723 ；Koufos et al．（1989）Am．J．Hum．Genet．44:711-719)。 ＢＷＳの１１ｐ１５のゲノムインプリンティングに関するさらに直接的な証拠 は、何名かのＢＷＳ患者が、β−グロビン遺伝子座からＲＡＳ遺伝子に延びる領 域を伴う父系ＵＰＤを有するということを示す研究から得られた(Henry et al .(1991)Nature 35:609−610)。大型１０Ｍｂ領域はインプリントされた遺伝子の 正確な局所限定を提供しないが、一方それはこの染色体上のインプリントされた 遺伝子座についての後の研究の基礎を提供する。 ウィルムス腫瘍（ＷＴ）からのＲＮＡの検査により、一方でなく両方のＩＧＦ ２対立遺伝子がウィルムス腫瘍の７０％で発現されたという発見がもたらされた (Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749：Ohisson et al.（1993）Nature Genet.4:94-97)。さらに、３０％の症例で、Ｈ１９の両対立遺伝子が発現され た(Rainier et al.（1993）Nature362:747-749)。これに対比して、正常組織か らのＲＮＡの検査は、ＩＧＦ２およびＨ１９の一方の対立遺伝子の発現に伴う正 常インプリンティングを示す。これは、ヒトにおけるインプリンティ ングの最初の証拠であった。この新規の遺伝的変化に関する用語は、インプリン ティングの損失（ＬＯＩ）(Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749)であり 、これは選択的親由来の特異的遺伝子発現の損失が、両対立遺伝子発現をもたら す正常サイレント対立遺伝子の異常発現化、または、遺伝子座の後成的サイレン トをもたらす正常発現対立遺伝子のサイレント化を伴うことを単に意味する(Rai nier et al.(1993)Nature 362:747-749；Feinberg(1993)Nature Genet．4:110-1 13;Feinberg et al.（1995）J．Natl．Cancer Inst．Monographs 17:21-26)。し たがって、癌における異常なインプリンティングは、増殖促進遺伝子の正常サイ レント対立遺伝子の活性化を引き起こし得る(Rainier et al.（1993）Nature 36 2:747-749)；(Feinberg（1993）Nature Genet．4:110-113)；(Feinberg et al .（1995）J．Natl．Cancer Inst．Monographs 17:21-26)。 その後、ＬＯＩは種々の型の腫瘍に関係があるとされてきた。最初に、ＬＯＩ は、その他の小児期腫瘍、例えば胚芽細胞腫(Rainier et al.(1995)Cancer Res ．55:1836-1838)；(Li et al.（1995）Oncogene 11:221-229)、横紋筋肉腫（Zha n et al.（1994）J．Clin．Invest．94:445-448）およびユーイング肉腫（Zhan et al.（1995a）Oncogene 11:2503-2507）において見出された。ＩＧＦ２および Ｈ１９のＬＯＩも、多数の成人腫瘍、例えば子宮癌(Vu et al．(1995)J．Clin ．Endocrinol．Metab．80:1670-1676)、頸部癌(Doucrasy et al.(1996)Oncogene 12:423-430)、食道癌(Hibi et al.(1996)Cancer Res．56:480-482)、前立腺癌( Jarrard et al.（1995）Clin．Cancer Res．1:1471-1478)、肺癌(Kondo et al. （1995）Oncogene 10:1193-1198)、絨毛癌(Hashimoto et al.（1995）Nat．Gene t．9:109-110)、胚芽細胞腫瘍(Van Gurp et al.（1994）J．Natl．Cancer Inst ．86:1070-1075)、ＢＷＳ(Steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;W eksberg et al.(1993)Nature Genet．5:143-150)およびウィルムス腫瘍(Ogawa e t al．（1993）Nature Genet．5:408-412)において現在見出されている。したが って、ＬＯＩはヒトの癌における最も一般的な遺伝子変化の１つである。 １１ｐ１５における別のインプリントされた遺伝子は、ｐ５３の標的であるｐ ２１^WAF1/Cip1とそのＣＤＫ阻害ドメイン中で同様のサイクリン依存性キナーゼ( ＣＤＫ)阻害剤であるｐ５７^KIP2である(Matsuoka et al.（1995）Genes Dev．9: 640-662;Lee et al.（1995）Genes Dev．9:639-649)。遺伝子は、その中断点に 対して末端小粒的に置かれるＩＧＦ２およびＨ１９に対比して、４０ｋｂの一群 のＢＷＳ均衡生殖系列染色体再配列中断点内に局在した(Hoovers et al.（1995 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:12456-12460)。ヒトｐ５７^KIP2は、母系対立 遺伝子からの選択的発現によりインプリントされることが見出された(Matsuoka et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3026-3030)。ｐ５７^KIP2も、いくつか の腫瘍およびＢＷＳ患者において異常インプリンティングおよび後成的なサイレ ントを示す(Thompson et al.(1996)Cancer Research 56:5723-5727)。 シトシンＤＮＡメチル化は、酵素シトシン（ＤＮＡ−５）−メチルトランスフ ェラーゼ（以下、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと呼ぶ）により触媒される。 ＤＮＡメチル化は、ＣｐＧジヌクレオチドでほとんど排他的に起こる(Cedar et al.（1990）Biochem．Biophys．Acta 1049:1-8で再検討されている)。ＤＮＡメ チル化のパターンは、体細胞により遺伝可能で、ＤＮＡ複製後、非メチル化ＤＮ Ａに対する親和性より、半メチル化ＤＮＡ（即ち、親鎖はメチル化され、娘鎖は メチル化されない）に対する親和性が１００倍以上大きいＤＮＡメチルトランス フェラーゼにより保持される(Cedar et al.（1990）Biochem．Biophys．Acta 10 49:1-8)。しかしながら、配偶子および胚の発生中の細胞は、メチル化の損失と デノボ（de novo）でのメチル化の両方によりＤＮＡメチル化において劇的なシ フトを蒙る（Cedar et al.（1990）Biochem．Biophys．Acta 1049:1-8)。ＤＮＡ メチル化のオリジナルパターンを確立するメカニズムは分かっていない。 ゲノムにおいては、２種類のシトシンＤＮＡのメチル化が存在する。第一の一 般的に遺伝子のサイレント化に関連するものは、組織特異的発現を示す遺伝子上 で起こる。この型は遺伝子発現の変化の前と後の両方で起こるために、必ずしも 発生中の遺伝子発現の変化の原因であるとは言えない；しかし、むしろ既定のパ ターンの遺伝子発現を「ロックイン」するのに役立ち得る(Cedar et al.(1990)Bio chem.Biophys．Acta 1049:1-8；Ri99S，A.D.（1989）Cell Biophys. 15:1-13)。第二の種類は、正常細胞ではほとんど常にメチル化されず、そして通 常はハウスキーピング遺伝子のプロモーターまたは第一エキソン内にあるＣｐＧ アイランドを包含する(Bird,A.P.（1986）Nature 321:209-213で再検討されてい る)。しかしながら、重要な例外は不活性Ｘ染色体上のＣｐＧアイランドであり 、これはメチル化される。したがって、ＣｐＧアイランドメチル化は、非ＣｐＧ アイランドメチル化とは違って、不活性Ｘ染色体の後成的なサイレント化および ／またはマーキングに関与すると考えられる(Riggs，A.D．and Pfeifer，G.P.（ 1992）Trends Genet．8:169-174で再検討されている)。 証拠のいくつかの方向は、ゲノムインプリンティングの制御においてＤＮＡメ チル化にある役割を提供する。第一に、マウスにおけるいくつかのインプリント された遺伝子、例えばＨ１９は、ＣｐＧアイランドの親由来の特異的組織非依存 性メチル化を示す(Ferguson-Smith et al.（1993）Nature 362:751-755；Bartol omei et al.（1993）Genes Develop．7:1663-1673)。このメチル化は父系染色体 上のインプリンティングを示し、遺伝子発現における変化に対して二次的でない 。第二に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを欠失し、広範なゲノム低メチル化 を示すノックアウトマウスは、Ｈ１９ＣｐＧアイランドの対立遺伝子特異的メチ ル化を示さず、そしてＨ１９の二対立遺伝子発現およびＩＧＦ２の発現の損失を 示す(Li et al.（1993）Nature 366:362-365)。同様の親由来の特異的メチル化 は、ＩＧＦ２受容体遺伝子（ＩＧＦ２Ｒ）の母系遺伝、発現対立遺伝子の第一イ ントロンにおけるＣｐＧアイランドに関しても観察されている(Stoger et al.（ 1993）Cell 73:61-71)。メチルトランスフェラーゼ−欠失ノックアウトマウス は、ＩＧＦ２Ｒのメチル化の損失およびその遺伝子の後成的無症候化を示す(Li et al.（1993）Nature １366:362-365)。 ヒト腫瘍におけるＤＮＡメチル化の大幅な変化は１５年前に発見され(Feinber g，A.P.（1983）Nature Genet．4:110-113)、依然としてヒトの癌で最も一般的 に見出される変化である。これらの変化は、良性および悪性の両方の新生物に遍 在する(Goelz et al.（1985）Science 228:187-190)。これらの変化の正確な役 割は依然として明らかでない；しかし、メチル化の減少および増大の両方が、定 量的なＤＮのＡメチル化の全体的減少を伴って、腫瘍の特定部位で 見出されている(Feinberg et al.（1988）Cancer Res．48:1159-1161;Feinberg ，A.P.（1988)Prog．Clin．Biol．Res．279:309-317;Jones et al.（1990）Adv ．Cancer Res．54:1-23)。 ヒトにおいては、マウスと同様に、Ｈ１９遺伝子およびそのプロモーターのＣ ｐＧアイランドの父系対立遺伝子は正常にメチル化され、母系対立遺伝子はメチ ル化されない(Steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Ferguson-Smi th et al.(1993)Nature 362:751-755;Bartolomei et al.