JP2001507569A

JP2001507569A - バチルス菌を用いたセルロース結合ドメインの細胞外発現

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Publication number: JP2001507569A
Application number: JP51993698A
Authority: JP
Inventors: エスケルントビョルンバズ，マズ; シューレイン，マルティン; リノヨルゲンセン，ペール
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 2001-06-12
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: EP0975745A1; CN1235635A; CN1183246C; DE69738526T2; WO1998018905A1; EP0975745B1; AU4699797A; DE69738526D1; US6060274A; ATE386799T1; JP4463878B2

Abstract

(57)【要約】セルロース結合ドメイン(CBD)をコードするDNA配列を有するベクターによって形質転換され、且つその配列を発現することができるバチルス菌宿主に関する。その発現したポリペプチドは本質的に１個以上の非触媒ドメインから成り、このセルロース結合ドメインの分子量は４〜35kDの範囲であり、微生物又は植物から、好ましくは細菌又は真菌から得られ、このバチルス菌宿主は、例えばバチルス・サブチリス、バチルス・ライケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィロス及びバチルス・アミロリクエフェイシェンスの１つの菌種である。並びに、このセルロース結合ドメインをコードするDNA配列が挿入され保持されているバチルス菌用の発現ベクター、及びバチルス菌宿主細胞でセルロース結合ドメインポリペプチドを生産する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス菌を用いたセルロース結合ドメインの細胞外発現本発明は、セルロース結合ドメイン(CBD)ポリペプチドを発現することができる形質転換されたバチルス菌宿主、バチルス菌用の発現ベクター、及びバチルス菌宿主細胞でセルロース結合ドメインを生産する方法に関する。発明の背景機能ドメインとしてのCBDに関する焦点は、単一ドメイン分子として、このドメインを合成することであった。最初の純粋なCBDの１つは、自動化固相合成法による合成として得られた(Kraulis P.et al.,1989)。 CBDを、機能的単一ドメインとして、大腸菌で発現させることができることが示された(Ong E.et al)。それによると、この大腸菌で、細胞の周辺質内に、培養液１Ｌあたり33mgの収量でCBDが発現することが開示されている。最近、大腸菌によって、真菌の二重CBD(二量体)を発現させることにも成功した(Linder M．et al.,1996)。しかし、この大腸菌によるCBDタンパク質の発現は、完全な細胞外発現ではなく、その収量は不満足なものであり、CBDを産業規模で生産するためにはあまりに低い。 US 5525195，US 5536655，WO 91/17244及びWO 91/10732には、バチルス菌宿主細胞におけるエンドグルカナーゼ酵素の発現が開示されている。この酵素は、セルロース結合ドメインに作用可能に連結した触媒活性ドメインを有している。従って、本発明の目的は、高収量に、特に従来の発酵技術を用いて、細胞外に CBDを生産する方法を提供することであり、そしてそれによって、CBDの産業応用を経済的に可能にすることである。本発明の要約発明者は、バチルス菌宿主の発現によって、セルロース結合ドメインを生産することが可能であることを見出した。本発明の以前には、バチルス菌におけるCBDの発現は、ほとんど期待されていなかった。なぜなら、１番目に、セルロース結合ドメインはジスルフィド結合を有し、そして２番目に、これは、バチルス菌宿主が生産するプロテアーゼによる分解を潜在的に受けやすいからである。従って、１番目の点として、本発明は、セルロース結合ドメインをコードする DNA配列を有するベクターによって形質転換され、且つそのDNA配列を発現することができるバチルス菌宿主に関する。２番目の点として、本発明は、セルロース結合ドメインをコードするDNA配列が挿入され保持されているバチルス菌用の発現ベクターに関する。さらに３番目の点として、本発明は、バチルス菌宿主細胞において、セルロース結合ドメインポリペプチドを生産する方法であって、作用可能に連結する構成成分として、ａ）転写及び翻訳開始調節領域、ｂ）セルロース結合ドメインポリペプチドをコードするDNA配列、ｃ）転写及び翻訳停止調節領域、ただし、前記の調節領域は、前記宿主細胞で機能するものであり、及び、ｄ）形質転換された宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子；を含んでいる発現カセットによって形質転換されたバチルス菌宿主細胞を、栄養培地中で、セルロース結合ドメインを過剰生産する条件下で、増殖させる過程、及び、このセルロース結合ドメインポリペプチドを回収する過程、を含んでいる前記方法に関する。発明の詳細な説明セルロース結合ドメインは、セルロース及びキチンの水不溶性の形、例えば結晶形に対して、高い結合親和性を有する、すなわち結合するポリペプチドである。 CBDは、２個以上の異なったポリペプチドドメインからなる巨大タンパク質複合体を構成する必須部分として、例えば、典型的に、基質を加水分解する活性部位を含んでいる触媒ドメイン及び不溶性マトリックスに結合するための炭水化物結合ドメイン又はセルロース結合ドメインから成っている加水分解酵素（ヒドロラーゼ）に見られる。この様な酵素は、１個以上の触媒ドメイン、及び１、２又は３個のCBD、及び任意には、触媒ドメインにCBDを連結するポリペプチド領域から構成され得る。最後の部分は、普通、リンカーと呼ばれる。CBDを含んでいる加水分解酵素の例は、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼである。CBDはまた、藻類、例えば紅藻ポルフィラ・プルプレア(Porphyra purpurea)において、非加水分解性の多糖結合タンパク質としても見出されている(Peter Tomme et al.,1996)。しかし、既知のCBDの大部分は、セルラーゼ及びキシラナーゼ由来である。本明細書において、「セルロース結合ドメイン」とは、Tomme et al.（前出）の定義通りである。この定義によれば、120個以上のセルロース結合ドメインは、基質結合の点から、異なる機能又は役割を有すると思われる10個の群(I〜X)に分類される。しかし、本発明に至る研究過程において、従来知られていないCBD が見つかった（実施例８）。将来的には、新しい分類例が出てきて、そしてCBD の分類群が追加されるであろう。前記のタンパク質複合体、典型的には加水分解酵素では、CBDは、N-末端又はC -末端、あるいは内部分に位置している。単量体のCBDは、典型的には、約30〜約250個のアミノ酸残基から成る。例えば、群Iに分類されるCBDは、33〜37個のアミノ酸残基から成る。群IIaに分類されるCBDは、95〜108個のアミノ酸残基から成る。群VIに分類されるCBDは、85〜92 個のアミノ酸残基から成る。従って、単量体のCBDの分子量は、典型的には約４〜約40kDaの範囲にあり、普通は約35kDa未満である。 CBDは、単一ドメインのポリペプチドとして、又は二量体、三量体もしくは多量体として、あるいはタンパク質ハイブリッドの一部分として、有用だろう。「キメラタンパク質ハイブリッド」キメラタンパク質ハイブリッドは、当技術分野において、例えばWO 90/00609 ，WO 94/24158及びWO 95/16782において知られていて、これは、タンパク質の必須部分としてセルロース結合ドメインを含んでいるキメラタンパク質であるよりは、別の起源の、好ましくは別の微生物起源のセルロース結合ドメインを含んでいる。典型的には、このキメラタンパク質ハイブリッドは、酵素ハイブリッドであり、すなわち触媒ドメイン及びこの結合ドメインを共に有する。