CN1235635A - 利用芽孢杆菌进行纤维素结合结构域(cbd)的细胞外表达 - Google Patents

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Abstract

转化了包含编码纤维素结合结构域(CBD)之DNA序列的载体的芽胞杆菌宿主。该宿主能表达所述序列,所表达的多肽蛋白质基本上由一个或多个非催化性结构域组成;纤维素结合结构域的分子量为4kD—35kD,并且得自于微生物或植物,优选地来自细菌或真菌;芽孢杆菌宿主例如可以是以下诸种之一:枯草芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌;携有编码纤维素结合结构域的DNA序列的芽孢杆菌表达载体;一种在芽孢杆菌宿主细胞中生产纤维素结合结构域多肽的方法。

Description

利用芽孢杆菌进行纤维素结合结构域(CBD)的细胞外表达
本发明涉及一种能表达纤维素结合结构域多肽的转化芽孢杆菌宿主，一种芽孢杆菌表达载体，以及在芽孢杆菌宿主细胞内生产纤维素结合结构域的方法。
发明背景
对CBD作为一种功能性结构域的研究涉及到以单一结构域分子合成该结构域。最早的纯CBD之一是通过自动固相合成法合成的(KraulisP.等(1989))。
已示CBD能以功能性的单一结构域形式在大肠杆菌中表达，参见例如：Ong E.等(1993)，其中公布，采用大肠杆菌进行的表达在细胞外围胞质中每升培养液的CBD产量为33mg。
最近，在大肠杆菌中也成功地表达了真菌CBD二体(二聚体)，见Linder M.等(1996)。
然而，CBD在大肠杆菌内的表达并不是真正的细胞外表达，并且产量也不尽如人意，对于CBD的工业水平生产来说该产量有些太低。
US5525195,US5536655,WO 91/17244和WO 91/10732公开了具有可操作地连接了纤维素结合结构域的催化活性结构域的内切葡聚糖酶在芽孢杆菌宿主细胞内的表达。
据此，本发明的目的是提供一种以高产率生产CBD的方法，该方法优选采用涉及CBD的细胞外生产的常规发酵技术，这样使得CBD在工业上的应用更为经济可行。
发明概述
本发明人现已发现可通过在芽孢杆菌宿主中表达而生产纤维素结合结构域(CBD)。
在本发明之前，在芽孢杆菌中表达CBD是非常不如人意的，因为，首先，已知纤维素结合结构域含有二硫桥，其次，纤维素结合结构域对由芽孢杆菌宿主产生的蛋白酶的降解可能比较敏感。
据此，本发明的第一个方面涉及转化了包含编码纤维素结合结构域之DNA序列的载体、并且能够表达该DNA序列的芽孢杆菌宿主。
在第二方面，本发明涉及一种芽孢杆菌表达载体，所述载体携带有编码纤维素结合结构域的一段插入的DNA序列。
另外，在第三方面，本发明涉及在芽孢杆菌宿主细胞内生产纤维素结合结构域多肽的方法，该方法包括以下步骤：--在营养培养基中，可以过量生产纤维素结合结构域的条件下，培养芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞已转化了包含可操作性地连接在一起的以下诸成分的表达盒：a)转录和翻译起始调控区，b)编码纤维素结合结构域多肽的DNA序列c)转录和翻译终止调控区，其中所述调控区在该宿主中具有功能，和d)用于选择已转化宿主细胞的选择标记基因；和--回收纤维素结合结构域多肽。发明详述
纤维素结合结构域(CBD)是一种可结合纤维素和几丁质的水不溶性形式(包括晶态形式)或与它们有高亲合力的多肽。
已发现CBD是由2个或多个不同多肽结构域组成的大蛋白质复合物的整合部分，例如存在于水解酶中，所述水解酶通常包含一个含有用于底物水解的活性位点的催化结构域和一个用于与不溶性基质结合的糖类结合结构域或纤维素结合结构域(CBD)。这样的酶可以包含一个以上的催化结构域和一个、两个或三个CBD，还可选择性地包含一个或多个将CBD与所述催化结构域连接起来的多肽区，后一类型的区域通常被称为“接头”。包含CBD的水解酶的例子有：纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和几丁质酶。也已经在藻类中，例如在红藻Porphyra purpurea中发现了非水解性多糖结合蛋白形式的CBD(参见Peter Tomme等人(1996))。但是，大多数已知的CBD来源于纤维素酶和木聚糖酶。
在本发明中，术语“纤维素结合结构域”与Tomme等人(出处同前)中的含义相同。其中将120种以上的纤维素结合结构域划分为10个家族(Ⅰ-Ⅹ)，它们可能在底物结合机理方面具有不同的功能或作用。然而，在进行本发明的工作中，已发现了一种迄今为止尚无人知晓的CBD家族，参见下述的实施例8；估计在将来还会出现新的家族代表和其它CBD家族。
在蛋白质复合物(通常是水解酶)中，CBD位于N或C末端或位于内部。
CBD单体通常由约30个以上且约250个以下的氨基酸残基组成。例如，归类为家族Ⅰ的CBD由33-37个氨基酸残基组成，归类为家族Ⅱa的CBD由95-108个氨基酸残基组成，归类为家族Ⅵ的CBD由85-92个氨基酸残基组成。因此，CBD单体的分子量通常约4kD-40kD，并且通常低于约35kD。
CBD可作为单一结构域多肽使用，或作为二聚体、三聚体或多聚体使用，或作为蛋白质杂合体的一部分使用。嵌合蛋白杂合体
嵌合蛋白杂合体在现有技术中是已知的，参见例如WO 90/00609，WO 94/24158和WO 95/16782，其包含源于其他来源的纤维素结合结构域(CBD)，优选是源于其他微生物来源的纤维素结合结构域(CBD)，而不是源于其中CBD以蛋白质整合部分存在的嵌合蛋白质。通常，嵌合蛋白杂合体是酶杂合体，即含有催化结构域和所述结合结构域。
嵌合蛋白质杂合体和酶杂合体可通过转化一种DNA构建体至宿主细胞中并培养宿主细胞以表达融合基因而得以制备，其中所述DNA构建体包含编码纤维素结合结构域(CBD)的至少一个DNA片段，该DNA片段通过或不通过接头而与编码所述蛋白质或酶的DNA序列相连接。重组融合蛋白或酶杂合体可用下式描述：