(1993)Genes Develop． 7:1663-1673)。ＩＧＦ２のＬＯＩを伴う腫瘍はＨ１９の発現減少を示したため、 Ｈ１９のメチル化パターンがＬＯＩを有する腫瘍で検査された。ＩＧＦ２のＬＯ Ｉを示す全症例において、Ｈ１９プロモーターは、母系遺伝対立遺伝子上の正常 ではメチル化されない部位で９０〜１００％のメチル化を示す(Steenman et al. （1994）Nature Genet．7:433-439;Moulton et al.（1994）Nature Genet．7:44 0-447)。したがって、母系対立遺伝子は父系パターンのメチル化を獲得したが、 これはこれらの腫瘍における同一母系由来染色体上のＩＧＦ２の観察された発現 と一致する。これに対比して、ＩＧＦ２のＬＯＩを伴わない腫瘍はＨ１９のメチ ル化の変化を示さず、このことはこれらの変化が異常なインプリンティングに関 係し、悪性疾患それ自体には関係がないことを示す(Steenman et al.（1994）Na ture Genet．7:433-439;Moulton et al.(1994)Nature Genet．7:440-447)。Ｈ１ ９の母系対立遺伝子のメチル化における同一変化は、ＩＧＦ２のＬＯＩを伴うＢ ＷＳ患者で見出される（steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Rei k et al.（1994）Hum．Mol．Genet．3:1297-1301;Reik et al.（1995）Hum．M ol．Genet．4:2379-2385)。 ＬＯＩについての第二の考え得るメカニズムは、第１５染色体のＢＷＳ／ＡＳ 領域に関して近年記載されたものと同様の、第１１染色体上のインプリンティン グ制御センター（中心）の破壊を包含する(Dittrich et al.（1996）Nat．Genet ．14:163-170)。一群の５つのＢＷＳ均衡生殖系列染色体再配列中断点は、セン トロメア側上のｐ５７^KIP2とテロメア側のＩＧＦ２およびＨ１９との間にある。 (Hoovers et al.(1995)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:12456-12460)。 したがって、この領域に広がる遺伝子の破壊は、少なくとも生殖系列により遺伝 される場合、ＢＷＳおよび／または癌と同様に、異常インプリンティングを引き 起こし得る。 ＬＯＩに関する別の考え得るメカニズムは、一旦このようなパターンが生殖系 列において確立されれば、ゲノムインプリンティングの正常パターンを確立し、 保持し得るトランス作用因子の損失を包含する。導入遺伝子のインプリンティン グは宿主株依存性であるため、インプリンティングのトランス作用修飾因子が存 在すると思われる(Sapienza et al.（1990）Develop．107:165-168;Allen et al .（1990）Cell 61:853-361)。したがって、このような遺伝子はヒトおよびその 他の種において腫瘍サプレッサー遺伝子として作用する。 癌において破壊され得るインプリンティングのさらに別の考え得るメカニズム は、ヒストン脱アセチル化を伴い、これは哺乳類ではＸ不活性化（Wolffe，A.P. （1994）Develop．Genet.15:463-470）に、酵母菌ではテロメアサイレント化（T hompson et al.（1994）Nature 369:245-247）に関連する。ヒストンアセチラー ゼおよびヒストンデアセチラーゼの両方に関する遺伝子は、近年単離された(Bro wnell et al.(1996)Cell 84:843-851;Taunton et al.(1996)Science 272:408-41 1)。さらに、酵母菌におけるテロメア無症候化も、特定の遺伝子、例えばＳＩＲ １−ＳＩＲ４の作用を伴い、このいくつかは哺乳類における相同物を有する(Bra chmann et al.(1995)Genes Develop．9:2888-2902)。同様に、哺乳類における遺 伝子サイレント化のいくつかの例は、位置依存性後成的サイレント化の一形態で あるショウジョウバエにおける位置−作用変動に類似し得る(Walters et al.（1 996）Genes Develop.10:185-195)。最後に、母系および父系染色体上のインプリ ントされた遺伝子座は、ＤＮＡ複製中に相互作用し得る。インプリントされた遺 伝子を保有する染色体領域は、複製および同時性を示す(Kitsberg et al.（1993 ）Nature 364:459-463)。さらに、いくつかのインプリントされた遺伝子のうち の２つの親相同物は、後期Ｓ期において非無作為的な近位性を示す（LaSalle，J .M．and Lalande，M.（1996）Science 272:725-728)が、このことはショウジョ ウバエにおける後成的なサイレント化に関して観察されているように、ある形態 の染色体クロストークを示唆する (Tatof，K.D．and Henikoff，S.（1991）Cell 65:201-203)。 ヒトＩＧＦ２およびＨ１９遺伝子は正常にインプリントされる。即ち特定の親 対立遺伝子の選択的発現を示す(Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749;Zh ang，Y．and Tycko，B.(1992)Nat．Genet．1:40-44;Giannoukakis et al.(1993) Nat．Genet．4:98-101;Ohisson et al.(1993)Nature Genet．4:94-97;Ogawa et al.(1993b)Nature 362:749-751)。さらに、前記のように、いくつかの腫瘍は癌 におけるインプリンティングの損失（ＬＯＩ）を蒙り、下記の１つ又はそれ以上 を伴い：ＩＧＦ２の二対立遺伝子発現(Rainier et al.（1993）Nature 362:747- 749;Ogawa et al.（1993b）Nature 362:749-751)、Ｈ１９の後成的なサイレン ト化(Steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Moulton et al.（1994 ）Nature Genet．7:440-447)、および／または父系Ｈ１９対立遺伝子の異常発現 (Rainier et al．（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6384-6388)、そして この観察は広範な種々の小児期および成人の悪性疾患にまで及んだ(Rainier et al.(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6384-6388；Suzuki et al.（1994）N at．Genet．6:332-333)。ＬＯＩは正常な非メチル化母系Ｈ１９対立遺伝子の異 常なメチル化に関連するため、正常なインプリンティングは、Ｈ１９の対立遺伝 子特異的、組織非依存性メチル化により一部保持され得る(Steenman et al.（19 94）Nature Genet．7:433-439；Moulton et al.（1994）Nature Genet．7:440-4 47)。 ゲノムインプリンティングの変化は、近年、ヒトの癌で同定されており、一般 に小児期および成人の悪性疾患の両方に現れる。当業界では異常なインプリンテ ィングおよび疾患状態とのその関連が教示されているが、しかしこのような細胞 に対して正常なインプリンティングを復元する方法は、当該技術分野にはない。 したがって、細胞への正常パターンのインプリンティングを復元する方法が、当 該技術分野には必要である。 発明の概要 インプリンティングに関連した疾患の診断および治療のための組成物および方 法が提供される。このような組成物および方法は、細胞へのインプリンティング の正常なパターンを復元するのに有用である。組成物は、インプリンティングに 関与する薬剤を包含する。この薬剤は、細胞へのインプリンティングの正常なパ ターンを復元し得る。このように、この組成物および方法は、異常なインプリン ティングに関連した疾患を有する患者の治療に用途を見出す。このような方法は 、インプリンティングの正常なパターンを復元するための薬剤による治療に反応 するであろう患者において、ある種の癌または悪性細胞増殖を含む疾患および疾 患サブタイプを同定するための診断マーカーとしても用いられ得る。 本発明の方法は、異常にインプリントされた染色体および遺伝子に対して、正 常にインプリンティングを復元させることによりそれらの効果を発揮する薬理学 的化合物を同定するための手段を含む。この実施態様では、どの薬剤が、そして 他の薬剤を開発するためのどのリード化合物がインプリンティング関連疾患の診 断および治療に有用であるかを判定するために、基準となる細胞系（即ち、正常 または異常なインプリンティングを伴う細胞系）に対して薬剤を試験するための 方法が提供される。どの薬剤がインプリンティングに関連する疾患の診断および 治療に有用であるかを判定するために、国立癌研究所National Cancer Institut e（ＮＣＩ）データベース中の細胞系のように基準となる細胞系に対して薬剤を 試験するための方法が提供される。さらに、このような化合物、このような化合 物を含む組成物、およびそれらの使用方法が包含される。 本発明はさらに、癌または悪性細胞増殖を発症する個体の傾向を判定するため の方法である。このような診断は、関心の細胞に対するインプリンティングのパ ターンの判定を含む。判定後は、異常なインプリンティングが見出されるところ で予防的な療法をすることができる。これらの場合、本発明の方法を用いて悪性 細胞を治療し、そしてインプリンティングの異常なパターンを示す正常なまたは 前疾患の細胞に正常パターンのインプリンティングを復元することができる。 同様に、本発明の方法を用いて、特定の個体における特定の悪性増殖の治療の た めに特殊化されたレジメン（養生法）が開発され得る。このような個別化なレジ メンは、正常細胞に対して最小限の損傷しか与えない癌または悪性疾患の治療と して有用である。 多数のタイプの癌または臓器の特異的な悪性細胞増殖のように、特に親由来の 特異的染色体のまたは遺伝子の改変に関連し、異常なインプリンティングに関連 したヒト疾患の診断および治療に有用な薬剤組成物が提供される。根元的なイン プリンティングメカニズムが未だ明らかにされていないインプリンティングに関 連する癌または悪性細胞増殖の診断および治療に有用な薬剤組成物を本発明は包 含する、ということに留意することは重要である。言い換えれば、本発明は、悪 性な増殖を抑制することにより、開示した治療方法に応答するあらゆる好結果の 癌の診断および治療を包含する。 図面の簡単な説明 添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読めば、本発明はさらによく理 解される。この場合、同一の参照番号は全体を通して同一のエレメントを示す。 図１は、ＬＯＩを伴う腫瘍細胞のインプリンティングに及ぼす５−ａｚａＣｄ Ｒの作用を示す。Ａ）ＩＧＦ２の選択的な対立遺伝子の発現へのスイッチング。 ０、０．３、０．６または１．０μＭ ５−ａｚａＣｄＲ（表示された）により １回、２４時間の処置をした後にＪＥＧ−３細胞から抽出されたＲＮＡ全体につ いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。２つのレーンは、逆転写酵素を用いた場合と用 いない場合の同時実験を示す。ＰＣＲ生成物をＡｐａ Ｉで消化した。ａおよび ｂ対立遺伝子は、それぞれ２３６および１７３ｂｐである。Ｂ）Ｈ１９発現の誘 導。５−ａｚａＣｄＲによる処置後のＪＥＧ−３細胞におけるＵ１９の発現を、 ノーザンブロット分析により測定した。ブロットを、負荷に対する対照としての ＧＡＰＤＨと再ハイブリダイズした。Ｃ）Ｈ１９の一対立遺伝子の発現へのスイ ッチング。前記（Ａ）と同様に、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ生成物をＡｌ ｕ Ｉで消化して、対立遺伝子の特異的発現を検出した。ａおよびｂ対立遺伝子 は、それぞれ２２７および１００ｂｐである。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは定量的で はなく、３組のＲＮＡの合計 量は正規化されなかったことに留意しておく。 図２は、Ｈ１９プロモーターのメチル化に及ぼす５−ａｚａＣｄＲの作用を示 す。（Ａ）５−ａｚａＣｄＲで処置後のＨ１９のメチル化の減少。０、０．３、 または１．０μＭ ５−ａｚａＣｄＲで処置した細胞からＤＮＡを抽出し、Ｐｓ ｔ ＩおよびＳｍａ Ｉで消化して、前記のようにＤＮＡのメチル化を検定した 。１．８ｋｂ断片はメチル化されているＤＮＡを示し、１．０ｋｂ断片は非メチ ル化されているＤＮＡを示す。（Ｂ）メチル化による変化の対立遺伝子の特異性 。ＢａｍＨ ＩおよびＨｐａ ＩＩにより消化したＤＮＡをＰＣＲにより増幅し 、Ａｌｕ Ｉで消化して、対立遺伝子に特異的なメチル化を検出した。Ａおよび Ｂの対立遺伝子（表示）は、それぞれ２２７および１００ｂｐである。 図３は、ウィルムス腫瘍のような数種の癌で生じる、ＬＯＩの統一モデルを示 し、これは腫瘍のサプレッサー遺伝子の後成的なサイレント化、ならびに増殖促 進遺伝子の正常なサイレント対立遺伝子の活性化の両方を説明する。このモデル によれば、ＬＯＩは、例えばウィルムス腫瘍の場合、母系から父系への、後成型 の染色体領域におけるスイッチングを包含する。したがって、ＩＧＦ２は、二対 立遺伝子発現を示し、Ｈ１９は後成的なサイレント化を受ける。しかしながら、 このモデルは普遍的であることを意味しない。例えば、すべての腫瘍が３つの遺 伝子、即ちＩＧＦ２、Ｈ１９およびｐ５７^KIP2の発現においてスイッチングを示 す訳ではない。胚芽細胞腫はＩＧＦ２のＬＯＩを示すが、しかしＩＧＦ２の二対 立遺伝子発現を伴う腫瘍は必ずしもＨ１９の後成的なサイレント化を受けない。 実際、正常パターンのインプリンティングがＬＯＩを示す細胞で復元されること ができ、多数の経路またはメカニズムが利用可能になることを本発明は実証した 、と目下認識されている。したがって、本発明は、インプリンティングの正常な パターンの復元においていかなる特定のメカニズムにも限定されない。 特に、図３は、クロマチン構造の変化を経由して(ＤＮＡループとして示され ている)、ＩＧＦ２およびその他のインプリントされた遺伝子（青色楕円形）に 長期シス作用を及ぼすインプリント組織化センター（赤色長方形）を示す。この インプリント組織化センターは、インプリンティングマークを母系または父系と して確定する。この作用は、Ｘ染色体上の組織化センターと同様に、発生中に外 に向かって 伝えられる。インプリンティングは、ＣｐＧアイランドの対立遺伝子の特異的な メチル化、ならびにトランス作用タンパク質（緑色円形）との相互作用により、 一部保持される。このモデルによれば、インプリンティングの損失は、下記のい くつかのメカニズム（図に番号を付した）のいずれによっても生じ得る：(１)イ ンプリンティング組織化センターそれ自体における欠失または突然変異で、これ により生殖系列の親起源の特異的なスイッチングの故障が引き起こされる；(２) ＢＷＳ生殖系列の染色体再配列の場合に認められるような、インプリントされた 標的遺伝子からのインプリント組織化センターの分離；(３)ＣｐＧアイランドの 異常なメチル化；(４)標的のインプリントされた遺伝子それ自体を制御する調節 配列の局所突然変異；または（５）正常なインプリンティングを保持するトラン ス作用因子のための遺伝子の損失または突然変異。図は、Feinberg et al.(1994 )Cambridge University Press，19:273-292（この記載内容は、参照により本明 細書中に含まれる）からの修正を加えた図である。 発明の詳細な説明 異常なインプリンティングパターンを有する細胞にインプリンティングの正常 パターンを復元するための組成物および方法が提供される。組成物は、細胞への インプリンティングの正常パターンに関与し、そして復元することができる薬剤 を含む。本発明の組成物および方法は、あらゆる種類の細胞において正常なイン プリンティングを復元するために使用することができる。特に興味深いのは真核 細胞、特に植物および哺乳類の細胞、特にヒトの細胞である。 インプリンティングは、植物および哺乳類の真核細胞で観察されている(Yoder and Bestor（1996）Biol．Chem．377（10）:605-610)。ヒトまたはその他の哺 乳類では、正常インプリンティングはいくつかの基本的な細胞のおよび発生の過 程が土台となる。したがって、異常なインプリンティングパターンは、広範な種 々の破局的なヒト疾患に関係がある。本発明により提供されるような正常なイン プリンティングパターンの復元は、異常なインプリンティングに関連した疾患の 診断、予防および治療に有用である。インプリンティングは、配偶子または接合 子中のそ れが存在する遺伝子または染色体の特定の親対立遺伝子の後成的な修飾と定義さ れ、子孫の体細胞中の２つの対立遺伝子の特異な発現を引き起こす。 本発明の方法は、細胞にインプリンティングの正常パターンを復元するのに使 用することができる。「インプリンティングの正常パターン」とは、インプリン トされた遺伝子の片親対立遺伝子の選択的な発現および／またはインプリントさ れた遺伝子の片親対立遺伝子の選択的なメチル化を意味する。「インプリンティ ングの損失またはＬＯＩ」とは、正常パターンのインプリンティングの損失、即 ち、インプリントされた遺伝子の片親対立遺伝子の選択的な発現の損失および／ またはインプリントされた遺伝子の片親対立遺伝子の選択的なメチル化の損失を 意味する。ＬＯＩは、種々の異常な発現パターンにより示される。このようなパ ターンとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：両対立遺 伝子の等しい発現；正常例が１つの対立遺伝子の完全なサイレント化である場合 における正常なサイレント対立遺伝子の有意（＞５％）な発現；インプリントさ れた遺伝子の正常な発現コピーの後成的なサイレント化；正常例は単一の対立遺 伝子のメチル化である場合における、両対立遺伝子のメチル化の非存在および／ または両対立遺伝子のメチル化。 本発明の組成物および方法は、このような正常パターンのインプリンティング を復元するよう働く。このような方法および組成物は、遺伝子発現の程度および パターンの両方を調整することができる。 したがって、本発明の目的のためには、「正常インプリンティングの復元」と は、インプリントされた遺伝子の片親対立遺伝子の選択的な発現を復元すること を意味する。正常なインプリンティングを復元するためには種々のメカニズムが 利用可能であり、このようなメカニズムはすべて本明細書中に包含されると認識 される。このようなメカニズムを以下に挙げる：処置前に有意な比較可能なレベ ルで両対立遺伝子が発現される場合における対立遺伝子対の１つのコピーの相対 的なサイレント化；正常に発現される同一親対立遺伝子の選択的な発現の復元； 正常な組織中で観察されるものとは逆のパターンでの特定の対立遺伝子の選択的 な発現(対立遺伝子スイッチング)；２つのコピーがサイレント化されていた場合 のインプリントされた遺伝子の１つのコピーの再発現；対立遺伝子対のメチル化 の正常パターンの復 元、即ち、一方の対立遺伝子がメチル化され、他方の対立遺伝子がメチル化され ない場合、異常なインプリンティングが両対立遺伝子上のメチル化の非存在によ り、あるいは両対立遺伝子のメチル化により示される場合；ならびにその他のメ カニズムである。各メカニズムで重要なことは、片親対立遺伝子の選択的発現が 復元されることである。 本発明の組成物および方法は、異常なインプリンティングに関連した疾患の治 療に有用である。いくつかの場合、異常なインプリンティングを示す遺伝子が明 らかにされている。癌の場合には、特に、多数の遺伝子が正常な発現対立遺伝子 の後成的にサイレント化を伴うインプリンティングの損失を示す。このような遺 伝子としてはＨ１９、ＩＧＦ２、ｐ５７^KIP2が挙げられるが、これらに限定され ない(Matsuoda et al.（1996）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3026-3030;およ びThompson et al.（1996）Cancer Res．56:5723-5727)；ＴＳＳＣ３；ＫｖＬＱ Ｔ１(Lee et al.(1997)Nature Genetics 15:181-185;Rainier et al.（1993）Na ture 362:747-749)。しかしながら、本発明の方法は、疾患に関与する遺伝子の 認知に依らない。本発明の組成物および方法は、関与する遺伝子または遺伝子群 が分からない場合でも、インプリンティングの正常パターンを復元するよう働く 。 本発明の方法は、多数の組織に影響を及ぼす一連の疾患に関与する細胞にイン プリンティングの正常パターンを復元するための使用を提供する。今日までのと ころ、このような疾患としては以下のものが挙げられる：親特異的二染色体によ り引き起こされるプラーダーヴィリおよびアンゲルマン症候群(Nicholls et al. （1989）Nature 342:281-285;Knoll et al.（1989）Am．J．Med．Genet．32: 285-290;Knoll et al.（1990）Am．J．Hum．Genet．47:149-155;Mattei et al.( 1984)Hum．Genet 666:313-334;Nicholls et al.(1993)Curr．Opin.，Genet．Dev ．3:445-446;Dittrich et al.（1996）Nat．Genet．14:163-170;Ledbetter et a l.（1995）Hum．Mol．Genet．4:1757-1764)；筋緊張性ジストロフィー(ＤＭ)、 ハンチントン病(ＨＤ)、１型脊髄小脳性運動失調(ＳＣＡ１)、脆弱Ｘ症候群(Ｆ ＲＡＸＡ)、ならびに１および２型神経繊維腫症（Chatkupt et al.（1995）J．N eurol．Sci．130:1-10） ；精神分裂病（Ohara et al.（1997）Biol．