リンカーを介して、又はリンカーなしに、タンパク質又は酵素をコードするDN A配列に連結された、セルロース結合ドメインをコードするDNA断片を少なくとも含んでいるDNA構成体を、宿主細胞に形質導入すること、及び、その宿主細胞を増殖させて、その融合遺伝子を発現させること、によって、キメラタンパク質ハイブリッド及び酵素ハイブリッドを調製することができる。組換え融合タンパク質又は酵素ハイブリッドは、次の式によって記述することができる： CBD-MR-X （式中、CBDは、セルロース結合ドメインに少なくとも一致するアミノ酸配列によるN-末端又はC-末端領域であり； MRは、中間領域（リンカー）であり、そしてこれは、１つの結合でもよく、又は好ましくは約２〜約100個の炭素原子、より好ましくは２〜40個の炭素原子からなる短い連結基でもよく、あるいは、好ましくは約２〜約100個のアミノ酸、より好ましくは２〜40個のアミノ酸でもよく； Xは、タンパク質又は酵素をコードするDNA配列がコードするポリペプチドによるN-末端又はC-末端領域である）。しかし、内部にCBDを有する組換え融合タンパク質又は酵素ハイブリッドも考えられる。 PCR技術を用いて従来通りに、任意の生物体に由来する、CBDをコードするDNA 配列を得ることができる。そして、現在の知識に基づいて、他の生物体から相同配列を見つけることも可能である。セルラーゼ、キシラナーゼ又は他の植物細胞壁分解酵素をクローニングして、セルロースとの結合を測定することによって、新しいCBDを見つけることができると考えられる。以下に記載する標準条件下に、この酵素活性がAvicelに結合する場合、その遺伝子の一部が、結合ドメインをコードすると考えることができる。 CBDをコードするDNA断片が得られたならば、そのDNA遺伝子を、バチルス菌種の発現に適するベクターに挿入する。例えば、セルロースとの親和性は、Avicel 10gを含んだ緩衝液スラリー(緩衝剤：0.1Mリン酸ナトリウムpH7.5)500mlを用いて測定することができる。これを、室温で、匙を使ってゆっくり撹拌して、30分間膨潤させる。次に、Avicel150 に対してセルロース結合ドメイン１の割合で、酵素を加える。氷上で５〜10分間放置して、最適な結合を得る。次に、このAvicelを洗浄し、結合タンパク質を観察するために、直接にSDS-PAGEにかける。SDSの使用及び加熱によって結合タンパク質が遊離する。あるいは、スラリーをカラムに詰めて、洗浄する。結合タンパク質を、脱イオン水又は高pH緩衝液（例えばトリエチルアミン1%溶液、pH11.2 ）によって溶出し、この溶出タンパク質のpHを直ぐに中性に合わす。いくつかのCBDタンパク質は大腸菌で発現されたが、これを、バチルス菌種で発現及び分泌させることは、これまで報告されていない。大腸菌は、バチルス菌種に対して、異種性タンパク質の発現宿主細胞として、いくつかの利点を有する。１番目に、大腸菌は、異種性に発現させた遺伝子産物が適切に折り畳まれる空間としての周辺質を有する(参考文献：Hockney,R.C.,1994)。特に、発現タンパク質の機能が、適切なジスルフィド架橋に依存する場合には、周辺質内における酸化力及びジスルフィド酸化還元酵素が必要となる(Emmanuel Brun et al.,1995 )。Eur.J.Biochem 231,142-14，及びOng et al.,1993には、エルビニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)から分泌されるエンドグルカナーゼEGZのセルロース結合ドメインの過剰生産、精製及び特性決定が開示されている。ジスルフィド結合を有するCBDの他の例には、シュードモナス・フルオレッセンス亜種セルローサ(P.fluorescens subsp cellulosa)(NCIMB10462)のCelBのN-末端CBD(前出Tomme P.et al.のアライメントを参照すること)、及びセルロモナス・フィミ( Cellulomonas fimi)(ATCC484)のCenAのN-末端CBD(N.R.Gilkes et al.,1991)がある。さらに、大腸菌の周辺質は、細胞外液及び細胞質に存在するプロテアーゼから、異種性に発現したタンパク質を保護する働きもある。バチルス・サブチリスにおいてジスルフィド架橋を有する分泌タンパク質を発現させた場合、発現レベルが有意に減少することも知られている(van den Berg et al.,1993)。異種性タンパク質の発現に伴う別の問題は、発現タンパク質のタンパク質分解である。バチルス・サブチリスでは、少なくとも７種類の細胞外プロテアーゼの発現が知られている(Eds.,A.L.Sonenshein et al.,1993)。特に、高度に疎水性なタンパク質であるCBDの場合、バチルス・サブチリスで発現した時には、そのタンパク質の移動が非常に妨げられ、そして仮にタンパク質が、その疎水性のために、細胞膜に捉えられた場合、その有害な影響によって細胞が死滅さえするだろう。１番目の点として、本発明は、CBDをコードするDNA配列を有するベクターによって形質転換され、且つその配列を発現することができるバチルス菌宿主に関する。明らかに、この発現したポリペプチドは、本質的に１個以上の非触媒性ドメインから成り、すなわちそのポリペプチドは、いかなる触媒活性ドメインも含まない。好ましい実施形態では、発現したCBD又はCBD含有ポリペプチドは、約４kD以上の分子量を有する。この分子量は、好ましくは約35 kD以下であり、より好ましくは約32kD以下、さらに好ましくは約30kD以下、特には約25kD以下である。このCBDを、単一ドメインのポリペプチド、すなわち１個のCBDを有するポリペプチドの形で発現させてもよい。あるいは、このCBDを、二量体、三量体、又は多量体の形で、すなわち、同一CBD単位を２、３又はそれ以上有するポリペプチド又はタンパク質の形で発現させてもよい。このCBDを、多重ドメインのポリペプチドの一部分として発現させることもでき、この様なポリペプチドの非CBD部分は、例えば１、２又はそれ以上の触媒活性を有さないドメインである。ほとんどの任意のCBDを、本発明に従って、すなわち形質転換されたバチルス菌宿主を用いて発現させることができると思われる。好ましくは、この様なCBD を、微生物又は植物から、より好ましくは細菌又は真菌から得ることができる。細菌由来のCBDの例には、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、セルロモナス属（Cellulomonas）、クロストリジウム属(Clostridium)、マイクロバイスポラ属（Microbispora）、マイクロモノスポラ属（Micromonospora）、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属（Streptomyces）、サーモモノスポラ属(Thermomonospora)、バチルス属（Bacillus）、カルドセルム属(Caldocellum) 、エルビニア属(Erwinia)、ミクソコッカス属（Myxococcus）、セルビブリオ属（Cellvibrio）、サーモアナロバクテリウム属(Thermoanaerobacterium)、およびサーモトガ属（Thermotoga）の中の１つに属する菌種から得られるCBDがある。真菌由来のCBDの例には、アガリクス属（Agaricus）、ジクチオステリウム属( Dictyostelium)、フサリウム属（Fusarium）、ヒュミコラ属（Humicola）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix ）、ニューロスポラ属（Neurospora）、リムルス属(Limulus)、ペニシリウム属( Penicillium)、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、およびトリコデルマ属(Tr ichoderma)の中の１つに属する菌種から得られるCBDがある。植物由来のCBDの例には、広範囲の植物から得られるCBDがある。本発明のバチルス菌宿主は、好中性(neutralophilic)、好アルカリ性(alkalop hilic)、中温性(mesophilic)又は好熱性(thermophilic)の宿主細胞である。