JP2001504340A

JP2001504340A - 癌におけるグルタチオンｓ―トランスフェラーゼ（ｇｓｔ）遺伝子

Info

Publication number: JP2001504340A
Application number: JP52289498A
Authority: JP
Inventors: アリーオズマン，フランシス; ロペズ―ベレステイン，ガブリエル; ケイ．ビュオランウィニ，ジョン; アントウン，ギャミル; ロ，ヒュイ―ウェン; ケラー，チャールズ; アカンデ，オラニケ
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-11-12
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2001-04-03
Also published as: EP0960208A1; WO1998021359A1; EP0960208A4; US5968737A; CA2270910A1

Abstract

(57)【要約】 GST-πの３つの改変体に対する相補的DNAおよびゲノムクローンが開示される。これらの改変体のいくつかは、神経膠腫中で過剰発現され、それによって癌のその形熊に関与することを示すことが実証される。このことは、GST-π遺伝子、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および抗体のような新しい組成物を使用して特定のクラスの腫瘍の検出および処置を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】癌におけるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子発明の背景本研究は、米国における国立保健研究所の国立癌研究所からの助成金CA55835 およびPOI CA 55261ならびにKleberg財団からの研究助成金によって一部分助成された。Ａ．発明の分野本発明は、癌の診断および処置の分野を含む。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞中のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）の多型性形態を同定することおよび標的にすることに依存する。Ｂ．従来技術グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、すなわちGSTは、タンパク質の１つのファミリーであり、その最も公知の機能は、多くの変異原物質、発癌物質、アルキル化抗癌剤、および異物代謝の求電子性産生物を含む、種々の内因性化合物および外因性化合物の求電子基によるグルタチオンの硫黄原子の好中球的攻撃の触媒物質である（MannervikおよびDanielson、1988；PickettおよびLu、1989；Hay esおよびPulford、1995；Commandeurら、1995）。現在公知のヒトの可溶性GSTは、Ｎ−末端アミノ酸配列相同性、酵素の基質特異性、および抗原性によって４つの群、α、μ、π、およびθに分類される（Mannervikら、1992）。 GSTは、多くの細胞性機能に関与し、GSTの最たる特徴は、第II相酵素としての役割であり、ここでGSTは、多くの変異原物質、発癌物質、抗癌剤、およびそれらの代謝産物を含む広範に種々の求電子化合物によってグルタチオンのＳ−結合 (GSH)を触媒する（Mannervik、1985；MannervikおよびDanielson、1988；Picket tおよびLu、1989；Daniel、1993；BoylandおよびChasseaud、1969；Colesおよび Ketterer、1980；KettererおよびSies、1987；Sato、1989；MorrowおよびCowa n、1990；Waxman、1990；TsuchidaおよびSato、1992；Commandeurら、1995）。 GST-π遺伝子の著しい過剰発現は、悪性トランスフォーメーション、腫瘍の薬剤耐性、および患者の低い生存性と関連づけられる（Sato、1989；Morrowおよび Cowan、1990；Waxman、1990；TsuchidaおよびSato、1992；Commandeurら、1995 ；Tidefeltら、1992；Muramatsuら、1993；Gilbertら、1993；Tew、1994）、そして多くのヒトの腫瘍および前新生物の病変において、GST-πタンパク質は、対応する正常組織においてこのタンパタ質が存在しないかまたは非常に低いレベルで発現されるかのいずれかにもかかわらず、過剰発現される。 GST-π遺伝子は、染色体11q13の比較的小さい領域にマップされており、この領域は、bcl1/prad1、int2およびhstflを含む多くの癌関連遺伝子および癌原遺伝子を含み、これらのいくつかは、いくつかの腫瘍中でGST-π遺伝子で同時増幅されることが報告されている（LammieおよびPeters、1991；Saint-Rufら、1991 ）。ヒトの悪性神経膠腫において、GST-π発現のレベルと腫瘍の組織学的程度および患者の生存の両方との間に正の相関が（免疫細胞化学によって）示されている（Saint-Rufら、1991；Haraら、1990）。いくつかのヒトの神経膠腫の細胞株において、高いGST-π発現と２−クロロエチルニトロソ尿素耐性との間の関連がまた示されている（Ali-Osmanら、1990）。種々の供給源（Kanoら、1987；Moscowら、1988；Cowellら、1998；Morrowら、 1989）に始まって報告された完全なヒトのGST-πのcDNAおよびGST-π遺伝子のヌクレオチド配列は、唯一のヒトGST-π遺伝子が存在することを示唆する（Manner vikら、1992）。しかし、ヒトの胎盤からの２つの異なるGST-πタンパタ質（Ahm adら、1990）の単離は、遺伝子の多型性がヒトGST-π遺伝子座において存在することを強く示唆する。この推定上の多型性の性質が腫瘍形成において役割を果すかまたは果していないかは、不明なままであり、そして従ってこの遺伝子座における構造的および機能的な変化の両方を探求することは重要である。発明の要旨したがって、特定の悪性形態とのGST-πの関連を活用することが本発明の目的である。より詳細には、GST-πの種々の形態の関与の差に基づいて癌の診断および処置の方法を提供することが本発明の目的である。したがってまた、遺伝子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチドフラグメント、および抗体を含む、そのような診断的および治療的な努力を容易にする組成物を提供することが目的である。これらの目的にしたがって、腫瘍細胞中の少なくとも１つのhGSTP1^*Bタンパタ質またはhGSTP1^*Cタンパク質の活性レベルを低減させる工程を包含する、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。好ましい実施態様において、hGSTP^*BまたはhGSTP^*Cタンパク質の活性の低減は、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質の発現を低減させることによって達成される。特定の実施態様において、発現のこの低減は、細胞内条件下においてhGSTP1^* BまたはhGSTP1^*C核酸にハイブリダイズするが、細胞内条件下においてhGSTP1^*A 核酸と実質的にハイブリダイズしないアンチセンス核酸と腫瘍細胞とを接触させることによって達成される。他の実施態様において、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸は、mRNAである。特定の実施態様において、アンチセンス核酸は、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸の少なくとも一部分を含むベクター構築物から発現されるmRNAである。さらに他の実施態様において、ベクター構築物は、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸のコード領域の少なくとも一部分を含む。好ましい実施態様において、コード領域は、cDNA由来である。他の実施態様において、ベクターは、配列番号４の少なくとも塩基+313または+341を含んで構築される。なおさらなる実施態様において、ベクター構築物は、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C 核酸の、転写されるが翻訳されない領域の少なくとも一部分を含む。ベクター構築物が、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸の、転写されるが翻訳されない領域の一部分を含むこれらの実施態様において、領域は、イントロンであり得る。他の実施態様において、ベクター構築物は、翻訳される領域の少なくとも一部分を含む。好ましい実施態様において、翻訳される領域の部分は、hGSTP1^*C核酸からのエキソン５および６の少なくとも一部分を含む。本発明はまた、アンチセンス核酸がDNA分子であり得る方法を提供する。好ましい実施態様において、DNA分子は、cDNA分子である。本発明の他の局面において、DNAは、配列番号４の少なくとも塩基+313または+341を含む。本発明はさらに、腫瘍細胞中のhGSTP1^*Bタンパタ質またはhGSTP1^*Cタンパタ質の少なくとも１つの発現を低減させる方法を提供し、ここで発現を低減させる工程は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するリボザイムと腫瘍細胞とを接触させる工程を包含する。好ましい実施態様において、リボザイムは、配列番号４の少なくとも塩基+313または+341の辺りで切断する。本発明の他の局面において、腫瘍細胞中のhGSTP1^*Bタンパク質またはhGSTP1^*C タンパク質の発現を低減させる方法が提供され、ここで活性を低減させる工程は、免疫学的にhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するが、hGSTP1^*Aタンパク質に実質的に結合しない抗体と腫瘍細胞とを接触させる工程を包含する。１つのこのような実施態様において、抗体は、配列番号３の残基104または113を含むエピトープに結合する。腫瘍細胞中のhGSTP1^*Bタンパク質またはhGSTP1^*Cタンパク質の発現が低減される特定の実施態様において、腫瘍細胞は、ヒトの被験体内にある。本発明の別の局面は、腫瘍細胞中の少なくとも１つのhGSTP1^*Bタンパク質またはhGSTP1^*Cタンパク質の活性レベルを低減させる工程を包含する、腫瘍細胞中のアルキル化剤の増殖阻害活性を増加するための方法を提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、hGSTP1^*B（配列番号１）の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、hGSTP1^*C（配列番号３）の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。好ましい実施態様において、本発明は、hGSTP1^*B（配列番号１）をコードする単離された核酸を提供する。hGSTP1^*C（配列番号３）をコードする単離された核酸は、本発明の別の局面において提供される。 hGSTP1^*Bをコードする単離された核酸を提供するこれらの実施態様において、好ましい配列は、配列番号２の配列である。hGSTP1^*Cをコードする単離された核酸を提供するこれらの実施態様において、好ましい配列は、配列番号４の配列である。本発明は、hGSTP1^*B（配列番号１）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明はさらに、hGSTP1^*C（配列番号３）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターが、hGSTP1^*B（配列番号１）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む特定の実施態様において、配列は、配列番号２の配列であり得る。発現ベクターが、hGSTP1^*C（配列番号３）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む他の実施態様において、配列は、配列番号４の配列であり得る。いくつかの実施態様において、核酸は、真核生物細胞中のプロモータ活性に対してアンチセンスに位置づけられ、そして真核生物細胞中のプロモータ活性の制御下である。本発明はさらに、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質の少なくとも１つに免疫学的に結合するがhGSTP1^*Aタンパタ質に結合しない抗体を提供する。好ましい実施態様において、抗体は、配列番号３の少なくとも残基104または113を含むエピトープに結合する。本発明の他の実施態様は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸にハイブリダイズするが、hGSTP1^*A核酸に実質的にハイブリダイズしないアンチセンス核酸を提供する。また、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するがhGSTP1^* A核酸を実質的に切断しないリボザイムが、本発明によって提供される。本発明はさらに、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するがhGSTP1^*Aタンパタ質に実質的に結合しない分子を調製する方法を提供する。この方法は、hG STP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質の３次元構造を決定する工程、およびhGSTP1^*B またはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するが、hGSTP1^*Aタンパク質に実質的に結合しない分子を設計する工程を包含し得る。ある実施態様において、この方法はさらに、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質への結合のために設計させた分子を試験する工程を包含する。さらに別の実施態様において、この方法は、hGSTP1^*Aタンパタ質への結合のために設計させた分子を試験する工程を包含し得る。別の局面において、本発明は、GST-πの活性を阻害する候補のインヒビター物質を同定するための方法を開示し、この方法は、GST-πタンパク質を発現する細胞と候補のインヒビター物質とを接触させる工程；および候補のインヒビター物質の非存在下で、細胞の増殖と細胞の増殖とを比較する工程；ここで増殖の増加は、物質がGST-πの活性のインヒビターであることを示す。特定の実施態様において、発現されているGST-πタンパク質は、GSTP^*Bである。他の実施態様において、発現されているGST-πタンパク質は、GSTP^*Cである。さらに他の実施態様において、発現されているGST-πタンパク質は、GSTP^*Aでない。いくつかの実施態様において、候補のインヒビター物質は、細胞内条件下において、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸に対するアンチセンス分子である。他の好ましい実施態様において、候補物質は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGST P1^*C核酸を切断するリボザイムである。特定の他の実施態様において、候補物質は、小分子インヒビターである。候補物質が小分子インヒビターであるこれらの実施態様において、候補物質は、置換イソキサゾール、複素環式芳香族化合物；または糖結合芳香族化合物であり得る。本発明はさらに、GST-πの発現を阻害する候補のインヒビター物質を同定するための方法を開示する。好ましい実施態様において、この方法は、GST-πタンパク質と発現する細胞と候補のインヒビター物質とを接触させる工程、および候補のインヒビター物質の非存在下で、細胞のGST-πの発現と細胞のGST-πの発現とを比較する工程；ここでGST-πの発現の低減は、物質が、GST-πの発現のインヒビターであることを示す。特定の実施態様において、GST-πタンパク質の発現の阻害するための候補物質は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸に対するアンチセンス分子である。本発明の他の実施態様において、候補物質は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するリボザイムである。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、発明の精神および範囲内の種々の変化および変更がこの詳細な説明から当業者に対し明らかとなるので、詳細な説明および特定の実施例は、発明の好ましい実施態様を示す一方で、例示のみによって所与されることが理解されるべきである。図面の簡単な説明以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中で提示される特定の実施態様の詳細な説明と合わせて、１つ以上のこれらの図面を参照することによってより良く理解され得る。図１。SuperCos-GSTpiの簡略化された制限地図。黒四角は、単離されたGST-π 遺伝子の位置に対応する。図２Ａおよび２Ｂ。図２Ａ：全GST-π遺伝子のDNA配列決定のためのSuperCos- GSTpiのサブクローン。pBS.GST-π/A（エキソン２および３、ならびにイントロン２）、pBS.GST-π/B（エキソン３〜６およびイントロン３〜５）、pBS.GST-π /C（エキソン６および７、イントロン６、および3’−非翻訳領域）およびpBS.G ST-π/D（エキソン２〜７およびイントロン２〜６）。図２Ｂ：完全なGST-π遺伝子のヌクレオチド配列を得るために使用されるDNA配列決定ストラテジー。矢印は、プライマーの配列決定方向を示す。配列決定は、両方向において少なくとも２度行われた。図３。+1521と+1644との間にタンデムに配置されたRARE共通ハーフ部位の１つのパリンドロームおよび４つの直接な繰り返しを示す、GST-π遺伝子のイントロン５の領域。図４Ａおよび４Ｂ。MGR-3細胞中のGST-π遺伝子発現に対する全トランスRAの効果。細胞を１μMのRAに６時間または48時間さらし、その後細胞は、GST-π転写物およびGST-πタンパク質についてのノーザン分析のために採取された。図５。pCMV-GSTpi真核生物細胞発現ベクター構築物。図６。３つのGST-πのcDNA改変体の全ヌクレオチド配列を得るために使用されるストラテジー。矢印は、配列決定された方向および領域の両方を示す。図７。改変体GST-πのcDNAのMAeIIおよびXcmI制限エンドヌクレアーゼ地図。図８。GSHアフィニティークロマトグラフィー精製された組み換えGST-π改変体タンパク質によるGSHとCDNBとの結合の触媒作用に対するLineweaver-Burkeプロット。反応速度を、2.5mM GSHおよび各酵素の0.015ユニットを用いて決定した。図９。それぞれ互いに対する側鎖の偏りを示す、GSTP1a（赤）、GSTP1b（シアン）、およびGSTP1c（黄）のＨ部位領域の過負(Super-imposed)エネルギー最小３次元構造。GSTPlbおよびGSTPlcは、Brookhaven Protein Databankから輸入された、ヒト胎盤GSTPla（Reindeerら、1992；Reinemerら、1993）のＸ線結晶学的構造において、val₁₀₄をIle₁₀₄に、Ile₁₀₄およびAla₁₁₃の両方をValに置換することによって生成された。図１０。改変体GST-πのmRNAの細胞内安定性。全RNAを、デノボRNA合成をブロックするためにアクチノマイシンＤで処理された細胞から単離し、細胞株は、各々１つのGST-πのmRNA改変体のみを発現した。図１１。改変体GST-πタンパク質の熱安定性。組み換えGSTP1a-1a，GSTP1b-1b 、およびGSTP1c-1cを、45℃でインキュベートし、そして１時間にわたり、15分ごとに残留のGST活性を、基質としてCDNBを用いて決定した。図１２Ａおよび１２Ｂ。悪性神経膠腫中の低、中、および高レベルのGST-π発現と患者の生存との間の関連を示すKaplan-Meier曲線：図１２Ａ）すべての神経膠腫患者；図１２Ｂ）神経膠腫多型患者。図１３Ａおよび１３Ｂ。悪性神経膠腫および生存患者における核GST-πの存在下と非存在下との間の関連についてのKaplan-Meier曲線：図１３Ａ）すべての神経膠腫患者；図１３Ｂ）神経膠腫多型患者。図１４Ａおよび図１４Ｂ。hGSTP1^*Cのアンチセンスオリゴヌクレオチド翻訳阻害の特異性。hGSTP1^*CのmRNAの翻訳阻害部位に対して相補的なセンス、ジャンブル、およびミスマッチのオリゴヌタレオチドを、0〜7.5μMのAS-ON濃度を達成するために³⁵Ｓ−メチオニン含有インビトロ翻訳反応混合物に加えた。37℃で１時間後、実施例４に記載されるように、反応生成物を電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図１５Ａおよび１５Ｂ．hGSTP1^*C翻訳阻害の効率に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド骨格改変の効果。「方法」の節に記載されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドに指向された翻訳開始部位の骨格がホスホジエステル結合中のリンを硫黄に置換することによって改変した。改変されない、部分的ホスホロチオエートおよび完全に改変されたチオエートAS-ONを、０〜25μMの濃度を達成するために³⁵Ｓ−メチオニン含有翻訳反応混合物に加えた。反応物を、37℃で１時間の間インキュベートし、前述のように電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図16Aおよび図16B。開始部位アンチセンスオリゴヌクレオチドによるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害に対するRNAseH効果。E.coli RNAseHを、10ユニット/mlの最終濃度を達成するように³⁵Ｓ−メチオニン含有インビトロ翻訳混合物に添加する。混合物を、37℃で一時間インキュベートし、そして反応産物を、実施例４に記載のように電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図17。翻訳開始部位特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドへの曝露の後のhG STP^*C mRNAのRNAseH媒介切断。L-[³⁵S]-メチオニンを非放射性メチオニンと置換した翻訳反応物混合物を、³²P-CTP標識hGSTP1^*C mRNA、10ユニット/mlのE.coli RNAseHおよび漸増濃度のAS-ONを含有するように設定した。混合物を30℃で１時間インキュベートし、その後、RNAを抽出し、エタノールおよび酢酸アンモニウムで沈澱させ、４％ポリアクリルアミド−尿素ゲル中で電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図18Aおよび図18B。hGSTP1^*C AS-ONによる翻訳のmRNA標的特異性。ウサギ網膜細胞溶解物インビトロ翻訳系を、翻訳開始部位AS-ON、および各350ngのhGSTP1^*C (図18A)またはルシフェラーゼ（図18B）のmRNAを含むように設定した。37℃で１時間後、実施例４のように、反応産物を電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図19Aおよび図19B。翻訳部位アンチセンスオリゴヌクレオチドによるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害。³⁵Ｓ−メチオニンを含むインビトロ翻訳混合物に、i)ヌクレオチド転位を含まない、ii)それぞれ、hGSTP1^*C mRNAの、+313（図19A）および+ 341（図19Ｂ）に対応する位置でのＡ→Ｇ転位およびＣ→Ｔ転位、を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。RNAseHのこれらの改変体特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドによる翻訳阻害に対する効果を試験するために、E.co liRNAseHを10ユニット/mlで、翻訳反応混合物に添加した。37℃での１時間のインキュベーションの後、混合物を電気泳動し、そしてオートラジオグラフを撮った。図20。Ｈ結合部位における推定GSTP1^*Cリガンドの分子モデリング。図21。Ｈ結合部位における推定GSTP1^*Cリガンドの分子モデリング。好ましい実施態様の詳細な説明Ａ．本発明ヒトGST-π遺伝子およびそのcDNA（Kanoら、1987；Moscowら、1988）は、以前に記載されており、そして４つの異なる報告において観察された同一のヌクレオチド配列に基づく。これは、一般に、ヒトGST-π遺伝子のみが存在すると受け入れられてきた（Mannervikら、1992）。しかし、本明細書中で記載するように、３つの異なる全長GST-πcDNA(hGSTP1^*A、hGSTP1^*B、およびhGSTP1^*C、ぞれぞれ、配列番号３、配列番号５、および配列番号７）は、ヒト悪性神経膠腫細胞から調製したλgtIIライブラリーから単離した。hGSTP1^*Aは、以前の報告において記載されるGST-π遺伝子と同一であり（Kanoら、1987；Moscowら、1988）；しかし、他の２つのcDNAは新規であった。それらの各々がコードするペプチドである、 GSTP1a、GSTP1bおよびGSTP1cは、密接に関連しており、そしてcDNAの、それぞれ、+313位および+341位におけるＡ→Ｇ，およびＣ→Ｔの２つのヌクレオチド転位から生じる。改変体mRNAの細胞安定性を決定し、そしてGST-πcDNAによってコードされるタンパク質をE.coliにおいて発現させ、GSHアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、そして酵素反応速度分析において使用して、構造の差異の機能性の結果を決定した。コードされるGST-πペプチドにおけるアミノ酸変化の構造上の結果をさらに試験するために、コンピューターモデリングを用いて、事前に単離され、Ｓ−ヘキシルグルタチオン（Reindeerら、1992）と共結晶化した、胎盤GS T-πタンパク質の３次元構造にアミノ酸変化を導入した。初代標本、悪性神経膠腫の細胞株、正常な脳、正常な胎盤、および末梢血リンパ球における遺伝子変異の各々の発現を調査し、そして観察された遺伝子型および表現型の一致を、代表的な標本のDNA-PCRおよびRNA-PCRによって決定した。腫瘍標本および正常標本における遺伝子改変体の分布頻度の予備分析を行った。結果を以下にまとめる。改変体GST-πmRNAの、正常標本および悪性標本の両方における存在および発現は、変異よりはむしろGST-π遺伝子座の対立遺伝子多型を示す。ここで試験した胎盤組織の一つは、hGSTP1^*Bのみを発現した。以前の報告において(Ahmadら、19 90)、ヒト胎盤から単離したGST−πタンパク質が、hGSTP1^*Bの+313でのＡ→Ｇ転位により生じるIle₁₀₄→Val₁₀₄置換を有することを示した。しかし、このGST-π ペプチドをコードする遺伝子もそのmRNAに対応するcDNAをコードする遺伝子も以前には記載されていないので、この結果は、このタンパク質が新たなGST-π遺伝子か、または公知のGST-π遺伝子の天然に存在する多型から得られたものかに関しては結論づけられなかった。同様に、現在までに、全長hGSTP1^*C cDNAまたは遺伝子の単離の報告はない。hGSTP1^*CのＮ末端の176アミノ酸をコードする短縮c DNA(83.8%)は、ヒト肺λgt11 cDNAライブラリーから以前に単離された（Boardら、1989)。ここで報告したヒトGST-πcDNAのヌクレオチド配列とラット正常型（o rthologue)のGSTPのヌクレオチド配列との比較（Sakaiら、1987）によって、コドン104およびコドン113が、２つの種のGST-πcDNAにおいて、ヒトからラットに Ile₁₀₄→Gly₁₀₄およびAla₁₁₃→Asn₁₁₃への変化を伴って変更されたヌクレオチド配列の間に存在することが示された。これは、これらの位置が、進化的論点から GST-πにおいて最も少なく保存されたものの間に存在することを示唆する。 GST-π改変体を生じるヌクレオチド転位はまた、改変体cDNAにおけるいくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を変換し、従って、制限酵素MaeIIおよびXcm Iを用いた制限エンドヌクレアーゼマッピングによるcDNAの特徴づけが可能になった。GST-πサブタイプを決定するこの技術は単純で迅速かつ特異的であり、そして多大な数の標本をスクリーニングするのに適切である。あるいは、GST-π表現型／遺伝子型は、この研究において実証されるように、異なる改変体に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとのサザンまたはノーザンによって決定され得る。しかし、交叉ハイブリダイゼーションのために、後者の手順の特異性は、特に、他の２つのGST-π改変体からhGSTP1^*Bを差別化することについて、制限される。さらに、これは、単一の標本におけるGST-π遺伝子またはmRNAの混合物の決定的な検出は可能にしない。これは、制限マッピングおよびヌクレオチド配列決定によって最良に達成される。アクチノマイシンＤでの転写ブロック後、本発明者らは、改変体とGST-π遺伝子との間のmRNA転写物の細胞内半減期における緩和な差異のみを観察した。hGST P1^*A転写物は、最も不安定で（t_1/2は9.4時間）あったが、hGSTP1^*Bの転写物が最も安定であり、半減期は14.1時間であった。全体として、以前に他の細胞型におけるGST-π転写物について報告された（Sheら、1995）観察された半減期は、3 .8時間〜8.6時間（エタクリン酸処理後）より長かった。コンピューターモデリングデータを用いて、本発明者らは、遺伝子hGSTP1^*BおよびhGSTP1^*Cによってコードされるペプチド、すなわち、GSTP1bおよびGSTP1cの三次元構造を、以前に決定された、GSTP1aのＸ線結晶構造（Reindeerら、1992； Reinemerら、1993）から作製した。得られた構造のエネルギー最小化によって、アミノ酸変化によって生じた６つの鍵となるＨ部位アミノ酸残基のうちの５つの原子配位および側鎖内の距離に有意な偏差が示された。影響を受けた残基のうち、Tyr₁₀₈が、特にVal₁₀、val₃₅、およびTyr₇との距離に関して、最も変化を受けていた。変化は、GSTP1bからGSTP1cへよりも、GSTP1aからGSTP1bまたはGSTP1cのいずれかへの発展に関してはるかに大きかった。このことは、+341における変化によるよりも+313転位による活性部位の構造および機能における影響がより大きかったことを示唆する。構造モデリングからの予測は、３つの改変体GST-π酵素の間に観察された酵素の反応速度の差異によって支持される。GSHのCDNBとの結合を触媒するにおいて、GSTP1a-1aのCDNBについてのKmは、GSTP1b-1bまたはGSTP1c-1cのいずれかのKm よりも約３倍低かった。Vmax値はまた、３つの酵素の間で同様に異なっていた。これらの結果は、少なくともGSTP1b（ここで、CDNBについて４倍低いKm値が、GS TP1b-1bと比較して、GSTP1^*c cDNAから生成され、部位特異的変異誘発によって人工的に作製された組換えGSTP1a-1aについて観察された）について、以前の研究における結果（Zimniakら、1994）と一致していた。これらのデータは、Val₁₀ ₄ 置換の、観察された酵素反応速度論への影響が、少なくとも一部が、GST-π活性（H-）部位におけるVal₁₀₄をIle₁₀₄の置換によって生じる立体効果の結果である。コンピューターモデリング研究によって、GSTP1b-1bおよびGSTP1c-1cにおける Ile₁₀₄→val₁₀₄置換がＨ部位に並ぶ６アミノ酸のうち５アミノ酸に有意に影響し、そしてTyr₁₀₈、Val₃₅、Val₁₀および、少ない程度でPhe₈と境をなすＨ部位の領域によって立体的に制限される残基の側鎖における有意なシフトを生じた一方で、Tyr₇およびVal₁₀と境をなす領域を開放したことを示した。これらの知見は、嵩だかい基質がこれらの残基およびIle₁₀₄によって区画される空間により良好に適合し得、そしてCDNBについてのGSTP1a-1aのKmがGSTP１b-１bのKmよりも低いという以前の知見を説明し得ることを示唆する。一方で、反対が、より嵩だかいブロモスルフタレインについても正しかった（Zimniakら、1994）。改変体GST-πタンパク質間で観察された機能の差異についてのさらなる基本は、GST-πペプチドのドメインII（Ｈ部位が存在する）が５つのαヘリックス（そのうち２つ（αＤ[AA_81-107]およびαE[AA_109-132]）が、Ile₁₀₄→Val₁₁₃および Ala₁₁₃→Val₁₁₃のアミノ酸置換を含む（Reindeerら、1992；Reinemerら、1993））を含むという事実に存在し得る。右巻きの超螺旋がこの領域に存在し、これは、部分的にαDおよびαEの上下の配置およびαEと第三の螺旋であるαFとの交叉結合によって超螺旋を形成するように生成される（Reindeerら、1992；Reinemer ら、1993）。