Psychiatry 42（9）:760-766）；自 己免疫疾患(Politaev and Selifanova（1994）Life Sci．54:1377-1381;Kerzin Storrar et al.（1988）Neurology 38:38-42)。 さらに、正常なインプリンティングパターンの損失は、腫瘍形成および特定の 癌、例えばウィルムス腫瘍(Ogawa et al.（1993）Nature 362:749-751)；横紋筋 肉腫(Zhan et al.(1994）J．Clin．Invest．94:445-448)、ユーイング肉腫(Zhan et al（1995)Oncogene 11:2503-2507)；生殖細胞腫瘍(van Gurp et al.（1994 ）J．Natl．Cancer Inst．86:1070-1075)；絨毛癌(Hashimoto et al.(1995)Nat ．Genet．9:109-110)、肺癌(Suzuki et al.(1994)Nat．Genet．6:332-333)、胚 芽細胞腫瘍(Rainier et al.（1995）Cancer Res．55:1836-1838)；胞状奇胎(Kaj ii and Ohama（1977）Nature 268:633)；単為生殖性卵巣tetromas(Linder et al.（1975）N．Eng．J．Med．292:63-66)；パラガングリオーマまたは糸球腫瘍( Van Der May et al.(1989)Lancet 2:1291-1294)；神経芽細胞腫における父系対 立遺伝子の選択的増幅を示す(Cheng et al.（1993）Nature Genet．4:187-19 0)；網膜芽細胞種(Naumova et al.（1994）Am．J．Hum．Genet．54:274-281)； 白血病(Momparler et al.(1997)Anti-Cancer Drugs 8:358-368;Petti et al.（1 993）Leukemia 7(Supp．1）:36-41)；肝細胞癌およびそれらの正常組織(Takeda et al.（1996）Oncogene 12:1589-1592)；食道癌(Hibi et al.(1996)Cancer Res ．56:480-482)；肺癌(Suzuki et al.（1994）Nat．Genet．6:332-333およびKond o et al.（1995）Oncogene 10:1193-1198)；副腎皮質癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌 、結腸癌、精巣癌、前立腺癌(Hu et al.(1997)Genomics 46:9-17，Jarrard et al.（1995）Clin．Cancer Res．1:1471-1478)、ならびにベックウィズ−ヴィ ーデマン症候群(ＢＷＳ)(Henry et al.（1991）Nature 35:609-610）の進行に特 に関連する(Rainier et al.(1993)Nature 362:747-749;Feinberg et al.（1993 ）Nature Genet．4:110-113;Feinberg et al.(1995)J．Natl．Cancer Inst．Mon ographs 17:21-26)。黒色腫、白血病、そして卵巣、腎臓および中枢神経系起源 の癌も含まれる。 さらに別の癌および／または疾患も異常なインプリンティングに関連する、と 認識されている。本発明の方法は、これらの疾患に適用可能であり、この場合、 インプリンティングの正常パターンがこのような細胞中に復元され得る。 ＬＯＩは、増殖促進遺伝子の正常なサイレントコピーの活性化、腫瘍サプレッ サー遺伝子の正常な転写コピーのサイレント化、またはその両方を伴い得る。こ れらの変化は、ある染色体から後遺伝子型の他の染色体へのスイッチングを伴い 得る。例えば、母系染色体は後遺伝子型の父系染色体にスイッチングされ得る。 本発明の組成物は、細胞のインプリンティングパターンを変え得る薬剤を含む 。このような薬剤としては、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラー ゼＩＩ、ＤＮＡ合成、微小管形成およびヒストン脱アセチル化の阻害剤などのよ うなＤＮＡのメチル化に関与する薬剤が挙げられる(Wachsman（1997）Mutat Res 375（1）:1-8)。このような薬剤の特定の例としては、５−ａｚａＣｄＲ、トリ コスタチンＡ、ランカシジン、ベンゼンアミン、ブループラチナウラシル、シク ロヘキサン酢酸およびメチル １３−ヒドロキシ−１５−オキソ−カウレノエー トなどが挙げられる。 ゲノムインプリンティングに関与するさらに別の薬剤を同定するための方法が 提供される。特に興味深いのは、異常にインプリントされた細胞にインプリンテ ィングの正常パターンを復元することができる薬剤の同定である。このような薬 剤の同定方法は、細胞への薬剤の投与、予備処置期間の細胞または基準となる細 胞系のものと比較した場合の細胞のインプリンティングのパターンの判定を含む 。多数のヒト癌細胞系は、関心のある薬剤によるインプリンティングの作用を試 験するために利用可能である（例えば、Weinstein et al.（1997）Science 275: 343-349（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照)。関心のあ る薬剤の投与は、単独で、または他の薬剤との組合せて行うことが可能である。 細胞は、異常にインプリントされた細胞にインプリンティングの正常パターンを 復元することができる既知の薬剤に対するそれらの性質を基礎にして選択され得 る(例えば、本明細書中の実施例を参照)。 インプリンティングに関与する薬剤を試験するための組合せアプローチを用い 得る、ということも認識される。したがって、細胞にインプリンティングの正常 パタ ーンを復元することができる化学化合物の選択方法が提供される。このような方 法は、Weinstein et al.（1997）Science 275:343-349に記載されているような 薬剤発見プログラム系への化合物の投与を包含する。インプリンティングの正常 パターンを復元する能力に関して試験される化合物は、このような細胞に投与さ れる。ＬＯＩの逆転を示すこれらの化合物が、さらなる試験のために選択される 。 試験される化合物は、有機化合物、ペプチド、化学的修飾または置換を含有す るペプチドなどである。このような化合物の合成方法は、当該技術分野のものを 利用することができる。組合せによる化学的なアプローチを用いることもできる 。このようなアプローチは、選択のために利用可能な分子の多様性の範囲を増大 させ、生物学的活性の調査がされる分子の無作為的な収集の範囲をより大きく広 げる(一般的には、John N．Abelson（ed.）Methods in Enzymology，Combinator ial Chemistry，Vol.267，Academic Press（1996）(この記載内容は、すべて参 照により本明細書中に含まれる)参照)。同様にして、一旦リード化合物が同定さ れると、それらはこのような組合せによる化学的な方法を用いて修飾することが でき、より大きい作用または安定性を有する化合物または薬剤を選択することが できる。 ペプチドは無作為に合成され、その後、インプリンティングに関与するものに 関して試験してもよい。このような無作為ペプチドライブラリーの作成方法は、 既知である(例えば、米国特許第５，２７０，１７０号；第５，４９８，５３０ 号；およびH．M．Sassenfeld（1990）TIBTECH 8:88-93（これらの記載内容は、 参照により本明細書中に含まれる）参照)。 同一効果は、活性を示すタンパク質の一部の遺伝子の伝達によっても成し遂げ 得る。遺伝子の伝達のためのこのようなベクターは当業界で利用可能であり、そ の例としては以下のものが挙げられる：ＳＶ４０ウイルス(例えば、Okayama et al.(1985)Molec．Cell Biol．5:1136-1142参照)；ウシパピローマウイルス(例え ば、DiMaio et al.（1982）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:4030-4034参照)； アデノウイルス(例えば、Morin et al.（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 :4626;Yifan et al.（1995）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:1401-1405;Yang et al.（1996）Gene Ther．3:137-144;Tripathy et al.（1996）Nat．Med．2:545-550;Quantin et al．（1992）Proc．Natl.Acad .Sci.USA 89:2581-2584;Rosenfeld et al.(1991)Science 252:431-434;Wagner（ 1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6099-6103;Curiel et al.（1992）Human Gene Therapy 3:147-154;Curiel（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:8850- 8854;LeGal LaSalle et al.（1993）Science 259:590-599;Kass-Eisler et al. （1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:11498-11502参照)；アデノ関連ウイル ス(例えば、Muzyczka et al.（1994）J．Clin．Invest．94:1351;Xiao et al.（ 1996）J．Virol．70:8098-8108参照)；単純ヘルペスウイルス(例えば、Geller e t al.(1988)Science 241:1667;Huard et al.(1995)Gene Therapy 2:385-392;米 国特許第５，５０１，９７９号参照)；レトロウィルスベースのベクター（例え ば、Curran et al.（1982）J．Virol．44:674-682;Gazit et al.（1986）J．V irol．60:19-28;Miller，A.D.（1992）Curr．Top．Microbiol．Immunol．158:1- 24;Cavanaugh et al.(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA91:7071-7075;Smith et al.(1990)Molecular and Cellular Biology 10:3268-3271参照）(これらの記載 内容は、参照により本明細書中に含まれる)。 同様に、ペプチドはあらゆる哺乳類発現ベクターに用い得る(例えば、Wu et a l.（1991）J．Biol．Chem．266:14338-14342;Wu and Wu（J．Biol．