本発明において有用な宿主の例には、バチルス・サブチリス(Bacillus subtil is)、バチルス・ライケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・メガテリウム (B.megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィロス(B.stearothermophilos)及びバチルス・アミロリクエフェイシェンス(B.amyloliquefaciens)の菌種の宿主がある。しかし、他のバチルス菌種も、CBDを発現する宿主として有用であり得る。以下に詳細に記載する様に、本発明の宿主は、CBDをコードするDNA配列を含んでいるベクターによって形質転換される。好ましくは、このベクターは、宿主ゲノムに組み込まれ、より好ましくは、これは、そのゲノム上で増幅される。好ましい別の実施形態では、このベクターは、発現プラスミドとして、好ましくは多重コピープラスミドとして、存在する。２番目の点として、本発明は、CBDをコードするDNA配列が挿入され保持されたバチルス菌用の発現ベクターに関する。好ましくは、このベクターの発現カッセトには、バチルス菌種由来の調節領域が含まれ、より好ましくは、この様な調節領域は、宿主細胞に内在するものである。３番目の点として、本発明は、CBDポリペプチドを生産する方法であって、作用可能に連結する構成成分として、ａ）転写及び翻訳開始調節領域、ｂ）セルロース結合ドメインポリペプチドをコードするDNA配列、ｃ）転写及び翻訳停止調節領域、ただし、前記の調節領域は、宿主細胞で機能するものであり、及び、ｄ）形質転換された宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子；を含んでいる発現カセットによって形質転換されたバチルス菌宿主細胞を、栄養培地中で、セルロース結合ドメインを過剰生産する条件下で、増殖させる過程、及び、このセルロース結合ドメインポリペプチドを回収する過程、を含んでいる前記方法に関する。４番目の点として、本発明は、バチルス菌宿主におけるCBDの発現を最適化する方法であって、宿主において、レポーター分子に融合したCBDを発現させる過程；及び、そのレポーター分子に固有の１つ以上の性質を測定することによって、発酵した宿主の上清中の存在する発現したCBDの濃度を監視する過程、を含んでいる前記方法に関する。好ましい実施形態では、このレポーター分子は緑色蛍光タンパク質(Green Flu orescent Protein)であり、その固有の性質は、蛍光放射である。５番目及び６番目の点として、本発明は、緑色蛍光タンパク質に融合した１個以上のセルロース結合ドメインから本質的に成るポリペプチドハイブリッド、並びに、バチルス菌宿主の発現によってその様なハイブリッドを生産する方法であって、形質転換培養菌中に実質的に非形質転換細胞が含まれない条件下で、形質転換された宿主を増殖させること；栄養培地中でその形質転換培養菌を培養して、そのハイブリッドを過剰生産すること；及び、そのハイブリッドを回収すること、を含んでいる前記方法に関する。「CBDの発現」「組換え発現ベクター」本発明のCBDをコードするDNA構成体を含んでいる組換えベクターは、組換えDN A技術によって都合よく操作される任意のベクターであろう。このベクターの選択は、しばしば、これを導入しようとする宿主細胞に依存するだろう。この様な宿主細胞へのベクターの導入は、しばしば宿主細胞の形質転換とも呼ばれる。この様な形質転換は、例えば、プロトプラスト、自然のコンピテント細胞、トランスフェクション、接合、電気穿孔法、又はこれらと等価な任意の方法を用いて、宿主細胞にDNAを導入することを指す。従って、このベクターは、自律複製性のベクター、すなわち染色体外体として存在して、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入された場合、その宿主細胞ゲノムに、部分的又は全部分的に組み込まれ、そして組み込まれた染色体と共に複製するものであってもよい。このベクターとしては、本発明のCBDをコードするDNA配列が、そのDNAの転写調節に必要な追加領域に作用可能に連結されている発現ベクターが好ましい。一般に、この発現ベクターは、プラスミド又はウイルスDNA由来であるか、あるいは両方の要素を含んでもよい。「作用可能に連結される」とは、目的のために協調して機能する様に領域同志が配列されることを指す。例えば、転写は、プロモーターにおいて始まり、そしてCBDをコードするDNA配列に沿って進行する。このプロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そしてその宿主細胞に対して同種性又は異種性のタンパク質のコード遺伝子から得ることができる。細菌宿主細胞で用いる適当なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース生成性アミラーゼ遺伝子、バチルス・ライケニホルミスのαアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリクエフェイシェンスのαアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス(B.pumilus)のキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはラムダファージのP_R又はP_Lプロモーター、あるいは大腸菌のlac，trp又はtacプロモーターがある。あるいは、宿主ゲノム内に適切に、例えば内在プロモーターの下流に組み込まれた場合にのみ、CBDをコードするDNA配列が機能的に発現する様に、組み込みベクターを設計することができる。必要がある場合、本発明のCBDをコードするDNA配列を、適当なターミネーターに作用可能に連結することができる。さらに本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞において、そのベクターの複製を可能にするDNA配列を含んでもよい。また、このベクターは、選択性マーカー、例えば、宿主細胞の欠陥を補完する産物の遺伝子、あるいは、抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリンもしくはスペクチノマイシンなどに対する耐性、又は重金属もしくは除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んでもよい。本発明のCBDが宿主細胞の分泌経路に入る様に指示するために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、この組換えベクターに含まれてもよい。この分泌シグナル配列を、CB DをコードするDNA配列に、適切な読み枠で連結する。分泌シグナル配列は、一般に、CBDをコードするDNA配列の5'側に位置する。この分泌シグナル配列は、CBD に常態で連結しているものであってもよいし、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子から得てもよい。本発明のCBDをコードするDNA配列、プロモーター、並びに任意にはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を各々連結するために用いる手順、あるいは適当なPCR増幅法によって、それらの配列を集めるために用いる手順、並びに、複製又は組み込みに必要な情報を有する適当なベクターに、それらを挿入するために用いる手順は、当業者に良く知られている(Sambrook et al.前出)。緑色蛍光タンパク質(GFP)は、遺伝子発現を監視するレポーター分子、細胞系譜のトレーサー、そしてタンパク質の融合タグとして、広く利用されている(Cra meri et al.,1996;Cubitt et al.,1995;International Patent Application PCT /DK96/00051)。 GFPをCBDと融合させて、セルロース結合特性及び蛍光特性を有する融合タンパク質を作成できるだろう。この融合タンパク質を利用して、バチルス菌種でのCB Dの発現を監視し、それによって任意のCBDの発現レベルを最適化することができるだろう。