以前の研究において、タンパク質におけるαヘリックス構造に寄与するIle、Ala、およびValの熱力学的性質が、タンパク質が天然のαヘリックス構造に折りたたまれる場合に計算された自由エネルギー（ΔΔＧ）によって示されるように、有意に異なっている（Blaberら、1993）。結果として、IleまたはA laからValへの変化は、Ｈ部位構造に影響を与え得るαヘリックスまたは超螺旋構造におけるわずかな変化を生じ得、そして究極的にはGST-π酵素間の基質結合親和性および触媒活性における差異を生じ得る。これは、実際、基質CDNBを用いた３つすべてのタンパク質について、および他の基質を用いたGSTP1a-1aおよびGSTP1b-1b（Zimniakら、1994）についての研究において見出された。興味深いことに、組換えGSTP1a-1aは、45℃において、GST P1b-1bまたはGSTP1c-1cの速度よりも２倍の速度でその活性を喪失した。GSTP1a とGSTP1bとの間の熱力学安定性における同様の差異もまた、以前に報告された（ Zimmiakら、1994）。これは、温度の上昇によって誘発されたＨ部位の安定性における異なる変化、およびコドン104およびコドン113における異なるアミノ酸で形成されるαヘリックスの自由エネルギーにおける差異に起因し得る。 CDNBについてのKm値に関する改変体GST-π間に観察された差異の重要な示唆は、異なるGST-π改変体タンパク質を含む細胞または組織におけるGST活性を決定するCDNBの使用によって、GSTP1a-1aと比較して、FSTP1b-1bおよびGSTP1c-1cの寄与を過小評価する結果をもたらすことである。しかし、本発明者らは、このような定量的な決定が、胎盤GST-π抗体（本明細書中で示されるように、３つすべてのGST-πタンパク質と交叉反応する）を用いるELISAアッセイによってなされ得ることを示した。標本間の異なるGST-π遺伝子改変体の分布頻度の結果によって、hGSTP1^*Cが止常組織よりも悪性神経膠腫、主にリンパ腫細胞において４倍高い頻度で存在したことが示された。反対に、hGSTP1^*Aは、神経膠腫におけるよりも正常の細胞および組織においてより頻繁に存在する。さらなる研究によって、腫瘍においてGSTP 1^*Cのより高い頻度が悪性化のプロセスに関して、クローン選択またはヘテロ接合性の損失を表すことが明らかになる。他の２つのGST-π遺伝子とは対照的に、 hGSTP1^*Bは、比較的稀な対立遺伝子かつホモ接合性であるようであり、研究されたいずれの脛瘍標本にも細胞株にも存在しなかった。また、試験したいずれの標本も、hGSTP1^*BおよびhGSTP1^*Cについてヘテロ接合性ではなかったことは興味をそそる。機能的に異なるGST-πタンパク質が細胞および組織におけるGST-π活性の微調整／調節のための機構を提供し、それ自体、GSTP1b-1bおよびGSTP1c-1cの類似の触媒特性のため、これら２つのGST-πを単一の細胞または組織において同時発現させることには生物学的利点は何ら存在しない。将来の研究によって、異なるGST-πペプチドが同程度に互いに二量体化し、そして異なる基質に対する異なる触媒活性を有するGST-πタンパク質を得るか否かが決定される。改変体GST-πタンパク質のＨ部位構造における差異が、この部位に対する、異なる変異原、発癌物質、およびアルカリ化抗癌剤に対する結合親和性における差異をもたらし、そして結果として、GSHに対するこれらの化合物の結合を触媒する酵素の異なる能力をもたらす。これは、異なるGSP-π遺伝子型および／または表現型を有する個体が癌を発生させる危険度に関して有意に関連することを示す。これはまた、実施例において記載するように、新規のGST-π標的化抗癌治療を合理的に設計するための基礎を提供するはずである。上記の研究をゲノムレベルにまで拡張して、単離されたhGSTP1^*C遺伝子は、Su perCos-GSTpiと命名されたコスミドベクタークローンの2.1kB NotIl/HinDIIIおよび11.5kB HindIIIフラグメント内に位置決定された。この3116塩基対は、開始メチオニンATGコドンの上流の161コドンおよびTGA終止コドンの下流の222ヌクレオチドを含み、そして７つのエキソンにおける210アミノ酸をコードする。エキソン−イントロン構成は、AG/GTスプライシングシグナルの同定およびこの細胞株から以前に記載されたGST-πcDNAの配列（Ali-Osmanら、1990）の比較によって決定された。単離された遺伝子のプロモーター領域は、Cowellら（1988）および Morrowら（1989）によって以前に記載されたプロモーター領域と類似しており、そして以前に報告されたようにすべての調節領域であるTATAボックスおよびAP1 部位およびSP1部位の両方を含んでいた。しかし、さらに、抗酸化剤応答エレメント（ARE）がこの遺伝子のAP1部位において同定された。続いてこのAREは、以前に記載されたGST-π遺伝子において同定された。この配列は、ヒトNAD(P)H：キノンオキシドレダクターゼ遺伝子のAREコア配列（GTGACTCAGC）と同一であり（HayesおよびPulford、1995；Xiaら、1991）、そしてラットGST Ya遺伝子におけるARE（GTGACAAAGC、配列番号32）と高度な相同性を有する（HayesおよびPulf ord、1995；LiおよびJaiswal、1992）。ここで記載される「c」改変体GST-π遺伝子と以前に報告された遺伝子との間の主要な差異は、+1404でのA→Gおよび+2294でのC→Tのヌクレオチド転位である。これによって、単離された遺伝子がGST-πのhGSTP1^*C改変体であることが検証される。これらの転位によって生じた、コドン104およびコドン113における、それぞれ、ATC（Ile）→GTC（Val）およびGCC（Ala）→GTC（Val）の変化は両方とも、GST-πペプチドの求電子結合（H-）部位に存在した。単離されたhGSTP1^*Cと以前に記載されたGST-π遺伝子との間の他の構造的差異は、イントロン５および６における転位を含み、これは、制限切断部位を変換することがこの遺伝子の構造的な特徴づけにおいて有用であるが、公知の調節モチーフは含まない。しかし、潜在的な機能的な重要性の構造的な差異は、イントロン１において保存されるIRE（CCCGCGTC）での+51でのグアニン挿入であった。このIREは、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子におけるIR E-A（CCCGCCTC）（Nasrinら、1990）、HPB-ALL細胞株およびMCF-7細胞株の両方から単離されたGST-πにおけるIRE（Cowellら、1988；Morrowら、1989）と高度に相同性であり、そしてインスリンによるGST-πの活性化の原因であり得る（Ah madら、1990）。ここで記載されるhGSTP1^*C遺伝子のIREにおける単一のグアニン挿入が神経膠腫細胞の共通の特徴であるか否か、およびそれがインスリン結合、および究極的にはGST-π遺伝子のインスリン応答性を有意に変化させるか否かは、検証されないままである。 GST-π遺伝子における機能性RAREの初めての同定は、本研究の特に重要な発見である。同定された配列は、他のRA応答性遺伝子に存在するRAREのハーフ部位である5'-A(G)GG(T)TC(G)A-3'（例えば、RARα2型、β2型、およびγ2型（Xiaら、 1996；Boardら、1989；Hoffmann、1990；FavreauおよびPickett、1990；Leroyら、1991；Lehmannら、1992；Smithら、1991；Mangelsdorfら、1991；Pikarskyら、1994）および細胞性レチノイン酸およびレチノール結合タンパク質（CRABPおよびCRBP）（Mangelsdorfら、1991；Plkarskyら、1994；BoylanおよびGudas、19 91；Durandら、1992；、1992；Yang-Ycnら；Schulcら、1991））と高度に相同である。hGSTP1^*C遺伝子において、シス作用性でそして制御される遺伝子のプロモーター領域に存在する、以前に記載された大部分のRAREとは対照的に、RAREコンセンサスハーフ部位の４つの反復および１つのパリンドロームハーフ部位がすべてイントロン５に存在する。実際、オンコジーン、腫瘍サプレッサー遺伝子、増殖因子および増殖因子レセプター遺伝子（Vasiosら、1989；Stumpoら、1988；Ta ubら、1987；LozanoおよびLevine、1991；Jungら、1993；TakimotoおよびKuramo to、1993；Chrysogelos、1993；Chenら、1994）を含む、種々の遺伝子において、機能性イントロン調節エレメントは、調節遺伝子の転写開始部位からの一次構造において離れて位置する。GST-π遺伝子において、RAREモチーフは、転写開始部位からおよそ1,500bpに位置し、これは、p53遺伝子における組織特異的な制御エレメント（Taubら、1987）およびPDGF-A鎖遺伝子のその転写開始部位からの２つのネガティブ制御エレメント（LozanoおよびLevlne、1991）の位置と同様の距離である。 hGSTP1^*Cにおける２つのRAREは、５ヌクレオチドで隔てられており、そして他の２つは、13ヌクレオチドで隔てられ、これは、RARE機能性に要求される最小限のヌクレオチドスペーサーに対応する（Xiaら、1996）。従って、これら２つのR AREは、hGSTP1^*C遺伝子において機能的なRAREであるようである。ゲル移動度アッセイを用いて、RAR-βが全トランスRAでの前処理によって誘発された、MGR-3 細胞からの核タンパク質抽出物が、hGSTP1^*C遺伝子におけるRAREに特異的に結合する画分を含んでいたことが示された。さらに、全トランスRA処理後に、GST-π 遺伝子の発現はMGR-3細胞において有意に上昇していた。RAREの機能性は、RA-RA R複合体の結合を必要とするので（Glassら、1991）、これらのデータは、hGSTP1^* C遺伝子におけるRAREが機能性である強力な証拠を提供し、そしてRA-RAR-RARE 結合が、少なくとも部分的に、MGR-3細胞株における全トランスレチノイン酸によるGST-π遺伝子の、観察された活性化に寄与し得ることを示唆する。この結果は、GST-π遺伝子のダウンレギュレーションが全トランスレチノイン酸への曝露後のGST-π-CAT融合遺伝子において観察された以前の研究（Xiaら、1993）とは対照的である。CATプラスミド欠失構築物を使用する最近の証拠によってもまた、GST-πプロモーターにおけるAP1部位が、RA媒介遺伝子抑制に必要とされることが示されている（Xiaら、1996）。これらの観察、ここで示されたデータおよび公知のRA媒介の，RA応答性遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション（Lehmannら、1992）に基づいて、RAによるGST-π遺伝子の活性化および抑制が、２つの別々の機構によって生じるというモデルが提唱される。このモデルにおいて、GST-π遺伝子は、RA-RAR複合体の、遺伝子におけるRAREへの結合によって活性化される。反対に、GST-π遺伝子の抑止得は、以前に示唆されている（Xiaら、1996；Schuleら、1 991）ように、RA-RAR複合体による、AP1結合タンパク質（例えば、junおよびfos ）の、AP1 DNA部位への結合の競合的阻害を介して生じる。このようなモデルは、リガンド活性化RARによるRA媒介の遺伝子調節について提唱された一般的な機構（Lehmannら、1992；Durandら、1992；Fanjuiら、1994）に一致する。GST-π 遺伝子発現のRA誘導の後者の機構は、レチノイン酸の長期の投与の癌予防性作用の分子的基礎の部分を構成し得る（Lipmanら、1987）。本研究において観察されたMGR-3細胞における全トランスRAによるGST-π遺伝子の活性化は、RAによるラミニンB1遺伝子の後期の転写誘導（Vasiosら、1991）に類似した、遅いプロセスであり、そしてRAREへのRAR-リガンド結合に関与する機構と一致していた。これらの結果および観察は、本発明にしたがって、以下の章において詳述されるように、開発される。Ｂ．ポリペプチドおよびペプチド本発明は、１つの実施態様において、上記の新規GST-πアミノ酸配列を含む。本発明はまた、別の部分と融合されたGST-πからの部分を含むハイブリッド分子を含む。あるいは、この種類の融合体は、単一のポリペプチド分子中に全ての３つの改変を含む配列を用いて産生され得る。開示された分子のフラグメント、ならびに挿入、欠損または置換変異体（ここで、それぞれ、非GST-π配列は導入されているか、GST-π配列は除去されているか、またはGST-π配列は、非GST-π配列で置換されている）もまた含まれる。本発明による、GST-πは、さらなる構造的または機能的分析、GST-π-関連ポリペプチドおよびGST-π-特異的抗体のような試薬の産生において、使用するためにフラグメントに有利に切断され得る。これは、精製または未精製のGST-πをエンドプロテイナーゼglu-C（Boehringer．Indianapolls，IN）のようなペプチダーゼで処理することによって達成され得る。CNBrでの処理は別の方法であり、それによって、GST-πフラグメントが、天然のGST-πから産生され得る。組換え技術もまた、GST-πの特異的フラグメントを産生するために使用され得る。より軽微な改変および変化は、コードされる本発明のGST-πポリペプチドの構造において作製され、そして上記の改変体を含む天然のGST-πポリペプチドの特徴を有するタンパク質またはペプチドをコードする分子が依然として得られる。以下は、等価物、またはさらに改善された、第２世代の分子を作製するために、タンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。アミノ酸変化は、以下のコドン表、表Ａに従って、DNA配列のコドンを変化させることによって達成され得る。その抗原性または活性を改変または改善するために、所定のアミノ酸が、タンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得ることが公知である（例えば、Ky teおよびDoolittle，1982;Hopp.米国特許第4,554,101号を参照のこと、これは参考として本明細書中に援用される）。例えば、代替アミノ酸の置換により、増大した活性または安定性を生じる小さなコンフォメーション変化が、ポリペプチドに付与され得る。あるいは、所定のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、他の目的に有用であるのに十分な抗原性の出発ペプチドを保持するペプチド-分子結合体を提供するために次いで他の分子に連結され得る残基を提供するために利用され得る。例えば、診断的な実施態様において特定の利点を有する、固相支持体に結合した選択されたGST-πペプチドが構築され得る。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与することにおけるアミノ酸の疎水性親水性指数の重要性は、KyteおよびDoolittle(1982)によって一般に考察された。ここで、所定のアミノ酸が、類似した疎水性親水性指数またはコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似した生物学的活性を保持することが見出されている。以下の表Ｂに示すように、アミノ酸は、それらの疎水性および荷電特徴を基礎として疎水性親水性指数を割り当てられる。アミノ酸の比較的な疎水性親水性特徴が、生じるタンパク質の二次構造を決定し、これは次に基質分子とのタンパク質の相互作用を定義する。抗原的に等価なペプチドまたはタンパク質を生じる好ましい置換は、一般に、互いに±２ユニット以内、より好ましくは±１ユニット以内、そしてさらにより好ましくは±0.5ユニット以内の指数の値を有するアミノ酸を含む。従って、例えば、イソロイシン（＋4.5の疎水性親水性指数を有する）は、好ましくは、バリン（＋4.2）またはロイシン（＋3.8）のようなアミノ酸と交換される。あるいは、好ましくは、この尺度の他方の末端では、リジン（−3.9）が、アルギニン（−4.5）などで置換される。同様のアミノ酸の置換はまた、親水性に基づいて作製され得る（特に、それによって作製された生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドが、免疫学的実施態様における使用に意図される場合）。本明細書中に参考として援用される米国特許第4,554,101号は、その隣接したアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最大の局所平均親水性が、免疫原性および抗原性（すなわち、タンパク質の重要な生物学的特性）と関連することを述べている。米国特許第4,554,101号に詳述されるように、各アミノ酸はまた、親水性値を割り当てられている。これらの値は、下記の表Ｃにおいて詳述されている。１つのアミノ酸が、類似した親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、なお生物学的に等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）が得られ得ることが理解される。このような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。従って、これらのアミノ酸置換は、Ｒ基置換基の比較的な類似性（例えば、サイズ、求電子特徴、電荷などに関して）に一般に基づく。一般に、種々の上記の特徴を考慮に入れた好ましい置換は、当業者に公知であり、そして例えば、以下の組み合わせが挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。さらに、これらの配列から、少なくとも約６つの連続したアミノ酸のペプチドを含むこれらのポリペプチドに由来するペプチドが意図される。あるいは、このようなペプチドは、約７，８，９，10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,2 3,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,4 7,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59または60の連続した残基を含み得る。例えば、６つの連続したアミノ酸残基を含むペプチドは、GST-πタンパク質の１から６、２から７、３から８などの残基を含み得る。このようなペプチドは、以下の式によって示され得る。ｘから（ｘ＋ｎ）＝第一および最後の連続残基の位置の５’から３’ ここで、ｘは、GST-πタンパク質の１から全長までの任意の数に等しく、ｎはペプチドマイナス１の長さに等しい。ペプチドが10残基長（ｎ＝10〜1）である場合、この式は、各抗原に対して可能な各10マーを示す。例えば、ｘが１である場合、ペプチドは残基１から（１＋［10−１］）、または１から10を含む。ｘが２である場合、ペプチドは、残基２から（２＋［10−２］）、または２から11を含み、そして以下同様である。ペプチドの合成は、固相方法のような従来の合成技術（例えば、Applied Bios ystems Model 430A Peptide Synthesizerのような市販のペプチド自動合成機の使用を介して）を用いて容易に達成される。次いで、この様式で合成されたペプチドは、所定の量にアリコートされ得、そして水溶液中、またはさらにより好ましくは粉末または未使用の凍結乾燥された状態のような従来の様式で保存され得る。一般的に、ペプチドの相対安定性に起因して、所望であれば、これらはかなり長期間にわたって水溶液中に容易に保存され得る。例えば、認識可能な分解または抗原活性の消失なしに事実上いかなる水溶液において６ヶ月までも保存され得る。しかし、長期の水性保存が意図された場合、7.0から7.5のpHを維持するためにTrisまたはリン酸緩衝剤のような、緩衝剤を含む薬剤を含むことが概して望ましい。さらに、微生物の増殖を阻害する、アジ化ナトリウムまたはMertiolateのような薬剤を含むことが望ましくあり得る。水性状態における長期の保存のために、溶液を４℃、またはより好ましくは凍結させて保存することが望ましい。もちろん、ペプチドが凍結乾燥状態または粉末状態、例えば、使用前に所定の量の水（好ましくは、蒸留脱イオン水）または緩衝液によって再水和され得る計測済アリコートで保存される場合、それらは、事実上無期限で保存され得る。本発明のGST-πポリペプチドの範囲内にある抗原性エピトープを表すペプチドは特に興味深い。「エピトープ」とは、Ｔ細胞またはＢ細胞からの応答を刺激し、それ故、これらの細胞からの免疫応答を誘発する分子の領域である。本明細書に用いられるエピトープコア配列とは、抗体またはＴ細胞レセプター上の結合部位に構造的に「相補的」であり、従って、それに結合する比較的短い範囲のアミノ酸である。本発明の開示の状況において、用語「相補的」とは、互いに向かって引力を示すアミノ酸またはペプチドをいう。従って、本発明の特定のエピトープコア配列は、対応するGST-πに特異的な抗血清に対する対応するGST-π抗原の結合と競合し、または、おそらく置換するそれらの能力に関して操作上で規定され得る。エピトープコア配列の同定は、当業者に公知である。例えば、米国特許第4,55 4,101号は、親水性に基づき、かつChou-Fasman分析によるアミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示している。多数のコンピュータプログラムがタンパク質の抗原部を予測するのに用いられるために利用可能である。これらのプログラムの例は、Jameson-Wolf分析（JamesonおよびWolf、1988；Wolfら、198 0；Weinbergerら、1985）、およびコンピュータ化されたペプチド配列分析プログラムと併用され得るタンパク質三次構造予測のための他の新しいプログラム（ FetrowおよびBryant、1993）を含む。一般的に、ポリペプチド抗原のサイズは、同定されたコア配列または配列を有するのに少なくとも十分な大きさである限り特別に重要でないと考えられている。本発明の開示によって予測される有用な最小のコア配列は、長さが約６アミノ酸のオーダーである。従って、このサイズは、本発明に従って調製される最小のペプチド抗原に概して対応する。しかし、抗原のサイズは、基本的なエピトープコア配列を含有している限り、所望であればより大きくし得る。Ｃ．ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドポリペプチドに加えて、本発明はまた、上述のGST-πをコードする核酸を含む。遺伝コードの縮重により、多数の他の核酸もまた、所与のGST-πをコードし得る。例えば、４つの異なる３塩基コドンは、アミノ酸アラニン、グリシン、プロリン、トレオニン、およびバリンをコードする一方、６つの異なるコドンは、アルギニン、ロイシン、およびセリンをコードする。メチオニンおよびトリプトファンのみが単一のコドンによってコードされる。表Ａは、このような実施態様に用いられるアミノ酸およびそれに対応するコドンのリストを提供する。GST-πをコードする任意の核酸を生成するために、当業者は本明細書に提供されるコドン表を参考にすることだけが必要とされる。同一のアミノ酸をコードする任意のコドンで天然コドンで置換することによって、GST-πをコードする異なる核酸が得られる。実際には、これは、存在するGST-π遺伝子の部位特異的変異誘発または１つ以上の核酸のデノボ化学合成によって達成され得る。置換の変異体GST-πペプチドおよびポリペプチドに関して上記に示した部位特異的変異誘発および化学合成に関する観察は、核酸の考証に対して同等の効力を適用する。より具体的には、所与のポリペプチドまたはエピトープの１つ以上のコドンを変更するように設計された核酸配列における部位特異的変化によって生成される置換変異体は、多数の変異体を迅速な方法で生成する、より簡便な方法を提供し得る。本発明の核酸は、GST-πフラグメント（例えば、トランケーション）、GST-π-GST-π融合分子（上述）および他の分子とGST-π融合を生成する簡単な方法を提供する。例えば、GST-π遺伝子における制限酵素、アクレアーゼ、リンカー、およびリガーゼを利用することは、これらの遺伝子の構造および得られた遺伝子産物を操作することを可能にする。本発明の開示によって提供される核酸配列情報はまた、選択されたGST-π遺伝子の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いDNA（またはRNA）配列の調製を可能にする。これらの局面において、適当な長さの核酸プローブは、GST−π遺伝子のコード配列または染色体におけるGST-π遺伝子の下流および上流領域のようなGST-π遺伝子近傍の隣接領域の考慮に基づいて調製される。GST−π遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする、このような核酸プローブの能力は、種々の実施態様における特定の有用性をプローブに与える。例えば、プローブは、所与のサンプルにおけるインタクトなGST−π遺伝子の検出のための種々の診断アッセイにおいて用いられ得る。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは、存在する抗体に対する反応性について、または診断もしくは治療用の試薬を生成する能力について対応するペプチドをスクリーニングする目的のために発現構築物にインフレームで挿入され得る。本発明による利点のいくつかを提供するために、ハイブリダイゼーション研究またはアッセイのために使用される好適な核酸配列は、少なくとも10から20程度の配列のヌクレオチド範囲に相補的な配列を含むが、30から60程度の配列のヌクレオチドも有用であると予測される。長さが少なくとも９ヌクレオチドのサイズは、フラグメント安定および選択的の両方である二重鎖分子を形成するために十分な長さであることを確実にすることを援助する。しかし、ハイブリッドの安定性および選択性を増加し、それにより、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度を改善するために、長さが10塩基を上回る範囲にわたって相補的配列を有する分子が概して好適ではある。従って、15から20ヌクレオチド、または、所望である場合30から60のような、より長いGST-π遺伝子相補的範囲を有する核酸分子を設計することが概して好ましい。このようなフラグメントは、例えば、化学的手段によってフラグメントを直接合成すること、米国特許番号第4,603,102 号のPCR技術のような核酸複製技術を適用すること、または組換え生成のための組換えベクター中に選択された配列を導入することによって、容易に調製され得る。有用であるプローブは、GST−π改変体の任意の部分から得られ得る。従って、プローブは、各GST−πのヌクレオチド配列の最後の９ヌクレオチドを含むプローブまでのヌクレオチド１から９、または２から10、または３から11などを含むことが特に意図される。従って、各プローブは、ｎが１から配列におけるヌクレオチド数の整数である式「ｎからｎ＋８」によって示されるヌクレオチド配列の少なくとも約９つの線状ヌクレオチドを含む。低い、中間の、中高の、および高いストリジェンシー条件下でGST−πとハイブリダイズするより長いプローブはまた、GST−π改変体のヌクレオチド配列の全体を含むプローブを含むことが意図される。この仮定は、約10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45, 50,60,70,80,90,100およびそれより長い塩基の長さを有するプローブに対して反復され得る。本発明のハイブリダイゼーショシ局面に関連して用いられ得る種々のハイブリダイゼーション技術およびシステムは公知であり、Falkowらの米国特許番号第4, 358,535号に記載のものなどの診断用アッセイを含む。意図される適用に依存して、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するためのハイブリダイゼーションの種々の条件を利用することが所望される。高い選択度を必要とする適用について、代表的にハイブリッドを形成する比較的ストリンジェントな条件を使用することが所望される。例えば、50℃から70℃の温度において0.02M −0.15MのNaClによって提供されるような比較的低塩および／または高温条件が選択される。これらの条件は、特に選択的であり、プローブと鋳型または標的鎖との間の不一致を存在したとしてもほとんど許容しない。もちろん、いくつかの適用に対して、例えば、元となる鋳型とハイブリダイズする変異プライマー鎖を使用する変異株を調製することが所望される場合、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするためにそれほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が要求される。これらの状況において、20℃から55℃までの範囲の温度において0.15Mから0.9Mの塩などの条件を利用することが所望される。いずれにせよ、条件が、昇温と同じ様式においてハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが概して理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、そして選択の手段は、概して所望の結果に依存する。特定の実施態様において、変異したクローンを含有するクローンバンクから改変体を単離する核酸プローブを利用することが所望され得る。特定の実施態様において、GST-π配列の改変体を含む固体培地上で増殖する変異クローンコロニーを、コロニーブロットアッセイに用いられる条件および方法のようなハイブリダイセーション条件および方法を用いる複製フィルタ上で同定して、配列改変体を含有するプローブと特異的なコロニーに含有される核酸配列改変体との間のみのハイブリダイゼーションを得ることができる。この様式において、GST-π遺伝子の短い改変体配列を含有する小さなハイブリダイゼーションプローブは、GST-π 遺伝子全体の配列改変体を含有する固体培地上で増殖するそれらのクローンを同定するために利用され得る。次いで、これらのクローンは改変体GST-π核酸配列または対応するGST-π抗原の所望の量を得るために増殖され得る。診断上の実施態様において、本発明の核酸配列は、ハイブリダイゼーションを判定するために標識のような適切な手段と併用される。検出可能な信号を与え得る放射活性、酵素的または、アビジン／ビオチンのような他のリガンドを含む広範な種々の適切な指標手段が当該技術において公知である。好適な診断上の実施態様において、おそらく、放射活性または他の輿境的に望ましくない試薬の代わりに、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが所望される。酵素タグの場合、核酸含有サンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するために人の眼または分光光度的に可視である手段を提供するために使用され得る比色分析指標基質は公知である。一般的に、本明細書において記載のハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダイゼーションおよび固体相を使用する実施態様における試薬の両方として有用であることが意図される。固体相を含む実施態様において、浸出液、体液（例えば、羊水、中耳浸出液、気管支肺胞洗浄液）またはさらに組織のような疑わしい臨床サンプルからの試験DNA(またはRNA)は、選択されたマトリクスまたは表面において吸着またはそうでなければ接着される。次いで、固定されたこの一本鎖核酸は、所望の条件下で選択されたプローブとの特異的なハイブリダイゼーションに供される。選択される条件は、（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ、などに依存して）必要とされる特定の基準に基づいた特定の状況に依存する。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイズされた表面を洗浄することに続いて、標識によって特定のハイブリダイゼーションが検出または定量化さえもされる。改変体配列をコードする核酸は、細胞（例えば、腫瘍細胞）のゲノム構成の変化を検出するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法論の組み合わせにおいて有用であり得る。一般に、例えば、米国特許第4,603,102号に記載のようなPCR技術を適用することによって、サンプル中でGST-π核酸の規定された一部のPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブとしてGST-π遺伝子配列の種々の一部分が利用され得る。次いで、GST-π配列の増幅部分は、相補的配列を含むハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズすることにより、検出され得る。この様式では、非常に低濃度の核酸を、GST-π配列を利用してサンプル中から検出し得る。アンチセンス技術 GST-πにハイブリダイズする配列の特異的適用において、本発明は、アンチセンス構築物の使用を意図する。用語「アンチセンス」とは、RNA GST-πの一部に相補的なポリヌクレオチド分子、またはそれに対応するDNAをいうことを意図する。「相補的な」ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン・クリック相補性規則に従って塩基対合し得るポリヌクレオチドである。すなわち、より大きなプリンは、シトシンと対合したグアニン（G:C）、DNAの場合はチミン（A:T）と、またはRNAの場合はウラシル（A:U）と対合したアデニンとの組み合わせを形成するために、より小さなピリミジンと塩基対合する。