Chem.（1988 ）263:14621-14624;Wu et al.（1989）J．Biol．Chem．264:16985-16987;Zenk e et al.（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3655-3659;Waqner et al.（1 990）87:3410-3414)参照)。 本発明のベクターの構築のための標準的技法は当業者には周知であり、Sambro ok et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd ed.（Cold Spring H arbor，New York，1989）といった参考文献に見出される。ＤＮＡの断片を結紮 するために種々の戦略が利用可能であり、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に 依っており、選択は当業者により容易になされ得る。 インプリンティングのパターンの判定方法は、当業界では知られている。本方 法は分析される遺伝子によって変わり得る、と認識される。一般に、対立遺伝子 特異 的遺伝子発現の検定方法では、ＲＮＡは逆転写酵素により逆転写され、次に、そ の部位が多形的である（即ち、集団で正常に変化可能である）エキソン内の部位 に及ぶＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲが実施され、そしてこの分析は多形性に 関してヘテロ接合性である（即ち情報を与え得る）個体で実施される。次に、多 数の検出計画のいずれかを用いて、一方または両方の対立遺伝子が発現されるか 否かを判定する。遺伝子発現、対立遺伝子の特異的遺伝子発現およびＤＮＡのメ チル化の査定方法が包含される(本明細書中の実施例の項を参照)。さらに、新規 のインプリントされた遺伝子を同定するための直接的アプローチとしては以下の ものが挙げられる：他の既知のインプリントされた遺伝子の近くのインプリント された遺伝子を同定する目的でのポジショナルクローニング（Barlow et al. （1991）Nature 349:84-87）の試み；単為生殖胚における遺伝子発現と正常胚の 場合とを比較する技術(Kuroiwa et al.（1996）Nat．Genet．12:186-190)；そし て制限ランドマークゲノムスキャニング(Nagai et al.（1995）Biochem．Biophy s．Res．Commun．213:258-265)。Rainier et al.(1993)Nature 362:747-749(こ れは、ＲＮＡを逆転写し、ネスティドＰＣＲというよりむしろ単一の環を可能に する新規のプライマーを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅することによるＩＧ Ｆ２およびＨ１９の対立遺伝子の特異的な発現の査定を教示する)；Matsuoka et al.（1996）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3026-3030(ｐ５７^KIP2における転 写多形の同定を教示)；Thompson et al.（1996）Cancer Research 56:5723-5 727(Ｐ５７^KIP2の対立遺伝子の特異的な発現のＲＰＡおよびＲＴ−ＰＣＲ分析に よるｍＲＮＡレベルの確定を教示)；そしてLee et al.（1997）Nature Geneti cs 15:181-185（２つの多形部位のＲＴ−ＰＣＲ ＳＳＣＰ分析を教示）も参照 のこと。このような開示は、参照により本明細書中に含まれる。 一旦薬剤が同定されれば、それらの薬剤は癌の、即ち組織または器官の悪性増 殖、ならびに前記のような異常インプリンティングに関連した他の疾患の治療ま たは予防のための方法に用い得る。このような方法は、それが必要な患者にイン プリンテイングの正常パターンを復元し得る有効量の薬剤の投与する工程を含む 。治療の必要性は、患者が標的細胞における根元的な異常パターンのインプリン ティングおよび特定の疾患に伴う症状の両方を示すという観察に基づく。予防の 必要性は、標的 細胞における根元的な異常インプリンティングパターンの観察に基づく。 「有効量」とは、それらの細胞にインプリンティングの正常パターンを復元す るのに必要な標的器官のまたは組織の細胞中における薬剤の濃度を誘導する量を 意図する。このような有効量は、薬剤（または化合物）毎に変わり得る。このよ うな有効量は、二次的作用である正常細胞への細胞毒性が最小限に保持され得る ように、培養中の癌細胞に投与され得る、ということが示されている。例えば、 このような結果は、０．３〜１．０μＭの５−ａｚａＣｄＲ中で２４時間培養さ れた腫瘍細胞を用いて得られた(本明細書の実施例の項参照)。本明細書中に記載 された同一または同様の薬剤のいくつかは一般的な細胞毒性作用を通して抗癌活 性を示し得るが、本発明は、異常なインプリンティングを有する標的細胞に及ぼ す一般的な非特異的な細胞毒性作用から明瞭に且つ別個にそれらの第一の作用を 発揮する方法および組成物を述べる、ということを強調すべきである。特定の薬 剤の用量は、腫瘍細胞でインビトロ（in vitro）で用いられた用量を基礎にし て予測され得る。化合物または薬剤が前に用いられたことがない場合、用いられ たことのある他の薬剤とのその関係に基づいて予測をすることができる。特定の 薬剤の予測できる範囲は、in vitroにおいて標的細胞に対応する細胞でさらに試 験して、異常なインプリンティングを変えるのに必要な濃度を決めることができ る。このような有効濃度を用いて、患者における適切な用量および投与方法を推 定し得る。 本発明はこのようには結びつかないが、一般的に細胞毒性作用を発揮するため に薬剤が用いられた場合には、有効量としてここに包含される量は、当該技術分 野で教示されている量を下回る。例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジンを 用いる場合、白血病に関する治療で教示されている従来技術では０．８６〜１． ３ｍＭである。本発明の目的のための同一薬剤の有効量は、約０．３〜約１．０ μＭであり、当該技術分野で教示されている値の１０００分の１の用量である。 薬剤の有効量は疾患の種類および程度、各々の特定の薬剤の薬理学的なパラメ ーター、ならびに特定の薬剤による治療に対する個々の患者の反応性によって変 わる、と認識される。 本発明の方法は悪性な増殖または癌に対する個々のレジメン計画を処方するの に用いることができる。この計画は、上記の変数の点で、特定の患者における特 定の 種類の癌に対して有効な薬剤の決定に基づく。例えば、患者から得られる癌性組 織および正常組織を用いて、細胞のインプリンティングパターンを決定すること ができる。得られた組織から確立される細胞系または一次培養は、細胞への正常 インプリンティングを復元し、ならびに悪性細胞の増殖を抑制し得る標的細胞中 での薬剤の種類および有効濃度を決定するために使用することができる。これに より、正常細胞に対する最小度の細胞毒性を有する有効なレジメンの提供が可能 になる。特定の作用物質または薬剤は、特定の患者のいくつかの癌には有効であ るが、他のものでは有効でない、と当業技術分野では認識される。本明細書中の 方法により、医者はある個体に特に適したレジメンを設計できる。 本発明の組成物は、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内および関節 内）投与に適した薬剤処方物として提供され得る。本発明の処方物は、生理学的 または製薬上許容可能な担体、例えば水性担体中に薬剤を包含する。このような 投与は、全身的、あるいは特定の組織または器官への還流を提供する。処方物は 単位投与形態で調製するのが便利であり、当該技術分野で周知のいずれかの方法 により調製され得る。このような処方物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 19th ed.,Osol,A.（ed.）,Mack Easton PA（1980）に記載されている (この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)。指示されたあらゆる場合 に最も適した投与経路は、被験者、処置される症状の性質および重症度、そして 使用中の特定の活性化合物による。 本発明は、種々の疾病のための薬剤の調製のための前記の特徴を有する薬剤の 使用を提供する。本発明による薬剤の製造においては、薬剤または薬剤群が典型 的には、とりわけ許容可能な担体と混合される。あらゆる不活性な製薬上許容可 能な担体、許容可能な純度の滅菌食塩水または水、あるいはリン酸緩衝化生理食 塩水、または本発明の方法に用いるために本発明の組成物が適切な溶解度特性を 有するこのようなあらゆる担体を用い得る。担体は、もちろん、処方物中の他の あらゆる成分と相溶性であるという意味で許容可能でなければならず、そして患 者に有害であってはならない。担体は、固体または液体である。本発明の１つ以 上の薬剤が本発明の処方物に混入され得るが、これらは本質的に、任意に１つ以 上の補助治療成分を含めた成分を混合することからなる薬学上周知な技術のいず れかにより調製され得 る。 処方物の水性および非水性の滅菌懸濁液は、沈殿防止剤および増粘剤を含み得 る。処方物は、単位投与のまたは多段階投与の容器中に、例えば密封アンプルお よびバイアル中に存在し、使用直前に注入するために滅菌液体担体、例えば食塩 水または水を付加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得 る。 さらに別の製薬法が作用持続期間を制御するために使用できる。制御された放 出をする薬剤は、組成物と複合体を形成するかまたは組成物を吸収するためのポ リマーの使用により成し遂げ得る。制御された供給は、適切な高分子物質（例え ばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセ テート、メチルセルロース、カルボシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン） を選択することにより行うことができる。薬剤の放出速度は、このような高分子 物質の濃度を変えることにより制御され得る。 作用持続時間を制御するための別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ 酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーの粒 子のような高分子物質の中に治療薬を組み入れることを含む。あるいは、例えば コアセルベーション技法により、または界面重合により、例えばヒドロキシメチ ルセルロースあるいはそれぞれゼラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メチル メタクリレート）マイクロカプセルの使用により調製されるマイクロカプセル中 に、もしくはコロイド薬剤送達系中に、例えばリポソーム、アルブミン、ミクロ スフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル中に、またはマクロエ マルション中に閉じ込め得る。