実施例「材料及び方法」「菌株」バチルス・アガラドヘレンス(B.agaradherens)(NCIMB40482)は、実施例８のエンドグルカナーゼ酵素をコードするDNA配列を含んでいる。大腸菌：SJ2(Diderichsen,B.et al.,1990)。 BioRad社のGenePulserTMを用いて、取扱説明書に従って、電気的に、コンピテント細胞を用意し、そして形質転換する。 B.サブチリスPL2306。この菌株は、既知のB.サブチリスのセルラーゼ遺伝子の転写ユニットを破壊して、それによってセルラーゼ陰性細胞にしたB.サブチリス DN1885(Diderichsen,B.,et al.,1990)である。さらに、この菌株では、aprE(Sta hl and Ferrari,1984)及びnprE(Yang et al.,1984)遺伝子も破壊した。本質的に Eds.Sonenshein et al.,1993,p.618の記載通りに、この破壊を行った。 B.サブチリスPL2304。この菌株は、既知のB.サブチリスのセルラーゼ遺伝子の転写ユニットを破壊して、それによってセルラーゼ陰性細胞にしたB.サブチリス DN1885(Diderichsen,B.,et al.前出)である。本質的にEds．A.L.Sonenshein et al.（前出）の記載通りに、この破壊を行った。 B.サブチリスToC46(Diderichsen,B.,et al．前出)。「プラスミド」 pMB100。これは、pDN1528(S.Jorgensen et al.,1991)の派生物である。このプラスミドは、本質的にpDN1528と同じであるが、クローニング用に、amyL遺伝子の停止コドンとターミネーターとの間に、SacI部位を挿入した。 pDN1981(P.L.Jorgensen et al.,1990)。「溶液／培地」 TY及びLBアガー：Ausubel,F.M．et al.,1995の記載通り。 SB：トリプトン32ｇ、酵母抽出物20g，NaCl 5g及び1N NaOH 5mlを滅菌水に混ぜ、最終容量を１Ｌにする。この溶液をオートクレーブ（121℃、20分間）で滅菌する。 10%Avicel：Avicel(FLUKA,Switserland)100gを滅菌水に混ぜ、最終容量を１Ｌにする。この10%Avicelをオートクレーブ（121℃、20分間）で滅菌する。コンゴーレッド(Sigma,USA)の保存溶液：脱イオン水で１％にする。緩衝液：0.1Mリン酸カリウム、pH7.5。「分子生物学の一般的な方法」 DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準的な方法（Sambrook et al.（1989 ）Molecular cloning:A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold S pring Harbor，NY;Ausubel，F.M.et al.，1995;Harwood and Cutting，1990）に従って行った。 DNAを操作するための酵素を、取扱説明書に従って利用した。実施例１〜３「ゲノムDNAの単離」セルロモナス・フィミ(ATCC484)を、TY中で、30℃で、250rpmで24時間増殖させた。遠心して細胞を集めた。クロストリジウム・ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)(NCIMB1175 4)を、National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.（Scotl and）の指示に従って、特別の培地で、60℃で、嫌気的に増殖させた。遠心して細胞を集めた。シュードモナス・フルオレッセンス亜種セルローサ(NCIMB10462)を、TYアガープレート上で、30℃で、24時間増殖させた。ゲノムDNAを単離するために、細胞をかき取った。前記の菌種から、Pitcher et al.(1989)の記載通りに、ゲノムDNAを単離した。「グリコシルヒドロラーゼに存在するセルロース結合ドメインの同定」セルロース結合ドメインは、そのアミノ酸配列に従って10個の群に分類される (Tomme et al．前出)。この論文に基づいて、潜在的に異なる３つのCBD配列を、 B.サブチリスで発現するためのモデルとして選択した。群IIaから、セルロモナス・フィミ(ATCC484)のセルラーゼCenA(GenBank and S WISS-PROT Accession No.M15823)のCBD、及びシュードモナス・フルオレッセンス(NCIMB10462)のCelB(GenBank and SWISS-PROT Accession No.X52615)のCBDを選択した。群VIから、クロストリジウム・ステルコラリウム(NCIMB11754)のXynA(GenBank and SWISS-PROT Accession No.13325)のCBD二量体を選択した。得られたSWISS-PROTのデータには、推定上のセルロース結合ドメインの位置が記載されている。前記の異なる３つの細菌からCBDをコードするDNA断片を得るために、この情報を用いて特別にPCRプライマーを設計した。同時に、amyLのシグナル配列のアミノ酸に対応するコドンを特別に追加するようにPCRプライマーを設計した。この配列は、CBDがバチルス・サブチリスの細胞外へ遊離することを指令するために利用される。「セルロモナス・フィミ(ATCC484)セルラーゼCenAのCBDのインビトロ増幅」各dNTP 200μM，1.5%DMSO(Sigma,USA)，AmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus,USA)2.5units及び以下の各プライマー100pmolを含んだPCR緩衝液(10mM Tr is-HCl,pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01%(w/v)ゼラチン)中で、約100-200n gのゲノムDNAをPCR増幅した： PstI及びSacIの制限部位を下線で示す。 DNA thermal cycler(Landgraf，Germany)でPCR反応を行った。94℃５分間で１回処理した後に、94℃１分間の変性、65℃１分間のアニーリング、及び72℃１分間の伸長を１サイクルとして、30サイクルしてPCRを行った。増幅産物10μlを、 1.5%アガロースゲル(NuSieve,FMC)中で電気泳動して、分析した。サイズマーカーとしてReadyLoad 100bp DNA ladder(GibcoBRL,Denmark)を用いた。「シュードモナス・フルオレッセンス(NCIMB10462)CelBのCBDのインビトロ増幅」各dNTP200μM，HiFidelity^TM Expand酵素ミックス2.6units及び以下の各プライマー300pmolを含んだHiFidelity^TM PCR緩衝液(Boehringer Mannheim,Germany) 中で、約100-200ngのゲノムDNAをPCR増幅した： PstI及びSacIの制限部位を下線で示す。 DNA thermal cycler(Landgraf，Germany)でPCR反応を行った。94℃２分間、60 ℃30秒間、及び72℃45秒間で１回処理した後に、94 ℃30秒間の変性、60℃30秒間のアニーリング及び72℃45秒間の伸長を１サイクルとして10サイクルし、さらに94℃30秒間の変性、60℃30秒間のアニーリング及び 72℃45秒間の伸長（この伸長過程は各サイクル毎に20秒多くする）を１サイクルとして20サイクルして、PCRを行った。増幅産物10μlを、1.5%アガロースゲル(N uSieve,FMC）中で電気泳動して、分析した。サイズマーカーとしてReadyLoad 10 0bp DNA ladder(GibcoBRL,Denmark)を用いた。「クロストリジウム・ステルコラリウム(NCIMB11754)XynAのCBD二量体のインビトロ増幅」各dNTP200μM，HiFidelity^TM Expand酵素ミックス2.6units及び以下の各プライマー300pmolを含んだHiFidelity^TM PCR緩衝液(Boehringer Mannheim,Germany) 中で、約100-200ngのゲノムDNAをPCR増幅した： PstI及びSacIの制限部位を下線で示す。 