イノシン、5-メチルシトシン、6- メチルアデニン、ヒポキサンチン、および配列とハイブリダイズする他のもののようなあまり一般的でない塩基の包含は、対合を妨害しない。ポリヌクレオチドで二本鎖（ds）DNAを標的化することは、三重らせん形成を導き；RNAを標的化することは、二重らせん形成を導く。標的細胞に導入される場合、アンチセンスポリヌクレオチドは、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨害する。アンチセンスRNA構築物、またはこのようなアンチセンスRNA構築物をコードするDNAは、インビトロまたはインビボのいずれかで、ヒト被験体を含む宿主動物のような宿主細胞内で遺伝子転写または翻訳あるいは両方を阻害するために用いられ得る。一価カチオンの細胞内濃度は約160mMである（10mM Na⁺；150mM K⁺）。二価カチオンの細胞内濃度は約20mMである(18mM Mg⁺⁺；2mM Ca⁺⁺。ハイブリダイゼーションの容量を減少させ、したがって核酸種の有効濃度を増加させるように作用する細胞内タンパク質濃度は、150mg/mlである。構築物は、これらのインビボ条件を模倣する条件下でインビトロで試験され得る。アンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の制御領域、遺伝子のエキソン、イントロン、またはさらにエキソン-イントロン境界に結合するように設計され得る。本発明についての最も有効なアンチセンス構築物は、mRNA開始部位に相補的な領域を含むことが意図される。標的タンパク質のレベルが影響を及ぼされるか否かを決定するために、単にインビトロで構築物を試験することによって、このような構築物を容易に試験し得る。同様に、タンパク質合成の有害な非特異的阻害はまた、インビトロで標的細胞生存度を決定することによって測定され得る。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「アンチセンス」とは、その全体の長さにわたって実質的に相補的でありそして非常にわずかの塩基のミスマッチを有するポリヌクレオチドを意味する。例えば、15塩基長の配列は、それらが15ヌクレオチドのうちの13または14ヌクレオチドの位置について相補的なヌクレオチドを有する場合に相補的と呼ばれ得る。もちろん、「完全に相補的」である配列は、その全体の長さを通して完全に相補的であり、そして塩基ミスマッチを有さない配列である。より低い程度の相同性を有する他の配列も意図される。例えば、高い相同性の限定された領域を有するが、非相同領域（例えば、リボザイム）も含むアンチセンス構築物が設計され得る。これらの分子は、50％以下の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。本発明によるポリヌクレオチドは、タンパク質発現のアンチセンス阻害をもたらすために十分なGST-π遺伝子または遺伝子の一部をコードし得る。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNAに由来し得、すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローン化され得る。しかし、他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、相補的DNA( cDNA)であり得る。cDNAは、テンプレートとしてスッセンジャーRNA（mRNA）を使用して調製されるDNAである。したがって、cDNAは、任意の中断されたコード配列を含まず、そして通常は対応するタンパク質のコード領域（単数または複数）をほとんど独占的に含む。他の実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチトは、合成的に生成され得る。特定の構築物を生成するために、ゲノムDNAの一部をcDNAまたは合成配列と組み合わせることは有利であり得る。例えば、イントロンが最終的構築物で所望される場合、ゲノムクローンが使用される必要がある。cDNAまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分についてのより都合の良い制限部位を提供し得、それゆえ、配列の残りに使用される。上述のように、アンチセンス配列は、全長ゲノムもしくはcDNAコピーまたはそれらの大きなフラグメントであり得るが、これらはまた、より短いフラグメント、または50塩基以下のポリヌクレオチドとして本明細書中に定義される「オリゴヌクレオチド」であり得る。より短いオリゴマー（8〜20）は作製することおよびインビボ接近性を増加させることがより容易であるが、多くの他の因子が塩基対合の特異性を決定することに関連する。例えば、オリゴヌクレオチドのその相補的標的への結合親和性および配列特異性の両方は、長さの増加とともに増加する。８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、 45、または50塩基対のオリゴヌクレオチドが使用されることが意図される。遺伝子配列のすべてまたは一部が、アンチセンス構築物の状況において用いられ得るが、統計学的には、17塩基長の任意の配列は、ヒトゲノムにおいて一度のみ存在するはずであり、したがって、独特の標的配列を特定するために十分である。特定の実施熊様では、他のエレメントを含むアンチセンス構築物、例えば、C- 5プロピンピリミジンを含む構築物を用いることが望まれ得る。ウリジンおよびシチジンのC-5プロピンアナログを含むオリゴヌクレオチドは、高い親和性でRNA を結合し、そして遺伝子発現の強力なアンチセンスインヒビターであることが示されている（Wagnerら，1993）。リボザイム標的されたアンチセンス送達の代わりとして、標的化されたリボザイムが使用され得る。用語「リボザイム」とは、DNAおよびRNAの両方において特定の塩基配列を標的化し、そして切断し得るRNAベースの酵素をいう。リボザイムは、リボザイム配列を組み込むRNAオリゴヌクレオチドの形態で、細胞に直接標的化され得るか、あるいは所望のリボザイムRNAをコードする発現ベクターとして細胞に導入され得るかのいずれかであり得る。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドについて記載されたのとほとんど同じように使用および適用され得る。リボザイム配列もまた、アンチセンスポリヌクレオチドについて記載されたのとほとんど同じように改変され得る、例えば、非ワトソン・クリック塩基を導入し得るか、もしくは混合したRNA/DNAオリゴヌクレオチドを作製し得るか、またはホスホジエステル骨格を改変し得るか、あるいはRNAの糖リボース群に2'-ヒドロキシ基を修飾し得る。あるいは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをコードする核酸を保有する発現構築物からの転写を介して、RNAとして提供され得る。発現構築物およびベクターの一般的な考察は、以下に提供される。 GST-p発現のアンチセンスおよびリボザイムインヒビターについてのスクリーニング本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム治療剤の原理は、それらが、これらの遺伝子のmRNA転写物とハイブリダイズし、それによって、タンパク質への翻訳を阻害することにより、ヒトGST-π遺伝子の特異的改変体の発現をダウンレギュレートするために用いられ得ることである。そのように行うことによって、GST-πタンパク質によって腫瘍細胞に提供される治療に対する防御がブロックされ、そして腫瘍が、それに続く治療に、より感受性になる。さらに、腫瘍細胞におけるGST-π遺伝子の発現を抑制することにより、腫瘍の急激な増殖および進行に対するGST-πタンパク質の寄与は減少する。GST-πのmRNAの比較的小さい領域（15塩基）とハイブリダイズするアンチセンス分子を合理的に設計する際に、このような小さい領域の標的化は、全長アンチセンスポリヌクレオチドストラテジーとは、異なる利点を有する。なぜなら、これは、遺伝子の異なる領域の標的化に、より高い選択性を可能にし、そして、本発明者は、特異的にかつ差次的に、異なるGST-π遺伝子改変体の発現をダウンレギュレートし得るからである。本発明が提供する特定の実施態様では、従って、例えば癌細胞において、GST- π遺伝子の発現を変更するアンチセンス分子を同定するスクリーニングアッセイが本発明によって提供される。これらの実施態様において、本発明は、癌細胞の GST-π発現を減少させる候補アンチセンスまたはリボザイム分子の能力を決定するための方法に関する。そして、その方法は、一般に、以下の工程を包含する：（a）GST-π発現を伴う細胞を得る工程；（b）候補分子をこの細胞と混合する工程；および（c）この細胞のGST-π成分を阻害する候補物質の能力を決定する工程。 GST-π発現を減少し得るような候補物質を同定するために、本発明者は、任意の付加および操作の前に、例えば癌細胞の基底GST-π状態を測定ならびに決定する。次いで、細胞に候補分子が添加され、そして候補分子の存在下でGST-π活性が再決定される。組成物の非存在下と比較して細胞のGST-π発現もしくは含量を減少させる候補アンチセンスまたはリボザイムは、GST-π発現のインヒビターである候補物質の指標である。 GST-π発現の有意な減少は、GST-πタンパク質レベルを少なくとも約30％〜40 ％減少することによって示される。そして、最も好ましくは、少なくとも約50％の減少により、示され、もちろんより高い値も可能である。細胞のGST-π含量を測定するアッセイは、当該分野で周知であり、インビトロまたはインビボで行われ得、本明細書の他の場所に、記載されている。あるいは、癌細胞の増殖の阻害を測定すること（例えば、MTTアッセイによる増殖の測定）が単に所望され得る。増殖での有意な阻害は、非阻害と比較して少なくとも約30〜40％の減少により示され、そして最も好ましくは、少なくとも約 50％の減少であり、より有意な減少もまた可能である。MTTアッセイによって測定される増殖アッセイは当該分野で周知である。アッセイは、Mosmannら、1983 ；Rubinsteinら、1990（本明細書中で参照として援用される）によって記載されるように行われ得る。それゆえ、候補の分子が、この型の研究において癌細胞の増殖の阻害を示す場合、本発明中での使用に適切な化合物であるようである。アンチセンスまたはリボザイム分子の定量的なインビトロでのテストは、本発明の要件ではない。なぜなら、一般に薬剤は、しばしば公知の特性に基づくか、または、有効であると既に実証されたこれらの薬剤に対する構造的および／もしくは機能的な比較によって、選択されるからである。したがって、有効量はしばしば、他の状況での動物への投与に安全であると提唱された有効量である。 D. 発現ベクター GST-πポリペプチドまたはアンチセンス構築物を発現するために、発現カセット中にGST-π核酸を提供することが必要である。発現カセットは、プロモーターの転写制御下のGST-π核酸を含む。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構または導入されたDNA配列をいう。句「転写制御下」とは、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御する核酸分子に関して止確な位置および方向にあることを意味する。原核生物の組換えDNAに最も一般的に使用されるこれらのプロモーターは、B-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系(Changら、1978;Itakuraら、1977;Goeddelら、1979)およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら、1980;EPO出願公開.第0036776号)を含む。これらが最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが発見および利用され、そしてこれらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開され、これにより当業者がその配列を機能的に他のプラスミドベクターに連結することが可能になった(EPO出願公開. 第0036776号)。適切な発現カセットは、標準的なサブクローニング技術により、市販の発現ベクター中に挿入され得る。本願を通じて、用語「発現構築物」または「発現ベクター」とは、アンチセンス生成物をコードする核酸を含む遺伝的構築物の任意の型を含むことを意味し、ここでこの核酸配列の一部または全部が転写され得る。例えば、E.collベクターpUCまたはpBlucscript^TMを、本発明に従って用いて、インビトロで組換えGST-πポリペプチドを産生し得る。これらのベクターの操作には当該分野で周知である。一般には、宿主細胞に適合する種に由来し、複製および制御配列を含み、プラスミドベクターはこれらの宿主とともに使用される。ベクターは通常、複製部位ならびに、形質転換された細胞における表現型選択を提供し得るマーカー配列を保有する。例えば、E.coliは代表的に、E.coli種に由来するプラスミドであるpBR322を使用して形質転換される（Bolivarら、1977）。p BR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って、形質転換された細胞の同定のための簡便な方法を提供する。pBRプラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージにもまたそれ自身のタンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターを含まなければならないか、または含むように改変されなければならない。さらに、宿主微生物に適合する複製および制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主とともに形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージλGEM^TM−11は、宿主細胞（例えば、E.coli LE392）を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターを作製する際に利用され得る。一つの実施態様では、タンパク質は、β-galを有する融合タンパク質として発現され、タンパク質の迅速なアフィニティー精製を可能にする。このような融合タンパク質発現の系の例には、グルタチオンS-トランスフェラーゼ系(Pharmacia .Piscataway.NJ)、マルトース結合タンパク質系(NEB,Beverly,MA)、FLAG系(IBI, New Haven.CT)、および6×His系(Qiagen,Chatsworth,CA)がある。これらの融合系のいくつかは、少数のさらなるアミノ酸のみを有する組換えタンパタ質を提供し、これらの組換えタンパク質の機能的な能力へは影響しないようである。例えば、FLAG系および6×His系の両方は、短い配列を付加するのみであり、これらの両方は抗原性が低いことが公知で、そして天然の高次構造へのタンパク質の折り畳みへの悪影響はない。他の融合系は所望のタンパク質からの融合パートナーを切り出すことが所望されるタンパク質を提供する。別の実施態様では、融合パートナーは、プロテアーゼに特異的な認識配列を含むペプチド配列によって組換えタンパク質と結合される。適切な配列の例は、Tobacco Etch Virusプロテアーゼ (Life Technologies,Gaithersburg,MD)または第Xa因子(New England Biolabs,Be verley,MA)による配列の認識である。 E.coliは、好ましい原核生物宿主である。例えば、E.coli株RR1は、特に有用である。使用され得る他の微生物株は、E.coli株(例えば、E.coli LE392、E.col i B、およびE.coli X1776(ATCC受託番号31537)を含む。前述の株ならびにE.coli W3110(F-、λ-、原栄養株、ATCC受託番号273325)、バチルス属(例えば、Bacill us subtilis)、または他の腸内細菌（例えば、Salmonella typhimurium、またはSerratia marcescens）、ならびに種々のPseudomonas種が使用され得る。これらの例は、当然、制限ではなく例示であることが意図される。組換え細菌細胞、例えば、E.coliは、多数の適切な培地のいずれか（例えば、LB)で増殖し、そして培地へのIPTG添加、またはインキュベーションを高温に変換することにより組換えポリペプチドの発現が誘導される。2時間と24時間との間のさらなる期間、細菌を培養した後、細胞を遠心分離により回収し、そして残った培地を洗浄して除去する。次いで細菌細胞を溶解し（例えば、細胞ホモジナイザーによる破砕）、そして遠心分離して高密度な封入体と細胞膜を可溶性の細胞成分から分離する。この遠心分離は、以下の条件下によって実施され得る。ここで、高密度な封入体を緩衝液中への糖（例えばスクロース）の取り込みおよび選択された速度での遠心分離により、選択的に濃縮する。組換えタンパク質が、封入体中に発現される場合、多くの例と同様に、これらを、いくつかの溶液のいずれかで洗浄して、混在する宿主タンパク質を除去し得、次いで高濃度の尿素(例えば、8M)またはカオトロピック剤（例えば、グアニジン塩酸塩）を含む溶液中に還元剤（例えば、β-メルカプトエタノール、またはD TT(ジチオトレイトール)）の存在下で溶解させ得る。いくつかの環境下では、タンパク質が天然タンパク質のコンホメーションにより密接に類似したコンホメーションへ再折り畳みするプロセスを経るのに適切な条件下で、数時間ポリペプチドをインキュベートすることが有利であり得る。このような条件は、一般には、500μg/mlより低いタンパク質濃度、低いレベルの還元剤、２Mよりも低い尿索濃度、およびしばしば、タンパク質分子内でのジスルフィド結合の変換を容易にする還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの混合物のような試薬の存在が含まれる。再折り畳みプロセスは、例えば、SDS-PAGE、または天然分子（これは、寄生生物から単離された天然分子でワクチンを受けた動物から得られ得る）に特異的な抗体とともにモニタリングされ得る。再折り畳みに続いて、次いで、タンパク質はさらに精製され、そしていくつかの任意の支持体（イオン交換樹脂、ゲル透過樹脂を含む）、または種々のアフィニティーカラムのクロマトグラフィーによって再折り畳み混合物から分離され得る。好ましい別の実施態様において、使用される発現系は、バキュロウイルスポリヘドロンプロモーターによって駆動される発現系である。タンパク質をコードする遺伝子は、バキュロウイルスベクターへのクローニングを容易にするために、標準的な技術によって操作され得る。好ましいバキュロウイルスベクターは、pB lueBacベクター（Invitrogen．Sorrento，CA）である。α4遺伝子を有するベクターは、標準的なプロトコルによってSpodoptera frugiperda（Sf9）細胞にトランスフェクトされ、そして細胞は培養され、そして組換えタンパク質を産生するようにプロセスされる。組換えGST-πが産生され得る適切なビヒクルを提供する他の種々の真核生物ベクターが存在する。本発明の種々の実施態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノム由来の操作された構築物を含み得る。特定のウイルスがレセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、そして宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そしてウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力により、ウイルスは、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入のための魅力的な候補となる（Ridgeway，1988；NicolasおよびRubenstein，1988；BaichwalおよびSugden，1 986；Temin．986）。ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポーバウイルス（シミアンウイルス40、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマ）（ Ridgeway，1988；BaichwalおよびSugden，1986）、およびアデノウイルス（Ridg eway，1988；BaichwalおよびSugden，1986）、およびアデノ随伴ウイルスを含む DNAウイルスであった。レトロウイルスもまた、ワクシナ（vaccina）ウイルス（ Ridgeway，1988）アデノ随伴ウイルス（Ridgeway，1988）およびHSV（Giorioso ら、1995）と同様に魅力的な遺伝子移入ビヒクル（NicolasおよびRubenstein，1 988；Temin，1986）である。このようなベクターは、（i）目的のタンパク質を発現する目的のためにインビトロで細胞株を形質転換するため、または（ii）遺伝子治療シナリオにおける治療ポリペプチドを提供するために、インビトロまたはインビボで細胞を形質転換するために使用され得る。真核生物ベクターに関して、用語、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIの開始部位周辺に凝集する転写制御モジュールの群をいうために、本明細書中で使用される。プロモーターが組織化される方法についての多くの考察は、いくつかのウイルスプロモーター（HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のためのプロモーターを含む）の分析に由来する。より最近の研究によって増大したこれらの研究は、プロモーターが別々の機能的モジュール（各々は、約７〜20 bpのDNAからなり、そして転写アクチベータータンパク質またはリプレッサータンパク質のための１つ以上の認識部位を含む）から構成されることを示している。各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、RNA合成のための開始部位を位置付けるように機能する。この最も知られている例は、TATAボックスであるが、TATAボックスを欠除するいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物終結デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV 40後期遺伝子のプロモーター）では、開始部位を覆う別々のエレメントが、それ自体、開始の場所を確定するのを援助する。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流の機能的エレメントも含むことが近年示されている。プロモーターエレメント間のスペーシングはしばしば可撓性であり、その結果、プロモーター機能は、エレメントが互いに比較して変化させられるかまたは動かされる場台、保存される。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が低下し始める前に50bp先まで増加され得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントが、共同してかまたは独立してかのいずれかで転写を活性化するように機能し得ることが明らかである。核酸の発現を制御するのに使用される特定のプロモーターは、標的細胞中で核酸を発現し得る限り、重要であるとは考えられていない。従って、ヒト細胞が標的とされる場合、ヒト細胞において発現され得るプロモーターの制御下で、そのプロモーターに隣接した領域をコードする核酸を位置付けることが好ましい。一般的に、このようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターが含まれ得た。好ましいプロモーターには、α４プロモーターを含むHSV由来のプロモーターが含まれる。別の好ましい実施態様は、テトラサイクリン制御プロモーターである。種々の他の実施態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）は、最初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス末端反復配列が、トランスジーンの高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所定の目的に十分であるならば、トランスジーンの発現を達成するための当該分野で周知の他のウイルスプロモーター、または哺乳動物細胞プロモーター、または細菌ファージプロモーターの使用も同様に意図される。表Ｄおよび表Ｅは、本発明の文脈においてトランスジーンの発現を調節するために使用され得るいくつかのエレメント/プロモーターを列挙する。この列挙は、トランスジーン発現の促進に関連する全ての可能なエレメントの網羅であることを意図せず、それらの例示にすぎない。エンハンサーは、もともと、同じDNA分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増強する遺伝子エレメントとして検出された。長い距離を超えて作用するこの能力は、原核生物転写調節の伝統的な研究においてはほとんど先例がなかった。その後の研究によって、エンハンサー活性を有するDNAの領域が、プロモーターと非常に類似して組織化されることを示した。すなわち、それらは多くの個々のエレメントから構成され、各々は１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な距離は操作可能である。全体としてのエンハンサー領域は、遠距離で転写を刺激し得なければならない；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントについてあてはまる必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向でRNA合成の開始を指向する１つ以上のエレメントを有さなければならなず、その一方で、エンハンサーはこれらの特異性を欠如する。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重なり、そして連続性であり、しばしば非常に類似したモジュラー組織を有するようである。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせ（Eukaryotic Promot er Data Base EPDBに従って）はまた、トランスジーンの発現を駆動するために使用され得る。T3、T7、またはSP6細胞質発現系の使用は、別の可能な実施態様である。真核生物細胞は、送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物としてのいずれかとして適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。宿主細胞には、真核微生物が含まれ、酵母培養物もまた使用され得る。Saccha romyces cerevislae、または一般のパン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に使用されるが、多数の他の株が通常入手可能である。Saccharomycesにおける発現のために、例えば、プラスミドYRp7は、通常使用される(Stinchcombら、1979 ；Kingsmanら、1979；Tschemperら、1980）。このプラスミドはすでに、トリプトファン中での増殖能力を欠除する酵母の変異株（例えば、ATCC番号44076またはPEP4-1（Jones，1977））のための選択マーカーを提供するtrpl遺伝子を含む。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl傷害の存在は、次いで、トリプトファンの非存在下における増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。酵母ベクターにおける適切なプロモーティング配列には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら、1980）または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）（Hessら、1968；Hollandら、1978）のためのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミドを構築することにおいて、これらの遺伝子に関連する終結配列はまた、mR NAのポリアデニル化および終結を提供するために発現されることが所望される配列の3'で発現ベクターに連結される。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製起源および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適切である。真核微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物はまた、宿主として使用され得る。原則として、脊椎培養物または無脊椎培養物由来の任意のこのような細胞培養物が使用される。しかし、脊椎細胞における興味が増大してきており、そして培養物（組織培養物）中の脊椎細胞の増殖が、近年日常的な手順となって来ている（Tissuc Culture，1973）。このような有用な宿主細胞株の例として、VE ROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、およびW138、B HK、COS-7、293、およびMDCK細胞株が挙げられる。このような細胞の発現ベクターには、通常（もし必要ならば）、複製起源、任意の必要なリボソーム結合部位に従って発現される遺伝子の前に位置するプロモーター、RNA婦プライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれる。 E．非ウイルス送達系上記のウイルス発現ベクターの使用に加えて、本発明のGST-πをコードする遺伝子を含む発現ベクターは、種々の他の方法を使用して送達され得る。これらには、リン酸カルシウム沈澱（GrahamおよびVan DerEb,1973；ChenおよびOkayama ，1987；Rippeら、1990）、DEAE-デキストラン（Gopal 1985）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspaら、1986；Potterら、1984）、直接マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub，1985）、DNA-充填リポソーム（NicolauおよびS ene、1982;Fraleyら、1979）、およびリポフェクトアミン-DNA複合体、細胞超音波処理（Fechheimerら、1987）、高粘度マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子ボンバートメンド（bonbardment）（Yangら、1990）、ポリカチオン（Bouss ifら、1995）、およびレセプター媒介トランスフェクション（WuおよびWu，1987 ；WuおよびWu，1988）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボ使用に首尾良く適合され得る。本発明の１つの実施態様において、発現ウイルスベタター（ウイルスまたは非ウイルス）は、単に裸の組換えベクターから構成され得る。構築物の移入は、物理学的または化学的に細胞膜を透過する上記の任意の方法によって行われ得る。例えば、Dubenskyら（1984）は、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓にCa PO₄沈澱形態にあるポリオーマウイルスDNAを首尾良く注入し、活性ウイルス複製および急性感染を実証した。BenvinstyおよびNeshif（1986）もまた、CaPO₄沈澱プラスミドの直接的な腹腔内注射がトランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを実証した。GSTπ構築物をコードするDNAもまた、同様の様式で、インビボで移入され得ることが予想される。細胞への裸のDNA発現ベクターを移入するための本発明の別の実施態様には、パーティクルボンバードメントが含まれ得る。この方法は、DNA被膜化マイクロプロジェクタイルを高速に加速する能力に依存し、これは、それらが細胞膜を通過し、そして細胞を殺傷することなく細胞に侵入することを可能にする（Klein ら、1987）。小粒子を加速するための幾つかのデバイスが開発されている。このようなデバイスの１つは、電流を生成するための高圧放電（これは、次いで、動力を提供する）に依存する（Yangら、1990）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、生物学的な挿入物質（例えば、タングステンまたは金ビーズ）からなる。ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされている（Yangら、1990;Zeleninら、1991）。これは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去するための組織または細胞の外科的曝露を必要とし得る。GST-π構築物をコードするDNAは、この方法を介して送達され得る。本発明の好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および発現ベクターは、リポソーム中に捕獲され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性培地によって特徴づけられる小胞構築物である。