このような教示は、Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)に開示されている。 投与される薬剤の用量は、実施される特定の方法に依り、被験者に投与されて いる場合には、疾患、被験者の症状、特定の処方物、投与経路等による。概して 、化合物の量は、前記のようにインプリンティングの正常パターンを有効に復元 するために細胞中に必要な化合物の濃度を基礎にして算出される。この量は、化 合物によって変わる。 本発明の組成物は、単独でまたは他の薬剤および癌および悪性の細胞増殖の治 療のための治療薬と、ならびに異常なインプリンティングに関連したその他の疾 患の 治療に有用な他の薬剤と組合せて用い得る。他の薬剤は、当該技術分野では既知 である。 癌または悪性な増殖の一モデルでは、悪性細胞の正常アポトーシス経路は破壊 されている、と仮定される。したがって、細胞は突然変異後に死なず、むしろ生 き残り増殖する。異常なインプリンティングはアポトーシスを抑制し得る(Chris tofori et al.（1994）Nature 369:414-418およびChristofori et al.（1995）N ature Genetics 10:196-201)。本明細書中ではこの仮説に限定されないが、しか し本発明の作用物質および方法は、インプリンティングの正常パターンを復元す ることにより、これらの細胞におけるアポトーシス経路を復元するのに役立ち得 る。このように、本発明の薬剤は、腫瘍細胞を治療する場合に他の薬または薬剤 の作用を増強するよう働く。 本発明の方法は、インプリンティングの異常パターンに関連した疾患の診断お よび分類に、そしてこのような疾患がインプリンティングの正常パターンを復元 する薬剤の投与後に治療に反応するか否かを決定するのにも有用である。例えば 、本明細書中の仕事は、結腸直腸癌患者が癌組織でＬＯＩを示すがこれらの癌患 者の正常粘膜細胞もＬＯＩを示すことを実証する。したがって、ＬＯＩは癌の発 症に先行し、癌あるいは悪性または腫瘍増殖の発症に対する個体の傾向を予測す るのに用い得ると考えられる。 したがって、本発明の方法は癌を発症する個体の傾向を判定するのに使用する ことができる。異常パターンが検出された場合、本発明の薬剤を用いて悪性な増 殖または疾患の開始を予防し得る。このような投与は、正常パターンのインプリ ンティングおよび正常一対立遺伝子発現の復元を生じる。特異的インプリントさ れた遺伝子座の特定の疾患との関連に関してさらに多くの情報が利用できるよう になるので、本発明の方法は、このような疾患に対する個体の傾向を確定する場 合に、そしてこのような疾患の予防および治療のための有効な療法を提供する場 合により広い適用性を獲得する。 実施例 実施例１：腫瘍細胞におけるインプリンティングの損失の逆転 材料と方法 細胞培養および５−ａｚａＣｄＲによる処置。ＪＥＧ−３ヒト絨毛癌およびＣ ＯＬＯ−２０５ヒト結腸腺癌細胞系を、ＡＴＴＣから入手した。細胞を、抗生物 質を含有するＲＰＭＩ １６４０、１０％ウシ胎仔血清、５％ＣＯ₂中で培養し た。６ｃｍ皿中の１０⁴〜１０⁵個の細胞を０．３〜１０μＭ ５−ａｚａＣｄＲ で２４時間処置した。培養をハンクの緩衝化生理食塩溶液中で洗浄し、集密増殖 させた。０．３〜３．０μＭの濃度で最小度（０〜３０％）の細胞毒性が生じた 。 遺伝子発現の分析。 遺伝子発現の定量的分析のために、全ＲＮＡを前記(Cho mczynski，P．and Sacchi，N.(1987)Anal．Biochem．162:156-159)のように単離 し、１０μｇをホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲル中で電気泳 動処理し、Hybond-N＋膜（Amersham）に移して、前記のようにＨ１９およびＩＧ Ｆ２プローブとハイブリダイズさせた(Steenrnan et al.（1994）Nature Genet ．7:433-439)。ＧＡＰＤＨとのハイブリダイゼーションを、ＲＮＡ負荷に関する 対照として用いた。対立遺伝子特異的発現の分析のために、０．５μｇのＲＮＡ をＤＮアーゼＩ（Boehringer Mannheim）で処理し、９５℃に７分間加熱して、 ＩＧＦ２およびＨ１９の両方に関して前記のようにＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ra inier et al.（1993）Nature 362:747-749）が、しかし、プライマーＨＰ１およ びＨＰ２を用いたネスティドＰＣＲ（Hashimoto et al.（1995）Nat．Genet．9 :109-110)をＨ１９分析のために実施した。ＰＣＲ生成物を、前記のように(Tado koro et al.（1991）Nucleic Acids Res．19:6967)、Ａｐａ Ｉ（ＩＧＦ２ 分析のために）またはＡｌｕ Ｉ（Ｈ１９分析のために）で消化し、４％Nusiev e−アガロース（３：１）ゲル上で電気泳動処理した。各試料を、逆転写酵素の 存在下および非存在下で２回分析して、ＤＮＡ夾雑物を除去した。ゲルをブロテ ィングして、³²Ｐ−標識化内部特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749）とハイブリダイズして、Phosphorimager（Mo lecular Dynamics）を用いて定量した。 ＤＮＡメチル化の分析。ＤＮＡメチル化の定量分析のために、前記のように（ Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749）ゲノムＤＮＡを調製し、Ｈ １９プロモーターＣｐＧアイランドのメチル化のサザン分析を、前記のように（ Reik et al.（1994）Hum．Mol．Genet．4:2379-2385）実施した。フィルターを Ｈ１９の１．８ｋｂ ｐｓｔ Ｉ断片とハイブリダイズさせた。これはインプリ ント特異的メチル化を検出する(Steenman et al.(1994)Nature Genet．7:433-43 9)。対立遺伝子特異的メチル化の分析のために、１μｇのＤＮＡをＢａｍＨ Ｉ またはＢａｍＨ Ｉ＋Ｈｐａで消化した。 消化後、１００℃に１０分間加熱して酵素を不活性化し、５０ｎｇの消化ＤＮ Ａを、プライマーＨＰ１（5’-TACAACC-ACTGCACTACCTG-3'）およびＨ３（5’-TG GAATGCTTGAAGGCTGCT-3'）(Hashimoto et al.（1995）Nat．Genet．9:109-110)を 含有する緩衝液Ｆ（Invitrogen）中のＰＣＲ反応ミックスに付加した。最初のサ イクル（９４℃、４分）の後に、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分の 処理を２８サイクル施した。ＰＣＲ生成物（２２７ ｂｐ）をＡｌｕ Ｉで消化 して、３％Nusieve/１％アガロースゲル上で電気泳動処理し、Hybond-N＋膜（Ar nersham）に移して、内部オリゴヌクレオチドプローブ ＨＰ２（5’-TGGCCATGA AGATGGAGTCG-3'）とハイブリダイズさせて、次にPhosphorimager（Molecular Dy namics）を用いて定量した。 結果 ここに記載した実験の目的は、腫瘍細胞におけるインプリンティングの損失（ Ｌ０Ｉ）の何らかの特徴が、ＤＮＡのメチル化の特異的阻害剤である５−アザ− ２’−デオキシシチジン（５’−ａｚａＣｄＲ）により逆転可能であるか否かを 判定することであった。２つの判定基準：即ちそれらはＩＧＦ２およびＨ１９に おける転写多形に関してヘテロ接合性であって、したがってインプリンティング 試験に関する情報を有していた；そして、それらはＬＯＩを示した：の２点を満 たしたものに関して細胞系をスクリーニングすることにより、我々は、モデル系 として２つの腫瘍細胞系、ＪＥＧ−３絨毛癌およびＣＯＬＯ−２０５結腸直腸癌 細胞を選定する。細胞を、我々の実験室(Rainier，S．and Feinberg，A.P.(1988 )Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6384-6388)および他の実験室(Taylor，S.M．a nd Jones，P.A.（1979）Cell 17:771-779）の両方で実験的に決定された濃度で 、 ５−ａｚａＣｄＲで２４時間（約１細胞分裂）処理し、低メチル化を最大にし、 細胞毒性を最小限にした。 ＩＧＦ２のＬＯＩに及ぼす５−ａｚａＣｄＲの作用を、我々は先ず調べた。Ｌ ＯＩを有する腫瘍細胞は、特異的な親対立遺伝子の選択的発現を示す正常なイン プリンティングに対比して、ＩＧＦ２の等しい二対立遺伝子発現を示す(Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749;Ogawa et al.（1993b）Nature 362:749 -751;Rainier et al.（1995）Cancer Res．55:1836-1838;Zhan et al.(1994)J． clin．Invest．94:445-448;Suzuki et al.(1994)Nat．Genet．6:332-333)。予想 通り、未処置腫瘍細胞、ならびにＰＢＳで処置したコントロール腫瘍細胞は、Ｉ ＧＦ２の２つの対立遺伝子とほぼ等しい発現を示した(図１Ａ)が、これはＬＯＩ を示す。これに対比して、５−ａｚａＣｄＲの量を増加させる処置は、２つのＩ ＧＦ２対立遺伝子の等しくない発現を生じさせ、Ａｐａ Ｉ多形部位を欠く対立 遺伝子の選択的な発現を伴った(図１Ａ)。対立遺伝子の選択的な発現は部分的で あり、絶対的ではないが、これらの実験を５回繰り返すと常に同一結果が生じ、 主に発現される対立遺伝子は常に、上部バンドにより示された。したがって、一 対立遺伝子の優勢発現へのスイッチングは５−ａｚａＣｄＲの無作為作用という わけではなかったが、しかし一つの対立遺伝子に特異的であった。５−ａｚａＣ ｄＲによる等しい二対立遺伝子発現から片親対立遺伝子の選択的な発現への一貫 したスイッチングは、二次癌細胞株に関しても観察された。したがって、ＣＱＬ Ｏ−２０５結腸直腸癌細胞の処置もＩＧＦ２の二対立遺伝子発現から主に一対立 遺伝子発現へのスイッチングを示し、同一対立遺伝子は反復実験で選択的に発現 された(データは示されていない)。したがって、５−ａｚａＣｄＲは、ＬＯＩを 有する腫瘍細胞におけるＩＧＦ２の等しい二対立遺伝子発現のパターンを部分的 に阻止した。 次に、Ｈ１９の全体的発現に及ぼす５−ａｚａＣｄＲ処置の影響を、我々は調 べた。早期に我々、そして他の人たちが見出したように、ＩＧＦ２のＬＯＩはウ ィルムス腫瘍におけるＨ１９のダウンレギュレーションに連関する(Steenman e t al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Moulton et al.（1994）Nature Genet ．7:440-447)。未処置ＪＥＧ−３細胞は、ウィルムス腫瘍と同様に、Ｈ１ ９の発現をほとんどかまたは全く示さなかった(図１Ｂ)。０．