CBD-MR-X其中，CBD是对应于至少是纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区；MR是中间区(接头)，它可以是一个键、或优选具有2至100个碳原子、更优选具有2至40个碳原子的短连接基团，或者优选是具有约2-100个氨基酸、更优选具有2至40个氨基酸；X是由编码该蛋白质或酶的DNA序列所编码的多肽的N末端或C末端区。
然而，也包括具有内部CBD的重组融合蛋白或酶杂合体。
编码源自给定生物体的CBD的DNA序列通常可采用PCR技术获得，并且，基于现有知识，也可以从其他生物体找到同源序列。
估计通过克隆纤维素酶、木聚糖酶或其他植物细胞壁降解酶并测量它们对纤维素的结合，可发现新的CBD。如果酶活性在以下所述的标准条件下与Avicel结合，那么可推定该基因的一部分编码结合结构域。
获得编码CBD的DNA片段后，将该DNA基因插入于适合在芽孢杆菌内进行表达的载体中。
例如，纤维素亲合性可采用在500ml缓冲的浆液(缓冲液：0.1磷酸钠，pH7.5)中的10g Avicel进行测量，所述浆液用一小勺缓慢搅拌并且在室温下放30分钟让其溶胀。然后以1份纤维素结合结构域比150份Avicel的比例加入酶。在冰上进行操作，这样在5至10分钟内可达到最佳结合。然后可洗涤Avicel，并对其直接进行SDS-PAGE以观察已结合的蛋白质(由于使用了SDS并进行了热煮，这样会将已结合的蛋白质释放下来)。另一种方法是将浆液装入柱内并洗涤。用离子化水或高pH缓冲液如三乙胺(pH11.2,1％溶液)洗脱已结合的蛋白质，经pH洗脱下来的蛋白质立即调节到中性。
在大肠杆菌中已表达了一些CBD。然而，尚无从芽孢杆菌中表达并分泌CBD的报道。大肠杆菌作为异源蛋白质的表达宿主相比于芽孢杆菌来说有一些优点，主要是由于大肠杆菌有壁膜间隙，异源表达的基因产物有可能在其中进行正确折叠(综述见例如Hockney,R.C.(1994))。特别是，当表达功能性依靠正确排列的双硫桥时，就需要在外围胞质中有氧化电位且存在二硫键氧化还原酶(Emmanuel Brun等，1995)。欧洲生化杂志，231,142-148，和Ong等(1993)中公开了Erwiniachrysanthemi分泌的内切葡聚糖酶EGZ的纤维素结合结构域的过量表达、纯化和鉴定。有二硫键的CBD的其它例子有：荧光假单胞菌纤维素亚种(NCIMB 10462)CelB的N-末端CBD[见Tomme P.等(出处同前)中的序列对比]，以及粪肥纤维单胞菌(ATCC 484)CenA的N末端CBD(N.R.Gilkes等，1991)。
此外，大肠杆菌的外围胞质也起着保护异源表达的蛋白质免受上清以及胞浆中存在的蛋白酶的作用。
也已知，当在枯草芽孢杆菌中表达含有二硫桥的分泌蛋白时，表达水平显著下降(Van den Berg等(1993))。
异源表达的另一个问题是已表达蛋白质的蛋白水解降解作用。已知枯草芽孢杆菌表达至少7种不同的胞外蛋白酶(A.L.Sonenshein等编(1993))。
特别是对于CBD这样一种高度疏水的蛋白质，当在枯草芽孢杆菌中表达时，该蛋白质的运输可能严重受阻，而若该蛋白质由于其疏水性而锚定于细胞膜上，将会因其有害效果而甚至引起细胞死亡。
在第一方面，本发明涉及转化了包含编码CBD之DNA序列的载体、并且能表达该序列的芽孢杆菌宿主。显而易见，所表达的多肽基本上由一个或多个非催化性的结构域组成，即该多肽不包含任何催化活性结构域。
在一个优选实施方案中，所表达的CBD或含CBD之多肽的分子量等于或高于约4kD。优选地，其分子量等于或低于35kD，较优选地约32kD，甚至更优选地约30kD，尤其是约25kD。
可以单一结构域多肽(即包含一个CBD的多肽)的形式表达CBD。或者，可以二聚体或三聚体甚或多聚体形式(即包含两个、三个甚或三个以上相同CBD“单元”的多肽或蛋白质形式)表达CBD。
也可以作为多结构域多肽的一部分而表达CBD，这种多肽的非CBD部分可以是例如一个、两个、甚或多个没有催化活性的结构域。部分可以是例如一个、两个、甚或多个没有催化活性的结构域。
可以相信，按照本发明，即通过已转化的芽孢杆菌宿主的途径，几乎可以表达任何一种CBD。优选地，可表达的CBD是可得自微生物或植物的CBD，更优选是可得自细菌或真菌的CBD。
来自细菌的CBD的实例包括可从下列各属之一的种内得到的CBD：丁酸弧菌属、纤维单胞菌属、梭菌属、小双孢菌属、小单孢菌属、假单胞菌属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、Caldocellum、欧文氏菌属、粘球菌属、纤维弧菌属、热厌氧杆菌属和栖热袍菌属。
源自真菌的CBD的实例包括可从下列各属之一的种内获得的CBD：蘑茹属、网柄菌属、镰孢属、腐质霉属、Neocallimastix，脉孢菌属，Limulus，青霉属，Phanerochaete和木霉属。
可得自植物的CBD的实例是来自苹果青霉素的CBD。
本发明的芽孢杆菌宿主是嗜中性的、嗜碱性的、嗜中温的或嗜热的宿主。
本发明中有用的宿主的实例是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的宿主。然而，估计其他芽孢杆菌种类也可以用作表达CBD的宿主。
如下详述，用包含编码CBD之DNA序列的载体转化本发明的宿主。优选地，所述载体整合到了宿主的基因组中，更优选地，其在基因组中已得到了扩增。
在本发明的另一优选实施方案中，所述载体为表达质粒，优选地为多挎贝质粒。
在第二方面，本发明涉及带有插入的编码CBD之DNA序列的一种芽孢杆菌表达载体。优选地，该载体的表达盒包含来自芽孢杆菌的调控区，更优选地，这类调控区是该宿主的内源区域。
在第三方面，本发明涉及生产CBD多肽的方法，该方法包括以下步骤：--在营养培养基中，过量表达纤维素结合结构域的条件下，培养芽孢杆菌宿主细胞，所述细胞已用包含以下可操作性地连接在一起的诸成分a)转录和翻译起始调控区，b)编码纤维素结合结构域的DNA序列，c)转录和翻译终止调控区，其中该调控区在宿主中是有功能的，和d)用于选择已转化的宿主的选择标记基因；并且--回收纤维素结合结构域多肽。