DNA thermal cycler(Landgraf，Germany)でPCR反応を行った。94℃２分間、60 ℃30秒間、及び72℃45秒間で１回処理した後に、94℃30秒間の変性、60℃30秒間のアニーリング及び72℃45秒間の伸長を１サイクルとして10サイクルし、そして 94℃30秒間の変性、60℃30秒間のアニーリング及び72℃45秒間の伸長（この伸長過程は各サイクル毎に20秒多くする）を１サイクルとして20サイクルして、PCR を行った。増幅産物10μlを、1.5%アガロースゲル(NuSieve,FMC )中で電気泳動して、分析した。サイズマーカーとしてReadyLoad 100bp DNA lad der(GibcoBRL,Denmark)を用いた。「PCRによるクローニング」「PCR断片のサブクローニング」前記通りに作成したPCR産物40μlを、QIAquick PCR purification kit(Qiagen ,USA)を用いて、取扱説明書に従って、精製した。50μlの10mM Tris-HCl(pH8.5) で、精製されたDNAを溶出した。精製されたPCR断片25μlを、SacI及びPstIで切断して、1.5%の低ゲル化温度アガロース(SeaPlaqueGTG,FMC)ゲル中で電気泳動して、そのゲルから適切な断片を切り出して、QIAquick Gel extraction Kit(Qiag en，USA)を用いて、取扱説明書に従って精製した。この単離されたDNA断片を、P stI/SacIで切断したpMB100に連結した。この連結混合液を用いて、B.サブチリス PL2306を形質転換した。「陽性菌株の同定及び特性決定」細胞を、６μg/mlクロラムフェニコール、0.4%グルコース及び10mMリン酸水素カリウムを含んでいるLBアガープレートにまき、そして37℃で一晩放置した。次の日に、複数のコロニーを、新しいLBPGクロラムフェニコールアガープレート上に再度画線培養して、37℃で一晩放置した。次の日に、各クローンの単一コロニーを、６μg/mlクロラムフェニコールを含んだ液体LB培地に移し、そして37℃で 250rpmで振動させながら一晩放置した。プラスミドを、その液体培地から、QIAgen Plasmid Purification mini kit(Q iagen,USA)を用いて、取扱説明書に従って抽出した。ただし、細胞を37℃で15分間溶解する前に、再縣濁液に1mg/mlのニワトリ卵白のリゾチーム(Sigma,USA)を加えた。プラスミドサンプル５μlを、PstI及びSacIで切断した。1.5%アガロースゲル(NuSieve,FMC)のゲル電気泳動で、この切断を確認した。前記のPCR増幅で観察されたものと同じサイズのDNA断片が出現することから、陽性菌株が示された。前記の異なる３つの細菌に由来するCBDを発現する代表的な３つの菌株を選択した：MB144(C.フィミCenAのCBDを発現する)、MB203(C.ステルコラリウムXy nAのCBD二量体を発現する)及びMB207(P．フルオレッセンス亜種セルローサCelB のCBDを発現する)。「クローン化されたDNA断片のヌクレオチド配列の決定」 Taq deoxy terminal cycle sequencing kit(Perkin Elmer,USA)及び前に用いたものと同じプライマーを用いて、Applied Biosystems 373A自動シークエンサーで、取扱説明書に従って、Qiagenのキットで精製したプラスミドDNAの配列を決定した。Devereux et al．の記載に従って、配列データの分析を行った。「クローン化されたCBDの発現、分泌及び機能分析」菌株MB144(C.フィミCenAのCBDを発現する)、MB203(C.ステルコラリウムXynAの CBD二量体を発現する)及びMB207(P.フルオレッセンス亜種セルローサCelBのCBD を発現する)を、SB培地中で、37℃及び250rpmで20時間培養した。細胞を除いた上清１mlを、10%Avicel 200μlに混合した。この混合液を０℃で１時間放置した。CBDをAvicelに結合させた後に、CBDと結合したAvicelを、5000ｇで５分間遠心した。このペレットを、SDS-PAGE緩衝液100μlに再縣濁して、95℃で５分間沸騰させて、5000ｇで５分間遠心して、そしてその25μlを18%Laemmli Tris-Glysine SDS-PAGE NOVEXゲル(NOVEX,USA)上にのせた。この試料を、取扱説明書通りにXc ellTM Mini-Cell(NOVEX,USA)で電気泳動した。その後の全てのゲル処理、例えばクマシー染色、脱染色及び乾燥化などは、取扱説明書通りに行った。期待されたサイズのタンパク質バンドが出現した(MB144タンパク質バンド約12kDa，MB203タンパク質バンド約35kDa，MB207タンパク質バンド約12 kDa)ことから、機能的CBDが、B.サブチリスで発現されたことが示された。実施例４「C.ステルコラリウムからクローン化されたCBD二量体の発現及び精製」 MB203から単離したプラスミドを用いて、他のバチルス・サブチリスToC46を形質転換して、新しいCBD二量体発現クローンMB206を得た。この菌株を、このCBD 二量体の発現宿主として用いて、SB培地(6μg/mlクロラムフェニコール）を加えた振動フラスコ内で、20時間、37℃及び250rpmで振動させて、この菌株を培養した。培養液の上清1400mlを氷上で冷却した。これを、Whatman glass filter Fで濾過し、さらに0.45micron millipore Type HVLPで濾過して無菌化した。50ｇの Avicelを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に室温で30分間縣濁した。その上清を除き、そしてそのAvicelのスラリーを４℃に冷却した。４℃で、前記の澄んだ培養上清を、このAvicelのスラリーに30分間混ぜた。前記のAvicelを10分間静置して、その上清を除いた。Avicelタンパク質複合体をカラムに詰めて、O.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で、次に0.5M塩化ナトリウムを含んだ緩衝液で洗浄した。最後に、脱イオン水でCBDを溶出した。 CBDが含まれている溶出液を合計78ml得た。最終濃度0.5Mで固形塩化ナトリウムを加えた後に、このCBDを、8kDカットオフのR81P膜を用いたAmicon cellで濃縮した。この濃縮CBD溶液(30ml)の280nmの吸光は1.2であった。MB206のモル吸光係数は 42000であり、これは、タンパク質濃度0.82に相当した。その結果、高度に精製されたCBD二量体は合計25mgであった。SDS-PAGEの結果から、この出発原料には、約0.1mg/mlの29kDが含まれていた。最終精製品は、SDS-PAGE上で、単一バンドを示した。実施例５「クローン化して、バチルス・サブチリスで発現させた、二量体化した真菌CBD の特性決定」ヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)EGIIのDNA配列にコードされているCBDを、ヒュミコラ・インソレンスの43kDaエンドグルカナーゼのDNA配列にコードされているCBDに融合することによって、真菌由来のCBD二量体を作成する。ヒュミコラ・インソレンスEGIIのCBDをコードするDNA配列及びリンカーを、EG II（CMC3としても知られている）cDNAを有するプラスミドから、そのCBD領域に特異的なプライマーを用いてPCR増幅する(Dalboge and Heldt Hansen,1994)。さらに、それに続くCBD、すなわちヒュミコラ・インソレンスの43kDaエンドグルカナーゼの遺伝子によってコードされているCBD（EP-B-0531372及びUS 5457046に詳細に記載されている）をコードするDNA断片に一致する延長部分が、そのPCR断片に付与されるように、アンチセンスプライマーを設計する。そのCBDをコードするDNAを、EP-B-0531372に記載されたヒュミコラ・インソレンスのゲノムDNAからPCR増幅する。