３μＭまたは１． ０μＭの５−ａｚａＣｄＲによる処置後、腫瘍細胞はＨ１９発現の実質的増大を 示し(図１Ｂ)、Phosphorimager分析により確定した場合、それぞれ３０倍または ５０倍であった。これらの変化も、二次癌細胞系で再現可能であった。したがっ て、ＣＯＬＯ−２０５細胞は、処置前はＨ１９の発現をほとんど全く示さなかっ た。１．０μＭの５−ａｚａＣｄＲによる処置後、細胞はＨ１９発現を２０倍増 大した(データは示されていない)。したがって、５−ａｚａＣｄＲはＬＯＩを有 する腫瘍細胞におけるＨ１９の後成的なサイレント化を阻止した。 腫瘍中ではＨ１９の全休的定量的な発現は相対的に低いにもかかわらず、ウィ ルムス腫瘍におけるＩＧＦ２のＬＯＩはＨ１９の二対立遺伝子発現に関連する(R ainier et al.（1993）Nature 362:747-749)、ということも、我々は早期に観察 している。Ｈ１９の二対立遺伝子発現は、ＪＥＧ−３細胞の特徴でもある(Hashi moto et al.（1995）Nat．Genet．9:109-110)。したがって、Ｈ１９の対立遺伝 子特異的発現を我々は調べた。対立遺伝子特異的発現を反映するＲＴ−ＰＣＲ検 定（Rainier et al.（1993）Nature 362:747-749）を我々は用いたが、しかし全 ＲＮＡレベルを定量するために用いるべきではない。５−ａｚａＣｄＲ処置は、 二対立遺伝子発現から単一のＨ１９対立遺伝子の選択的な発現へ変化させた。こ の変化は、ＩＧＦ２に関して観察されたものより劇的でさえあり、Ａ１ｕ Ｉ多 形部位を含有する対立遺伝子の一対立遺伝子発現を伴うものであった(図１Ｃ)。 ＬＯＩは、父系対立遺伝子の正常なメチル化と同様の程度に、正常に非メチル 化さている母系Ｈ１９プロモーターの異常なメチル化に関連するということを、 我々そして他の人々は早期に示した(Steenman et al.（1994）Nature Genet．7: 433-439;Moulton et al.（1994）Nature Genet．7:440-447;Reik et al.（1994 ）Hum．Mol．Genet．3:1297-1301)。５−ａｚａＣｄＲによる処置がこのインプ リント特異的領域のメチル化を変えたか否かを確かめるために、前記のように(R eik et al.（1994）Hum．Mol．Genet．3:1297-1301)、細胞をＰｓｔ Ｉおよび Ｓｍａ Ｉで消化した。父系対立遺伝子はメチル化され、母系対立遺伝子はメチ ル化されないため、正常細胞は約５０％のメチル化を示す (Steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Moulton et al.(1994)Natu re Genet．7:440-447;Reik et al.(1994)Hum．Mol．Genet．3:1297-1301)。ＬＯ Ｉを有する細胞はメチル化の増大を示し、これは母系対立遺伝子の異常メチル化 を反映する(Steenman et al.（1994）Nature Genet．7:433-439;Moulton et al. （1994）Nature Genet．7:440-447;Reik et al.（1994）Hum．Mol．Genet．3:12 97-1301)。予想通り、ＰＢＳで処理したコントロール細胞は、Ｈ１９ ＣｐＧア イランドのメチル化の増大を示した(図２Ａ)。しかしながら、５−ａｚａＣｄＲ による処置後は、Ｈ１９ ＣｐＧアイランドは５０％に近づくメチル化のパター ンを示した(図２Ａ)。５−ａｚａＣｄＲ処置後のＩＧＦ２インプリンティングの 変化と同様に、ＤＮＡメチル化のこれらの変化も二次癌細胞株ＣＯＬＯ−２０５ で再現可能であった(データは示されていない)。 最後に、これらの変化がゲノムインプリンティングにおける変化に関連し、両 方のメチル化された対立遺伝子に及ぼす５−ａｚａＣｄＲの無作為的に作用には 関連しない場合に予測されたように、５−ａｚａＣｄＲの作用が単一の対立遺伝 子に特異的であるか否かを、我々は問うた。インプリント特異的メチル化を示す Ｈｐａ ＩＩ部位、ならびに遺伝子の２つの対立遺伝子を識別するＡｌｕ Ｉ多 形を含有するＨ１９の領域を、我々はＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ前にゲノムＤＮＡ をＨｐａ ＩＩで消化することにより、５−ａｚａＣｄＲによる細胞の処置の前 および後に対立遺伝子がメチル化されることを我々は決定することができる。こ の分析は、予想通り、両対立遺伝子が５−ａｚａＣｄＲの非存在下でメチル化さ れることを示した(図２Ｂ)。しかしながら、５−ａｚａＣｄＲによる処置後、Ａ ｌｕ Ｉ多形部位を欠く対立遺伝子が主として増幅された(図２Ｂ)。したがって 、５−ａｚａＣｄＲ処置後、Ａｌｕ Ｉを含有しない対立遺伝子は依然としてメ チル化されたままであるが、一方Ａｌｕ Ｉを含有する対立遺伝子はメチル化さ れないようになる。したかって、一対立遺伝子は５−ａｚａＣｄＲにより選択的 に影響を受けた。さらに、ＩＧＦ２メチル化の変化は、５−ａｚａＣｄＲによる 影響を受けず(データは示されていない)、これもこれらの細胞に及ぼす５−ａｚ ａＣｄＲの特異的作用を示す。 要するに、５−ａｚａＣｄＲは、以下の判定基準の各々により、ＬＯＩを有す る 腫瘍細胞への正常なゲノムインプリンティングのパターンを復元した：ＩＧＦ２ の等しい二対立遺伝子発現は５回の反復実験において同一対立遺伝子の選択的発 現にスイッチングした；Ｈ１９の後成的なサイレント化は逆転された；Ｈ１９の 二対立遺伝子発現はすべての実験において同一対立遺伝子の一対立遺伝子発現に スイッチングした；そしてＨ１９プロモーターの低メチル化は、一方の対立遺伝 子の脱メチル化（他方はそうでない）にスイッチングした。ＬＯＩを有する腫瘍 細胞に及ぼすこれらの作用は無作為的ではなく、各場合に、一方の対立遺伝子に 特異的であり、それらは細胞系内および系間の両方で再現可能であった。５−ａ ｚａＣｄＲは反復実験においてＩＧＦ２を母系および父系の対立遺伝子のほぼ等 しい発現を特異的な親対立遺伝子の優勢発現にスイッチングし、そしてＨ１９の 二対立遺伝子発現から一対立遺伝子発現へのスイッチングを、そしてＨ１９発現 の定量的活性化を引き起こす、ということを我々は示した。これらの作用は５− ａｚａＣｄＲに対する無作為的な反応ではなく、または他の腫瘍細胞はＩＧＦ２ およびＨ１９の両対立遺伝子の等しい発現を示し続けた。これらの実験における ５−ａｚａＣｄＲの非無作為的な作用と一致して、Ｈ１９プロモーターのＤＮＡ のメチル化の損失は一対立遺伝子に特異的であった。したがって、５−ａｚａＣ ｄＲ処置はＬＯＩを有する腫瘍細胞に正常パターンのゲノムインプリンティング を付与する。ＩＧＦ２の場合は両対立遺伝子が発現されるため、このパターンは Ｈ１９に関しては完全であり、ＩＧＦ２に関しては部分的であったが、しかし同 一対立遺伝子は反復実験では選択的に発現された。 これらの結果は、３つの重要な意味を有する。第一に、腫瘍細胞における異常 なインプリンティングは薬学的に修飾され得る、ということをそれらは示してい る。５−ａｚａＣｄＲに関する従来の研究により、これらの薬剤が単に両方の染 色体の低メチル化を起こすと当業者は結論づけたため、これらの結果は予測され ない。例えば、第７染色体に関する母系二染色体を用いたマウス細胞の５−ａｚ ａＣｄＲ処置は、その染色体上の正常では無症候性の母系ＩＧＦ２遺伝子の後成 的活性化を引き起こすことを、Eversole−Cire等は過去に示した(Eversole−Cir e et al.(1993)Mol．Cell．Biol．13:4928-4938)。同様に、Hu等は、５−ａｚａ ＣｄＲによる正常ヒト脳細胞の処置がＩＧＦ２を一対立遺伝子の選択的発現のパ タ ーンから等しい二対立遺伝子発現にスイッチングする、ということを近年見出し た(Hu et al.（1993）J．Biol．Chem．271:18253-18262)。これに対比して、Ｌ ＯＩを有する腫瘍細胞を用いた本明細書に記載した実験では、ＩＧＦ２の対立遺 伝子特異的発現のパターンは、予期に反して、等しい二対立遺伝子発現から単一 対立遺伝子の優勢発現にスイッチングされた。したがって、ここに記載した結果 は、従来技術で教示されたものと反対である。 第二に、これらの実験はいくつかのインプリント特異的な情報は依然としてＬ ＯＩを有する腫瘍細胞中に存在するにちがいないことを示す。これらの結果は、 予期に反して、発現に影響を及ぼすＨ１９プロモーターのメチル化がインプリン トとは無関係であり、そしてインプリントは無傷であるが、異常なメチル化によ りマスクされる、ということを示す。第三に、これらの研究は、ＩＧＦ２および Ｈ１９のそのインプリンティングの点で異なる同遺伝子系細胞系を生じるために 、癌における異常なインプリンティングの分子的基礎の理解に向けての新規の実 験的戦略を提供し得る。次に、例えばインプリントされることを我々が見出した ｐ５７^KIP2のような付加的な標的部位での変化に関して(Matsuoka et al.（1996 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3026-3030)、またはこれらの作用を仲介する ために５−ａｚａＣｄＲにより活性化されていたトランス作用因子の変化に関し て、これらの細胞株を試験し得る。ゲノムインプリンティングに影響を及ぼし得 る他の薬剤を発見するために、本明細書中に記載したような細胞または実験を用 い得る。 ５−ａｚａＣｄＲを用いた結果は薬剤開発のための戦略を示すが、しかしこの アイデアは特定の化合物に限定されない。さらに別の薬剤を試験して、それらが インプリンティングの変化を示すか否かを決定した。インプリンティングおよび ／または細胞毒性作用で少なくとも何らかの変化を示す薬剤としては、ランカシ ジン、ベンゼンアミン、ブループラチナウラシル、シクロヘキサン酢酸、メチル １３−ヒドロキシ−１５−オキシ−カウレノエート等が挙げられる。インビボ （in vivo）においてインプリンティングの作用を及ぼさない薬剤でも、生物利 用能、薬剤供給、安定性等を増強するために薬剤が生化学的に修飾されると、こ のような作用を示し得る。 実施例２：個体の癌または悪性的成長の傾向の確定 材料と方法 以下の結腸癌患者および正常コントロールの組織から、ＤＮＡおよびＲＮＡを 調製した。結腸癌、同一患者からの正常粘膜、および結腸癌は有さないが、他の 理由、例えば憩室炎のために結腸を除去された患者からの正常粘膜。液体窒素中 で組織を粉砕し、その後５ｍｌのＴＥ９［５００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０］中に再懸濁することにより、ＤＮＡ を抽出した。プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌに、そしてＳＤＳを１％の最 終濃度に加えた後に、試料を５５℃で一夜インキュベートした。試料をフェノー ル−クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、試料中のＤＮＡをエタノ ール沈殿させて、洗浄し、ＴＥ［３ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ Ｈ７．