多重膜リポソームは、水性培地によって分離される複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰な水性溶液中に懸濁される場合、自発的に形成する。脂質成分は、閉鎖構造物の形成の前に自己再編成を受け、そして水および脂質二重層間の溶解した溶質を捕獲する（GhoshおよびBachhawat,199 1）。また、リポフェクトアミン-核酸複合体が意図される。インビトロでのリポソーム媒介ポリヌクレオチド送達および外来DNAの発現は、非常に良好である。Wongら（1980）は、培養ニワトリ胚、HeLa、および肝癌細胞において、リポソーム媒介送達および外来DNAの発現の可能性を実証した。Nic olauら（1987）は、静脈内注射の後、ラットにおける首尾良いリポソーム媒介遺伝子移入を達成した。本発明の特定の実施態様において、リポソームは赤血球凝集性ウイルス（HVJ ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にすること、およびリポソームカプセル化DNAの細胞侵入を促進することが示されている（Kanedaら、198 9）。他の実施態様において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（H MG-1）との組合せにおいて複合体化されるかまたは使用され得る（Katoら、1991 ）。なおさらなる実施態様において、リポソームはHVJおよびHMG-1との組合せにおいて複合体化または使用され得る。このような発現において、ベクターは、インビトロおよびインビボでのポリヌクレオチドの移入および発現において首尾良く使用されており、そしてそれらは本発明に適用可能である。細菌性プロモーターがDNA構築物中で使用される場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含むことが所望される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層の生成によって形成される種々の単一および多重膜脂質ビヒクルを含む遺伝子用語である。リン脂質は、本発明に従うリポソームの調製のために使用され、そして正味の正電荷もしくは正味の負電荷を有し得るか、またはそれらは中性である。リポソームに負電荷を与えるためにリン酸ジセチルが使用され得、そしてリポソームに陽電荷を与えるためにステアリルアミンが使用され得る。本発明の使用に適切な脂質が、市販供給源から得られ得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はSigma Chemlical Co.から得られ、リン酸ジセチル（「DCP」）はK&K Laboratories（Plainview，NY）から得られ；コレステロール（「Chol）はCalbiochem-Behringから得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids，Inc ．（Birmingham．Ala.）から得られ得る。リポソームのトランスフェクションのため他の脂質には、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、コレステロール（Chol）、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)-プロピル]-N,N-トリメチル-アンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、および／または3β[N-(N'N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイルコレステロール（DC-Chol）、ならびに当業者に公知の他の脂質が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本発明において有用な種々のリポソームトランスフェクション技術が存在することを認識する。これらの技術の例は、Nicolauら、1987、Nabelら、1990、およびGaoら、1991に記載されている技術である。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールにおける脂質のストック溶液は、約-20℃で貯蔵され得る。好ましくは、クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発されるので、唯一の溶媒として使用される。天然供給源由来のリン脂質（例えば、卵またはダイズホスファチジルコリン、脳ホスファチジル酸、脳または植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン、および植物または細菌ホスファチジルエタノールアミン）は、得られたリポソームの不安定性および漏出性のために、一次ホスファチド（すなわち、50 ％以上の総ホスファチド組成物を構成する）として好ましくは使用されない。本発明に従って使用されるリポソームは、種々の方法によって作製され得る。リポソームのサイズは、合成方法に依存して変化する。水性溶液中に懸濁されたリポソームは、一般には、１つ以上の短縮（concentric）脂質二重層を有する球状小胞の形状である。各層は、式XYによって示される分子の平行アレイからなり、ここで、Ｘは親水性部分であり、そしてＹは疎水性部分である。水性懸濁において、短縮層は、親水性部分が水性層との接触したままの傾向にあるように、そして疎水性領域が自己会合する傾向にあるように配置される。例えば、水性層がリポソーム内およびリポソーム外の両方に存在する場合、脂質部分は、配置XY-YX のラメラ（lamella）として知られる二重層を形成する。本発明の範囲内のリポソームは、公知の実験室技法に従って調製され得る。１つの好ましい実施態様では、リポソームは、容器（例えば、ガラス、ナス型フラスコ）中の溶媒中で、リポソーム脂質を混合することによって調製される。容器は、リポソームの予測された懸濁液の容量よりも10倍大きい容量を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を減圧下で約40℃で除去した。溶媒は、正常には、リポソームの所望の容量に依存して、約５分から２時間以内で除去される。組成物は、減圧下でデシケーター中でさらに乾燥され得る。乾燥した脂質は、一般的に、時間とともに変質する傾向のため、約１週間後に廃棄される。乾燥した脂質は、すべての脂質フィルムが再懸濁されるまで振盪することによって、滅菌した発熱物質を含まない水中の約25〜50mMのリン脂質で水和され得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分離され、それぞれバイアルに入れられ、凍結乾燥され、そして減圧下で密封され得る。あるいは、リポソームは、他の公知の実験室手順に従って調製され得る：Bang hamら（1965）の方法、その内容は参考として本明細書に援用される；DRUG CARR IERS IN BIOLOGY AND MEDICINE，G．Gregoriadis編（1979）287-341頁に記載されるような、Gregoriadisの方法、その内容は参考として本明細書に援用される；その内容の方法は参考として本明細書に援用される；および逆相エバポレーション方法。上記の方法は、水性物質を捕らえるためのそれぞれの能力およびそれらのそれぞれの水性空隙対脂質比で異なる。上記のように調製した乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームを、脱水し、そして阻害ペプチドの溶液中で再構成し、そして適切な溶媒、例えば、DPBSで適切な濃度に希釈し得る。次いで、混合物を、ボルテックスミキサーで激しく振盪する。カプセル化されていない核酸を、29,000×gでの遠心分離によって除去し、そしてリポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを、適切な総リン脂質濃度、例えば、約50〜200mMで再懸濁する。カプセル化された核酸の量を、標準的方法に従って決定し得る。リポソーム調製物にカプセル化される核酸の量の決定後、リポソームを、適切な濃度に希釈し、そして使用まで４℃で貯蔵し得る。好ましい実施態様では、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンが用いられる。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを、過剰のt-ブタノールの存在下で脂質と混合した。混合物を、アセトン／ドライアイス浴中で凍結する前にボルテックスした。凍結した混合物を凍結乾燥し、そしてHepes緩衝化生理食塩水（１mM He pes、10mM NaCl、pH7.5）で一晩水和し、次いで、リポソームを10〜15分間、浴槽型のソニケーター中で超音波処理した。リポソームオリゴヌクレオチドのサイズは、代表的には、サブミクロン粒子サイザー(sizer)自動希釈モデル370（Nico mp，Santa Barbara，CA）によって決定される場合、200〜300nmの直径の範囲であった。リポソームは、種々の方法によってトランスフェクトされるべき細胞と接触して導入され得る。細胞培養において、リポソームは単に、細胞培養溶液に分散され得る。インビボでの適用のために、リポソームは、代表的には注射される。静脈内注射によって、例えば、肝臓および脾臓への、リポソームとのDNA複合体のリポソーム媒介移入が可能になる。静脈内注射を介して接近可能ではない細胞へのDNAのトランスフェクションを可能にするために、動物体で特定の部位へリポソーム-DNA複合体を直接注射することが可能である。例えば、Nabelら(1990)は、動脈壁へのカテーテルを介する注入を教示している。他の例では、腹腔内注射を、マウスへの遺伝子移入を可能にするために、本明細書中で用いた。本発明はまた、リポソームの複合体を含む組成物を意図する。このリポソームの複合体は、脂質成分およびGST-π遺伝子をコードするDNAセグメントまたはそのアンチセンス構築物を含む。リポソームの複合体に使用される遺伝子は、例えば、GSTP1^*B、GSTP1^*C、または任意のその改変体であり得る。アンチセンス構築物を含むリポソームの複合体は、本明細書中に記載のように、異なる利点を有し得る。リポソームの複合体は、リポソームの送達において本明細書中で概説される任意の遺伝子産物を使用し得るか、または、代わりに、２つ以上の遺伝子産物が一緒に、本発明の実施に用いられ得ることが提唱される。リポソームの複合体がGST-π遺伝子構築物を受ける細胞に不必要なDNAを導入しないように、必要な治療的効果を誘発する必要がある最小領域を使用することが、究極的に好ましい。例えば、制限酵素の使用のように、当業者に周知の技術は、このような目的のためにGST-πの小領域の生成を可能にする。腫瘍を阻害するこれらの領域の能力は、実施例において報告されるアッセイによって、容易に測定され得る。細胞に発現ベクターを移入する別の機構は、レセプター媒介送達である。このアプローチは、ほとんど全ての真核生物細胞において、レセプター媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布のために、送達は、高度に特異的であり得る(WuおよびWu、1993) 。レセプター媒介遺伝子標的化ビヒクルは、一般に２つの成分からなる：細胞レセプター特異的リガンドおよびDNA結合剤。いくつかのリガンドが、レセプター媒介遺伝子移入に用いられている。最も広範に特徴付けされたリガンドは、アシアロオロソムコイド(ASOR)(WuおよびWu、1987)およびトランスフェリン（Wagner ら、1993）である。最近、ASORと同様のレセプターを認識する合成ネオグリコプロテインが、遺伝子送達ビヒクルとして用いられており（Ferkolら、1993;Peral esら、1994）、そして、上皮性増殖因子(EGF)もまた、扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するために用いられている(Myers，EPO 0273085)。他の実施態様において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Nicolauら(1987)は、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを用い、リポソームに組み込み、そして、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加を観察した。従って、アデノウイルス発現ベクターもまた、リポソームを用いてまたは用いないで、任意の数のレセプターリガンド系によって、肺、上皮または腫瘍細胞のような細胞型へ特異的に送達され得ることが可能である。例えば、上皮性増殖因子(EGF)は、EGFレセプターのアップレギュレートを示す、多くの腫瘍細胞におけるGST-π構築物の媒介される送達のための、レセプターとして用いられ得る。マンノースは、肝臓細胞においてマンノースレセプターを標的化するために用いられ得る。CD5(CLL)、CD22(リンパ腫)、 CD25(Ｔ細胞白血病)、およびMAA（黒色腫)に対する抗体はまた、標的化部分として同様に用いられ得る。特定の実施態様において、遺伝子移入は、エキソビボ条件下でより容易に実施され得る。エキソビボでの遺伝子治療は、動物からの細胞の単離、インビトロでの細胞へのポリヌクレオチドの送達、そして、次いで、動物に改変した細胞を戻すことをいう。これは、動物から組織/器官を外科的に除去すること、または、細胞および組織の初代培養を含み得る。Andersonら（米国特許第5,399,346号）（本明細書中でその全体が参考として援用される）は、エキソビボでの治療的方法を開示する。エキソビボでの培養の間、発現ベクターは、GST-π構築物を発現し得る。最終的に、細胞は、元の動物に再導入され得るか、または以下に記載の任意の手段によって、薬学的に許容可能な形態で異なる動物に投与され得る。 F．抗体 GST-πペプチドまたはポリペプチドに対する抗体は、米国特許第4,196,265号に例示されている技術のような周知の技術の使用によって容易に調製され得る。代表的には、この技術は、ポリペプチドについての章で議論されているように、選択された免疫原組成物（例えば、精製もしくは部分的に精製されたタンパク質、合成タンパク質、またはそのフラグメント）で、適切な動物を免疫化する工程を含む。免疫化されるべき動物は、ネコ、イヌおよびウマのような哺乳動物であるが、この被験体が何らかの種類の免疫応答を身につけ得る（mount）という以外の制限はない。免疫化組成物は、抗体産生細胞を刺激するに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯動物が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジまたはカエルの細胞の使用は可能である。ラットの使用は、特定の利点を提供し得るが、マウスが好ましく、BALB/cマウスが、最も日常的に使用される動物、および一般的により高い百分率の安定した融合を与える動物として最も好ましい。免疫化後のモノクローナル抗体（MAb）の産生のために、抗体、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生する能力を有する体細胞が、MAb産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃腺、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞は好ましく、前者は、形質芽球分割段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるためであり、後者は、末梢血が容易にアクセス可能であるからである。しばしば、動物の集団は免疫化されており、そして最も高い抗体力価を有する動物の脾臓が取り除かれている。脾臓リンパ球は、シリンジで脾臓を均質化することにより得られる。代表的には、免疫化されたマウス由来の脾臓は、約５×10⁷個〜約２×10⁸個のリンパ球を含む。次いで、免疫化された動物からの抗体産生Ｂ細胞は、不死化骨髄腫細胞系、一般には免疫化された動物と同じ種の骨髄腫細胞系の細胞と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは抗体を産生するものではなく、高い融合効率、および「ハイブリドーマ」と呼ばれる所望の融合細胞のみの増殖を支持する特定の選択培地において骨髄腫細胞株を増殖し得ないようにする酵素欠損を有する。多数の骨髄腫細胞のうちの任意の骨髄腫細胞が使用され得、これらは、当該分野において公知である。例えば、免疫化された動物がマウスである場合、P3-X63 /Ag8、X63-Ag8.653、NS1/l.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45 -GTG 1.7、およびS194/5XX0 Bulが使用され得；ラットの場合、R210.RCY3、Y3-A g 1.2.3、IR983F、および4B210が使用され得；そしてU-266、GM1500-GRG2、LICR -LON-HMy2、およびUC729-6はすべて、ヒト細胞融合に関して有用である。１つの好ましいマウス骨髄腫細胞株は、NS-1骨髄腫細胞株（P3-NS-1-Ag4-1とも呼ばれる）であり、これは、細胞株受託番号GM3573を要請することによって、 NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repositoryから容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、8-アザグアニン耐性マウスのマウス骨髄腫 SP2/0非産生細胞株である。抗体産生脾臓またはリンパ節細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法は、通常、体細胞と骨髄肺細胞とを2:1の割合で混合する工程を包含するが、この割合は、細胞膜の融合を促進する薬剤（化学的または電気的）の存在下でそれぞれ約20:1〜約１：１の範囲で変化し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、KohlerおよびMilstein（1975；1976）により記載されており、37％（ v/v）PEGのようなポリエチレングリコール（PEG）を使用する融合方法は、Gefte rら（1977）により記載されている。電気的に誘導される融合方法の使用もまた、適切である。融合手順では、通常、約１×10^-6〜約１×10^-8の範囲の低頻度で生存可能なハイブリッドを生成する。これは問題を引き起こさないが、生存可能な場合、融合ハイブリッドは、選択培地における培養により、親の融合されていない細胞（特に、通常無限に分割し続ける融合されていない骨髄腫細胞）とは区別される。選択培地は、一般に組識培養培地におけるヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的な好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成をブロックするが、アザセリンはプリンの合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが使用される場合、培地は、ヌクレオチドの供給源として、ヒポキサンチンおよびチミジンを補充される（HAT培地）。アザセリンが使用される場合、培地はヒポキサンチンを補充される。好ましい選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作し得る細胞のみが、HAT培地において生存し得る。骨髄肺細胞は、サルベージ経路の重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT））を欠損しており、生存し得ない。Ｂ細胞は、この経路を操作し得るが、培養において限られた寿命を有し、そして一般に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地において生存し得る唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されたハイブリッドである。この培養工程は、ハイブリドーマの集団を提供し、この集団から、特定のハイブリドーマが選択される。代表的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈し、続いて個々のクローン上清を所望の反応性について試験する（約２〜３週間後）ことによって実施する。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのような感度がよく、単純で、そして迅速なものであるべきである。次いで、選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈され、そして個々の抗体産生細胞株にクローン化される。その後、このクローンは、MAbを提供するために無限に増殖され得る。細胞株は、２つの基本的な方法でMAb産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、最初の融合のための体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組識適合性動物へ、通常腹腔内で注射され得る。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドにより産生される特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで、MAbを高濃度で提供するために、血清または腹水液のような動物の体液が取り出され得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得、ここでMAbは培養培地に自然に分泌され、この培地から、MAbが容易に高濃度で得られ得る。いずれの手段により産生されたMAb はさらに、所望の場合、濾過、遠心分離、およびHPLCまたはアフィニティクロマトグラフィのような様々なクロマトグラフィー法を用いて精製され得る。本発明のモノクローナル抗体はまた、当該分野において周知の方法により産生される抗イディオタイプ抗体を含む。本発明によるモノクローナル抗体はまた、モノタローナルヘテロ結合体（すなわち、２つ以上の抗体分子のハイブリッド）であり得る。別の実施形態において、本発明によるモノクローナル抗体は、キメラモノクローナル抗体である。１つのアプローチにおいて、キメラモノクローナル抗体は、マウス抗体産生細胞からのプロモーター配列、リーダー配列、および可変領域配列、ならびにヒト抗体遺伝子からの定常領域エキソンを含む組換えDN Aをクローニングすることにより操作される。このような組換え遺伝子によってコードされた抗体は、マウス−ヒトキメラである。その抗体特異性は、マウスの配列由来の可変領域により決定される。定常領域により決定されるそのイソ型は、ヒトDNAに由来する。別の実施形態において、本発明によるモノクローナル抗体は、当該分野において周知の技術により産生される「ヒト化」モノクローナル抗体である。すなわち、マウス相補性決定領域（「CDR」）は、マウスIgの重Ｖ鎖および軽Ｖ鎖からヒトＶドメインに移入され、続いてそのネズミ対応物の枠組み領域においていくつかのヒト残基(residue)が置換される。本発明による「ヒト化」モノクローナル抗体は、Moroxella感染症を処置するためのインビボでの診断および治療方法における使用に特に適している。上記のように、本発明によるモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、当該分野において周知のインビトロおよびインビボでの方法に従って増殖され得る。インビトロでの増殖は、ダルベッコ改変イーグル培地またはRPMI 1640培地のような適切な培養培地において行われる。この培地は、必要に応じてウシ胎児血清または微量元素および増殖持続補充物（例えば、正常なマウス腹腔浸出(exu date)細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージなどのような支持細胞）が補充される。インビトロでの産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、そして大量の所望の抗体を与えるためにスケールアップを可能にする。組識培養条件下での大規模なハイブリドーマ培養の技術は、当該分野において公知であり、例えばエアーリフト反応器もしくは連続攪拌反応器における同種の懸濁培養、または固定化もしくは捕獲した細胞培養を含む。本発明の大量のモノクローナル抗体はまた、ハイブリドーマ細胞をインビボで増殖させることにより得られ得る。抗体産生腫瘍の成長を引き起こすために、細胞クローンが、親細胞と組識適合性である哺乳動物（例えば同系マウス）に注射される。必要に応じて、動物は、注射の前に、炭化水素、特に、プリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油で初回刺激される。本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、ペプシンもしくはパパインのような酵素での消化、および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法により上記のように産生されたモノクローナル抗体から得られ得る。あるいは、本発明に含まれるモノクローナル抗体のフラグメントは、自動ペプチド合成機を用いて合成され得るか、またはそれらは、当該分野において周知の技術を用いて手動で産生され得る。本発明のモノクローナル結合体は、当該分野において公知の方法（例えば、上記のように調製されたモノクローナル抗体を、例えばグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させること）により調製される。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらのカップリング剤の存在下で調製されるか、または、イソチオシアン酸塩との反応により調製される。金属キレートとの結合体は、同様に産生される。抗体が結合され得る他の部分は、³H、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹ ⁵² Eu、および⁹⁹mTcなどの放射性核種を含み、そしてこれらの部分は、抗体に結合され得る他の有用な標識である。放射標識された本発明のモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法により産生される。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼのような酵素酸化剤と接触させることによりヨウ素化され得る。本発明によるモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセス（例えば、スズ溶液で過テクネチウム酸塩（pertechnate）を還元し、還元されたテクネチウムをSephadexカラム上にキレート化し、そしてこのカラムに抗体を適用すること）、または直接標識技術（例えば、過テクネチウム酸塩、SNCl₂のような還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液のような緩衝液、および抗体をインキュベートすること）により、テクネチウム⁹⁹mで標識され得る。Ｇ．診断的適用本発明は、GST-πの特定の形態の存在を決定することによる癌の診断を提供する。これは、核酸レベルまたはタンパク質レベルで細胞表現型を試験することによりなされ得る。核酸レベルでは、いくつかの異なるフォーマットが意図される。第一に、目的の遺伝子の制限フラグメント分析を実施し得る。これは、遺伝子を単離し、そしてそれらの制限消化を実施することにより達成され得る。あるいは、これは、ゲノムDNAを消化し、そして適切な標識プローブで切断DNAをプローブすることにより達成され得る。いずれの場合でも、プロービング実験（サザンブロットと呼ばれる）は、標的配列に相補的な標識された核酸のそれらにハイブリダイズする能力に依存する。制限パターンにおける差異に基づいて、異なる大きさの核酸が生成される。一般に、サイズ分画は、プロービングの前に電気泳動によって実施される。核酸は、適切な支持体（例えば、ニトロセルロース）上に転移または「ブロット」され、次いで標識された核酸でプローブされる。第二に、核酸配列分析を実施し得る。また、最初に、目的の遺伝子をクローン化し得、より代表的には、クローン化の前にゲノムDNAを、しばしば標識されたプライマーを用いるPCRアプローチを利用することにより配列決定する。プライマーは、目的の配列の上流に位置し、そしてポリメラーゼ（例えば、Sequenase^T ^M ）により伸長される。一連の再生−変性（naturation-denaturation）工程を用いて、テンプレートの増幅が達成される。ジデオキシヌクレオチドの使用は、Sa ngerジデオキシ鎖終止配列決定プロトコルの実行を可能にする。タンパク質レベルでは、試験は、上記のようにGST-π特異的抗体を用いて、免疫学的観点から実施する。従って、本発明のモノクローナル抗体は、標準的な免疫化学手順（例えば、ELISAおよびウエスタンブロット方法）ならびにGST-πエピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順において有用な診断適用を見出すことが提案される。ELISAは免疫アッセイの好ましい形態であるが、アッセイはまた、RIAおよび他の非酵素結合抗体結合アッセイまたは手順を含むことが容易に理解される。さらに、特定のGST-πエピトープに特異的なモノクローナル抗体が他の有用な適用において利用され得ることが提案される。例えば、免疫吸着プロトコルにおけるそれらの使用は、天然または組換えGST-π種またはそれらの改変体を精製することにおいて有用であり得る。開示されたGST-πペプチドおよびポリペプチドは、抗体を惹起させるための、および抗GST-π抗原反応性抗体およびGST-π抗原の検出のための免疫アッセイ（競合アッセイ）における抗原としての使用を見出すことが提案される。あるいは、免疫アッセイは、特定のGST-π変異ペプチド間の構造抗原関連を決定するために開発され得る。このようなスクリーニングアッセイは、（ｉ）ペプチドに対する抗血清または抗体の生成または（ii）GST-π抗原に対して開発された一揃いの免疫試薬との変異ペプチド反応性の試験を包含し得る。このように、種々のエピトープの変異分析が実施され得る。本発明により包含される免疫アッセイは、米国特許第4,367,110号に記載のアッセイ（二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ）および米国特許第4,45 2,901号に記載のアッセイ（ウェスタンブロット）を包含するが、これらに限定されない。他のアッセイは、インビトロおよびインビボの両方の標識されたリガンドの免疫沈降および免疫細胞化学を包含する。免疫アッセイは、そのもっとも単純で直接的な意味において、結合アッセイである。特定の好ましい免疫アッセイは、当該分野で公知の種々のタイプの酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）および放射性免疫アッセイ（RIA）である。組織切片を用いる免疫組織化学検出もまた、特に有用である。しかし、検出は、このような技術に限定されず、そしてウェスタンブロッティング、ドットプロッティング、FACS分析などもまた用いられ得ることが、容易に理解される。１つの例示的なELISAでは、本発明の抗GST-π抗体を、タンパク質親和性を示す選択された表面（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル）上に固定化する。次いで、所望の抗原を含有すると思われる試験組成物（例えば、臨床サンプル）を、ウェルに添加する。結合させて、そして洗浄して非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合抗原を検出し得る。検出は、一般的に、検出可能標識に連結された、所望の抗原に特異的な別の抗体の添加によって達成される。このタイプのELISAは、単純な「サンドイッチELISA」である。検出はまた、所望の抗原に特異的な第二抗体の添加、次いで第二抗体に対して結合親和性を有する第三抗体の添加によって達成され得る。この第三抗体は、検出可能な標識に連結される。別の例示のELISAでは、サンプルを、ウェル表面上に固定化し、次いで抗GST- π抗体と接触させる。結合させて、そして適切に洗浄した後、結合免疫複合体を検出する。開始抗原特異的抗体が検出可能標識と連結される場合、免疫複合体は直接的に検出され得る。また、免疫複合体は、第一抗原特異的抗体に対して結合親和性を有する第二抗体を用いて検出され得る。この第二抗体は、検出可能標識に連結される。試験サンプルが既知量の標識された抗原または抗体との結合について競合する競合ELISAもまた、可能である。未知サンプルにおける反応種の量は、コートされたウェルとのインキュベーションの前または間にサンプルを既知の標識された種と混合することにより決定される。ペプチド抗原または抗体もまた、固体支持体（例えば、ビーズ、ディップスティック、メンブレン、またはカラムマトリックスの形態で）に連結され得、そして固定化されたペプチドまたは抗体に分析されるべきサンプルが適用され得る。サンプルにおける反応種の存在は、ウェルへの結合に利用可能な標識された種の量を減少させるように作用し、従って最終的なシグナルを減少させる。用いられるフォーマットに関わらず、ELISAは、ある種の特徴を共通に有する。この特徴は、例えば、コーティングすること、インキュベートまたは結合させること、洗浄して非特異的結合種を除去すること、そして結合免疫複合体を検出することである。これらを以下に記載する。