在第四方面，本发明涉及优化CBD在芽孢杆菌宿主中的表达的一种方法，该方法包括在宿主中表达与报道分子融合的CBD的诸步骤；以及通过测量报道分子的内在性质而监测发酵宿主的上清中已表达的CBD的浓度。
在一个优选的实施方案中，所述报道分子是绿色荧光蛋白，其内在性质是发射荧光。
在第五与第六方面，本发明涉及一种基本上由与绿色荧光蛋白融合的一个或多个纤维素结合结构域组成的多肽杂合体，以及通过在芽孢杆菌宿主中表达而生产这种杂合体的方法，所述方法包括在一定条件下培养已转化的宿主，从而使已转化的培养物基本上无未转化的细胞；在营养培养基中培养已转化的培养物以使所述杂合体过量产生；以及回收该杂合体。CBD的表达重组表达载体
包含编码本发明CBD的DNA构建体的重组载体可以是可方便用于重组DNA操作的任何载体，载体的选择常常取决于其将被导入的宿主细胞。导入载体的宿主细胞通常是指已转化的宿主细胞。这样的转化表示采用例如原生质体、天然的感受态细胞、转染、接合、电穿孔或任何相当的方法将DNA导入宿主细胞。因此，载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。或者，载体可以是这样一种载体，当将其导入宿主细胞时，能部分或全部整合到宿主细胞基因组中并随其整合入的染色体一起复制。
载体优选地是一种表达载体，其内编码本发明CBD的DNA序列可操作地与该DNA转录所需的附加区段相连接。通常，表达载体是从质粒或病毒DNA衍生而来的，或者同时含有二者的元件。术语“可操作地连接”是指所述区段的排列方式使得它们能够协调地发挥作用而达到预期目的，例如由启动子起始转录并穿过编码CBD的DNA序列进行下去。
该启动子可以是在选定的宿主细胞中有转录活性的任何DNA序列，其可以衍生自编码宿主细胞的同源或异源蛋白质的基因。
可用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽原淀粉酶基因的启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子，或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子，或者λ噬菌体PR或PL启动子，或者大肠杆菌lac,trp或tac启动子。或者，可以设计整合载体，使得仅在其正确整合至宿主细胞基因组中(如旁侧启动子的下游)，方可有效地表达编码CBD的DNA。
必要时，编码本发明CBD的DNA序列也可以可操作性地连接一种合适的终止子。
本发明的重组载体还可包含可使所述载体在选用的宿主细胞中复制的DNA序列。
载体还可以包含一种选择性标记，例如，其产物可弥补宿主细胞内一个缺陷的基因，或者，编码对诸如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、链霉素等抗生素的抗性或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了将本发明的CBD引入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供一种分泌信号序列(也已知为前导序列、前原序列或前序列)。该分泌信号序列是以正确的阅读框架与编码所述CBD的DNA序列连接在一起的。分泌信号序列通常位于编码CBD的DNA序列的5′端。该分泌信号序列可以是通常与CBD有关的分泌信号序列，也可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
本领域熟知用来分别连接编码本发明CBD的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列或用来通过合适的PCR扩增方案组装这些序列，并将它们插入含有复制或整合所需信息的合适载体中的方法(参见例如Sambrook等，出处同前)
绿色荧光蛋白(GFP)已广泛用作监控基因表达的报道分子，细胞系的示踪物以及蛋白质的融合标记(Crameri等(1996)；Cubitt等(1995)；国际专利申请PCT/DK96/00051)。
GFP可与CBD融合而产生具有纤维素结合性质以及发荧光性质的融合蛋白。可利用这一融合蛋白的表达来监控CBD在芽孢杆菌各种中的表达情况，因此可用于优化给定CBD的表达水平。
实施例材料与方法菌株：
Bacillus agaradherens NCIMB No.40482包含实施例8中的编码内切葡聚糖酶的DNA序列。
大肠杆菌：SJ2(Diderichsen,B.等(1990))利用Bio-Rad GenePu lserTM，按照生产商的推荐方法制备电感受态细胞和进行转化。
枯草芽孢杆菌PL2306：该菌株为枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen,B.等(1990))在已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位中发生破坏而产生的纤维素酶阴性细胞。此外，该菌株的aprE和nprE基因(aprE:Stahl和Ferrari(1984)；nprE:Yang等(1984))也已被破坏。这种破坏基本上按照Sonenshein等编(1993),P618中所述进行。
枯草芽孢杆菌PL2304。该菌株为枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen B.，出处同前)在已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位中发生破坏而产生的纤维素酶阴性细胞。这一破坏基本上按照A.L.Sonenshein(编)(出处同前)中所述进行。质粒：