５］中に再懸濁した。MicroFastTrack ｍＲＮＡ単離キット（Invitrogen ）を用いて、ＲＮＡを調製した。 結果 ８例の情報提供可能な結腸直腸癌を、ＩＧＦ２のＬＯＩを用いて同定した。適 合正常組織の実験は、これら８名のうち６名の患者が正常結腸粘膜細胞のＬＯＩ を有したことを明示した。これに対比して、直腸結腸癌を有さない１６名の情報 提供可能な患者のうち、３名だけが正常粘膜のＬＯＩを有した。これらの患者は 癌を発症する危険性があった、と予測される。結果を下記の表に示す。 これらのデータは統計学的に非常に有意である(ｐ＝０．０１３)。 したがって、正常粘膜中のＬＯＩは、ＬＯＩを有する癌が存在するところに、 癌が存在しない場合より有意に高い割合で認められる。このようなＬＯＩを有す る「正常」細胞では、ＬＯＩは、ＬＯＩを有する癌細胞と本明細書中に記載したア プローチにより可逆的になり得ることが予測される。したがって、そのアプロー チは、ＬＯＩを有する結脳癌に対する化学的な予防戦略として用途を提供する。 同様に、本方法は、ＬＯＩを伴うその他の癌または腫瘍形成の増殖またはその他 の疾患に用途を提供する。 実施例３：参照データベースを用いたインプリンティングの正常パターンを復 元するための新規のリード化合物の同定 ５−アザ−２’−デオキシシチジンがＬＯＩを有する腫瘍細胞に対する正常イ ンプリンティングを復元し得ることを示す結果に基づいて、Weinstein et al. (1997)Science 275:343-349（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれ る）に記載された薬剤発見プログラムを用いて分析を実施した。本プログラムは 、特に相関集団、即ち６０例の参照細胞系に対する５−アザ−２’−デオキシシ チジンと同様の生物学的活性の最大度の相関を示す化合物を探すために用いられ た。最高相関を以下に示す。１２７７１６、６１９００３、６２６８８３、６２ ４６４６、１４５１１８、１８５０５１２、６２６８８４、６２６８８６、６２ ２８１０、１７６８８９、６２２６１６、６２０３５８、６１９９４８、６２２ ４６１、６２４６４５、１５３０９、６３８７３７、２９４７３４、１１２１５ ２、１５３１７４、２０４８１６、７９０３７、６２８０８２、６２０３１９( ＮＣＩ参照番号)。これらは、それらが正常インプリンティングを復元するかま たはそうするように化学的に修飾されるかを決定するためのリード化合物である と考えられる。 本アプローチの一次試験として、これらの化合物のうちの１２のインビボ（in vitro）における作用を、ネガティブコントロールとして生理的食塩水を用いて 分析した。 このようにして同定されたリード化合物は、ＬＯＩを逆転させた。化合物が一 旦同定されると、それらは最大の効果または安定性を得るよう指定してもよい。 このようにして、前記のように同定された化合物を基礎にして、多数の新規の化 合物を開発し得る。このような修飾化合物は、同一データベース中で別々に用い られて、第二の階級のリード化合物を同定し得る。修飾および選択のこのサイク ルは、えり抜きの化合物または作用物質が得られるまで繰り返される。 Hollingshead et al.（1995）Life Sci．57:131-141（この記載内容は、参照 により本明細書中に含まれる）に記載されたような中空繊維検定を用いて、癌細 胞に及ぼすそれらのインビボ（in vivo）細胞毒性作用に関して、化合物を付加 的に試験した。これらの化合物のうち、以下のものが、異種移植片検定に関する 参照のための閾値を上回るスコア、即ち全有効スコア＞２０を有し、多価、また は直接観察されたインビボ（in vivo）細胞屠殺作用を示した。１５３０９、１ １２１５２、１２７７１６(５−アザ−デオキシ−シチジン、即ち、in vitro作 用と同様のin vivo作用)、２０４８１６、６２０３５８、６２４６４６。したが って、文献では教示されていない腫瘍および／または用量に関して、いくつかの 新規の潜在的に有効な化学療法薬が同定された。 ＬＯＩを有するＮＣＩセットの細胞系とＬＯＩを有さないものを同定すること により、ＮＣＩデータベースの異なる使用が実施された。例えば下表を参照。 Ａ群に対しては有効な作用物質であるが、Ｂ群に対してはそうでない化合物を 同定した。このような化合物は、Ａ群の腫瘍に対する正常なインプリンティング を復元する効力および能力に関して試験されるリード化合物である。このような 化合物は、以下のものに対して全身性効力を有する。すなわち、１）一般にＬＯ Ｉを示す種類の腫瘍、２）特別用途の化学療法のためのＬＯＩを有する患者から の個々の腫瘍、そして３）ＬＯＩを有する組織における化学予防。 注：天然誘導体であるために、またはデータベースに入れられてはいるがヒトで 試験されていないために、多数の化合物に名称がない(ヒトで試験されていない 化合物が同定される場合、このような検定方法は当該分野では利用可能である) 。 本明細書に記載した出版物および特許出願はすべて、本発明が属する技術分野 の当業者のレベルを示す。本明細書に記載した出版物および特許出願はすべて、 個々 の出版物または特許出願が特定的に及び別々に参照により組み込まれることが示 されるのと同程度に、参照により本明細書中に含まれる。 前記した本発明は理解を明瞭にするための説明および実施例により詳細に記載 されているが、添付の請求の範囲の範囲内であれば、ある種の変更および修正が 実施され得ることは明らかである。 本発明の多数の修正およびその他の実施態様は、前記の説明および関連図面に 示された教示の利点を有すると、本発明が属する当業者は思い至る。したがって 、本発明は開示された特定の実施態様に限定されないと理解されるべきである。 特定の用語が用いられているが、それらは包括的且つ説明のために用いられてい るだけであり、それらに限定されるものではなく、修正および実施態様は添付の 請求の範囲内に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/555 Ａ６１Ｋ 31/555 31/661 31/661 31/7068 31/7068 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 // Ｃ０７Ｄ 311/94 Ｃ０７Ｄ 311/94 Ｃ０７Ｈ 19/09 Ｃ０７Ｈ 19/09 19/12 19/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｅ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真核細胞において正常なインプリンティングを復元する方法であって、前 記細胞をゲノムインプリンティングに影響を及ぼす有効量の薬剤と接触させる工 程を含み、前記有効量は異常なインプリンティングを示す細胞を標的にするのに 十分であるが一般的な細胞毒性を示さないことを特徴とする方法。 ２．前記真核細胞は哺乳類細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記薬剤はＤＮＡのメチル化、ヒストンの脱アセチル化、トポイソメラー ゼＩＩおよびＤＮＡ合成に対する阻害剤からなる群から選択される請求の範囲第 １項記載の方法。 ４．前記薬剤は５−アザ−２’−デオキシシトジン、トリコスタチンＡ、ラン カシジン、ベンゼンアミン、シクロヘキサン酢酸、ブループラチナウラシル、メ チル １３−ヒドロキシ−１５−オキソ−カウレノエート、スルホニウム、ユー ホルニンＤ、オクタデシルホスホリルクロリン、グニジマクリンおよびアスピク ラマイシンＨＣＬから成る群から選択される請求の範囲第３項記載の方法。 ５．前記接触工程は必要とする哺乳類に有効量の薬剤組成物を投与する工程を 含む請求の範囲第２項記載の方法。 ６．前記投与工程は組織への投与である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記薬剤はＤＮＡのメチル化およびヒストンの脱アセチル化の阻害剤から なる群から選択される請求の範囲第５項記載の方法。 ８．前記薬剤は５−アザ−２’−デオキシシトジン、トリコスタチンＡ、ラン カシジン、ベンゼンアミン、シクロヘキサン酢酸、ブループラチナウラシル、メ チル １３−ヒドロキシ−１５−オキソ−カウレノエート、スルホニウム、ユー ホルニンＤ、オクタデシルホスホリルクロリン、グニジマクリンおよびアスピク ラマイシンＨＣＬから成る群から選択される請求の範囲第７項記載の方法。 ９．異常なインプリンティングを伴う疾患の治療または予防をする方法であっ て、必要とする哺乳類にゲノムインプリンティングに関与する有効量の薬剤を投 与する工程を含むことを特徴とする方法。 １０．前記疾患はウィルムス腫瘍、肺癌、パラガングリオーマ腫瘍、前立腺癌 、 乳癌、結腸癌、膀胱癌、白血病、卵巣癌、腎臓癌および網膜芽細胞腫から成る群 から選択される請求の範囲第９項記載の方法。 １１．前記疾患は組織または器官の悪性な増殖である請求の範囲第９項記載の 方法。 １２．前記薬剤はＤＮＡのメチル化およびヒストンの脱アセチル化の阻害剤か ら成る群から選択される請求の範囲第９項記載の方法。 １３．前記薬剤は５−アザ−２’−デオキシシトジン、トリコスタチンＡ、ラ ンカシジン、ベンゼンアミン、シクロヘキサン酢酸、ブループラチナウラシル、 メチル １３−ヒドロキシ−１５−オキソ−カウレノエート、スルホニウム、ユ ーホルニンＤ、オクタデシルホスホリルクロリン、グニジマクリンおよびアスピ クラマイシンＨＣＬから成る群から選択される請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．標的とする器官または組織中で癌を発症する哺乳類の傾向を診断する方 法であって、前記の器官または組織からの細胞のインプリンティングパターンを 判定する工程を含むことを特徴とする方法。 １５．前記の器官または組織は結腸、乳房、前立腺、肝臓、肺、膀胱、腎臓、 卵巣および精巣からなる群から選択される請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．ゲノムインプリンティングに関与する薬剤を同定する方法であって、薬 剤を細胞に投与する工程および前記細胞のインプリンティングパターンを判定す る工程を含むことを特徴とする方法。 １７．インプリンティングに関与する薬剤を含む薬剤組成物であって、ゲノム インプリンティングに影響を及ぼす有効量の薬剤を含み、前記有効量は異常なイ ンプリンティングを示す細胞を標的にするのに十分であるが一般的な細胞毒性を 示さないことを特徴とする組成物。 １８．前記薬剤はＤＮＡのメチル化およびヒストンの脱アセチル化の阻害剤か らなる群から選択される請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．前記薬剤は５−アザ−２’−デオキシシトジン、トリコスタチンＡ、ラ ンカシジン、ベンゼンアミン、シクロヘキサン酢酸、ブループラチナウラシル、 メチル １３−ヒドロキシ−１５−オキソ−カウレノエート、スルホニウム、ユ ーホルニンＤ、オクタデシルホスホリルクロリン、グニジマクリンおよびアスピ クラマイ シンＨＣＬから成る群から選択される請求の範囲第１８項記載の方法。