抗原または抗体のいずれかでプレートをコーティングすることにおいて、一般には、プレートのウェルを、抗原または抗体の溶液と、一晩または特定の期間の間、インキュベートする。次いで、プレートのウェルを洗浄し、不完全に吸着した材料を除去する。次いで、ウェルの任意の残りの利用可能な表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「コーティング」する。これらは、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、および粉乳溶液を含む。コーティングは、固定化表面における非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、そして従って抗血清の表面上への非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを減少させる。材料をウェルに結合させ、未反応材料でコーティングしてバックグラウンドを減少させ、そして洗浄して非結合材料を除去した後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成につながる様式で抗血清または試験されるべき臨床もしくは生物学的抽出物と接触させる。このような条件は、好ましくは、希釈液（例えば BSA、ウシγグロブリン（BGG）、およびリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）/Tween ）での抗血消の希釈を包含する。これらの添加因子はまた、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向にある。次いで、重層された抗血清を、好ましくは、 25〜27℃の程度の温度で、２〜４時間インキュベートさせる。インキュベーション後、抗血清接触表面を、非免疫複合材料を除去するために洗浄する。好ましい洗浄手順は、例えば、PBS/Tweenまたはホウ酸緩衝液のような溶液での洗浄を包含する。試験サンプルと結合抗原または抗体との間で特異的免疫複合体を形成させ、次いで続く洗浄を行った後、免疫複合体形成の発生および量でさえ、同じものを結合抗原の第一または別個のエピトープに対する特異性を有する第二抗体に供することにより決定され得る。もちろん、ヒト起源の抗体を含有すると思われる試験サンプルにおいて、第二抗体は、好ましくは、一般に、ヒトIgGに対する特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、検出抗体は、好ましくは、適切な発色基質とのインキュベートの際に発色を生じる結合酵素を有する。従って、例えば、抗血消結合表面をウレアーゼまたはペルオキシダーセ結合抗ヒトIgGと、免疫複合体形成の発達を好む期間および条件下で接触およびインキュベートすることを所望する（例えば、PBS含有溶液（例えば、PBS-Tween）中で室温で２時間のインキュベーション）。酵素タグ化抗体とのインキュベーション、および続いて洗浄して非結合材料を除去した後、標識の量を、発色基質（例えば、尿素およびブロモタレゾールパープルまたは2,2'-アジノ-ジ-（3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸）[ABTS ]およびH₂O₂（酵素標識としてペルオキシダーゼの場合））とのインキュベーションにより定量する。定量は、次いで、（例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて）色生成の程度を測定するとにより達成される。あるいは、標識は、化学発光標識であり得る。このような標識の使用は、米国特許第5,310,687号、第5,2 38,808号、および第5,221,605号に記載されている。競合フォーマットでは、標識または末標識のペプチドをサンプルにおける抗原に対する競合物として使用し得る。あるいは、競合抗体は、２つの異なる抗体の結合が区別可能であることを要求する。これは、一方の種を標識し、そして他方を標識しないことによるか、または異なる標識（例えば、ローダミンおよびフルオレセイン）で両方の種を標識することにより達成され得る。Ｈ．GST-π改変タンパク質の小分子インヒビター本発明は、GST-πタンパク質の小分子インヒビターをスクリーニングおよび同定するための方法を提供し、そしてこのようなインヒビターを同定する（表１８〜２１）。小分子GST-πタンパク質インヒビターの設計の理論的根拠は、タンパク質の活性部位におけるアミノ酸残基の原子間距離における偏差により生じるGS T-πタンパク質間の構造的差異が、タンパク質の機能的活性を有効に阻害するのに十分な熱力学的安定性を有する複合体を得るために、異なる改変タンパク質の活性部位に結合する化学リガンドを設計するように開発されることである。従って、阻害されたGST-πタンパク質は、腫瘍細胞を、それを処置するために用いられる抗癌剤の毒性作用に対して保護することが不可能である。異なるGST-π改変タンパク質の活性部位に結合する適当なリガンドを得るために、本発明者らは、市販の化学フラグメントライブラリー、および研究室内で生成されたライブラリーの両方からの化学フラグメントの、各改変タンパク質の誘導結晶構造における活性求電子結合（H-）部位への力場ドッキング(forcefield docking)の技術を利用する。ドッキングされたフラグメントはエネルギーが最小化され、そして結合エネルギーは、候補リガンドを選択するためにコンピューター計算されそして使用され得る。 GST-πインヒビターの生成。インヒビターの生成は、化学フラグメントおよび化合物の改変GST-πタンパク質の活性部位への力場ドッキングおよびエネルギー最小化を包含する合理的薬物開発ストラテジーにより達成される。化合物および化学フラグメントは、化学フラグメントライブラリー（例えば、Leapfrogデータベース）から引き出され得る。さらなる化学ライブラリーは、必要に応じて生成される。改変GST-πタンパク質の活性部位および他の構造成分は、GSTP1^*Ａコード化タンパク質の公開された結晶構造に由来する。GSTP1^*Ｂによりコードされたタンパク質は、アミノ酸104位のイソロイシンをバリンに置換することにより得られる。GSTP1^*Ｃによりコードされたタンパタ質は、アミノ酸104位のイソロイシンをバリンに、そしてアミノ酸113位のアラニンをバリンに置換することにより得られる。化学フラグメント／化合物のエネルギー最小化後に得られたΔΔＧ値に基づいて、候補インヒビターは、改変GST-πタンパク質においてそれらの阻害または他の作用について合成およびさらなる分析のために化学フラグメントから選択され、そして／または新規に構築される。合成およびさらなる分析のためのインヒビターについての選択基準は、親油性、化学安定性、および合成の利用可能性または容易さを包含する。本発明の候補インヒビターは、置換イソキサゾール（例えば、表１８に示される分子）；複素環式芳香族化合物（表１９）；糖結合芳香族化合物（表２０）；および他の芳香族化合物（表２１）を包含する。置換イソキサゾール化合物は、以下に示されるような一般構造を有し得る：一般構造（置換イソキサゾール）置換基は、異なる化合物間で変化し得、そしてGST-πタンパク質の活性部位ポケットにおける化合物の結合エネルギーの有意な変化を生じ得る。例えば、NH₂ またはOHのいずれかのＲ₁置換は、ほぼ10kcal/molの結合エネルギーの変化を引き起こす。他の重要な置換は、Ｒ₃のアルキルまたはアミノアルキル置換およびＲ₄のアルキル、フェニル、または2-ピリジル置換であり、それらのいくつかは、10kcal/molより大きい結合エネルギーの変化を生じる。しかし、置換イソキサゾールのＲ基のいずれかは、フェニル基、ベンジル基、アリール基、アルキル基、エステル結合を介して別のアリール基と結合されたアリール基、エステル結合でアルキル基と結合されたアリール基、エーテル結合を介して別のアリール基と結合されたアリール基、およびチオールエステル結合でアルキル基と結合されたアリール基、エステル結合を介して別のアルキル基と結合されたアルキル基、エーテル結合を介して別のアルキル基と結合されたアルキル基、アミノ基を介してアルキル結合されたアルキル、アミノ基を介してアルキル結合されたアリール、ジスルフィド基を介して結合されたアルキル−アルキル基、ジスルフィド基を介してアルキル基に結合されたアリール、ジスルフィド基を介して別のアリール基に結合されたアリール、チオエステル結合を介して別のアルキル基に結合されたアルキル、ポリエステル結合を介してアルキル基に結合されたアリール、ポリエステル結合を介して別のアリールに結合されたアリール基、ポリアミン結合を介して別のアルキル基に結合されたアルキル基、ポリアミン結合を介してアルキル基に結合されたアリール、ポリアミン結合を介して別のアリールに結合されたアリール基、ポリチオエステル結合を介して別のアルキル基に結合されたアルキル基、ポリチオエステル結合を介してアルキル基に結合されたアリール、ポリチオエステル結合を介して別のアリールに結合されたアリール基であり得る。本開示を考慮する有機合成の当業者は、本開示を考慮してGST-π阻害効果を有すると期待され、かつ腫瘍および／またはGST-πタンパク質が主要な役割を果たす他の疾患を阻害するために使用され得る多くの種々の置換イソキサゾールを調製または同定することが可能である。 GST-πのモジュレーターについてのスクリーニング。本発明の特定の実施熊様では、GST-πタンパク質活性のモジュレーターについてスクリーニングするための方法が提供される。このような方法は、標識されたGST-πタンパク質またはアナログ、抗GST-πタンパク質または抗GST-π抗体などを、GST-πタンパク質活性のモジュレーターを同定するために小分子およびペプチドライブラリーをスクリーニングするための試薬として使用し得る。一つの例では、GST-πタンパク質を発現する細胞が、適切な条件下で、かつ因子にGST-πタンパタ質の活性をもたらさせ得るのに十分な時間、試験物質に曝露される、モジュレータースクリーニングアッセイが実施される。次いで、GST-π活性を、反応混合物を、GST-πタンパク質特異的抗体（ここで、抗体は、直接標識され得るか、または（例えば、標識イディオタイプまたは種特異的抗体を用いることにより）二次的に検出され得る）と、GST-πタンパク質とその特異的抗体との間で免疫複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることにより、検出する。試験反応を、試験サンプルを欠くコントロール反応と比較する。モジュレータースクリーニングアッセイを完了するためには、GST-πタンパク質と抗GST-π抗体との間で形成される複合体の存在および／または量を、試験サンプルにおいて検出する（例えば、抗体または一次抗体に対して指向された二次抗体に直接結合された標識の存在または量を決定することにより）。この例示的なアッセイにおいて、GST-πタンパク質の活性を阻害する因子は、コントロールサンプルと比較したGST-πタンパク質特異的抗体との結合の減少を示し、そしてGST-πタンパク質の活性を誘導する因子は、コントロールサンプルと比較したGST-πタンパク質特異的抗体との結合の増大を示す。一般的には、試験物質を精製因子の形態で添加するが、本発明において有用な試験物質は、試験サンプル成分の操作を通じて存在する物質（例えば、試験サンプルを生成するために使用された細胞溶解物中に存在する宿主細胞因子）を含むこともまた意図される。このような内因性因子は、例えば、溶解物を調製するために異なる細胞型を用いることにより、試験サンプルとコントロールサンプルとの間で分離され得る。ここで、試験サンプルを調製するために用いられる細胞型は、コントロールサンプルを調製するにおいて用いられる細胞型によって発現されない推定試験物質を発現する。この点において有用な化合物は、表１８〜２１において言及されている化合物に限定されない。活性化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは部分を含み得るか、またはそうでなければ不活性である既知の化合物の活性な組み合わせとして単に見出され得る。しかし、ヒトまたは動物モデルにおけるこのような化合物の試験の前に、種々の候補を試験して効力を有するものを決定することが必要であり得る。従って、例えば、癌細胞におけるGST-πタンパク質の活性を変化させる因子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいては、天然源（例えば、動物、細菌、真菌、植物源（葉および樹皮を含む）、および海洋サンプル）から単離された化合物は、潜在的に有用な薬学的因子の存在についての候補としてアッセイされ得ることが提案される。スクリーニングされるべき薬学的因子はまた、化学組成物または人工化合物に由来するかまたは合成され得ることが理解される。これらの実施態様において、本発明は、候補物質が癌細胞のGST-π活性を減少させる能力を決定するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する： (a)GST-π活性を有する細胞を得る工程； (b)候補物質を該細胞と混合する工程；および (c)該候補物質が該細胞のGST-π活性を阻害する能力を決定する工程。 GST-π活性を減少することが可能である候補物質を同定するために、任意の添加または操作前に、例えば、癌細胞の基底GST-π状態を測定または決定する。次いで、候補物質を細胞に添加し、そして候補物質の存在下でのGST-π活性を再び決定する。その非存在下での組成物に対してGST-π活性を減少させる候補物質は、GST-πのインヒビターである候補物質を示す。候補スクリーニングアッセイは、設定および実施が非常に簡単であり、そして GST-π含有量の決定について上述したアッセイに様々に関連する。「有効量」とは、特定の状況では、それらの正常レベルに比較して、アッセイにおいてGST-π活性を再現可能に減少させるのに有効な量である。活性において有意な適切な変化を達成する化合物が、用いられる。所望であれば、一揃いの化合物がインビトロでスクリーニングされて、本発明において使用するための他の因子を同定し得る。 GST-π活性における有意な変化は、少なくとも約30％〜40％GST-πタンパク質活性レベルの減少、そして最も好ましくは約50％の減少により表される。もちろん、より高い値も可能である。細胞におけるGST-π活性を測定するアッセイは、当該分野で周知であり、そしてインビトロまたはインビボで実施され得、そして明細書の他の箇所に記載されている。あるいは、例えば、MTTアッセイに従って増殖を測定することによって、癌細胞の増殖阻害を単純に測定することが望ましくあり得る。増殖の顕著な阻害は、阻害されていないものと比較して、少なくとも約30％〜40％の減少、そして最も好ましくは、少なくとも約50％の減少によって表される。より顕著な減少もまた可能である。MTTアッセイにより測定される増殖アッセイは、当該分野において周知である。アッセイは、Mosmannら、1983；Rubinsteinら、1990(本明細書に参考として援用される)により記載されるように行われ得る。したがって、候補物質が、このタイプの研究において、癌細胞の増殖阻害を示す場合、それは、本発明における使用に適切な化合物であり得る。 GST-πインヒビターの定量的なインビトロ試験は、本発明の要件ではない。なぜなら、薬剤は、しばしば、その公知の特性に基づいて、または効果的であることが既に示されている薬剤との構造的および/もしくは機能的比較によって選択されることが一般に意図されるからである。したがって、効果的な量は、しばしば、別の状況では、動物への投与について安全であると提案された量である。Ｉ．治療方法本出願に記載された本発明の実施において、いくつかの局面は独特である。治療について、本発明は、後の治療に対する腫瘍の応答を調整するために使用される。このアプローチは、腫瘍および/または患者の細胞に存在するGST-π改変体に基づいて、小分子インヒビターおよび/またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを投与することである。この処置は、後の任意の治療の毒性作用をブロックする、腫瘍の能力を減少させる。AS-ONまたはリボザイムでの最初の処置のいくらかの時間経過後、抗癌剤での処置が続く。抗癌剤には、アルキル化剤ならびにシスプラチンおよび他のプラチナアナログが含まれるが、これらに限定されない。この調整が使用される腫瘍には、変化したGST-πレベルに関連することが示されている腫瘍が含まれ、メラノーマ、白血病およびリンパ腫、メラノーマ、ならびに脳、頭および首、胃、肝臓、肺、卵巣、乳房、結腸および膀胱の腫瘍が含まれる。さらに、亢進したGST-πを有する腫瘍において、小分子インヒビターおよび/またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、悪性表現型を減少させるか、増殖を減少もしくは阻害するか、または腫瘍を殺傷するというゴールを有して与えられる。後者は、単独または他の治療剤との組合せでのこの薬剤のより長い期間の投与を包含すると予測される。広範囲の化学療法剤が、本発明の治療用遺伝子と組み合わせて使用され得る。例えば、これらは、DNAを直接架橋する薬剤、DNAにインターカレートする薬剤、ならびに核酸合成に影響して染色体および有糸分裂の異常を導く薬剤であり得る。核酸(具体的には、DNA)を直接架橋する薬剤は、相乗作用の抗腫瘍性組合せを導くDNA損傷を生じると意図され、そして本明細書中で示される。シスプラチンのような薬剤および他のDNAアルキル化剤が使用され得る。 DNAを損傷する薬剤はまた、DNA複製、有糸分裂および染色体分離を妨げる化合物を包含する。これらの化合物の例には、アドリアマイシン(ドキソルビシンとしても知られる)、VP-16(エトポシドとしても知られる)、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが含まれる。これらの化合物は、新生物の処置のための臨床設定において広く使用されており、アドリアマイシンについては、ボーラス注射により、静脈内に、25〜75mg/m²の範囲の用量で、21日間隔にて、エトポシドについては、35〜100mg/m²で、静脈内にまたは経口で投与される。ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシンのような抗生物質、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチンのような植物アルカロイド、カルムスチン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ロムスチンのようなアルキル化剤、およびシスプラチン、VP16(エトポシド)および腫瘍壊死因子のような雑多な薬剤は、本発明との組合せに有用であることが企図される。これらは、日常的に使用されるいくつかの化学療法剤の例であり、これらは単なる例示的な薬剤であり、そしてこのリストは決して完全でなく、当業者は、これらおよび他の化学療法剤についてのさらなる情報に関しては、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版第61章を参照する。化学療法剤の投与に責任を有する人物が、個々の被験体について適切な用量を決定する。本発明は、特定の局面では、アンチセンス、および腫瘍細胞中への送達のための他の遺伝子構築物を提供する。したがって、本発明の組成物は、癌細胞の処置に有利に適用され得る。組成物は、その中にポリヌクレオチドがカプセル化されるリポソームを含み得る。このような組成物は、１用量あたり0.50〜10.0mlの容量で、被験体に有利に送達され得る。遺伝子構築物の用量は、約５〜約30mgポリヌクレオチド/m²の間の量で送達され得ることが意図される。あるいは、用量は、約６mgポリヌクレオチド/m²と25mgポリヌクレオチド/m²との間、約７mgポリヌクレオチド/m²と約20mgポリヌクレオチド/m²との間、約10mgポリヌクレオチド/m² と約15mgポリヌクレオチド/m²との間であり得る。Ｊ．薬学的組成物および投与経路本発明は、GST-πに対する抗体の作製、およびGST-πが関与する癌の予防または処置のための薬学組成物を提供する。抗原の投与および抗体の作製は上記で議論されている。インビボの細胞への核酸(発現構築物を含む)の投与は、現在入手可能な情報から改変され得る。当業者は、一般的に腫瘍の処置に十分に精通している。本明細書に提供された情報を考えれば、本発明は、種々の特定の医薬、治療のための投与の用量および経路を使用して、開発され得る。本発明の水溶性組成物は、有効量の抗原または治療薬剤を有する。このような組成物は一般に、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解されるか、または分散される。句「薬学的または薬理学的に受容可能」は、動物またはヒトに適切に投与された場合、有害な、アレルギー性のまたは他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当業者に周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と配合不適である場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が意図される。鎮痛薬および抗炎症剤のような補充有効成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。非経口投与のために処方される化合物(例えば、静脈内注射または筋肉内注射のための化合物)に加えて、他の薬学的に受容可能な形態として、例えば、経口投与のための錠剤または他の固形物；時間放出カプセル；およびクリーム、ローション、うがい薬、吸入剤などを含む現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。本発明の活性な化合物は、非経口投与のために処方され得る。例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらに腹腔内経路を介する注射のために処方される。本発明の成分の活性な化合物を含む水性組成物の調製は、本発明の開示に照らして当業者に公知である。代表的には、このような組成物は、注射液として、液体溶液または懸濁物のいずれかとして調製され得る；注射前の液体添加の際に溶液または懸濁物を調製するための使用に適切な固体形態もまた、調製され得る；そして調製物はまた乳化され得る。遊離の塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を予防するために保存剤を含む。直接腫瘍内注射または切除した腫瘍床の連続灌流は、本発明により意図された投与方法である。注射液用途に適切な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散物；ゴマ油、ピーナツ油、または水性プロピレングリコールを含む処方物；および注射可能な溶液または懸濁物の即時調製のための無菌の粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、そして容易に注入可能である程度に流体でなければならない。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。活性な化合物は、中性または塩の形態で組成物に処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩に由来し得る。キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど )によってもたらされ得る。多くの場合において、等張化剤(例えば、糖または塩化ナトリウム)を含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物における吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)の使用によってもたらされ得る。滅菌注射溶液は、先に列挙された種々の他の成分と、適切な溶媒中に、必要とされる量の活性な化合物を取り込むことによって調製され、必要な場合は、続いて濾過滅菌される。一般に、分散物は、種々の滅菌された有効成分を、基本の分散媒体および先に列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された溶液から有効成分の粉末および任意のさらなる所望の成分を生じる、減圧乾燥技術および凍結乾燥技術である。特定の場合、本発明の治療用処方物はまた、局所投与に適切な形態(例えば、クリームおよびローション)で調製され得る。これらの形態は、種々の肉腫のような皮膚関連疾患を処置するために使用され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と配合適合様式で、そして治療に有効な量で投与される。処方物は、種々の投薬形態(例えば、上記のような注射溶液の形態) で容易に投与され、薬物放出カプセルなどでさえ使用可能である。水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤はまず、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張化される。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体が、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１投薬量は、１mLの等張 NaCl溶液中に溶解され得、そして1000mLの皮下注入液体に添加されるかまたは注入の推奨される部位で注射されるかのいずれかである(例えば、「Remington's Ph armaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照のこと )。投薬量のいくつかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。いずれにしても、投与に責任を有する人物が、個々の被験体に適切な用量を決定する。Ｋ．キット本発明の種々の実施態様の実施に必要とされる全ての必須な物質および試薬は、キット内で一緒に組み立てられ得る。キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は、好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。インビボでの使用のために、抗原または治療薬剤、試薬は、単一または別個の薬学的に受容可能な注射可能組成物に処方され得る。この場合、容器手段自体は、吸入、シリンジ、ピペット、眼滴器、または他の同様な装置であり得、それから処方物が、身体の罹患領域に適用され得るか、動物に注射され得るか、またはキットの他の成分に適用されそして混合され得る。これらのキットの組成物はまた、乾燥された形態または凍結乾燥された形態で提供され得る。試薬または成分が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に適切な溶媒の添加による。溶媒はまた別の容器手段で提供され得ることが意図される。本発明のキットはまた、活性化合物の投与を規定するか、またはサンプル中の皮脂形成を決定するためのアッセイを説明する説明書を含み得る。本発明のキットはまた、代表的には、例えば、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器この中に所望されるバイアルが保持される)のような市販用の、しっかりと拘束してバイアルを含むための手段を含む。容器の数またはタイプとは無関係に、本発明のキットはまた、動物の体内への最終的な複合体組成物の注射/投与または配置を補助するための装置を含み得るか、またはそれでパッケージされ得る。このような装置は、吸入、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン、眼滴器、または任意のそのような医学用認可された送達ビヒクルであり得る。別の装置には、インビトロでの反応の読みとりまたはモニタリングを可能にするデバイスが含まれる。Ｌ．実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施例を示すために含まれる。以下の実施例に開示された技術が、本発明者らによって、本発明の実施において十分に機能することが見出された技術を代表し、したがって、その実施に好ましい態様を構成すると考えられ得ることは、当業者によって認識されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施態様において多くの変化がなされ得、そして同じかまたは同様な結果を得ることを理解するはずである。実施例１：３つのヒトGST遺伝子のクローニングおよび特徴付け１．材料および方法材料．制限エンドヌクレアーゼ、Klenow酵素およびT4 DNAリガーゼを、Boehri nger Mannheim(Indianapolis，IN)から購入し、プロテイナーゼＫ、RNAse Aおよびすべてのトランスレチノイン酸(RA)を、Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO) から購入した。SuperCos Iコスミドベクター、Bluescriptファージミド11、Giga pack 11パッケージング系、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(CIAP)、pBK-CMV発現ベクター、およびMSB哺乳動物トランスフェクションキットをStrategene(La J olla，CA)から購入した。[³⁵Ｓ]dATPおよび［α-³²Ｐ]dCTPをAmersham(Arlingto n Heights，IL)から購入した。Taq DNAポリメラーゼをPerkin Elmer Cetus(Norw alk，CT)から購入した。Dulbecco改変Eagle培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FCS) をLlfe Technology(Gaithersberg，MD)から購入した。T7 DNA Sequenase 2.0 Di deoxy DNA Sequencing KitをUS Biochemicals(Cleveland，OH)から購入した。腫瘍細胞．MGR-3ヒト神経膠芽細胞腫多型細胞株を、以前に記載(Ali-Osman、1 996)されたように、一次標本から本発明者らの実験室において樹立した。これは、免疫細胞化学によりポジティブである、グリア原線維酸性タンパク質であり、そしてこの細胞は、新生物グリア細胞の代表的な多型態性の特徴を示す。これは、10％FCS、非必須アミノ酸を補充したDMEMにおいて日常的に維持され、そしてこれらの研究において使用される前に、インビトロで11代の継代を経験した。サザンおよびノーザンブロット．これらは、標準的な技術(Sambrookら、1989) を使用して実施された。サザン分析については、ゲノムDNAを、フェノール/クロロホルム手順を使用してMGR-3細胞から抽出し、ノーザンブロットについては、全RNAを、酸グアニジニウムチオシアネート/フェノール/クロロホルム法(Chomcz nskiおよびSaachi、1987)で単離した。 PCR．示される場合、PCRをDNAサーモサイクラー(Perkin-Eimer、Norwalk、CT) において実施した。100μl反応混合物は、50ng SuperCos-GSTpiまたは他のDNAテンプレート、各500ngの順方向および逆方向プライマー、10×PCR緩衝液、各100n MのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、鉱油で覆われた2.5単位のAmplitaqポリメラーゼを含んでいた。変性(95℃で90秒間)、アニール(55℃で２分間)、および鎖伸長 (72℃で３分間)の１サイクル後、95℃(１分)、55℃(２分)、および72℃(３分)の 35サイクルを実施した。コスミドゲノムDNAライブラリーの構築、スクリーニングおよびマッピング．M GR-3細胞由来の高分子量ゲノムDNAをSau3A Iで部分的に消化し、そしてフラグメントを、BamH IおよびXabIで消化し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(C IAP)で脱リン酸化しておいたSuperCos Iコスミドベクターに連結した。構築物を、Gigapack 11パッケージング系を使用して、バクテリオファージλ粒子にパッケージし、そして得られたファージを使用して細菌宿主株XL-I Blue MRに感染させ、増幅し、そして合計約１×10⁶コロニーに対して、150mmプレートあたり50,0 00cfuでLB/アンピシリンプレートにプレートした。コロニーをプールし、力価測定し、そしてストックを、20％グリセロールを含有するLBブロス中で−80℃にて貯蔵した。アリコートを再プレートし、正に荷電したナイロンフィルターに引き上げ、そして標準的な技術(Sambrookら、1989)を使用して、[α-³²Ｐ]標識完全長GST-πcDNAプローブとのハイブリダイセーションによりスクリーニングした。二次および三次スクリーニング後、１つのポジティブクローン(SuperCosGSTpiと呼ぶ)を、さらなる特徴付けのために選択した。SuperCos-GSTpiの制限マッピングを、標準的な方法を使用して実施し、そしてコンピュータ分析によって配列の正確さを確認した。 SuperCos-GSTpiのサブクローニング。SuperCos-GSTpi DNAの0.5μgを、NotIおよびHinD IIIで、単独または組み合わせて消化し、そして1.2％アガロース中で電気泳動した。サザンブロッティングにより確認した、GST-π陽性フラグメントを、アガロースゲルから精製し、pBluescript 11ファージミドベクターのNotIおよびHinD III部位中に連結し、そしてコンピテントXL-I Blue細胞中にトランスフェクトした。