pMB100，它是pDN1528(S.Jφrgensen等(1991))的衍生物。该质粒基本上与pDN1528相同，只是为了进行克隆，前者在amyL基因的终止密码子和终止子之间导入了一个SacⅠ位点。
pDN1981(P.L.Jφrgensen等(1990))溶液/培养基
TY和LB琼脂(如Ausubel,F.M.等(1995)所述)
SB：在无菌水中混合32g蛋白胨，20g酵母提取物，5g NaCl和5ml 1N NaOH至终体积为1升。该溶液在121℃下，高压蒸气灭菌20分钟。
10％Avicel：将100g Avicel(FLUKA，瑞士)与无菌水混合至终体积为1升。此10％Avicel在121℃下高压蒸气灭菌20分钟。
Congo红(SIGMA，美国)贮存液：1％于离子化水中。
缓冲液：0.1M磷酸钾，pH7.5。普通分子生物学方法：
利用分子生物学标准方法(Sambrook等(1989)，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY；Ausubel F.M.等，1995；Harwood和Cutting,1990)进行DNA操作和转化。
按照供应商的详细说明使用DNA操作中的酶。实施例1-3基因组DNA的分离
在TY中，于30℃,250rpm下培养粪肥纤维单胞菌24小时，通过离心收获细胞。
60℃下，在国家工业和海洋细菌保藏有限公司(苏格兰)推荐的特殊培养基中厌氧地培养粪堆梭菌NCIMB 11754。通过离心收获细胞。
30℃下，在TY琼脂板上培养荧光假单胞菌纤维素亚种NCIMB1046224小时。刮下细胞用于分离基因组DNA。
按照Pitcher等(1989)中描述的方法分离上述提及的任一种的基因组DNA。鉴定糖基水解酶中存在的纤维素结合结构域
根据其氨基酸序列，将纤维素结合结构域划分为10个家族，见Tommel等(出处同前)。基于该综述文章的公开内容，选择三种潜在不同的CBD序列作为旨在研究枯草芽孢杆菌中表达情况的模型：
从家族Ⅱa中选出粪肥纤维单胞菌(ATCC 484)纤维素酶CenA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.M15823)的CBD和荧光假单胞菌(NCIMB 10462)CelB(GenBank和SWISS-PROT Accession No.X52615)的CBD。
从家族Ⅵ中选出粪堆梭菌(NCIMB 11754)XynA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.13325)的CBD二聚体。
所得到的SWISS-PROT数据中描述了推定的纤维素结合结构域的位置，利用该信息来特异性地设计PCR引物以用于从这三种不同的细菌中得到编码CBD的DNA片段。
同时，设计PCR引物使其添加上相应于amyL之信号序列的氨基酸的额外密码子，该序列用于引导CBD至枯草芽孢杆菌细胞的外部。粪肥纤维单胞菌(ATCC 484)纤维素酶CenA的CBD的体外扩增
在包含每种dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA，美国)，2.5单位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus美国)和各100pmol的下述引物：CELFIM01U,5′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCC GGCTGC CGC GTC GAC TAC -3′CELFIM01D,5′-CTG  CCT CAT TGC ATG  CAG AGC TCC TAC TAC ACG GTG CCC GTG CAGGTG GTG -3′
划线处为PstⅠ和SacⅠ限制性位点的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明胶)中对大约100-200ng基因组DNA进行PCR扩增。
在DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。先在94℃下保温5分钟，接着按下述循环方案进行PCR 30个循环：94℃变性1分钟，65℃退火1分钟以及72℃延伸1分钟。通过在1.5％琼脂糖凝胶(Nasieve,FMC)上进行电泳，并以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作为分子量标记，对10μl的扩增产物等分试样进行分析。荧光假单胞菌(NCIMB 10462)CelB的CBD的体外扩增
在添加了每种dNTP各200μM、2.6单位HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物：PSUPPER,5′-CGT CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCA GCA GTGTGT GAA TAT CGG G-3′PSLOWER,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAT TGT CCA CCG CAA ATCGCC-3′
划线处为PstⅠ和SacⅠ限制性位点
的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中对大约100-200ng基因组DNA进行PCR扩增。
在DNA热循环仪(Landgraf，德国)中进行PCR反应。首先是94℃下2分钟，60℃下30秒和72℃下45秒温育一个循环，接着按照下述循环方案进行PCR 10个循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按下述方案进行20个循环：94℃下30秒，60℃下30秒和72℃下45秒(在此延伸步骤中每一循环均增加20秒)。通过在1.5％的琼脂糖凝胶(Nusieve,FMC)上电泳，以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作为分子量标记，对10μl扩增产物等分试样进行分析。粪堆梭菌(NCIMB 11754)XynA)的CBD二聚体的体外扩增