前記の２つの断片を、以下のプライマーを用いて、SOE-PCR(Higuchi et al.,1 988)で連結する：このPCR断片を、PstI/SacI断片として、pMB100に連結する。そしてこの連結混合液を用いて、バチルス・サブチリスPL2306を形質転換する。このCBD二量体を本質的にコードするクローン化DNAは、以下の配列CBD-EGII-C Z(327bp)に認められる：そして、それに対応するアミノ酸配列(108アミノ酸残基)を示す：前記載通りに、このCBDの発現、分泌及び機能性を評価する。実施例６「CBD発現の最適化するために用いるGFP-CBD融合体の作成」各dNTP 200μM，1.5%DMSO(Sigma,USA)，AmpliTaqポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Cetus,USA)2.5units及び以下の各プライマー100pmolを含んだPCR緩衝液(10mM Tr is-HCl,pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01%(w/v)ゼラチン)中で、前記通りに MB144から単離したプラスミドpMB144のDNA約100ngをPCR増幅する。 EcoRI及びHindIIIの制限部位を下線で示す。 DNA thermal cycler(Landgraf，Germany)でPCR反応を行う。94℃５分間で１回処理した後に、94℃１分間の変性、60℃１分間のアニーリング、及び72℃１分間の伸長を１サイクルとして、30サイクルしてPCRを行う。増幅産物10μlを、0.7% アガロースゲル(NuSieve,FMC)中で電気泳動して、分析する。サイズマーカーとしてReadyLoad 100bp DNA ladder(GibcoBRL,Denmark)を用いる。この断片を精製し、EcoRI及びHindIIIで切断し、ゲルで精製し、そしてベクターpBR322に連結する(Bolivar et al.,1977,Gene 2,95-113)。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化したSJ2大腸菌を形質転換する。「陽性菌株の同定及び特性決定」形質転換細胞を、アンピシリン(200μg/ml)を含んだLBアガープレートにまき、そして37℃で一晩培養する。次の日に、複数のコロニーを、新しいアンピシリンを含んだLBアガープレート上に再度画線培養して、37℃で一晩放置する。次の日に、各クローンの単一コロニーを、アンピシリン(200μg/ml)を含んだ液体LB 培地に移し、そして37℃で250rpmで振動させながら一晩放置する。その液体培地から、プラスミドを、QIAgen Plasmid Purification mini kit(Q iagen,USA)を用いて取扱説明書に従って抽出する。そのプラスミドサンプル５μ lをEcoRI及びHindIIIで切断する。0. 7%アガロースゲル(NuSieve,FMC)のゲル電気泳動で、この切断を確認する。国際特許出願PCT/DK96/00051の記載通りに作成した変異体F64L-S65T-GFPのDNA 構成体から、GFPの誘導体をクローン化する。 F64L-S65T-GFPをコードするDNA断片を、BamHI/HindIII断片としてクローン化して、そしてpBR322内にクローン化したCBDをコードするDNA配列に、読み枠を合わせて連結する。連結、形質転換及び陽性菌株の同定を、本質的に前記載通りに行う。この融合構成体を、EcoRI/BamHI断片として、前記大腸菌ベクターから、ベクターpUB110に移す(Gryczan et al.,1978)。バチルス・サブチリスPL2306を形質転換し、そして蛍光性及びF64L-S65T-GFP-CBD融合ポリペプチドのAvicel結合性によって、陽性菌株を同定する。このF64L-S65T-GFPの励起光の波長は488nmであり、これによって活性化された F64L-S65T-GFPは、510-530nmの光を放射する。上清中の蛍光を蛍光分光法によって測定し、そしてAvicelと混合した後の上清中の蛍光と比較する。さらに、この融合タンパク質をAvicelと結合させ、過剰の上清を除き、そしてそのAvicelをキュベットに入れ、蛍光分光光度計で蛍光を測定することによって、CBDに付いている蛍光分子を視認することができる。 Avicelと結合した、又は結合していない融合タンパク質を連続的に希釈して、その発現レベルを決定することができる。従って、これによって、相対的により多くの量のCBDを発現するバチルス菌株を同定することが可能になる。実施例７「CMC-コンゴーレッドを用いたスクリーニング」 CBDの発現レベルによって、CBDを発現する組換えバチルス菌株をスクリーニングできる。任意のCBDの発現に最適なバチルス菌株を見つけるために、注目する菌株を、適当な培地、例えばTY中で、適当な増殖条件下で、24時間培養する。それらの菌株の上清を、複数の穴を有するアガロース−CMC-コンゴーレッド−プレートに移し、そのCBDを含む上清を37℃で５時間放置して、CMCと結合させる。2%NaCl溶液で15分間洗浄すると、そのCBD活性を透明なゾーンとして観察することができる。以下のように、プレートアッセイを併用することができる。 CBDプレートアッセイに用いるゲルの調製：96％アルコールによってCMC及びアガロースを湿らせて、0.5%CNC(カルボキシメチルセルロース,7LF，Hercules)及び0.7%アガロース(Litex HSA/HSB)を調製する。0.1Mリン酸カリウム(pH7.5)を加えて、完全に溶解するまで、この混合液を100℃に加熱する。この溶液を放置して60℃に冷却する。コンゴーレッド保存溶液を終濃度5%で加え、そしてこれを、９cm径のペトリ皿１枚あたり15ml注ぎ、プレートを作る。サンプルを加える穴を、パンチャーで作る。実施例８「CBDの新しい分類群を規定する新規なCBDの同定」以下の記載通りに、バチルス・サブチリス内にクローン化されたアルカリ性セルラーゼを、その菌株を37℃、250rpmで、SB培地中で20時間培養することによって発現させる。Avicelに特異的に結合する性質から、発現したセルラーゼがCBD を有することが示された。さらに20時間培養を続けた場合、このセルラーゼはタンパク質分解で切断され、そしてSDS-PAGEによると、２つの特異的なタンパク質バンドが出現した。１つは、推定分子量35kDのセルラーゼの触媒部分に一致し、別の１つは、推定分子量８kDのリンカー及びCBDに一致した。このCBDは、このセルラーゼのC-末端部分であることが判った。そしてこのCBD は、以前に記載されたCBD分類群(Tomme et al.,1995,p.142-161)のいずれにも一致しなかった。従って、このCBDは新しい分類群の最初のものである。「バチルス・アガラドヘレンス由来のアルカリ性セルラーゼのクローニング、及びバチルス・サブチリスにおけるこのアルカリ性エンドグルカナーゼの発現」バチルス・アガラドヘレンス（寄託番号NCIMB40482）由来のアルカリ性セルラーゼをコードするヌクレオチド配列をPCRでクローン化して、発現プラスミドpDN 1981に導入した。 500ngのゲノムDNA及び以下の２つのプライマーを用いて、本質的に前記載通りにPCRを行った。これらのプライマーには、このエンドグルカナーゼをコードするDNA配列を発現用のpDN1981に導入するために、NdeI及びKpnIの制限部位が含まれた。プライマー５：(#20887) プライマー６：(#21318) PCR反応後に、そのPCR断片を、QIAquick PCR column Kit(Qiagen,USA)によって取扱説明書通りに精製した。50μlの10mM Tris-HCl,pH8.5によって、精製されたDNAを溶出した。これをNdeI及びKpnIで切断し、精製し、そして切断したpDN19 81に連結した。この連結混合液を用いて、B.サブチリスPL2304を形質転換した。コンピテント細胞を調製して、Yasbin et al.（1975）の記載通りに形質転換した。「バチルス・サブチリスの形質転換体の単離及び検査」 10mg/mlカナマイシン、0.4%グルコース、10mM KH2PO4及び0.1%AZCL HE-cellul ose(Megazyme,Australia)を含んだLBアガープレートに、形質転換した細胞をまき、そして37℃で18時間培養した。