プレートした後、GST-π陽性クローンを、サザンハイブリダイゼーションにより同定し、そして重複するGST-π遺伝子フラグメントを、公開されたGST-π配列(Cowellら、1988;Morrowら、1989)およびコスミド配列(表１)に由来するプライマーを用いて、PCRによりこれらクローンから増幅した。PCR産物を 1.2％アガロースゲル中で電気泳動し、そして適切なサイズのフラグメントを切除し、精製し、0.05単位/pmol DNAクレノー酵素で平滑末端とし、そしてEcoRV 消化し、かつCIAP処理したpBluescriptファージミド11中に連結した。コンピテントXL-I Blue細胞をベクター構築物でトランスフェクトし、そしてGST-π陽性クローンをサザンハイブリダイゼーションにより同定し、そして配列決定に用いた。 DNA配列決定および構造分析。ヌクレオチド配列決定は、³⁵S−ジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Sangerら、1977)を用い、製造業者のプロトコールに従い、わずかに改変して、T7 DNA Sequenase^TMを用いて実施した。各遺伝子フラグメントを、両方向に２度の配列決定をした。配列決定プライマーは、公開されたGST-π 遺伝子配列から、およびコスミドの配列から設計した。PCR産物から得られた配列がPCRアーチファクトを含まないことを確実にするために、各フラグメントのP CRおよび配列決定は少なくとも１回繰り返した。ヌクレオチド配列のコンピューター支援分析および単離されたGST-π遺伝子の構造組織化は、市販のDNA配列分析パッケージ(Macmolly Tetra、Berlin、German y)を用いて実施した。配列は、先に記載された、MCF-7およびHPB-ALL細胞株からのGST-π遺伝子の配列(それぞれ、GenBank受託番号X08058およびX0894-6)と比較した。単離されたGST-π遺伝子のイントロン５および６のさらなる分析のために、イントロン５を含む１kB DNAフラグメントおよびイントロン６を含む450bpフラグメント、ならびにこれらのイントロンに隣接する領域を、表１に列挙したプライマー対を用いて増幅した。1.2％アガロースゲル中の電気泳動の後、PCR産物を精製し、そしてSpeIおよびAvaIIで消化し、イントロン５中のSpeI制限部位の存在およびイントロン６中のAvaIIについて決定した。この両者は、ヌクレオチド配列分析により、GST-π遺伝子のこれらの領域に存在すると推定されていた。 GST-π遺伝子がレチノイン酸により調節され得たことを示す先のデータのため(X iaら、1993、1996)、本発明者らは、クローン化されたGST-π遺伝子を、既知のレチノイン酸応答エレメント(RARE)コンセンサス配列(Glassら、1991)と相同な、配列のタイル状の存在について分析した。 GST-πベタター構築とCOS-1細胞における発現。完全GST-π遺伝子を、2.2kB N otI/BamHI pBS-GST-πフラグメントを、0.9kB BamHI/KpnI pBS-GST-πフラグメントに連結し、次いで、これを、真核発現がサイトメガロウイルス(CMV)即時初期プロモーターにより駆動されるPBK-CMV発現ベクター(Strategene、La Jolla 、CA)のNotI/KpnI部位中に連結することにより得た。得られるGST-π発現構築物は、pGSTpI-CMVと呼ばれ、完全長3.1kB GST-π遺伝子を含み、これは、131bpの５'プロモーター領域、109bpのポリアデニル化シグナルを含む３'非翻訳領域、およびポリアデニル化シグナルの下流の68bpからなる。 pGSTpI-CMVベクターを、リン酸カルシウム法(Sambrookら、1989)を用いて、対数増殖するCOS-1細胞中にトランスフェクトし、そして48時間後に細胞を収集し、PBS中で２度洗浄し、ホモジナイズし、そして４℃で20分間20,000×gで遠心分離した。上清中のタンパク質濃度および総GST酵素活性を、先に記載のように(Al i-Osmanら、1990；Habigら、1974)、後者は、基質として1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンを用いて測定した。特異的GST-πタンパク質含量は、本発明者らが先に記載したように(Ali-Osmanら、1990)、ウエスタンブロッティングにより測定した。 GST-π遺伝子中のRAREへのRA-RAP結合に対するDNA移動度シフトアッセイ。GST -π遺伝子中のRARE配列のRA-RAR複合体への結合を、ゲル移動度シフトアッセイ( Huppら、1992)を用い、１μMの全トランスRAで48時間処理して、レチノイン酸レセプター(RAP)発現を誘導し、そしてRA-RAR複合体を生成したMGR-3細胞からの核抽出物で調べた。抗RAR-βモノクローナル抗体(Santa Cruz、Santa Cruz、CA)を用いた免疫沈降は、RARE結合研究で用いたRA処理したMGR細胞の核抽出物においてRAR-βの顕著な誘導を示した。単離されたGST-π遺伝子からDNA-PCR(プライマーについては表２を参照のこと)により200bpのフラグメントを合成し、RAREコンセンサスのハーフサイズを含むイントロン５中の領域をカバーした。コントロールおよびRA処理細胞の両方から調製された2.5μgの核タンパク質を、３²γP-dAT P末端ラベルRAREとともに、100mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM KCl、５mM MgCl₂、1 0％グリセロール、１mM DDTおよび2μgポリ(dl-dC)の緩衝液中でインキュベートした。室温で30分後、反応混合物を、３％スタッキングおよび10％分離非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、その後ゲルを10％メタノール/10％酢酸中で固定し、Whatman濾紙上で乾燥し、そしてＸ線フィルムに感光した。結合競合実験は、³²P標識RAREの添加前に、200モル過剰の非標識RAREと核抽出物とを30 分間インキュベートすることにより実施した。腫瘍細胞におけるGST-π遺伝子発現に対するレチノイン酸の影響。MGR-3細胞株のGST-π遺伝子中のRAREの機能をさらに測定するために、本発明者らは、RAに曝した後のMGR-3細胞中のGST-π遺伝子転写物の変化を調べた。この研究には、対数増殖するMGR-3細胞を、１μMの全トランスRAで処理した。RA処理なしの別のセットの培養をコントロールとした。37℃で24および48時間のインキュベーション後、総RNAを抽出し、そしてGST-π遺伝子転写物レベルを、先に記載のようにノーザンブロッティングにより測定した。GST-πタンパク質含量における変化を、１μMの全トランスRAで同様に処理した細胞中で測定した。培養を、RAに曝した0、12、24および48時間後収集し、これらから先に記載のように細胞抽出物を調製し、そして抗GST-π抗体を用いるウェスタンブロッティングに供した。２．結果ゲノムライブラリーの構築とスクリーニング。MGR-3 SuperCosIゲノムライブラリーの約10⁶コロニーを、GST-π cDNAプローブで初めにスクリーニングした。 20の陽性コロニーを、二次スクリーニングに供し、その後２つを三次スクリーニング用に選択した。インタクトなGST-π遺伝子を含むSuperCos-GSTpiと呼ぶ１つの陽性クローンをさらなる分析のために選択した。 SuperCos-GSTpiの制限エンドヌクレアーゼマッピング。GST-π cDNAプローブを用いたNotIおよびHin DIII消化SuperCos-GSTpiのサザン分析の結果を用いて、 SuperCos-GSTpiクローンの単純にした制限マップを構築した(図１)。このマップは、GST-π遺伝子が、SuperCos-GSTpiクローンの２つのNotI部位の間に位置し、そして２つのHinD IIIフラグメントに重なることを示す。完全長遺伝子は、2.1k BのNotI-Hin DIIIフラグメントおよび11.5kBのHin DIIIフラグメント内に含まれる。これは、次の最終DNA配列のコンピューター分析により確認された。ヌクレオチド配列および構造分析。図２Ａは、完全GST-π遺伝子を配列決定するために用いたSuperCos-GSTpiのサブクローンを示し、そして図２Ｂは用いた配列決定ストラテジーを示す。単離されたGST-π遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１として示す。配列決定された領域はサイズが31l6bpであり、そしてヌクレオチド＋30と＋2762内に位置する７つのエキソンおよび６つのイントロンからなる完全長GST-π遺伝子を含む。各エキソンイントロンの境界は、５'および３'末端にあるAGおよびGTスプライシングシグナルによりそれぞれ特徴付けられる。単離されたGST-π遺伝子のコード領域は、ATG開始コドンおよびTGA停止コドンを含む211コドンからなる。遺伝子の３'非コード領域は、ヌクレオチド＋2763 〜＋2984をカバーし、そして＋2818〜＋2823にポリアデニル化シグナルAATAAAを含む。遺伝子の第１番目のエキソンの上流５'隣接領域、即ちプロモーター領域は、５つの調節モチーフを含み、これらのすべては先に報告されている(Cowell ら、1988；Morrowら、1989)。転写開始部位(Morrowら、1989)に対して、これらは、-31〜-27に位置するTATAボックス、-46〜-41および-57〜-51にある２つのSp l部位、および-69〜-63にあるAP1部位が存在した。AP1部位が包埋されて、-70〜 -61に、抗酸化剤応答エレメント(ARE)コアコンセンサス配列GTGACTCAGC(配列番号33)があった。単離された遺伝子の先に記載されたGST-π遺伝子との比較。表２は、MGR-3細胞株から単離されたGST-π遺伝子と、先に報告された(Morrowら、1989)MCF-7細胞株からのGST-π遺伝子のそれとの構造的差異を要約している。２つの転位、＋ 1404におけるＡからＧおよび+2294におけるＣからＴは、コドン105を、ATC(Ile) からGTC(Val)、およびコドン114を、GCG(Ala)からGTG(Val)にそれぞれ変化させた。これらの知見は、単離された遺伝子が、最近実験室で単離された完全長cDNA であるhGSTPl^*Cであることを確証した。ヌクレオチド+2684に存在するサイレントなＴからＣへのヌクレオチド転位は、影響されたコドン185にコードされるアミノ酸セリンを変えなかった。エキソン５、６および７における３つのヌクレオチド転位に加えて、MGR-3遺伝子とMCF-7GST-π遺伝子との間でいくつかのイントロンの差異もまた観察された。インスリン応答エレメントＡのコア配列(CCCGCCTC)と相同性の高い領域IRE- A(Nasrinら、1990)が+45〜+52で観察された。このIREは、MCF-7から単離されたG ST-π遺伝子中で同じ位置にある先に記載の(Morrowら、1989)それとは、+50にグアニン挿入を有し、それ故、AccII、AciI、Bsp50I、BstUIおよびMvnIを含むいくつかの制限エンドヌタレアーゼに対する切断部位(CG'CG)を生成することにより異なっていた。さらに、イントロン５および６におけるヌタレオチド転位は、MC F-7遺伝子にはないMGR-3GST-π遺伝子に余分のエンドヌクレアーゼ切断部位を生成した。ヌタレオチド+l968におけるＧからＡへの転位は、イントロン５においてSpeI部位A'CTAGTを生成し、これは、イントロン５を含む１kB PCR産物のSpeI 消化により確認された。興味深いことに、ヒトリンパ球およびMCF-7細胞からの同じDNA領域のSpeI消化に際しては部分的切断のみが観察され、この位置におけるGST-π遺伝子の多型性の存在を示した。さらに、+2557および+2559におけるＡからＧおよびＣからＴへの２つの転位は、それぞれ、イントロン６内に、MCF-7 遺伝子には存在しない新たなAvaII切断部位G'GTCCを生成した。イントロン６のこの領域をカバーする、MGR-3細胞から増幅された450bpのDNAフラグメントのAva II消化は、予想された400および50bpフラグメントを示した。これに対し、正常なヒトリンパ球およびMCF-7細胞からの同じDNAフラグメントは、これら２つのAv aII切断産物を、そして、さらに、MCF-7の場合非切断DNAを、そしてリンパ球の場合複数の制限フラグメントを生じた。単離されたGST-π遺伝子中のRARE。レチノイン酸応答性エレメント、RARESは、直接反復調節モチーフであり、これに、RA-RA受容体(RAR)複合体が結合し、RA -応答性遺伝子の転写を媒介する(Glassら、1991;de Theら、1990;Duesterら、19 91)。本発明者らは、GST-π遺伝子におけるRARE配列の存在を初めて報告する。これらのRAREモチーフは、ヌクレオチド+152l〜+1644にわたる領域のGST-π遺伝子のイントロン５に位置し、縦列に配置されたRAREコンセンサスハーフ部位の一つのパリドンローム性反復と四つの直接反復からなる。図３は、RAREハーフ部位の領域を示す。表３は、単離されたGST-π遺伝子のコンセンサスRAREを、他の選択された遺伝子の公知RAREと比較したものである。ゲルシフト実験。RA-RARへのRARE結合性を検討したゲルシフト研究の結果は、 GST-π遺伝子のRAREコンセンサス配列が、全トランス型RAで処理したMGR-3細胞由来の核タンパク質に有意に結合することを示す。結合は、過剰の冷RAREと競合したと思われ、従って、RARE特異的であることを示す。同じ条件下において、血清アルブミンコントロールのRAREへの結合は観察されなかった。免疫沈降により、１μM全トランス型RAに48時間曝露後、RA処理細胞におけるRAR-βレベルが未処理コントロールと比較して三倍を超えて増加し、RARE-核タンパク質複合体が抗R AR-β抗体と免疫反応性であったことを示した。有意に低度のRARE結合をRAで処理されていない細胞由来の核タンパク質で認めた。 MGR-3細胞におけるGST-π遺伝子発現に及ぼすレチノイン酸の作用。RAに、MGR -3細胞でGST-π遺伝子を調節する能力があるかどうかを検討するように設計したこれらの研究の結果を、図4Aおよび図4Bに示す。ノーザン分析（図4A）は、１.0 μM全トランス型レチノイン酸にMGR3細胞を曝露した後、24時間および48時間にわたってGST-π遺伝子転写レベルが中程度であるが有意に増加したことを示し、 48時間では、コントロールレベルと比較して最大3.4-倍増加した。ウエスタンブロット分析（図4B）は、１μM全トランス型レチノイ冫酸に曝露後、24時間および48時間目のGST-πタンパク質が同様に増加したことを示す。48時間後、RA処理細胞のGST-πタンパク質含有量は、未処理コントロールに対して2.8倍増加した。 COS-1細胞におけるクローン化GST-π遺伝子の発現。pGSTpi-CMV発現ベクターの構造を図５に示す。コントロールCOS-1細胞およびpGSTpi-CMVによるトランスフェクション後48時間目のCOS-1細胞におけるGST-πタンパク質のウエスタンブロット分析は、コントロールに対して、トランスフェクトCOS-1細胞のGST-πタンパタ質含有量が2.9倍増加したことを示した。大部分のGST酵素活性は、トランスフェクト細胞およびコントロール細胞において、それぞれ51.9および22.0nmol /分/mgタンパク質であった。両方のウエスタン分析により、総GST活性および特異的GST-π含有量レベルが類似して増加したが、これは、GST酵素活性の増加が、主として過剰発現GST-πタンパク質に起因することを示す。実施例２：３つのヒトGSTcDNAのクローニングおよび発現１．材料と方法細胞、組織および試薬。PBLを健常ドナーの末梢血から単一工程のFicol-Hypaq ue密度勾配遠心法（Ali-Osman、1996）により単離した。満月（full−term）ヒト胎盤を正常膣式分娩後に得た。原発性悪性神経膠腫標本を手術に付随して得た。全標本を公的な承認を受けたプロトコールに基づいて得た。神経膠腫細胞系を前述（Maurerら、1977）の通り、原発性標本から株化し、40回より少なくin vit roで継代した。別に明記しない限り、全化学物質をSIGMA Chemical Co.、St.Lou is、MOから得た。制限酵素および生化学製品は、Boehringer Mannheim、Indiana polis、INから入手し、PCR試薬は、Perkin Elmer Cetus、Norwalk、CTから得た。ヒトGST-α、GST-μおよびGST-πに対するポリクローナル抗体をBiotrin Inc. 、Dublin、Irelandから得た。 cDNAライブラリー合成およびスクリーニング。ポリアデニル化RNAをオリゴ- dTセルロースカラムにより、標準的な酸グアニジンチオシアネートフェノールークロロホルム法（Sambrookら、1989）を使用して、悪性神経膠腫細胞系から単離した全RNAから精製した。λgt 11 cDNAライブラリーを、Clontech、Polo Alto、 CAのプロトコールを使用するGublerおよびHoffman(1983)の改変された手順に従って、ポリ-A RNAから合成した。第一および第二鎖cDNA合成後、cDNAプールを50 0bpカットオフによりサイズ分画し、短縮型GST-π cDNAの比率を少なくした。次に、二重鎖cDNAをT4 DNAポリメラーセで平滑末端化し、EcoR Iメチラーセでメチル化した後、EcoR Iリンカーに連結した。EcoR I消化で過剰リンカーを除去した後、cDNAをバクテリオファージλgt 11 EcoR Iアームに連結し、Gigapack 11 Go ldパッケージング抽出物（Stratagcne、La Jolla、CA）を使用してパッケージングした。得られたcDNAライブラリーの系列希釈を、迅速PCRスクリーニング法（T akumiおよびLodish、1994）を使用してスクリーニングした。この方法は、Expan d^TMPCRシステム(Boehringer Mannhelm)を使用して、本発明者らが以前に改変（A li-OsmanおよびAkande、1995）したものである。陽性cDNAプールを、³²P標識GST -πcDNAプローブでスクリーニングしたE.coli株Y109 Or上にプレートし、GST-π 陽性クローンを増幅した後、DNAの単離、精製および配列決定を行った。 DNA配列決定。ヌクレオチドの配列決定を迂回熱サイクル配列決定プロトコール（New England Biolabs．MA）を使用する[³⁵S]-ジデオキシヌクレオチド連鎖終結法(Sangerら、1977)により、直接またはBluescriptファージミドIIへのサブクローニング後に行った。配列決定プライマーは、内部GST-πcDNA領域を同様にベクターにオーバーラップするように設計したものである。各クローンについて両方向に２回配列決定を行った。制限部位地図の作製。コンピューター援用分析（Macmolley Tetra、Berlin、G ermany）を使用して、改変体GST-πcDNAの制限エンドヌクレアーゼ切断地図を作製し、さらにREを同定した。ヌクレオチド転位の結果として、制限モチーフを得たか、または失った。これら２つのRE、Mae IIおよびXcm Iは、GST-πcDNAに制限部位が比較的少ないことから、制限部位地図の作製に選択した。GST-πcDNAの部位+112〜+596に及ぶ484bp cDNAフラグメントを各標本からプライマーを使用してRT-PCRにより増幅した。 RT-PCRの全RNAを前述の細胞または組織から単離した。第一鎖cDNA合成を、逆方向プライマー100ng、全RNA１μg、250μM dNTP、3.2mM ピロリン酸Naおよび各 0.4U/mlの胎盤性RNAse阻害剤、およびAMV逆転写酵素を含む反応混合物20μl中で行った。94℃で２分間、次に、42℃で１時間の後、混合物を95℃に２分間加熱し、25℃に急冷した。次に、前方向および逆方向GST-πプライマー500ng、200μM dNTP、1.5mM MgCl₂、0.025U/ml IAmplitaqポリメラーゼ、およびPCR緩衝液（100 μlに）を添加し、PCR増幅を94℃（１分間）、58℃（２分間）および72℃（３分間）で34サイクル行った。cDNA産物を精製し、Mae IIおよびXcm Iによる制限後、２％アガロースで電気泳動を行い、0.5μg/ml臭化エチジウムで染色し、この制限パターンを紫外線照射下で写真撮影した。フラグメントサイズをマーカーDN A(ψX174 DNA-Hae III消化）に対して決定し、その構造を代表例においてヌクレオチド配列決定により確定した。 GST-π遺伝子改変体のサザンハイブリダイゼーション。これらの実験用に、 32-merオリゴヌクレオチドプローブを、各GST-π cONAに特異的なヌクレオチド変化を含むように設計した。プローブは、GST−πcDNAの領域+312を+342へ変換し、以下の配列を有した。星印は、転位ヌクレオチドを示す。T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各プローブをγ-³²P-ATPで末端標識し、比活性約４×10⁶cpm/mlにした。サザンハイブリダイゼーションを標準法（ChomcznskiおよびSaachi、1987）でよりストリンジェントな条件により行った。簡単に説明すると、完全長GST-π cDNAを代表的標本からRNA-PCRにより増幅し、前述の通り、DNA生成物を精製し、２％アガロースで電気泳動を行った。0.5M NaOHおよび1.5M NaCl中で変性後、1.5M NaCl を含む1M Tris HCl(pH7.4)により中和し、DNAを10X SSC中でナイロン膜へ毛細管により移し、50％ホルムアミド、5X SSC、１％SDSおよび100μg/ml変性ニシン精子DNA中、42℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。³²P-標識オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションを50℃で一晩進行させた後、膜を2×SSC中、室温で30分間洗浄した後、60℃で1×SSCにより洗浄し、Kodak XAR-5 X線フィルムで撮影してオートラジオグラムを得た。写真撮影後、膜からハイブリダイセーションプローブを除去し、次のものと再プローブした。 GST-π遺伝子型分析。所定の標本におけるGST-π遺伝子型と表現型間の一致性を測定するため、エキソン５および６のヌクレオチド配列を検討した。これらのエキソンは、GST-π mRNA改変体に認めるヌクレオチド転位を有した。このため、９個の代表的試料を選択して、３つのGST-π mRNA改変体のそれぞれを示した。ゲノムDNAを使用して、GST-π遺伝子のクレオチド+1219〜+1524に及び、全エキソン５およびイントロン４と５に側面領域を有する305bp DNAフラグメント、および全エキソン６およびイントロン５と６に側面領域を有するヌクレオチド+2 136〜+2467の321bpフラグメントをPCRにより増幅した。これらの増幅用のプライマーは、本発明者らのGST-π遺伝子配列データ（Genbank Accession No.U21689 ）から設計したもので、以下の通りであった。エキソン５に対して5'-CCAGGCTGGGGCTCACAGACAGC-3'(前方向配列番号28)および5'-GGTCAGCCCAAGCCACCTGAGG-3'(逆方向配列番号29)、エキソン６に対して5'-T GGCAGCTGAAGTGGACAGGATT-3'（前方向配列番号30）および5'-ATGGCTCACACCTGTGTC CATCT-3'（逆方向配列番号31）。改変体GST-πタンパク質の原核生物発現。GST-π遺伝子改変体の完全長cDNAを λgt IIライブラリーから単離した各GST-πクローンからPCRにより増幅した。発現ベクターへの指向性サブクローニングを促進するため、前方向および逆方向プライマーを設計し、EcoR I制限部位およびXba I部位をそれぞれ5'-末端に有するようにした。両制限部位は、GST-πcDNAに存在しない。ヌクレオチド配列を決定し、PCR-誘発性突然変異が存在しないことを確認した後、cDNA産物をpBK-CMVファージミドベクター（Stratagene、La Jolla、CA）に連結した。ここでは、原核性遺伝子発現は、lacプロモーターにより促進され、真核性発現は即時性CMVプロモーターにより促進される。XL1 Blue細菌株を得られたcDNA構築物で形質転換し、陽性クローンをスクリーニングしてこれらの細菌培養物をLBブロス中で一晩増殖させた。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを培養終了1時間前に添加して、濃度を1mMにした。細菌を遠心分離によりペレット化し、２μg/mlリゾチームを含む50mM Tris-HCl(pH7.4)に37℃で１時間再懸濁した後、超音波処理した。粗ホモジネートを30,000×gで20分間遠心分離し、上清液を膜ろ過により10kD 分子量をカットオフして10倍濃縮した。上清液中のタンパタ質含有量を測定し（ Lowryら、1951）、GST酵素活性を前述（Ali-Osmanら、1990）の通りCDNBを基質として使用して測定した。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法をヒトGST-α、 -μおよび-πに対するポリクローナル抗体により前述の通り行った（Ali-Osnlan ら、1990）。改変体GST-πタンパク質の精製および酵素反応速度分析。 GST-π改変体タンパク質における構造の差異による機能的結果を、組換えGST-πタンパタ質の、ユニバーサルGST基質である1-クロロ-2、4-ジニトロベンゼン(CDNB)とのGSHの結合を触媒する能力の差異により測定した。E.coliで発現後、３つのGST-πタンパク質を、前述（SimonsおよびVan der Jagt、1981）のように、エポキシ活性化セファロース6Bに連結したS-ヘキシルグルタチオンにおけるGSH-親和性クロマトグラフィーにより精製した後、酵素反応速度分析に使用した。100mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.3中の反応混合物(25℃)は、0.5〜2.5mM CDNB、2.5mM GSHおよび精製GST-πタンパク質0.015単位を含有した。吸光度変化を340nmで２分間モニターし、反応速度を計算した。CDNBによるGSHの自然反応速度を、GST-π酵素の代わりに緩衝液を使用した反応混合物で測定し、酵素触媒反応速度から減じた。得られた反応速度を使用して、二重逆数プロットを作製し、これからVmaxおよびKm値を標準方法（Segel、1976）により測定した。改変体GST-πタンパタ質のコンピューター構造モデリング。三つのGST-πタンパク質の三次元構造に及ぼすアミノ酸変化の可能性のある作用を測定するため、 S-ヘキシル-グルタチオンと共結晶化した胎盤性GST-π(GSTPla)のX線結晶構造座標(2.8A°解像度)（Reindeerら、1992）を、Silicon Graphics Indigo 2ワークステーションIRIX 5.2、64MB)で実行するBrookhaven Protein DatabankからSYBY L分子モデリングプログラム（Version 6.2、1995;Tripos Associates、St.Louis 、MO）から移送した。SYBYL BIOPOLYMERモジュールを使用して、GSTPlbをアミノ酸残基104のValをIleに置換して作製し、GSTP1cをアミノ酸残基104のIleをValに、残基113のAlaをValに置換して得た。209アミノ酸の各モノマーサブ単位を、SY BYLのアンバー全原子力場を使用してエネルギーを最小限にした。エネルギー最小化構造をSYBYLの整合機能により重ね合わせた。原子座標、および推定求電子- (H)-部位に並ぶアミノ酸残基の側鎖間距離の変化を試験し、これらの構造変化がいかに機能的活性の差異を予測し得るかを決定した。改変体GST-π遺伝子転写物の安定性。アクチノマイシンDによる転写ブロックは、細胞におけるmRNA回転置換および安定性を測定する確かな方法であると前の研究で示された（Daniら、1984）。したがって、この技術を適用して、異なる GST-π遺伝子の転写物の細胞内安定性における差を検討した。３つの神経膠腫細胞株は、それぞれ３つのGST-π改変体の１つを発現するもので、これを約70％周密度になるまで増殖した後、５μg/mlアクチノマイシンDを含む新鮮培養培地で再フィードした。コントロールについて同様に試験を行ったが、アクチノマイシンD処理は行わなかった。アクチノマイシンD曝露後、０、６、15および24時間目に全RNAを各培養物から単離し、前述の通り、レーン当り、7.5μgRNAで電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線光下で観察して、レーンのRNA負荷量が等しいことを確認した後、ナイロンフィルターに移した。G ST-π転写レベルのノーザンハイブリダイゼーションを前述のように行った。ハイブリッダイゼーションバンドを濃度計により定量し、時間に対してプロットした。改変体GST-πタンパク質の熱安定性。前の研究において（Zimnlakら、1994）、部位指向性突然変異誘発により作製したGSTP1b-1bに相当する組換えGST-π酵素が親酵素より機能的に熱に安定であったことを示した。従って、この研究において、３つの改変体GST-πタンパク質酵素機能の熱安定性を比較した。このため、約0.1U/mlの各改変体GST-πタンパク質をPBS(pH7.2)中、45℃の水浴内のPBS中でインキュベートした。１時間にわたって15分ごとに、アリコート50μlを各インキュベート物から採取し、GST活性を前述のように、基質にCDNBを使用して測定した。残留GST活性を25℃で維持したコントロール活性に対して計算し、時間に対してプロットした。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法を前述のように行い、GST-πペプチド分解がインキュベーション中に生じたかどうかを決定した。２．結果改変体GST-π cDNAクローンの単離および配列決定。各cDNAライブラリーの約３×10⁶プラーク形成単位を分析し、数種のGST-π陽性クローンを得た。そこから選択したクローンを第二次および第三次スクリーニングにかけた後、配列決定した。単離したクローンの数種は、短縮型GST-π cDNAを含有したが、得られた３つのクローン、P13A-7、P13B-2およびP13C-9は、各3つのGST-πmRNA改変体に相当する完全長GST-πcDNAを含有した。これらを対立GST遺伝子改変体の提唱された命名法（Mannervikら、1992）により、hGSTP1^*A、hGSTP1^*BおよびhGSTP1^* Cとした。配列決定のストラテジーを図６に示し、cDNAの完全ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を配列番号3と配列番号4(GSTP1^*A);配列番号5と配列番号6(GSTP1^*B) および配列番号7と配列番号8(GSTP1^*C)に示す。各cDNAは、開始メチオニンなどの210アミノ酸をコードする630ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有した。hGSTP1^*Aは、ヌクレオチド配列において、前に報告したヒトGST-π cDN A と完全に一致した（Kanoら、1987;Moscowら、1988）。これは、712ヌクレオチドからなり、この内９ヌクレオチドは、5'非コード領域に存在した。hGSTP1^*Bは、 hGSTP1^*Aとヌクレオチド+313にA→G転位を有する点で異なるため、コドン104をA TC(Ile)→GTC(Val)に変化させた。719ヌクレオチドの内、12ヌクレオチドは、5' 非コード領域に存在した。hGSTP1^*Cは、hGSTP1^*Bで認める+313のA→G転位および +341のC→T転位の二つの活性転位を特徴とし、コドン104をATC(Ile)→GTC(Val)G CCおよびコドン113を(Ala)→GTC(Val)に変化させた。hGSTP1^*Cは、723ヌクレオチドからなり、この内13ヌクレオチドは、ATGスタートコドンの5'にあった。３つのcDNAすべての3'非コード領域は、類似しており、+689〜+696にAATAAAポリアデニル化信号を有した。検討した８例において、ゲノムDNAのエキソン５と６のヌクレオチド配列とmRNAの相当領域のヌクレオチド配列が完全に一致した。ヌクレオチド位+313および+341での転位に加えて、+555のサイレントC→T転位をhGST P1^*BおよびhGSTP1^*Cで認めた。この転位はまた、Moscowら(1988)が以前に単離したGST-πcDNAで認められたが、これは、影響を受けたコドン185のコード化アミノ酸（セリン）を変化させない。制限エンドヌクレアーセ地図の作製。３つのGST-π cDNAにヌクレオチド転位を有する領域の部分制限エンドヌクレアーゼ地図を図７に示す。+313のA→G転位により、hGSTP1^*BおよびhGSTP1^*CにMae II認識配列(A'CGT)が作製された。従って、hGSTP1^*BおよびhGSTP1^*Cを発現する標本からの484bp cDNAのMae II消化により、サイズが199bpと285bpの二つのフラグメントを得た。+341のC→T転位から生じるGSTP1^*CのXcm I認識配列(CCANNNNN'NNNNTGG配列番号34)の獲得により、Xc mI消化に基づき224bpおよび260bpフラグメントを得、hGSTP1^*CをhGSTP1^*Aおよび hGSTP1^*Bと識別化した。hGSTP1^*Aのみを発現する標本からのcDNAは、MaeIIやXcm Iのどちらによっても制限を受けなかった。何故なら、図７に示すように、両RE 部位がこのcDNA改変体に存在しなかったからである。GSTP1^*AとGSTP1^*Bの混合物およびGSTP1^*AとGSTP1^*Cの混合物を発現する神経膠腫標本からRT-PCRにより得た cDNAの直接配列決定は、予想された配列を明らかにした。