在补充了每种dNTP各200μM,2.6单位的HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物：CLOST03U,5′-CTG CCT CAT TCTGCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CCA ACT CCTGCC CCA TCT CAA AGC-3′CLOST03D2,5′-CTG CCT CAT TGC ATG  CAG AGC TCC TAC TAC  CAG TCA ACA TTA ACAGGA CCT GAG-3′
划线处为PstⅠ和SacⅠ限制性位点
的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannbeim，德国)中对大约100-200ng基因组DNA进行PCR扩增。
在DNA热循环仪(Landgraf，德国)中进行PCR反应。首先是94℃下2分钟，60℃30秒和72℃下45秒进行一次温育，接着按下列循环方案进行10个PCR循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按以下循环方案进行20个循环：94℃下变性30秒，60℃下30秒，72℃下45秒(在此延伸步骤中每个循环均增加20秒)。通过在1.5％的琼脂糖凝胶(NuSieve,FMC)上电泳，并以ReadyLoad 100bpDNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作为分子量标记，对10μl扩增产物等分试样进行分析。通过聚合酶链反应(PCR)进行克隆：PCR片段的亚克隆
用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)，按照生产商说明纯化上述产生的PCR产物40μl等分试样。用50μl 10mM Tris-HCl,pH8.5洗脱已纯化的DNA。用SacⅠ和PstⅠ消化25μl已纯化的PCR片段，在1.5％低融点琼脂糖(SeaPlaque GTG,FMC)凝胶上电泳，从胶上切下相关的片段，并用QIA quick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，美国)按照生产商说明进行纯化。然后将已分离的DNA片段连接到经PstⅠ、SacⅠ消化的pMB100上，用该连接混合物转化枯草芽孢杆菌PL2306。阳性克隆的鉴别和鉴定
细胞铺于含有氯霉素(6μg/ml),0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂平板上，并在37℃下培养过夜。第二天，将菌落再划线到新鲜的LBPG氯霉素琼脂板上，并在37℃下培养过夜。一天后将每一克隆的单菌落转移到含氯霉素(6μg/ml)的液体LB培养基中，于37℃以250rpm振荡培养过夜。
用QIAgen质粒纯化小试剂盒(Qiagen，美国)，按照生产商说明，从液体培养物中提取质粒，与说明书不同的是，在于37℃裂解细胞15分钟前，在重悬缓冲液中补充了1mg/ml的鸡蛋白溶菌酶(SIGMA，美国)。用PstⅠ和SacⅠ消化5μl质粒样品。消化产物经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieve,FMC)电泳进行检测。出现一个大小与PCR扩增产物相同的DNA片段表明为阳性克隆。选出三个克隆，它们分别代表上述提及的来自三种不同细菌的CBD:MB144(表达粪肥纤维单胞菌CenA-CBD)、MB203(表达粪堆梭菌XynA二聚体CBD)和MB207(表达荧光纤维单胞菌纤维素亚种CelB-CBD)。已克隆DNA片段的核苷酸测序
使用以上用过的同样引物和Taq双脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer,USA)，采用Applied Biosystems 373A自动测序仪，按照生产商说明，对经Qiagen纯化的质粒DNA进行测序。克隆CBD的表达、分泌和功能分析
克隆MB144(表达粪肥纤维单胞菌CenA-CBD),MB203(表达粪堆梭菌XynA二聚体CBD)和MB207(表达荧光假单胞菌纤维素亚种CelB-CBD)均在SB培养基中于37℃,250rpm培养20小时。将1ml无细胞的上清液与200μl 10％Avicel混合。将该混合物置于0℃1小时。在CBD和Avicel结合后，将有CBD的Avicel于5000g离心5分钟。将沉淀物重悬浮于100μl SDS-PAGE缓冲液中，在95℃煮5分钟，以5000g离心5分钟，再取25μl上样到18％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGENOVEX凝胶(Novex，美国)上。按照生产商推荐的方法在XcellTM微槽(NOVEX，美国)中电泳，按照生产商所述进行凝胶的所有后续操作，包括用考马斯染色、脱色和干燥。
出现预期大小的蛋白质条带(MB144蛋白质条带大约是12kDa,MB203蛋白质条带约是35kDa,MB207蛋白质条带约是12kDa)表明在枯草芽孢杆菌中表达了有功能性的CBD。实施例4由粪堆梭菌克隆的CBD二聚体的表达和纯化
用分离自MB203的质粒转化另一种枯草芽孢杆菌TOC46，这样获得了一种表达CBD二聚体的新克隆MB206。用这株菌作为CBD二聚体的表达宿主，在含有SB培养基(氯霉素6μg/ml)的摇瓶中于37℃并以250rpm振摇培养该克隆20小时。
在冰浴上冷却1400ml的培养液上清。用Whatman玻璃过滤器F过滤，再通过0.45微米的Millipore HVLP型滤器过滤除菌。