エンドグルカナーゼ陽性コロニーを、青色輪に囲まれたコロニーとして同定した。各陽性形質転換体を、10mg/mlカナマイシンを含んだTY培地10mlに接種した。3 7℃、250rpmで１日間培養した後に、上清50mlを採取した。上清50mlを、0.1%AZC L HE-celluloseを含んだLBアガープレート上の穴に加えることによって、そのエンドグルカナーゼ活性を同定した。 37℃で16時間放置した後に、穴の周囲に青色輪ができることによって、このエンドグルカナーゼが、バチルス・サブチリスで発現したことが示された。実施例９「CBDの選択アッセイ」「リン酸膨潤セルロース(PASC)の調製」 5gのAvicelを水によって湿らせ、そして150mlの氷冷した85%リン酸を加え、そして氷上で１時間弱く撹拌する。次に、撹拌しながら、500mlの冷アセトンを加える。この膨潤したAvicel(PASC)をガラスフィルター漏斗で濾過し、そして100m lの氷冷アセトンで３回洗浄し、さらに500mlの水で２回洗浄する。次に、このPA SCを水500mlに縣濁し、そしてUltra Thoraxホモジナイザーで均質に混合する。このPASCを低温で保存する。「リン酸膨潤セルロースへのCBDの結合：CBDの選択」エッペンドルフチューブで、400μlの10mg/ml PASC（前記通り調製し、50mMリン酸ナトリウム(pH7)で洗浄した）の50mMリン酸ナトリウム(pH7) 溶液を、50mMリン酸ナトリウム(pH7)で希釈した400μlのセルロース結合ドメイン(Cel5AのCBD又はMB206の二量体CBD)と混合した。Cel5AのCBDを用いた場合には、CBDの濃度を、例えば０mMから約８mMまで変えた。PASCを含まないコントロールサンプルも用意した。サンプルを室温で１時間放置して、次にそのサンプルを４分間14000gで遠心した。その上清500μlを２mlの水に希釈した。次に、その上清に存在するCBD(遊離CBD)の量を、トリプトファン蛍光の分光測定によって決定した。Perkin-Elmer LS50発光分光計（励起280nm及び放射340nm）を用いて、PAS Cを含まないサンプルの蛍光強度を対照（基準キュベット）として用いた。結合C BDの量を、「全CBDの量（PASCを含まないサンプル）−遊離CBDの量」として計算した。従って、図１及び図２に示したように、PASC 1gあたりのCBD結合量を、溶液中の遊離CBD量(mM)の関数としてプロットすることによって、結合等量線(bind ing isotherm)を得た。これらのデータを、単純Langmuir結合モデル(Bothwell e t al.,1995)： E(結合)=(Amax*E(遊離))/(Kd+E(遊離)) （式中、E(結合)は、結合CBDの量(mmol/g PASC)であり、E(遊離)は、遊離CBDの量(mM)であり、Amaxは、PASCに結合し得るCBDの最大量であり、そしてKdは、E( 結合)とE(遊離)の平衡における平衡定数である）に適合させる。従って、Kd（解離定数）が低いほど、結合は強くなる。GraphPad Prizmのアルゴリズムを用いて、そのモデルにデータを適合させると、その定数が得られる。Cel5AのCBD及びMB206の二量体CBDの解離定数は、各々0.42及びO.76 mMである（図１及び２）。本発明のCBDの解離定数は、１mM未満、より好ましくは0.1mM未満、最も好ましくは10mM未満である。文献リスト

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月２８日（１９９８．１０．２８）【補正内容】明細書バチルス菌を用いたセルロース結合ドメインの細胞外発現本発明は、セルロース結合ドメイン(CBD)ポリペプチドを発現することができる形質転換されたバチルス菌宿主、バチルス菌用の発現ベクター、及びバチルス菌宿主細胞でセルロース結合ドメインを生産する方法に関する。発明の背景機能ドメインとしてのCBDに関する焦点は、単一ドメイン分子として、このドメインを合成することであった。最初の純粋なCBDの１つは、自動化固相合成法による合成として得られた(Kraulis P．et al.,1989)。 CBDを、機能的単一ドメインとして、大腸菌で発現させることができることが示された(Ong E.et al)。それによると、この大腸菌で、細胞の周辺質内に、培養液１Ｌあたり33mgの収量でCBDが発現することが開示されている。最近、大腸菌によって、真菌の二重CBD(二量体)を発現させることにも成功した(Linder M．et al.,1996)。 WO96/13524には、修飾CBDタンパク質の大腸菌での発現が開示されている。しかし、この大腸菌によるCBDタンパク質の発現は、完全な細胞外発現ではなく、その収量は不満足なものであり、CBDを産業規模で生産するためにはあまりに低い。 US 5525195，US 5536655，WO 91/17244及びWO 91/10732には、バチルス菌宿主細胞におけるエンドグルカナーゼ酵素の発現が開示されている。この酵素は、セルロース結合ドメインに作用可能に連結した触媒活性ドメインを有している。従って、本発明の目的は、高収量に、特に従来の発酵技術を用いて、細胞外に CBDを生産する方法を提供することであり、そしてそれによって、CBDの産業応用を経済的に可能にすることである。本発明の要約発明者は、バチルス菌宿主での発現によって、セルロース結合ドメインを生産することが可能であることを見出した。請求の範囲 10．前記細菌が、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、セルロモナス属（Cell ulomonas）、クロストリジウム属(Clostridium)、マイクロバイスポラ属（Micro bispora）、マイクロモノスポラ属（Micromonospora）、シュードモナス属(Pseu domonas)、ストレプトミセス属（Streptomyces）、サーモモノスポラ属(Thermom onospora)、バチルス属（Bacillus）、カルドセルム属(Caldocellum)、エルビニア属(Erwinia)、ミクソコッカス属（Myxococcus）、セルビブリオ属（Cellvibri o）、サーモアナロバクテリウム属(Thermoanaerobacterium)、およびサーモトガ属（Thermotoga）の群の中から選択される、請求項９の宿主。 11．前記真菌が、アガリクス属（Agaricus）、ジクチオステリウム属(Dictyos telium)、フサリウム属（Fusarium）、ヒュミコラ属（Humicola）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、リムルス属(Limulus)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete )、およびトリコデルマ属(Trichoderma)の群の中から選択される、請求項９の宿主。 12．好中性(neutralophilic)、好アルカリ性(alkalophilic)、中温性又は好熱性である、請求項１〜11の任意の１項のバチルス菌宿主。 13．バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ライケニホルミス(B．licheniformis)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィロス(B.stearothermophilos)及びバチルス・アミロリクエフェイシェンス(B.amyloliquefaciens)の菌種の群の中から選択される、請求項12のバチルス菌宿主。 14．前記ベクターが、前記の形質転換されていない宿主のゲノムに組み込まれる、請求項１〜13の任意の１項の宿主。 15．前記ベクターが、発現プラスミドとして存在する、請求項１〜14の任意の１項の宿主。 16．前記ベクターがゲノム上で複製されるか、又は前記発現プラスミドが多重コピープラスミドである、請求項１〜15の任意の１項の宿主。 17．本質的に１個以上の非触媒性ドメインから成るポリペプチドをコードする DNA配列が挿入され保持されている、バチルス菌用の発現ベクター。 