サザンハイブリダイゼーションによる発現GST遺伝子の検出。異なるGST-π 遺伝子を発現する６標本からRT-PCRにより生成したcDNAのサザンハイブリダイゼーション結果は、以下の通りである。hGSTP1^*AおよびhGSTP1^*Bに特異的な両プローブは、それぞれのDNAと強硬にハイブリダイズした。予想通り、hGSTP1^*Cプローブは、hGSTP1^*A DNAとハイブリダイゼーションしなかったが、逆に、hGSTP1^*A プローブは、hGSTP1^*C DNAと僅かだがハイブリダイズした。最強のハイブリダイゼーション信号は、hGSTP1^*Cプローブを使用してhGSTP1^*C DNAをプローブしたときに認め、最小の特異的ハイブリダイゼーションはhGSTP1*Bプローブで認めた。おそらく、hGSTP1^*BのプローブとhGSTP1^*AやhGSTP1^*Cのプローブ間に一ヌクレオチドの差異しか存在しないからであろう。改変体GST-πタンパク質の発現、精製および機能分析。３つのGST-π遺伝子によりコードしたGST-πペプチドを前に推奨した通り（Mannervikら、1992）、G STP1a、GSTP1b、およびGSTP1cと命名した。cDNAをE.coliで発現し、発現したタンパク質をGSH-親和性クロマトグラフィーにより精製した。３つのGST-πタンパク質すべてに対して約200倍精製を達成し、GSTP1a-la、GSTP1b-1bおよびGSTP1c- 1cの収率はそれぞれ78％、63％および72％であった。各場合において、単離タンパク質のSDS-PAGEは、Coumassie Blue染色後、単一バンドを示し、陽性免疫反応性を抗-GST-π抗体とのウエスタン分析により認めたが、GST-μまたはGST-αに対する抗体とのウエスタン分析では認めなかった。３つのGST-πタンパク質による、CDNBとのGSHの抱合の触媒作用の酵素反応速度分析を、図８および表４のLin eweaver-Burkeプロットに要約する。K_m(CDNB)およびV_max値は、GSTP1a-1aに対して、それぞれ0.98mM±0.06および4.7±0.03μmol.min^-1.mg^-1、GSTP1b-1bに対して2.7±0.023mMおよび1.7±0.087μmol.min^-1．mg^-1およびGSTP1c-1cに対して3. 1±0.17mMおよび1.4±0.23μmol.min^-1.mg^-1であった。改変体GST-πタンパク質の構造分析。前に報告した（Reindeerら、1992;Rei nemerら、1993）GSTP1aのX線結晶構造データは、ヒト胎盤GST-πの推定求電子結合(H-)部位に並ぶ主要アミノ酸残基が、Tyr₇、Tyr₁₀₈、Val₁₀、Val₃₅、Phe₈およびGly₂₀₅からなることを示した。得られたペプチドの構造、特に、活性(H-)部位に及ぼす改変体GST-πタンパク質のアミノ酸置換作用をモデル化した。GSTP1aおよびGSTP1bのH-部位領域のエネルギーを最低限に抑えた重ね合わせ構造をGSTP1a については図9Aに、GSTP1cについては図９Bに示す。GSTP1bおよびGSTP1cにおけるIle ₁₀₄ →Va₁₀₄の置換およびGSTP1cにおけるVal₁₁₃→Ala₁₁₃の置換は、主要H-部位残基の側鎖の原子座標に有意な偏差を引き起こした（表５）。Ile₁₀₄をVal₁₀₄に置換して生じた偏差は、同方向に拡大されたが、Ala₁₁₃のval₁₁₃への置換により生じた偏差ほど大きくなかった。最も大きな偏差は、Tyr₁₀₈およびTyr₇の側鎖を含み、GSTP1aに対して、GSTP1bでは0.153A°および0.116A°、GSTP1cでは0.242A° および0.185A°シフトした。Phe₈は、アミノ酸変化による影響が最も少なかった。全般的に、活性部位残基の原子座標における偏差は、GSTP1bからGSTP1cよりも GSTP1aからGSTP1cにかけて大きかった。改変体ペプチドの三次元構造内の側鎖間距離の変化を表６に要約した。この変化はまた、図9Aおよび図9Bにおいて明らかである。残基Tyr₁₀₈とVal₁₀との間の距離およびTyr₁₀₈とval₃₅との間の距離は、GSTP1aからGSTP1bおよびGSTP1cへ次第に減少した。図9Aおよび図9Bの重ね合わせ構造から、GSTP1bおよびGSTP1cにおいてTyr₁₀₈に近位のval₁₀₄のメチル基は、GSTP1aのIle₁₀₄の第二級メチル基より、いくつかの推定活性部位残基の近くにあることが明らかである。GSTP1bおよび GSTP1cにおけるval₁₀₄のメチル基のTyr₁₀₈へ向けた配向は、val₁₀₄とVal₁₀の間およびval₁₀₄とval₃₅の間の両方の距離を減少させ、Tyr₁₀₈、Val₁₀およびval₃₅ と接する活性部位領域を制限する。また、Ile₁₀₄をかさ高がより小さいVal₁₀₄と置換すると、Tyr7、Tyr10、Phe8が裏打ちする領域が開放する。対合した残基Tyr₇ およびVal₁₀の側鎖間距離は、GSTP1bとGSTP1cの両方よりもGSTP1aで短いが、Ty r₇とTyr₁₀₈間の距離およびTyr₇とPhe₈間の距離は長い。改変体GST-π mRNAおよびタンパタ質の安定性。それぞれが異なるGST-π mRNA を発現する悪性神経膠腫細胞株における３つの改変体GST-π mRNAの細胞内崩壊を、アクチノマイシンＤに細胞を曝露することによるデノボRNA合成の阻害後に測定した。崩壊曲線(図10)は、これらの条件下では、３つの改変体GST-π遺伝子転写物の細胞内安定性にあまり差がないことを示した。各細胞株におけるGST-π メッセージの崩壊は、一次元の反応速度論に従い、半減期はGSTP1^*A、GSTP1^*BおよびGSTP1^*Cに対して、それぞれ、9.4、14.1および11.8時間であった。 45℃における３つの改変体組換えGST-πタンパク質の酵素活性の時間依存性損失もまた、一次元の反応速度論に従い、比較的速やかであった。図11に要約した結果は、３つの酵素間の有意な差を示した。GST酵素活性(基質としてCDNB)が45 ℃で消失した速度は、GSTP1a-1aについては1.81hr^-1、GSTP1b-1bについては1.01 hr^-1そしてGSTP1c-1cについては0.89hr^-1で、半減期はそれぞれ23分、47分および51分であった。SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングは、これらの条件下での酵素活性の損失に関連する、検出可能なGST-ペプチドの分解を示さなかった。正常細胞、組織および腫瘍における改変体GST-π mRNAの発現および分布。3つのGST-π遺伝子改変体を悪性神経膠腫および正常標本(リンパ球および胎盤)で認めた頻度を表７に要約する。GSTP1^*Aホモ接合性の頻度は、正常標本の0.51(43例中22例)に対して神経膠腫については0.22(32例中７例)であった。対照的に、GST P1^*Cホモ接合性は、正常標本では0.07(43例中３例)の頻度であり、そして神経膠腫では0.25(32例中４例)の頻度であった。GSTP1^*A/GSTP1^*Cヘテロ接合性は、神経膠腫および正常標本について、それぞれ0.34および0.09の頻度で認めた。したがって、総合的に、GSTP1^*Cは、正常標本における0.16の頻度に対して、神経膠腫において0.59の頻度で存在した。43の正常標本のうち２例は、GSTP1^*Bについてホモ接合であったが、神経膠腫は、１例もホモ接合ではなかった。しかし、GS TP1^*A/GSTP1^*Bヘテロ接合性の頻度は顕著に高く、それぞれ神経膠腫において0.1 9であり、そして正常標本において0.28であった。75例の腫瘍および正常標本は、１例もGSTP1^*BおよびGSTP1^*Cについてヘテロ接合でなかった。実施例３：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ発現および神経膠腫における細胞下局在。１．材料と方法抗体、生化学薬品および他の試薬。ヒト胎盤GST-πに対するウサギポリクローナル抗体をBiotrin Inc.、Dublin、Irelandから入手し、種々の希釈率で試験して、最小のバックグラウンド染色での再現性の免疫組織染色に必要な最適濃度を測定した。マウス抗ウサギ抗体および非免疫ウサギIgGをBecton-Dickenson，Pal oAlto、CAから購入した。研究を通じて同じバッチの抗体を使用した。他に明記しない限り、その他の試薬すべてをSigma Chemical Company、St．Louis、MOから購入した。患者および腫瘍。研究における患者はすべて、M.D.Anderson Cancer Center(M DACC)で外科手術を受けており、本研究は、研究所内審査委員会(IRB)の事前承認を受けた。手術および診断は共に、本研究とは無関係に行った。全標本を中性10％ホルマリン中で６〜24時間固定することによって処理し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。神経病理学者が腫瘍の組織学的診断および等級付けを行った後、４μm厚の切片を各標本から切り出し、GST-π発現のGST- π免疫細胞化学的分析を行った。GST-π免疫細胞化学的分析が完了すると、生物統計学者にデータを提供した。生物統計学者は、患者の病院記録から統計学的相関関係に必要な関連する臨床および組織学的情報を得た。生存についての参照点は、手術日、最終経過観察日または死亡日であった。この研究のために、腫瘍を以下の群のうちの１つに分類した：神経膠芽細胞腫多型、未分化神経膠星状細胞腫および他の神経膠腫(神経膠星状細胞腫、希星状細胞腫および未分化希星状細胞腫からなる)(予後と関連することが示されているカテゴリー化)(Nelsonら、19 83；Burgerら、1985)。 GST-π発現の免疫細胞化学。パラフィン切片を60℃に予め加温し、キシレンを二回交換して脱パラフィン化を行い、減少する濃度のエタノール(100％〜70％) 中でリンスし、PBSで再水和した。内因性ペルオキシダーゼをメタノール中0.3％のH₂O₂で不活化し、そしてスライドを、1:500希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトGST-π抗体と一晩インキュベートした。スライドを、PBSを４回交換してリンスした後、マウス抗ウサギ抗体と４℃で30分間インキュベートし、次いでビオチン化ペルオキシダーゼ(Vector Laboratories、Burlingame、CA)溶液とインキュベートした。スライドを、50mM Tris/HCl緩衝液(pH7.5)中0.05％ジアミノベンジジンおよび0.01％H₂O₂で発色させた。非免疫ウサギIgGをGST-π抗体の陰性コントロールとして使用し、そしてMGR3神経膠芽細胞腫細胞株をGST-π染色の陽性コントロールとして使用した。 GST-π発現レベルの定量およびその細胞下局在(subcellular localization)の評価。上述の免疫細胞化学的染色後、各標本におけるGST-π発現レベルを、600 細胞の染色強度を採点することにより決定した(無作為に選択した３つの異なる顕微鏡視野のそれぞれにおいて200細胞を200×の倍率で)。GST-π染色強度を、7 0％以上の腫瘍細胞の染色特性に基づき、低度、中度、高度と評価した。細胞質G ST-π免疫反応性は、GST-π発現細胞において常に陽性であるため、細胞下GST- π発現を、腫瘍細胞の核におけるGST-π免疫反応性の存在または不在のいずれかとして特徴付けた。他の非腫瘍細胞、例えば、反応性神経膠星状細胞、内皮細胞および浸潤リンパ球のGST-π染色特性もまた決定したが、腫瘍におけるGST-π発現の評価には使用しなかった。統計学的分析。GST-π発現と組織構造との間の関係をKruskal-Wallis検定(精密バージョン)を使用して決定した。年齢の関数としての神経膠腫細胞における核GST-πの存在を、確率推定値により測定した。GST-π発現レベルおよび神経膠腫細胞における核GST-πの有無と患者生存との相関を、Cox比例危険回帰モデル( Cox proportional hazard regression moded；Cox 1972)を使用して単変量解析および多変量解析の両方により決定した。生存推定値をKaplan-Meier(1972)法により計算し、プロットした。多変量解析における共変量は、年齢(連続)と組織構造であった。 2．結果腫瘍および患者の特性。61人の患者の腫瘍を本研究で検討した。組織病理構造に従ったこれらの標本の分布を表８に示す。標本の54％は、神経膠芽細胞腫多型、21％は未分化神経膠星状細胞腫、そして25％は他の神経膠腫であった。61人の患者のうち59人は、新たに診断され、GST-π発現についての分析に先だって事前の治療を受けていなかった。残りの２人は、再発性神経膠芽細胞腫であった。 GST-π染色のパターンおよび不均一性。腫瘍におけるGST-π免疫反応性の程度は、低または無から中および強までの範囲であった。したがって、各腫瘍を、GS T-π発現の程度に関して、半定量的に３群、すなわち、低度、中度および高度に容易に分類された。このようなGST-π免疫反応性のカテゴリーは、予後との関連が示されている(Glibertら、1993；Tidefeltら、1992)。GST-π陽性腫瘍において、強度に拘わらず、免疫反応性は、常に、神経膠腫、および(いくつかの場合には)反応性神経膠星状細胞に専ら存在した。GST-π陽性腫瘍の細胞質は常にGST -πについて陽性であったが、細胞核は、GST-πについて陽性かまたは陰性のいずれかであった。１つの例は、神経膠腫細胞の核および細胞質が共に、GST-πについて強く陽性である神経膠芽細胞腫多型を示し、別の例は、腫瘍細胞の細胞質でGST-πが強く染色され、細胞核はGST-π陰性である神経膠芽細胞腫多型を示した。核および細胞質のGST-π染色が共に所定の腫瘍に存在する場合、そのパターンおよび強度は一般に類似しており、二つの細胞下区画は、しばしば、GST-π染色に関して区別できない。大多数の腫瘍において、GST-π免疫反応性の全体的レベルは、所定の腫瘍切片の異なる領域内において均一であったが、多くの場合、顕著な程度の細胞間不均一性が、GST-π染色において認められた。強い核および細胞質GST-π発現を有する細胞が、GST-πについて陰性である細胞または細胞質 GST-πのみを発現する細胞に隣接して認めれれた。細胞質が強い陽性であった場合でさえ、核GST-πは、常に反応性神経膠星状細胞に存在しなかった。正常な非反応性神経膠星状細胞は、一般に陰性であり、内皮細胞および血管周囲カフとして存在するかまたは腫瘍内で拡散する腫瘍浸潤性リンパ球も同様であった。腫瘍の壊死領域は、GST-πについて陰性であった。 GST-π発現レベル、組織構造および患者年齢の間の関係。GST-π発現レベルに従った神経膠腫の組織学的カテゴリーの分布を表８に要約する。GST-π染色の増加したレベルと神経膠腫の増加した等級との関連を示す傾向を認めたが、その相関は、統計学的に有意ではなかった(p値0.16)。しかし、それぞれの組織学的カテゴリー内では、高または低GST-πを発現する腫瘍の比率とそのカテゴリーの組織学的等級との間に強い関連性が存在した。したがって、神経膠芽細胞腫の内、 45％が高GST-π発現を有し、そして27％が低GST-π発現を有し、これに対し、未分化神経膠星状細胞腫の31％および15％、そして他の、主に、より低い等級の神経膠腫の27％および47％が、それぞれ高GST-π発現および低GST-π発現を有した。 GST-π染色と年齢との相関の統計学的分析を表９に示す。高度、中度および低度のGST-πを発現する腫瘍を有する患者の年齢中央値(メジアン)は、それぞれ、 58、46および48歳であった。より老齢の患者における神経膠腫においてより高い、GST-πレベルになるあまり強くない傾向があったが、その相関はあまり強くなく、統計学的に有意でなかった；p値は、全ての神経膠腫患者について0.27、神経膠芽細胞腫多型を有する患者について0.16、そして未分化神経膠星状細胞腫患者について0.23であった。他の神経膠肺群において、GST-π発現レベルと年齢との間に、関連を認めなかった(p値＝0.78)。核GST-π、組織構造および患者年齢の間の関係。核GST-π染色特性に基づき、神経膠腫を２つのカテゴリーに分けた。一方では、GST-πが腫瘍細胞の核に存在し、他方では、GST-πが存在しなかった。結果(表10)は、GST-π発現レベルと核 GST-πの存在/不在との間に強い相関(p値0.0003)を示す。また、高いGST-π発現を有する神経膠腫の74％が、核にGST-πが存在するのに対し、中程度および低い GST-π発現を有する腫瘍については、55％および11％であった。GST-π発現レベルとは対照的に、患者年齢と核GST-πの存在との間の相関は、高度に有意であり、 Kruskal-Wallis分析によるp値は、0.0024であった。60〜75歳の患者の腫瘍の79 ％が核GST-πを有し、これに対し、15〜39歳の患者の腫瘍の22％が核GST-πを有した。核GST-πを有さない神経膠芽細胞腫患者の中央値年齢は、50歳であった( 範囲49〜75歳)のに対し、核GST-πを有する神経膠芽細胞肺患者については、65 歳であった(範囲30〜69歳)。表10に示すように、神経膠腫細胞において、組織構造と核GST-πの存在との間には、統計学的に有意な相関を認めなかった(正確な χ二乗分析により、p値＝0.63)。 GST-π発現のレベルおよび細胞下パターンと患者生存との相関。単変量および多変量Cox比例危険回帰モデルを使用して、GST-π発現レベルと患者生存との間の関係を検討した。腫瘍の組織学的等級および患者年齢について調整する多変量解析を行った。これらの解析結果(表11に要約)は、高い(または中程度の)GST-π レベルで腫瘍を有する患者は、低GST-π発現腫瘍を有する患者より有意に高い危険にあったことを示す。低GST-πと比較して高GST-πの相対的危険性は、単変量解析によると3.2(95％C.I.1.4、7.5)で、p値は0.0069、そして多変量解析では、 2.6(95％C.I.l.1、6.2)で、p値は0.036であった。同様の値を、中程度のおよび低いGST-π発現腫瘍患者を比較したときにも認めた。核GST-πが存在しない場合と比較したとき、核GST-πの存在の相対的危険性は、単変量解析では1.98(95％C .I．1.43、2.75)、p値は0.0010、そして多変量解析では、4.4(95％C.I.2.1、9.2 )に増加し、p値は0.0001であった。 61人の患者全員についてのKaplan-Meier生存率プロット。図12Aは、GST-π発現レベルと経過観察期間の最初の52ヶ月にわたる患者生存率との間の強い逆相関を示し、p値は0.017である。高度または中程度のGST-π発現を示す腫瘍患者の生存率の差は、より長い経過観察期間で次第により小さくなった。神経膠芽細胞腫多型は悪性神経膠腫の最悪の予後を有するので、GST-π発現と生存との相関について、神経膠芽細胞腫患者の亜群を解析した。結果(12B図）は、腫瘍細胞において、GST-πを低度に発現するかまたは発現しない腫瘍患者と比較して、高GST-π 発現腫瘍を有する神経膠芽細胞腫患者は、有意に低い生存率を示す(p値＝0.026) 。全患者についてのデータと同様に、GST-π発現の異なるレベル間での患者生存の差は、経過観察の初期段階で最も高かった。図13Aおよび図13Bは、すべての神経膠腫患者(図13A)および神経膠芽細胞腫患者(13B図)の腫瘍における核GST-πの存在または不在についのKaplan-Meier生存プロットを示す。腫瘍細胞の核にGST-πが存在する患者は、核GST-πについて陰性である腫瘍細胞を有する患者よりも、有意に低い生存率を有した。神経膠芽細胞腫患者について、生存の差は、経過観察期間の初期で特に大きかった。経過観察15ヶ月目で、核GST-π腫瘍陰性患者の約92％が生存したのに対して、核GST-π について陽性である腫瘍を有する患者は、３％しか生存していなかった。 GST-π発現レベルおよび核GST-πの存在/不在についての多変量モデルを、年齢( 連続)および組織構造について調整した。また、モデルは、生存期間の変動の51 ％を説明した。略語：RR.相対危険性；CI.信頼区間。実施例４：GST改変体のアンチセンスインヒビター 1.材料と方法試薬。³²Ｐ-CTPおよび³⁵Ｓ-メチオニンをAmersham Life Science、Inc.、Arli ngton Heights、ILから購入した。PCR^TM試薬はPerkin Elmer-Cetus、CAのものであった。インビトロ転写/翻訳系および他の試薬はすべて、他に明記しない限り、Promega Corporation、Madison、WIからのものである。オリゴヌクレオチド合成。以前の研究(Heleneら、1990;Woolfら、1992；Stein ら、1988)は、AS-ONの活性および特異性に最適であるような12〜15ヌクレオチドを示した。したがって、この研究に使用する全てのAS-ONおよびコントロールON を15-merとして設計した。ONは、Genosys Biotechnologies Inc.、The Woodland s、TXが合成し、NAP-10 Sephadexカラムクロマトグラフィーにより精製した。 hGSTπ^*Cの翻訳開始領域を指向するAS-ONは、mRNAの配列+1〜+15をカバーした。寄せ集め(jumbled)ONコントロールは、AS-ONと同じ塩基組成を含んでいたが、塩基をランダム化して、標的mRNAとの相補性を除く一方、C-またはG-四重鎖(これは、非配列特異的媒介性翻訳阻害を生じることが示されている(Stein、1994)) を回避した。ミスマッチONは、第６および第７ヌクレオチドが相互に入れ代わっていたこと以外、AS-ONと同じ構造を有した。部分ホスホロチオエートAS-ONは、 3'および5'末端の３つのホスホジエステル結合にチオエート置換を有した。完全に改変されたAS-ONは、ONの全ホスホジエステル結合にチオエート置換を有した。非改変AS-ONは、置換のないホスホジエステル結合を有した。AS-ONおよびコントロールONの一次構造を表12に示す。+313および+341にそれぞれＡ→ＧおよびＣ →Ｔ転位を含ませて、転位ヌクレオチド特異的AS-ON(TS-AS-ON)を設計した。これらの転位は、hGSTπ^*CmRNAに独自のものである。すべてのTS-AS-ONは、部分的ホスホロチオエートであった。 GST-π発現ベクターの構築。これらの研究に使用したGST-π発現ベクターpT7 β-πを、Dr.Austin Cooney、Baylor、College of Medicine、Houston、Texasから入手したプラスミドpT7βから構築した。pT7βは、pGEM2(Genebankアセッション番号X65301)の誘導体で、詳細については別に述べられている(Normanら、1988 )。pT7β-πは、hGSTP1^*C cDNAをpT7βのマルチクローニング部位に連結して作製したもので、その結果、この挿入物は、pT7βにおいて、NcoIの5'側、XbaI部位の3'側、かつ非コードβグロビン配列の上流に存在する。hGSTP1^*C cDNA挿入物を、λgt 11ライブラリー(Stein、1994)から単離したcDNAクローンから、プライマーに5'-CCGCCCTACACCGTGGT-3'(順方向)および5'-GCCGCCTCTAGACATTCACTGTTT CCCGTTGC-3'(逆方向)を使用してPCR^TMにより生成した。これらのプライマーは、平滑末端(順方向プライマー)およびXbaI部位(逆方向プライマー)を含むように設計された。PCR^TM条件は、前述(Ali-Osmanら、1997)の通りであった。 pT7Bβ-π cDNAテンプレートにおけるインビトロでの転写。pT7Bβ-πプラスミドにおけるhGSTπ^*C cDNAのインビトロでの転写を、ウサギ網状赤血球系（Pro mega）を用いて行った（業者の推薦プロトコールを改変した）。ベクター100μg を80単位のXbaIで１時間消化して、線状にした。線状プラスミドをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、70%エタノールで洗浄し、そしてヌクレアーゼを含まない水400μlに再溶解した。1mlの転写反応混合物は、100 μgの線状DNA、100mMジチオスレイトール、ATP、UTP、CTP、およびGTPを各々600 nM、10000U/ml RNAsinリボヌクレアーゼインヒビター、ならびに400単位／mlバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを含むように設定した。混合物は38.5℃で２時間インキュベートし、そしてさらに400単位のT7 RNAポリメラーゼを添加した。さらに２時間後、78単位のRNAseを含まないDNAseを添加してDNAテンプレートを消化した。37℃で15分間インキュベーションの後に、RNA産物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール／酢酸アンモニウムで２回沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水に再溶解させ、そして1.3%変性アガロース−ホルムアルデヒドゲルの電気泳動、およびUV分光測定によってモニターした。同様のプロトコールを10倍縮小し、そして反応混合物において低放射能のCTPを、250μCiの5'[α-³² P]-CTPで置換することにより、放射標識したmRNAを得た。 hGSTπ^*C mRNAテンプレートにおける³⁵S標識したGST-πタンパク質のインビトロ翻訳。本研究では、hGSTP1^*C mRNAのAS-ONの翻訳阻害効果、およびコントロールONでの翻訳を調べるために、市販のウサギ網状赤血球溶解物インビトロ翻訳系を用いた。約350ngの組換えhGSTP1^*C mRNA、または等量のルシフェラーゼmRNAを 67℃で５分加熱し、そしてRNAの２次構造を除去するため、氷上で10分間急冷した。他に記載しない限り、反応混合物（全量25μl）は、14.5μg/ml hGSTP1^*CmR NAまたは等量のルシフェラーゼコントロールmRNA、16.5μl網状赤血球溶解物、6 0mMKCl20μMのメチオニン以外のアミノ酸混合物、800U/ml RNAsinリボヌクレアーゼインヒビター、および0.4mCi/ml L-[³⁵S]-メチオニンを含んでいた。30℃で１時間後に、翻訳されたタンパク質を、4%スタッキングゲル、および12%分離ゲルを用いた不連続SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、１レーン毎に６倍希釈したサンプルを15μl用いて分析した。ゲルは固定させ、EN3HANCE溶液（Dupon t Corporation,Boston,MA）中で30分間インキュベートさせ、乾燥させ、そしてK odak XOMAT-AR5フィルムでオートラジオグラフィーを行った。オリゴヌクレオチド骨格の改変およびhGSTP1^*C翻訳阻害の有効性。AS-ONのホスホジエステル骨格の改変は、ヌクレアーゼ抵抗性の増加およびAS-ONの安定性の増加のために必要とされる。しかしこのような改変は、しばしばAS-ON作用の有効性を変化させる（Ghosら、1992;Gagnorら、1987;Hokeら、1991）。それゆえ本研究において、本発明者らは、AS-ON骨格の異なった構造の改変が、AS-ONの、 hGSTP1^*C mRNAテンプレートにおける翻訳を阻害する能力に影響を与える程度を試験した。このため、改変していないAS-ON、部分的に改変したモノチオリン酸A S-ON、および完全に改変したチオ酸AS-ON（先に述べたように設計された）を、A S-ON濃度が０〜12.5μMに達するように、³⁵S-Met含有翻訳反応混合物に添加した。混合物を37℃で１時間インキュベートし、そして翻訳産物中のGST-πタンパク質を分析した。ヌクレオチド転位に対して標的とされたAS-ONによるhGSTP1^*C翻訳の阻害。これらの研究は、AS-ONが、多型のGST-π遺伝子改変体を生じるヌクレオチド転位を含むGST-πmRNAの領域を特異的に標的化するために用いられ得る程度を試験するために設計した。インビトロ翻訳反応を先に述べたように設定した。転位部位 AS-ONを０〜7.5μMの濃度に達するように添加した。１時間インキュベーション（37℃）の後、反応生成物をSDS-PAGEによって先に述べたように分析した。TS-A S-ONの特異性に対するコントロールは、センスON、寄せ集めON、および部分的ミスマッチAS-ONであった。これらの研究に用いたONは全て、部分的に改変されたモノチオリン酸であった。 hGSTP1^*C mRNAの、AS-ON介在翻訳阻害におけるRNAse Hの役割。いくつかの研究(Stein,1994;Furdonら,1994;Crooke,1992)が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用機序に、RNAse H（これはmRNA:アンチセンスONのハイブリッド中のmRNA の分解を仲介する）を含むことを証明している。それゆえ本研究において、本発明者らは、AS-ONによるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害の機序にRNAse Hが関与している程度を試験した。したがって、インビトロ翻訳混合物を先に述べたように設定した。次いで、非改変AS-ON、部分モノチオリン酸-AS-ON、および完全改変モノチオリン酸AS-ONを添加し、続けてE.coli RNAse Hを終濃度10U/mlとなるように添加した。RNAsinリボヌクレアーゼインヒビターは本反応では除いた。１時間インキュベーションの後、先に述べたようにGST-π翻訳産物についてサンプルを分析した。反応混合物中のL-[³⁵S]メチオニンを低放射能のメチオニンで置換したことを除いては、³⁵S標識GST-πタンパク質翻訳と同様のプロトコールを用いて、AS-ON にさらした後のhGSTP1^*C mRNAのRNAse H媒介切断の程度を試験した。次いで、低放射能のmRNAおよび³²P-CTPで標識したmRNAを、各サンプルにそれぞれ最終濃度が2.5ng/μl mRNA、および2×10４cpm/ml放射活性となるように添加した。次いで混合物を30℃で１時間インキュベートし、RNA（フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールおよび酢酸アンモニウムで沈殿させ、そしてその後RNAseを含まないH₂Oに溶解したもの）を、RNAサイズマーカーと同時に4%ポリアクリルアミド−尿素ゲルで１時間電気泳動した。電気泳動の後、先に述べたように、ゲルはオートラジオグラフィーを行った。 hGSTP1^*C指向AS ONに対する潜在的相補性についての他の遺伝子中の標的核酸配列の分析。hGSTP1^*C AS-ONが潜在的にハイブリダイズし得、そして非GST-π特異的効果を生じ得る潜在的な相補的配列について、FASTA配列検索演算手段(Pear son,1990;Schulerら,1991)（これはHixton Hall UKのEuropean BioinformaticsI nstitute Outstation(Emmert-David,1994)により提供される）を用いて、EMBL/G enebankヌクレオチド配列データベースを検索した。対をなす比較を、ブロック検索プログラム(MACAW)で行い、hGSTP1^*C AS-ON、および標的hGSTP1^*C、およびルシフェラーゼmRNA配列の間で部分的に相補性である非ギャップ領域を見出した。２．結果表13に要約した結果は、処理していないコントロールと比較した場合、アンチセンス構築物は、GST-π mRNAを42%、そしてGST-πタンパク質を53％減少させることを示す。混合オリゴおよびセンスオリゴに見られた効果は、それぞれ5%および4.7%(mRNA)、7.2%および8.9%（タンパク質）であった。このことはアンチセンス構築物においてみられた効果が非特異的な相互作用の結果として見られるものではないことを示す。さらに、クローン原性（clonogenic survival）の生存は、アンチセンス処理したものでは有意に減少したが、一方コントロールでは減少しなかった。 pT7β-πベクター上のhGSTP1^*C mRNAの翻訳。図14Aおよび図14Bは、hGSTP1^*C 翻訳開始部位に対して指向するAS-ONによるhGSTP1^*C mRNA翻訳阻害の本研究の結果を示す。オートラジオグラフ（図14A）は、pT7β-πベクターから合成されたh GSTP1^*C mRNA鋳型における、³⁵S標識GST-πタンパク質の効率的な翻訳を示している。翻訳された産生物は、ほぼ24.5kdの明らかな分子量を有し、コントロールの精製ヒト胎盤GST-πタンパク質と全く同一に移動した。図14においてレーン１は、mRNAを含まず、一方レーン２、３、および４はそれぞれ1.25、2.5、および5 ngのGST-πmRNAを含んだ。 hGSTP1^*Cの翻訳阻害のAS-ONの配列特異性。これらの研究の結果は、図15Aおよび図15Bに要約されている。hGSTP1^*C mRNA翻訳の有意な阻害が、０〜12.5μMのA S-ONの範囲にわたって観察され、7.5μMのAS-ONではほぼ85%の阻害（ON:mRNAのモル比は107：1）だった。０〜7.5μMの濃度範囲のセンスON、寄せ集めON、およびミスマッチONを用いた場合、hGSTP1^*C翻訳の阻害は観察されなかった。しかし高いON濃度（7.5〜12.5μM）では、緩和な用量依存の非特異的一次の翻訳阻害が、寄せ集めON、およびミスマッチONで観察されたが、センスONでは観察されなかった。 AS-ON骨格の改変およびhGSTP1^*C mRNA翻訳阻害の有効性。０〜25μM AS-ONの濃度範囲にわたるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害におけるその異なる有効性について、非改変AS-ON、部分モノチオリン酸AS-ON、および完全改変モノチオリン酸AS-O N（全てhGSTP1^*C mRNAの翻訳開始領域に相補的）を試験した。結果は、部分改変モノチオリン酸AS-ONが、hGSTP1^*C翻訳を阻害する上で完全改変AS-ONより有効であることを示した（図16Aおよび図16B）。