在室温下，将50g Avicel悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.5中30分钟。去除上清并将Avicel悬浮液冷却至4℃。将清亮上清与Avicel悬浮液在4℃混合30分钟。
使Avicel静置10分钟，然后除去上清。将Avicel蛋白质复合物装入柱中并用0.1M磷酸钠缓冲液洗涤，接着用含有0.5M氯化钠的缓冲液洗。最后，用去离子水洗脱CBD。
含有CBD的洗脱液总体积为78ml。加入固体氯化钠至终浓度为0.5M后，在有拦截8kD分子的R8lP膜的Amicon槽中浓缩CBD。
已浓缩的CBD溶液(30ml)在280nm的吸收值为1.2。MB206的克分子消光系数为42000，对应于蛋白质浓度为0.82，这样可得出高度纯化的双CBD的总量为25mg。根据SDS-PAGE，起始材料每毫升有0.1mg的29kD蛋白质。最终的纯化产物在SDS-PAGE上仅显示一条带。实施例5在枯草芽孢杆菌中克隆和表达的二聚化真菌CBD的鉴定
通过融合由Humicola insolens EGII的DNA序列编码的CBD与由源于Humicola insolens的所述43kDa的DNA序列所编码的CBD而构建出一种真菌起源的CBD二聚体。
利用特异于CBD区的引物，从携有EGⅡ(又称为CMC3)(Dalbφge和Heldt Hansen,1994)的cDNA的质粒中PCR扩增出编码Humicolainsolens EGⅡCBD和接头的DNA序列，此外，将反义引物设计成使所得PCR片段具有与编码前一CBD的DNA片段相同的突出，所述CBD由详述于EP-B-0531372和US5457046中的H.insolens之43kDa内切葡聚糖酶基因所编码。从EP-B-0531372中所述的Humicolainsulens的基因组DNA中PCR扩增编码此CBD的DNA。
用下述引物：#228575′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CAG GGC GGTGCA TGG CAG CAG-3′#206225′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC AGG CAC TGA TGG TACCAG TC-3′通过SOE-PCR(Higuchi等(1988))将所述两片段组合起来。
将此PCR片段作为PstⅠ-SacⅠ片段连接至pMB100中，用连接混合物转化枯草芽孢杆菌PL2306。
主要编码CBD二聚体的克隆DNA可在序列CBD-EGⅡ-CZ(327bp):GCAAATCTTA ATCAGGGCGG TGCATGGCAG CAGTGTGGTG GCGTTGGCTTCTCGGGCTCT ACGTCCTGTG TGTCCGGTTA CACGTGCGTG TACTTGAACG ACTGGTA-CAG CCAATGCCAG CCGCAGCCGA CGACGTTACG GACAACAACA ACGCCAGGGGCAACATCGAC AACAAGGTCA GCCCCGGCTG CCACTTCAAC CACTCCGGCCGGCTGCACTG CTGAGAGGTG GGCTCAGTGC GGCGGCAATG GCTGGAGCGG CTGCAC-CACC TGCGTCGCTG GCAGCACTTG CACGAAGATTAATGACTGGT ACCATCAGTG CCTGTAG和相应的氨基酸序列(108个氨基酸残基)：ANLNQGGAWQ QCGGVGFSGS TSCVSGYTCV YLNDWYSQCQ PQPTTLRTTTTPGATSTTRS APAATSTTPA GCTAERWAQC GGNGWSGCTT CVAGSTCTKI NDWYHQCL中找到。
如上所述进行CBD的表达、分泌和功能性分析。实施例6：构建GFP-CBD融合体以用于优化CBD的表达在含有每种dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA,USA),2.5单位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus，美国)和各100pmol下述引物：C-融合体1:5′-GTC AGT GAA TTC GCA TGC GTC CTT CTT TGT GCT TG-3′C-融合体2:5′-CTC ATA AAG CTT ACG GTG CCC GTG CAG GTG GTG-3′下划线处为EcoRⅠ和HindⅢ限制性位点的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明胶)中，PCR扩增按上述方法分离的100ng质粒DNApMB144。
在DNA热循环仪(Landgraf，德国)中进行PCR反应。首先在94℃温育5分钟，接着按下述循环方案进行三十个循环的PCR:94℃变性1分钟，60℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。通过在0.7％的琼脂糖凝胶(NuSieve,FMC)中电泳，并以Readload 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作为分子量标记，对10μl扩增产物等分试样进行分析。
对该片段进行纯化、EcoRⅠ和HindⅢ消化以及凝胶纯化，并连接至载体pBR322(Bolivar等(1977)，基因，2,95-113)中。
用连接混合物转化SJ2电感受态大肠杆菌。阳性克隆的鉴定和表征
将转化细胞平铺于含有氨苄青霉素(200μg/ml)的LB琼脂平板上并在37℃下培养过夜。一天后将菌落重新划线至新鲜的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下培养过夜。第二天将每个克隆的单菌落转移至含有氨苄青霉素(200μg/ml)的LB液体培养基中，在37℃下以250rpm振摇培养过夜。