18．その発現カセットが、バチルス菌種由来の調節領域を含んでいる、請求項 17のベクター。 19．前記のバチルス菌種の調節領域が、用いる宿主に固有である、請求項18のベクター。 20．バチルス菌宿主細胞において、本質的に１個以上の非触媒性ドメインから成るポリペプチドを生産する方法であって、作用可能に連結する構成成分として、ａ）転写及び翻訳開始調節領域、ｂ）セルロース結合ドメインポリペプチドをコードするDNA配列、ｃ）転写及び翻訳停止調節領域、ただし、前記の調節領域は、前記宿主細胞で機能するものであり、及び、ｄ）形質転換された宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子；を含んでいる発現カセットによって形質転換されたバチルス菌宿主細胞を、栄養培地中で、セルロース結合ドメインを過剰生産する条件下で、増殖させる過程、及び、このセルロース結合ドメインポリペプチドを回収する過程、を含んでいる前記方法。 21．生産されたセルロース結合ドメインポリペプチドの分子量が４〜35kDの範囲である、請求項20の方法。 22．バチルス菌宿主におけるCBDの発現を最適化する方法であって、ａ）この宿主において、レポーター分子に融合したCBDを発現させる過程；及び、ｂ）そのレポーター分子に固有の１つ以上の性質を測定することによって、発酵した宿主の上清中の存在する発現したCBDの濃度を監視する過程、を含んでいる前記方法。 23．前記レポーター分子が緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein) であり、そしてその固有の性質が蛍光放射である、請求項22の方法。 24．緑色蛍光タンパク質に融合した１個以上の非触媒性のセルロース結合ドメインから本質的に成るポリペプチドハイブリッド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヨルゲンセン，ペールリノデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．セルロース結合ドメイン(CBD)をコードするDNA配列を有するベクターによって形質転換され、且つその配列を発現することができ、その発現したポリペプチドが本質的に１個以上の非触媒性ドメインから成る、バチルス菌宿主。２．前記DNA配列が、バチルス菌種以外の別の起源に由来する、請求項１の宿主。３．前記セルロース結合ドメインを、単一ポリペプチドドメインとして発現することができる、請求項１又は２の宿主。４．前記セルロース結合ドメインの分子量が４〜35kDの範囲である、請求項１〜３の任意の１項の宿主。５．前記セルロース結合ドメインの分子量が30kD以下、好ましくは28kD以下、より好ましくは25kD以下である、請求項４の宿主。６．前記ベクターが、単一のセルロース結合ドメインをコードするDNA配列を含んでいる、請求項１〜５の任意の１項の宿主。７．前記ベクターが、二量体又は三量体のセルロース結合ドメインをコードするDNA配列を含んでいる、請求項１〜５の任意の１項の宿主。８．前記ベクターが、少なくとも１個の他の非触媒活性ドメインに連結されているセルロース結合ドメインをコードするDNA配列を含んでいる、請求項１〜５の任意の１項の宿主。９．前記セルロース結合ドメインが、微生物又は植物から、好ましくは細菌又は真菌から得られる、請求項１〜８の任意の１項の宿主。 10．前記細菌が、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、セルロモナス属（Cell ulomonas）、クロストリジウム属(Clostridium)、マイクロバイスポラ属（Microbispora）、マイクロモノスポラ属（Micromonospora ）、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属（Streptomyces）、サーモモノスポラ属（Thermomonospora）、バチルス属（Bacillus）、カルドセルム属(Caldocellum)、エルビニア属(Erwinia)、ミクソコッカス属（Myxococcus ）、セルビブリオ属（Cellvibrio）、サーモアナロバクテリウム属(Thermoanaer obacterium)、およびサーモトガ属（Thermotoga）の群の中から選択される、請求項９の宿主。 11．前記真菌が、アガリクス属（Agaricus）、ジクチオステリウム属(Dictyos telium)、フサリウム属（Fusarium）、ヒュミコラ属（Humicola）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、リムルス属(Limulus)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete )、およびトリコデルマ属(Trichoderma)の群の中から選択される、請求項９の宿主。 12．好中性(neutralophilic)、好アルカリ性(alkalophilic)、中温性又は好熱性である、請求項１〜11の任意の１項のバチルス菌宿主。 13．バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ライケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィロス(B.stearothermophilos)及びバチルス・アミロリクエフェイシェンス(B.amyloliquefaciens)の菌種の群の中から選択される、請求項12のバチルス菌宿主。 14．前記ベクターが、前記の形質転換されていない宿主のゲノムに組み込まれる、請求項１〜13の任意の１項の宿主。 15．前記ベクターが、発現プラスミドとして存在する、請求項１〜14の任意の１項の宿主。 16．前記ベクターがゲノム上で複製されるか、又は前記発現プラスミドが多重コピープラスミドである、請求項１〜15の任意の１項の宿主。 17．セルロース結合ドメインをコードするDNA配列が挿入され保持されている、バチルス菌用の発現ベクター。 18．その発現カセットが、バチルス菌種由来の調節領域を含んでいる、請求項 17のベクター。 19．前記のバチルス菌種の調節領域が、用いる宿主に固有である、請求項18のベクター。 20．バチルス菌宿主細胞において、セルロース結合ドメインポリペプチドを生産する方法であって、作用可能に連結する構成成分として、ａ）転写及び翻訳開始調節領域、ｂ）セルロース結合ドメインポリペプチドをコードするDNA配列、ｃ）転写及び翻訳停止調節領域、ただし、前記の調節領域は、前記宿主細胞で機能するものであり、及び、ｄ）形質転換された宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子；を含んでいる発現カセットによって形質転換されたバチルス菌宿主細胞を、栄養培地中で、セルロース結合ドメインを過剰生産する条件下で、増殖させる過程、及び、このセルロース結合ドメインポリペプチドを回収する過程、を含んでいる前記方法。 21．生産されたセルロース結合ドメインポリペプチドの分子量が４〜35kDの範囲である、請求項20の方法。 22．バチルス菌宿主におけるCBDの発現を最適化する方法であって、ａ）この宿主において、レポーター分子に融合したCBDを発現させる過程；及び、ｂ）そのレポーター分子に固有の１つ以上の性質を測定することによって、発酵した宿主の上清中の存在する発現したCBDの濃度を監視する過程、を含んでいる前記方法。 23．前記レポーター分子が緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein) であり、そしてその固有の性質が蛍光放射である、請求項22の方法。 24．緑色蛍光タンパク質に融合した１個以上のセルロース結合ドメインから本質的に成るポリペプチドハイブリッド。 25．請求項24のハイブリッドを生産する方法であって、形質転換培養菌中に実質的に非形質転換細胞が含まれない条件下で、前記の形質転換された宿主を増殖させること；栄養培地中でその形質転換培養菌を培養して、前記ハイブリッドを過剰生産すること；及び、そのハイブリッドを回収すること、によって、前記ハイブリッドをバチルス菌宿主で発現させる前記方法。