非改変AS-ONを用いると、比較的高いA S-ON濃度である12.5μMでさえ、有意な翻訳阻害は観察されなかった。25μMでは、３つのAS-ON全てが阻害的だった。開始部位AS-ONによるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害におけるRNAse Hの効果。開始部位AS-ONによるhGSTP1^*CのAS-ON媒介翻訳阻害におけるRNAse Hの効果に対する本研究の結果を、図17に要約する。RNAse Hを10μ/mlで補充すると、５μM AS-O Nの翻訳阻害は６倍増強された。しかしRNAse Hによる阻害は、RNAse H非存在下において観察されたAS-ON濃度とのはっきりとした直線関係を示さなかった。 hGSTP1^*C mRNAのアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介翻訳阻害におけるRNAse Hの役割を研究するため、mRNAを、RNAse Hの存在下および非存在下における翻訳開始部位AS-ONとのインキュベーション後の切断について調べた。図18Aおよび図 18Bに要約されているこれらの研究の結果は、RNAse HおよびAS-ON存在下において、hGSTP1^*CmRNAが73ヌクレオチドおよび626ヌクレオチドのサイズの２つのフラグメントに切断されたことを示す。これらのフラグメントサイズは、AS-ONとのハイブリダイセーションの部位におけるmRNAの切断に対応する。RNAse H非存在下（レーン2〜4）、またはRNAse Hを含むがAS-ONは含まない反応混合物（レーン6〜8）中ではAS-ONを増加させてもmRNAの切断は観察されなかった。 AS-ONによる翻訳阻害のhGSTP1^*C mRNA標的特異性。hGSTP1^*C標的化AS-ONによる翻訳阻害のmRNA標的特異性、および阻害特異性に対するRNAse H要求性を試験した本研究の結果を、図19Aおよび図19Bに要約する。ルシフェラーゼmRNAコントロールと比較すると、AS-ONによる翻訳阻害はhGSTP1^*C mRNA標的特異的であった。7.5μM AS-ONでは、hGSTP1^*C特異的AS-ONによるhGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害は、ルシフェラーゼmRNAの5%阻害と比較すると90%阻害だった。しかし高いAS-ON濃度（＞12.5μM）は、翻訳阻害に対するテンプレート要求性の特異性を減少させた。10U/mlのRNAe H存在下では、hGSTP1^*C mRNAテンプレートにおいて、2.5μM AS -ONで翻訳の完全な遮断が観察された。このときルシフェラーゼmRNAの翻訳には検出可能な影響は見られなかった。 hGSTP1^*Cにおけるヌクレオチド転位に指向されるAS-ONによる翻訳阻害。アンチセンスオリゴヌクレオチドの主要な利点は、所定のmRNAの特異的領域を標的とするためにそれらを用いる可能性である。このことは、多型のヒトGST-π遺伝子について、３つの改変遺伝子のそれぞれの発現を、他の遺伝子の発現に有意に影響を与えることなくダウンレギュレーションする手段を提供し得る。従って、本研究は、hGSTP1^*Cにおけるそれぞれ+313および+341でのA→GおよびC→T転位が、それらに対して設計された転位部位特異的AS-ON(TS-AS-ON)による特異的な翻訳阻害に対して標的化され得るかどうかを調べるために設計した。観察された効果のRNAse H依存性もまた試験した。本結果はTS-AS-ON（これはhGSTP1^*Cにおける+ 313および+341での転位に相補的なヌクレオチドを含有する）が、転位ヌクレオチドのないAS-ONよりも有意に高い程度に、hGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害を特異的に阻害したことを示す（図19Aおよび図19B）。さらに、本データは、阻害が特異的であるAS-ON濃度範囲において、効果は強いRNAse H依存性であったことを示す。興味深いことに、+341での転位に特異的なTS-AS-ONは、hGSTP1^*C mRNAの翻訳阻害において、+313での転位ヌクレオチドに対して標的化されるTS-AS-ONよりも、２倍有効だった。しかし、２つの塩基転位特異的なAS-ONの組合せは、単に相加的な翻訳阻害を生じた。 hGSTP1^*C AS-ONに相補性を有する遺伝子配列の分析。本研究に用いた各AS-ON の13塩基、14塩基、および15塩基に相補的なヒト遺伝子配列のデータベース検索の結果を、表14〜16に示す。完全にAS-ONと適合するテンプレートは、３つのGST -π遺伝子改変体のみであった。表14は、さらに、翻訳開始部位について、15のうち15のヌクレオチド相補性が、脂肪酸エチルエステルシンターゼIII遺伝子（E MBL/Genebank受託番号M69113）に対して観察されたことを示す。A→TおよびC→T のヌクレオチド転位を含むhGSTP1^*Cの領域についての相補性分析を表３および表４に要約する。完全な（15個中15個）ヌクレオチド配列相補性は+313 AS-ONに対しては観察されなかったが、しかし正常筋肉由来の未同定の部分cDNA（受託番号 Z24964）は、+341 AS-ONの全15ヌクレオチドに相補的な領域を含んだ。hGSTP1^*C mRNAの+487〜+587に拡がる3'末端の領域は、翻訳開始部位AS-ONと部分的な相補性を有することが観察された。ルシフェラーゼmRNA配列と、開始部位hGSTP1^*C翻訳配列との対をなす配列比較（表17）は、３ヶ所の９ヌクレオチドの部分的な適合を+4、+88、および+620位に示した。３．考察 GST-πの過剰発現と、多くのヒト腫瘍における悪性の進展および治療失敗との強い関連性は、前臨床レベルおよび臨床レベルで、抗癌治療の効力を増強する手段としてGST-πタンパク質の阻害を開発するための努力を導いた。現在、主としてこれらの研究では小分子GSTインヒビターが挙げられるが最近、プラスミドベクター内に送達されたアンチセンスGST-πcDNAが、GST-π発現をダウンレギュレートし、そして腫瘍細胞をアルカリ化剤に対して感作するのに効果的であること (Banら、1996)が示されてきた。しかし、ヒトGST-π遺伝子座が多型であること、および改変体GST-π遺伝子が機能的に異なるタンパク質をコードし、そして正常組織および腫瘍組織で異なる発現をするという最近の知見は、さらなる複雑さおよび細胞内のこれらのタンパク質を特異的に標的化する試みへの挑戦を与える。AS-ONを用いてGST-π mRNAを標的化する別のストラテジーは、タンンパク質インヒビターに対する独特の利点（高度に特異的で、より効果的な、GST-π遺伝子発現のダウンレギュレーションの可能性を含む）を潜在的に有する。さらに、適切な条件下における単一ヌクレオチド変化が、AS-ON:mRNAハイブリダイゼーションの特異性、および次のmRNA翻訳阻害を提供し得る、という事実は、このアプローチがGST-π遺伝子の多型改変体の特異的な鑑別阻害の手段を提供し得ることを示唆する。大量の証拠（Banら、1996；Mirabelliら、1991；Gyurkoら、1993；PiergaおよびMagdelenat、1994；Saisonら、1991;Temsamaniら、1994；SteinおよびCohen、 1988；StephensonおよびZamencik、1978；ZamencikおよびStephenson、1978；Wi elboら、1995）は、AS-ONがmRNA翻訳の効率的なインヒビターであることを明らかに示している（翻訳プロセス自体の阻害に関与する正確なメカニズムは未だ部分的にしか理解されていない）。本研究の主たる到達地点は、AS-ONがGST-πmRN A翻訳を効率的および特異的に阻害に用いられ得るかどうかを試験し、そしてRNA se HによるRNA:DNA(AS-ON)ハイブリッド中の標的mRNAの切断が、どの程度までGS T-π翻訳阻害機構の重要な部分であるかを調査することである。これらの研究において、hGSTP1^*C cDNAが用いられた。なぜなら、１つには、というのもこれまでの研究において、GST-π遺伝子の本改変体は、正常リンパ球よりも神経膠腫細胞でより顕著に高頻度で発現されることが示されてきたからである。ここで、AS -ONがhGSTπ^*CmRNAの翻訳の効率的なインヒビターであることが分かった。比較的低いAS-ON濃度で達成される翻訳阻害の特異性、AS-ON用量応答性、および完全性は、細胞中のGST-π遺伝子発現をダウンレギュレートする手段としての本ステラトジーの可能性を支持する。本研究は、単一塩基ミスマッチが、hGSTP1^*C mRN AテンプレートにおけるAS-ON媒介翻訳阻害の特異性を顕著に減少させるのに有効であることを実証した。本結果はまた、AS-ON媒介翻訳阻害の強力なRNAse H増強も示す。しかし、RNAse H効果の程度は、GST-π mRNAの標的領域ならびにAS-ON の骨格改変および濃度に依存した。hGSTP1^*C mRNAの翻訳開始領域を指向するAS- ONによる翻訳阻害は、RNAse Hの非存在下では用量依存的であり、そしてRNAse H 存在下では用量非依存的であった。この観察は、RNAse H非存在下において、AS- ONが同じmRNAに結合したままであり、さらなる阻害は追加のAS-ONを必要とし、化学量論的なAS-ON:mRNAの関係を生じる、翻訳阻害の機構と一致する。対照的に RNAse H存在下では、mRNA:AS-ONハイブリッド中のmRNAは、RNAse Hによって消化され、そして遊離したAS-ONは、別の標的mRNAと再アニールおよび阻害するのに利用可能である。従ってRNAse H存在下において一つのAS-ONは、いくつかの標的 mRNAを阻害し得る。RNAse HおよびAS-ONの存在下において標的GST-π mRNAが、A S-ONとのハイブリダイゼーション部位でのmRNAの消化と一致するサイズの二つのフラグメントを生じるように切断されるという実証は、hGSTP1^*C mRNA翻訳阻害の基礎をなす機構を支持する。 hGSTP1^*C翻訳阻害のAS-ON配列およびmRNA標的特異性は、高AS-ON濃度における場合よりも、低AS-ON濃度(＜7.5μM)において有意に高かった。この相補性分析は、hGSTP1^*CとルシフェラーセmRNAとの間における９ヌクレオチドの部分的な一致を示した。このことは、高ON:mRNA割当における標的GST-π AS-ONの非特異性が、標的mRNAとの非特異的なAS-ONハイブリダイゼーションに起因することを示す。翻訳開始部位の下流領域での翻訳ブロックに対するRNAse Hの優先性を示す以前の報告（Crooke,1992;Schulerら、1991）のために、hGSTP1^*C mRNAとルシフェラーゼmRNAとの間の部分的な一致を有する+4位の領域は、高AS-ON濃度で観察される、ルシフェラーゼmRNA翻訳の非特異的なRNAse H媒介性阻害のための適当な部位である（WeidnerおよびBusch,1994;Cazenaveら、1987）。RNAse Hはまた、ホスホロチオエートAS-ONの存在下で特異的な部位および非特異的な部位の両方において標的mRNAを切断することが報告されている。しかし、ルシフェラーゼ mRNA阻害が生じない濃度で、hGSTπ^*C mRNAの約90%の翻訳阻害が観察されることは、GST-π遺伝子について、RNAse H作用に起因する特異性のいかなる損失も、特異的な翻訳阻害に必要とされる低AS-ON濃度において重要でないことが示唆される。 AS-ONホスホジエステル骨格の改変が翻訳阻害の効力に重大な影響を与えた。R NAse H非存在下において、非改変ホスホジエステルAS-ONは、ほとんどまたは全く翻訳阻害作用を有さなかった。非改変AS-ONの不活性は、網状赤血球溶解物系に微量で存在することが以前に示されたヌクレアーゼ（ホスホジエステルAS-ON が天然の基質である）によるその迅速な消化により生じるようである（Cazenave ら、1987;Cazenaveら、1993）。対照的に、部分的におよび完全に改変されたホスホロチオエートは共に、高度に有効な翻訳インヒビターであり、前者は４倍有効であった。後者の結果は、AS-ONのホスホロチオエート改変物がそのmRNA標的アニーリング親和性を減少させ、そしてそのRNAse H感受性を低下させる（Stein 、1994;Geoら、1992;Quartinら、1987）という以前の観察の結果と一致する。これらの改変されたAS-ONの特性は、AS-ON骨格に導入された改変の数に比例することが示されている。それゆえAS-ONの改変において、改変によって達成されるヌクレアーゼ耐性と得られたAS-ONの所望の翻訳阻害活性との均衡をとる必要がある。本研究において、AS-ONの３’末端および５’末端の３つのホスホジエステル結合におけるチオエート置換が、AS-ONのRNAse Hに対する耐性を維持した一方で、hGSTπ^*C mRNA翻訳の有効な翻訳インヒビターを生じることが判明した。本研究で用いられるhGSTP1^*C cDNAは、+313でA→G、および+341でC→Tのヌクレオチド転位を含む。従ってhGSTP1^*C mRNAの翻訳は、対応するアンチセンス転位ヌクレオチドを含むAS-ONによって、このような転位を含まないコンセンサスA S-ONより効果的に阻害され得ることが示された。これは重要な知見であり、そして改変体GST-π遺伝子の発現が、AS-ONでその転位領域を標的化することによってダウンレギュレートされ得ること、および本ストラテジーにおいて細胞中の異なるGST-π遺伝子改変体の区別的でダウンレギュレーションについての独特の機会を存在し得ることが示される。RNAse H存在下において、+313転位ヌクレオチドを含むAS-ONは、hGSTP1^*C mRNA翻訳の阻害において、+341転位ヌクレオチドを有するAS-ONよりも有効であった。開始部位AS-ONに対する影響と比較して、転位部位AS-ON作用に対するRNAse Hのあまり大きくない影響は、RNAse H存在下において、上流標的mRNA配列に指向するAS-ONは、下流のmRNA領域を指向するAS-ONより阻害性であるという他の観察（Ghosら、1992;MinshullおよびHunt、1986）と一致する。このことはまた、部分的に、それぞれのmRNA:AS-ONハイブリッドの結合自由エネルギー（ΔΔG⁰）の差異から生じ得る。以前の報告（Banら、1996）では、(rG:dT)ミスマッチを含むものと比較して、(rG:dC)含有18マーRNA:DNAハイブリッドについて42.5kcal/モルのΔΔG⁰ ₃₇ ⁰Cが報告された。一方、（rT:dG）ミスマッチと比較して(rT:dA)では41.6cal/モルのΔΔG⁰ ₃₇ ⁰Cが観察された。これらの研究は、2.5kcal/モルのΔΔGが、変異体mRNAに比較して野生型Ha-ras標的mRNAへのAS-ONの選択的ハイブリダイゼーションにおいて7.6倍の増加を生じることを示した。一方、+1.6kcal/モルの変化は約3.4倍の差異に対応した。本研究において試験した、AS-ONに相補的なヒト遺伝子配列に対するデータベース検索は、hGSTP1^*A、hGSTP1^*B、およびhGSTP1^*Cに対して以外に、翻訳開始部位AS-ONに対する唯一の完全な一致が、脂肪酸エチルエステルシンターゼIII遺伝子であることを示した。これは全15ヌクレオチドにおいて相補的であった。正常筋肉cDNAライブラリーから単離された短縮型cDNAは、+341 TS-AS-ONの全15ヌクレオチドで相補的であったが、本cDNAの正確な同一性は知られていない。これらの観察は、GST-π特異的AS-ONによる、GST-π以外の他の遺伝子の転写物の翻訳の交差阻害が、最小限であることを示唆する。本研究の結果は、ヒトGST-π遺伝子が、アンチセンスストラテジーを用いるダウンレギュレーションに過敏であることを立証し、そしてさらなる研究を保証する。実施例５：GST改変体の小分子インヒビター１．材料および方法 GST-πインヒビターの生成。インヒビターの生成は、改変体GST-πタンパク質の活性部位の化学的フラグメントおよび化合物の力場におけるドッキングおよびエネルギー最小化を含む合理的な薬剤開発ストラテジーによって達成される。化合物および化学的フラグメントは、例えばLeapfrogデータベースにおいて利用可能なライブラリーのような、化学フラグメントライブラリーから得ることができる。さらなる化学ライブラリーが、必要に応じて生成される。改変体GST-πタンパク質の活性部位および他の構造成分は、GSTP1^*Aコードタンパク質の公表されている結晶構造由来である。GSTP1^*Bによってコードされるタンパク質は、アミノ酸104のイソロイシンをバリンで置換することにより得られる；GSTP1^*Cによってコードされるタンパク質はアミノ酸104のイソロイシンをバリンで置換することにより、そしてアミノ酸113のアラニンをバリンで置換することにより得られる。化学的フラグメント／化合物のエネルギー極小化の後に得られたΔΔG値に基づき、合成、および改変体GST-πタンパク質に対する阻害作用または他の作用についてのさらなる分析のため、候補インヒビターが化学フラグメントから選択および／または新規に構築される。合成、およびさらなる分析のためのインヒビターについての選択基準には、親油性、化学的安定性および利用可能性、もしくは合成の容易さが挙げられる。 GST-πインヒビターの合成。同定し、そして／または新規に構築した可能性のあるインヒビターが市販されていない場合、それらは、複素環構築および官能化、ならびに求電子および求核置換反応を含む標準的な有機合成方法論を用いて合成される。反応混合物は、薄層クロマトグラフィー、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー、ならびに高速液体クロマトグラフィー(TLC、CC、および HPLC)によって分離される。化合物は、必要に応じて改変された標準技術を用いて精製される。合成産物の特徴付けは、融点決定、フーリエ変換赤外線(FT-1R) 、紫外線(UV)、および核磁気共鳴(NMR)分光法、ならびに質量分析法によって行われる。生物学的試験のための化合物は、調製HPLCによって精製される。化合物の純度は、元素分析、およびHPLCによって決定される。改変体GST-πタンパク質の供給源。上記の合理的設計から選択されたインヒビターの能力を試験し改変体GST-πタンパク質を阻害するため、本発明者らは、対応するcDNAを含む発現ベクターでトランスフェクトしたE.coliで発現した組換え GST-πタンパク質を利用する。これらのベクターは本出願の他の場所に記載されている。このGST-πタンパク質は、S-ヘキシルグルタチオン結合エポキシ活性化セファロース6BのGSHアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、次いで酵素動力学分析に用いたられる。インヒビターのGST阻害活性の分析。これらの研究は、標準的な酵素速度論方法を用いて行なわれる。精製改変体GST-πタンパク質を、増加する濃度のインヒビターと混合し、そして異なる時点において残留GST活性を、0〜5mM 1-クロロ-2 ，4-ジニトロベンゼン(CDNB)、および2.5mM GSTを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.3)中の、反応混合物中(25℃)で測定する。吸光度変化を２分にわたって340nmでモニターし、そして反応速度を計算するために用いた。GSHとCDNBとの自発的な反応の速度（これはGST-π酵素を緩衝液で置換する反応混合物を用いて決定される）は、酵素触媒反応の速度から減算される。得られる反応速度は、標準的な方法を用いて適切な酵素速度論プロットを生成するのに用いられる。阻害定数が異なるインヒビターについて計算され、そして腫瘍細胞における活性、および次のインビボでのさらなる分析のための候補を選択することに用いられる。イソキサゾールの合成。上記の技術を用いて、イソキサゾールのような潜在的 GST-πインヒビターが同定された。イソキサゾールGSTインヒビターを得るための合成ストラテジーでは、ヒドロキシルアミンと３炭素原子成分（例えば1,3-ジケトン、またはα,β-不飽和ケトン）との間の環状下の通常のアプローチによるか、あるいは1,3二極性環付加反応（これにはアルケンまたはアルキンを有するニトリル酸化物が関与する）によって環系が達成され得る（Glichrist,T.L.(199 2)Heterocyclic Chemistry、第２版、John Wiley & Sons、New York、第８章,31 4〜316頁）。２．結果 GST-πペプチド中の７つの必須アミノ酸に対する推定結合エネルギーに基づいて、表18に示されるように、関連化合物群（置換されたイソキサゾール類）を、 GSTP1aとのそれらの結合エネルギーについて試験した。改変体GST-πタンパク質の活性部位中への化学的フラグメントおよび化学的化合物の力場ドッキングの初期結果は、潜在的なGST-π改変体タンパク質インヒビターであるいくつかのクラスの化合物を同定した。第一のクラスの化合物は、構造１〜３（表18）に示される一般構造を有する置換イソキサゾールである。異なる化合物における置換基は、R₁、R₂、R₃、および R₄で表される。異なる化合物間で置換基は変化し、そしてGST-πタンパク質の活性部位ポケットで、化合物の結合エネルギーにおいて有意な変化を生ずる。例えば、NH₂、またはOHいずれかのR₁置換は、ほぼ10kcal/molの結合エネルギーの変化を起こす。他の重要な置換は、R₃のアルキル、またはアミノアルキル置換、およびR₄のアルキル、フェニルまたは2-ピリジル置換であり、これらのいくつかは 10kcal/molより大きな結合エネルギーの変化を生じる。本発明中に記載されるストラテジーによって同定される潜在的な改変体GST-π タンパク質インヒビターの別の群は、ヘテロ環芳香族化合物である。この構造は表19に示されている。結合エネルギーは、化合物または置換の型に依存して、-3 4kcal/mol〜-94kcal/molの範囲である。他の群のインヒビターは、分岐鎖を有するかまたは有さない芳香族化合物、および芳香族化合物の単糖類誘導体または２糖類誘導体である。これらのGST-πII -部位リガンドの代表的な候補の構造は、表20および表21に示される。表18〜表21に示される構造は、本出願に記載される合理的設計アプローチで得られる構造の、代表例にすぎない。結合エネルギーは全て、リガンドがGST-πタンパク質のH-部位に安定に結合することを示す。従って、本発明を用いて、同じストラテジーを用いて更なる化合物を同定し、かつこれらの化合物、および得られるべき他の化合物に更なる構造的改変を行い得る。これらの改変は、有効性を最適化するため、溶解度および／または安定性を増加または減少させるためおよび／または、そうでなければ化合物の生物学的効果および／または治療効果を増強するために行われる。本明細書中で開示されおよび請求項に記載されるすべての組成物および方法は、本願の開示を考慮して過度の実験を要することなく作製かつ実施され得る。好ましい実施態様について、本発明の組成物および方法が記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および方法および方法の工程または一連の工程に変更が適応され得るということは当業者に明らかである。より具体的には、化学的および生理学的にの両方で関連する特定薬剤が、同じまたは類似の結果を達成しながら、本明細書中に記載される薬剤と置換され得ることが明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の置換物、および改変物はすべて、添付した請求項によって規定されるような本発明の精神、範囲、および概念内にあるとみなされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/10 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者アリーオズマン，フランシスアメリカ合衆国テキサス 77459，ミズーリシティ，コターレイクドライブ 5007 (72)発明者ロペズ―ベレステイン，ガブリエルアメリカ合衆国テキサス 77402，ベレア，ベレアコート 122 (72)発明者ビュオランウィニ，ジョンケイ. アメリカ合衆国ミシシッピ 38655，オックスフォード，ビーンランドドライブ 1201 (72)発明者アントウン，ギャミルアメリカ合衆国テキサス 77036，ヒューストン，サンドストーンストリート 8903 (72)発明者ロ，ヒュイ―ウェンアメリカ合衆国テキサス 77478，シュガーランド，ローリングミルドライブ 731 (72)発明者ケラー，チャールズアメリカ合衆国テキサス 77025，ヒューストン，ウッドフォックス 4057 (72)発明者アカンデ，オラニケアメリカ合衆国テキサス 77054，ヒューストン，ケンブリッジナンバー27 7901

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、該腫瘍細胞中の少なくとも１つのhGSTP1^*Bタンパク質またはhGSTP1^*Cタンパク質の活性レベルを低減させる工程を包含する、方法。２．前記活性を低減させる工程が、前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質の発現を低減させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。３．前記発現を低減させる工程が、前記肺瘍細胞と、細胞内条件下においてhG STP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸にハイブリダイズするが、細胞内条件下においてhGST P1^*A核酸に実質的にハイブリダイズしないアンチセンス核酸とを接触させる工程を包含する、請求項２に記載の方法。４．前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸がmRNAである、請求項３に記載の方法。５．前記アンチセンス核酸が、前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸の少なくとも一部分を含むベクター構築物から発現されるmRNAである、請求項３に記載の方法。６．前記ベクター構築物が、前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸コード領域の少なくとも一部分を含む、請求項５に記載の方法。７．前記コード領域がcDNA由来である、請求項８に記載の方法。８．前記ベクター構築物が配列番号４の少なくとも塩基+313または+341を含む、請求項７に記載の方法。９．前記ベクター構築物が、前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸の、転写されるが翻訳されない領域の少なくとも一部分を含む、請求項５に記載の方法。１０．前記転写されるが翻訳されない領域がイントロンである、請求項９に記載の方法。１１．前記ベクター構築物が翻訳される領域の少なくとも一部分を含む、請求項５に記載の方法。１２．前記ベクター構築物が、前記hGSTP1^*Bからのエキソン５の少なくとも一部分、または前記hGSTP1^*C核酸からのエキソン５および６の少なくとも一部分を含む、請求項１１に記載の方法。１３．前記アンチセンス核酸がDNA分子である、請求項３に記載の方法。１４．前記DNA分子がcDNAである、請求項１３に記載の方法。１５．前記DNAが配列番号４の少なくとも塩基+313または+341を含む、請求項１３に記載の方法。１６．前記発現を低減させる工程が、細胞内条件下において、前記腫瘍細胞と、前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するリボザイムとを接触させる工程を含む、請求項２に記載の方法。１７．前記リボザイムが配列番号４の少なくとも塩基+313または+341を切断する、請求項１６に記載の方法。１８．前記活性を低減させる工程が、前記腫瘍細胞と、免疫学的にhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するが、hGSTP1^*Aタンパク質に実質的に結合しない抗体とを接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。１９．前記抗体が、配列番号３の残基104または113を含むエピトープに結合する、請求項１８に記載の方法。２０．前記腫瘍細胞がヒトの被験体内にある、請求項１に記載の方法。２１．腫瘍細胞中のアルキル化剤の増殖阻害の活性を増加するための方法であって、該腫瘍細胞中の少なくとも１つのhGSTP1^*Bタンパク質またはhGSTP1^*Cタンパク質の活性レベルを低減させる工程を含む、方法。２２．hGSTP1^*B（配列番号１）の配列を有する、単離されたポリペプチド。２３．hGSTP1^*C（配列番号３）の配列を有する、単離されたポリペプチド。２４．hGSTP1^*B（配列番号１）をコードする、単離された核酸。２５．hGSTP1^*C（配列番号３）をコードする、単離された核酸。２６．前記配列が配列番号２の配列である、請求項２４に記載の単離された核酸。２７．前記配列が配列番号４の配列である、請求項２５に記載の単離された核酸。２８．hGSTP1^*B（配列番号１）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む、発現ベクター。２９．hGSTP1^*C（配列番号３）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む、発現ベクター。３０．前記配列が配列番号２の配列である、請求項２８に記載の発現ベクター。３１．前記配列が配列番号４の配列である、請求項２９に記載の発現ベクター。３２．前記核酸が、真核生物細胞中のプロモータ活性に対してアンチセンスに位置づけられ、そして真核生物細胞中のプロモータ活性の制御下である、請求項２８に記載の発現ベクター。３３．前記核酸が、真核生物細胞中のプロモータ活性に対してアンチセンスに位置づけられ、そして真核生物細胞中のプロモータ活性の制御下である、請求項２９に記載の発現ベクター。３４．hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質の少なくとも１つに免疫学的に結合するが、hGSTP1^*Aタンパク質に結合しない、抗体。３５．前記抗体が配列番号３の少なくとも残基104または113を含むエピトープに結合する、請求項３４に記載の抗体。３６．細胞内条件下において、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸にハイブリダイズするが、細胞内条件下においてhGSTP1^*A核酸に実質的にハイブリダイズしない、アンチセンス核酸。３７．細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するが、細胞内条件下においてhGSTP1^*A核酸を実質的に切断しない、リボザイム。３８．hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するがhGSTP^*Aタンパク質に実質的に結合しない分子を調製する方法であって、hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパタ質の３次元構造を決定する工程、およびhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質に結合するが、hGSTP1^*Aタンパク質に実質的に結合しない分子を設計する工程を包含する、方法。３９．さらに前記hGSTP1^*BまたはhGSTP1^*Cタンパク質への結合のために設計された分子を試験する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。４０．さらに前記hGSTP1^*Aタンパク質への結合のために設計された分子を試験する工程を包含する、請求項３９に記載の方法。４１．GST-π活性を阻害する候補インヒビター物質を同定するための方法であって、以下：ａ）GST-πタンパク質を発現する細胞と候補インヒビター物質とを接触させる工程；およびｂ）該候補インヒビター物質の非存在下で、該細胞の増殖と該細胞の増殖とを比較する工程；を包含し、ここで、増殖の増加は、該物質がGST-πの活性のインヒビターであることを示す、方法。４２．前記発現されているGST-πタンパタ質がGSTP^*Bである、請求項４１に記載の方法。４３．前記発現されているGST-πタンパク質がGSTP^*Cである、請求項４１に記載の方法。４４．前記発現されているGST-πタンパク質がGSTP^*Aでない、請求項４１に記載の方法。４５．前記候補物質が、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸に対するアンチセンス分子である、請求項４１に記載の方法。４６．前記候補物質が、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するリボザイムである、請求項４１に記載の方法。４７．前記候補物質が小分子インヒビターである、請求項４１に記載の方法。４８．前記小分子インヒビターが、置換イソキサゾール、複素環式芳香族化合物；または糖結合芳香族化合物である、請求項４７に記載の方法。４９．GST-πの発現を阻害する候補インヒビター物質を同定するための方法であって、以下：ａ）GST-πタンパク質を発現する細胞と、候補インヒビター物質とを接触させる工程；およびｂ）前記候補インヒビター物質の非存在下で、該細胞のGST-πの発現と該細胞のGST-πの発現とを比較する工程；を包含し、ここで、発現のGST-πの低減は、該物質が、GST-πの発現のインヒビターであることを示す、方法。５０．前記候補物質が、細胞内条件下においてhGSTP1*BまたはhGSTP1^*C核酸に対するアンチセンス分子である、請求項４９に記載の方法。５１．前記候補物質は、細胞内条件下においてhGSTP1^*BまたはhGSTP1^*C核酸を切断するリボザイムである、請求項４９に記載の方法。