用QIAgen质粒纯化小型试剂盒(Qiagen，美国)，按照生产商说明从液体培养物中提取质粒。用HindⅢ和EcoRⅠ消化5μl质粒样品。通过在0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve,FMC)上凝胶电泳而检测消化产物。
从按照国际专利申请PCT/DK96/00051中所述构建的突变体F64L-S65T-GFP的DNA构建物中克隆获得GFP的衍生物。
将编码此F64L-S65T-GFP的DNA片断作为BamHⅠ-HindⅢ片断，与已克隆至pBR322中的CBD编码DNA读框一致地克隆。基本上按上述方法进行连接、转化和阳性克隆的鉴定。
将此融合构建物以EcoRⅠ-BamHⅠ片段形成从大肠杆菌载体中转换至pUB110载体(Gryczan等(1978))中。转化枯草芽孢杆菌PL2306，通过其发光能力以及可结合Avicel的F64L-S657-GFB CBD融合多肽的存在来鉴定阳性克隆。
用于激发本研究中F64L-S65T-GFP的光波长为488nm，其激活F64L-S65T-GFP，从而发出510-530nm的光。
通过荧光分光术测量上清中的荧光，并与同AVicel共温育后的上清的荧光进行比较。此外，通过使融合蛋白结合至AVicel，去除多余的上清，并将Avicel移至比色杯中用于在荧光分光光度计中检测荧光，即可以肉眼观察到带有CBD的发光分子。
通过制备结合于或未结合于Avicel的融合蛋白的系列稀释度，可以确定表达水平，这样就可以鉴定出以相对较高水平表达CBD的芽孢杆菌克隆。实施例7用CMC-CongoRed筛选
可通过CBD表达水平的分析筛选出能表达CBD的重组芽孢杆菌克隆。
为了找到表达给定CBD的最佳芽孢杆菌菌株，在合适培养基(例如上述的TY)中，适当的生长条件下培养目的克隆24小时。将诸克隆的上清转移至挖有孔洞的琼脂糖-CMC-CongoRed平板上，使具有CBD的上清与CMC在37℃下结合5小时。当用2％NaCl溶液洗15分钟时，即可看到作为一个清晰区域的CBD活性。
平板分析可按以下方法进行。
用于CBD平板分析的凝胶的制备：用96％乙醇润湿CMC(CMC：羧甲基纤维素，7LF，来自Hercules)和琼脂糖(Litex HSA/HSB)而制备0.5％CMC和0.7％琼脂糖。加入0.1M磷酸钾pH7.5缓冲液，加热混合物至100℃直至完全溶解。将溶液冷却至60℃。加入Congo Red贮存液至终浓度5％，倒平板，每个直径9cm的Petri平皿中倒入15ml。
用打孔器制作装样品的孔。实施例8定义一种新CBD家族的新CBD的鉴定
通过在SB培养基中，于37℃下，250rpm振摇培养克隆20小时，从而表达下述的克隆于枯草芽孢杆菌中的碱性纤维素酶。由于其具有与Avicel特异性结合的能力，显示所表达的纤维素酶含有CBD。
当继续培养20小时时，该纤维素酶发生蛋白水解性切割，在SDS-PAGE上可看到两条特异的蛋白质条带，其中一条相当于纤维素酶催化部分，其分子量(MW)为大约35kD，另一条相当于预计的接头和CBD，分子量约8kD。
已发现该CBD位于该纤维素酶的C-末端部分，并且该CBD与以前描述的任何CBD家族都不相符(Tomme等，1995，第142-161页)。据此，这个CBD是一个新家族的首位成员。从Bacillus agaradherens克隆碱性纤维素酶并在枯草芽孢杆菌中表达碱性内切葡聚糖酶
通过PCR克隆编码Bacillus agaradherers(保藏号NCIMB 40482)碱性纤维素酶的核苷酸序列，以用于插入到表达质粒pDN1981中。
基本上如上述对500ng基因组DNA进行PCR，其中使用含NdeⅠ和KpnⅠ限制位点的下述两个引物：引物5:(#20887)5′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AAT CATGAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′引物6:(#21318)5′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCC CACGGA CCG-3′
所述NdeⅠ和KpnⅠ位点用于将编码内切葡聚糖酶的DNA序列导入pDN1981中以便进行表达。
在PCR后，用QIAquick PCR柱试剂盒(Qiagen，美国)按照生产商说明纯化PCR片断。将纯化的DNA在50μl 10mM Tris-HCl pH8.5中洗脱。经NdeⅠ和KpnⅠ消化，进行纯化，再连接至已消化的pDN1981中。用连接混合物转化枯草芽孢杆菌PL2304。制备感受态细胞并按照Yasbin等(1975)所述进行转化。枯草芽孢杆菌转化体的分离和检测
将已转化细胞平铺于含有10mg/ml卡那霉素，0.4％葡萄糖，10mMKH2PO4和0.1％AZCL HE纤维素(Megazyme，澳大利亚)的LB琼脂平板上，在37℃下培养18小时。周围有蓝晕的克隆被鉴定为内切葡聚糖酶阳性克隆。
将每一阳性转化体接种在10ml含有10mg/ml卡那霉素的TY培养基中。经37℃、250rpm培养一天后，取出50ml上清。通过将50ml上清加到在含有0.1％AZCL HE-纤维素的LB琼脂平板上所挖的孔中而鉴定内切葡聚糖酶活性。
在37℃下培养16小时后，周围有蓝晕的孔表示枯草芽孢杆菌中有内切葡聚糖酶的表达。实施例9选择CBD的方法制备磷酸溶胀的纤维素(PASC)
用水湿润5g Avicel，加入到150ml冰冷的85％磷酸中，在冰浴中轻微地搅拌1小时。然后边搅拌边加入500ml冷丙酮。用玻璃过滤漏斗过滤已溶胀的Avicel(PASC)，并用100ml冰冷的丙酮洗3次，随后用500ml水洗两次。然后将PASC悬浮在500ml水中，并用UltraThorax匀浆器混合均匀。将PASC冷藏。CBD与磷酸溶胀的纤维素(PASC)的结合一-CBD的选择
将Eppendorf管中溶解于50mM磷酸钠pH7的400ml 10mg/mlPASC(按照上述制备，并经50mM磷酸钠pH清洗)与稀释于50mM磷酸钠，pH7中的400ml纤维素结合结构域(Cel5A CBD或MB206双CBD)混合。改变CBD的浓度，例如，从0mM至约8mM的Cel5A CBD。设计一个没有PASC的对照组。将样品在室温下温育1小时，然后在14000g离心4分钟。将500μl上清稀释成2ml水。在Perkin-Elmer LS50分光光度计(激发光为280nm，发射光为340nm)中，通过色氨酸荧光光度术测定上清中存在的CBD(游离CBD)量，其中使用不加入PASC的样品的荧光密度作为参照(标准曲线)。然后可按照：
总CBD(未加PASC)-游离CBD计算出已结合的CBD量。这样，将每克PASC结合CBD的量作为溶液中游离CBD(以mM表示)的函数作图，即可得到结合等温线见图1和图2。数据可用简单的Langmuir结合模式(Bothwell等，(1995)进行调整：E(结合)=(A最大值×E(游离)/(Kd+E(游离))，其中E(结合)是以mmol/gPASC表示的已结合的CBD量，E(游离)是以mM表示的游离CBD量，A最大值是可与PASC结合的CBD的最大量，Kd是平衡E(结合)《E(游离)的平衡常数。这样，Kd(解离常数)越低，结合就越强。将数据用GraphPad Prizm中的算法调整成该模式，即可获得这些常数。Cel5ACBD和MB206双CBD的解离常数分别是0.42和0.76mM(参见图1和图2)。
本发明CBD的解离常数低于1mM，更优选为低于0.1mM，最优选为低于10mM。
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Claims (25)

1．一种芽孢杆菌宿主，其转化了包含编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列的载体并能表达该序列，所表达的多肽基本上由一个或多个非催化性结构域组成。
2．根据权利要求1的宿主，其中所述DNA序列是另一种来源而非芽孢杆菌。
3．根据权利要求1或2的宿主，其能以单一多肽结构域形式表达该纤维素结合结构域。
4．根据权利要求1至3中任一项的宿主，其中所述纤维素结合结构域的分子量为4kD-35kD。
5．根据权利要求4的宿主，其中所述纤维素结合结构域的分子量不高于30kD，优选不高于28kD，更优选不高于25kD。
6．根据权利要求1-5中任一项的宿主，其中所述载体包含编码单一纤维素结合结构域的DNA序列。
7．根据权利要求1-5中任一项的宿主，其中所述载体包含编码二聚体或三聚体纤维素结合结构域的DNA序列。
8．根据权利要求1-5中任一项的宿主，其中所述载体包含编码连有至少一个其他非催化活性结构域的纤维素结合结构域的DNA序列。
9．根据权利要求1-8中任一项的宿主，其中所述纤维素结合结构域可得自微生物或植物，优选得自细菌或真菌。
10．根据权利要求9的宿主，其中所述细菌选自由以下各属组成的组：丁酸弧菌属、纤维单胞菌属、梭菌属、小双孢菌属、小单孢菌属、假单胞菌属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、Caldocellum、欧文氏菌属、粘球菌属、纤维弧菌属、热厌氧杆菌属和栖热袍菌属。
11．根据权利要求9的宿主，其中所述真菌选自由以下各属组成的组：蘑茹属、网柄菌属、镰孢属、腐质霉属、Neocallimastix，脉孢菌属，Limulus，青霉属，Phanerochaete和木霉属。
12．根据权利要求1-11中任一项的芽孢杆菌宿主，其为嗜中性的、嗜碱性的、嗜温性的或嗜热性的。
13．根据权利要求12的芽孢杆菌宿主，其选自由下列各种组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
14．根据权利要求1-13中任一项的宿主，其中所述载体整合至未转化宿主的基因组中。
15．根据权利要求1-14中任一项的宿主，其中所述载体以表达质粒形式存在。
16．根据权利要求1-15中任一项的宿主，其中所述载体已在基因组内发生了扩增，或者所述表达质粒为多拷贝质粒。
17．一种芽孢杆菌表达载体，其携有插入的编码纤维素结合结构域的DNA序列。
18．根据权利要求17的载体，其内表达盒包含源自芽孢杆菌的调控区。
19．根据权利要求18的载体，其中所述芽孢杆菌调控区对该宿主是内源的。
20．在芽孢杆菌宿主细胞中生产纤维素结合结构域多肽的方法，该方法包括以下步骤：
--在营养培养基中，过量生产纤维素结合结构域的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞已转化了包含可操作性地连接在一起的下述元件的表达盒：
a)转录和翻译起始调控区，
b)编码纤维素结合结构域多肽的DNA序列，
c)转录和翻译终止调控区，其中所述调控区在该宿主中是有功能的，和
d)用于选择已转化的宿主的选择性标记基因；和
--回收纤维素结合结构域多肽。
21．根据权利要求20的方法，其中生产的纤维素结合结构域多肽的分子量为4kD-35kD。
22．一种优化芽孢杆菌宿主中CBD表达的方法，该方法包括以下步骤：
a．在宿主中表达融合于报道分子的CBD，
b．通过测定报道分子的内在性质，鉴测已发酵宿主的上清中已表达CBD的浓度。
23．根据权利要求22的方法，其中所述报道分子是绿色荧光蛋白，所述内在性质为发射荧光。
24．基本上由与绿色荧光蛋白融合的一个或多个纤维素结合结构域组成的多肽杂合体。
25．生产权利要求24的杂合体的方法，其中所述杂合体是在芽孢杆菌宿主中表达的，即在一定条件下培养已转化的宿主，从而使转化培养物中基本上无未转化细胞；将已转化的培养物接种于营养培养基中，从而使所述杂合体得到过量表达；并且回收该杂合体。
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